JPS631972A - 放射性標識蛋白質のためのカツプリング剤 - Google Patents

放射性標識蛋白質のためのカツプリング剤

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JPS631972A
JPS631972A JP62130023A JP13002387A JPS631972A JP S631972 A JPS631972 A JP S631972A JP 62130023 A JP62130023 A JP 62130023A JP 13002387 A JP13002387 A JP 13002387A JP S631972 A JPS631972 A JP S631972A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３３、　　発明の訂イ、）１１な説明 ト発明は、金属イオン、特にテクネチウｌ、およびし・
二パフムの放ル１性同位元素で標識化された生物学的に
イ１用な分Ｙ−の製造に用いられるカップリング剤に関
１″る４）のである。発明のカップリング剤を′ｋＩＩ
−’、１込んだ放射性標識抗体断片は、治療および生体
内診断の用途に用いられる。
放射性核種金属イオンの、治療的および生体内診断の用
途における使用はしばらく前から実際るこ行われている
。たとえば、テクネチウム−９９ｍを含むガンマ放射　
放射性核種金属イオンが、１ＩＩＴ！瘍発見のための診
断的シンチグラフィーに用いられている。レニウム−１
８６、レニウム−１８８およびレニウム〜１８９を含む
ヘータ放躬同位体は腫瘍治療に治療的に用いられる。
放射性核種の生体内診断および治療への応用における効
率は、放射性核種を標的細胞部位まで運搬できるかどう
かによってきまる。放射性核種を標的細胞部位に運搬す
る一つの方法は、放射性核種金属イオンを、生物学的に
有用な分子、たとえば抗体にカップリングすることを含
む、その抗体は標的細胞と結合する特異的配位子を選択
的に確認し、これと結合する。たとえば、診断的造影（
ｉｍａｇｉｎｇ）目的で、または腫瘍を照射してそれを
破壊する目的で、悪性腫瘍細胞によって産生されるまた
は悪性腫瘍細胞と結合することが知られている抗原を、
抗体と結合した放射性核種に結合させることができる。
ゴールデンヘルグ等（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇｅｔ　ａｌ
）（Ｎ、ＥｎＢ、ｊ−、Ｍｃｄ　、。、２９８巻１３８
４−１．３８８ページ、　１９７８）は、既知の癌関連
抗原である癌胚抗原（ＣＥＡ）　　（ゴールド（Ｇｏｌ
ｒｌ）等、１．７４．ｘＢ、Ｍｅｄ、　１２１巻４３９
−４６２ページ、１９６５〕に対する抗体をヨード！３
１　で標識化し、癌の病歴のある患者に注射するという
実験を報告した。
４８時間後その患者をガンマ−シンチレーションカメラ
により走査し、ガンマ放射パターンによって癌を定位し
た。同様に英国特許出願第２．１（１９．４（１７号は
、金属性放射性核種で標識化した、癌関連抗原に対する
モノクローナル抗体を、生体内腫瘍検知および定位のた
めに使用することを記載している。
放射性標識された抗体断片は、放射性標識された全抗体
よりもしばしば生体内診断および治療への応用に用いら
れることが示唆されている。その理由は、断片の方が所
望標的部位に浸透することができること、および抗体断
片は、全抗体と関係する免疫原性および交叉反応性の問
題を最小にすることである（例：米国特許第４，０３６
，９４５号；ラーンセット（トジ凹旦υ−１■巻、　Ｎ
ｏ、８０８７．４６２ページ（１９７Ｂ）　；ベリツキ
−（Ｂｅｌｉｔｓｋｙ）等、、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、
＋１９巻４２９ページ、１９７Ｂ）。抗体断片はいくつ
かの方法でつくることができる。抗体分子を酵素的に処
理してＨ鎖のカルボキシル末端部分（Ｆｃ断片）を除去
し、二価のＦ（ａｂ　′）ｚ断片、すなわちＨ８ｊＶに
つながる１箇以上のジスルフィド結合によって結合して
いる二つのＦａｂ　′部分は残すことができる。
Ｐ（ａｂ　’　）ｚ断片をその後、Ｈ鎖につながってい
るジスルフィド結合のところで選択的に還元し、各々が
一つの抗原結合部位を有する二つのｍ個Ｆａｂ　’断片
をつくる。
抗体分子は、放射性核種金属イオンが抗体に結合するた
めの付着部位として用いることのできる反応性側鎖を多
数含む。たとえば、放射性核種は、アスパラギン酸−ま
たはグルタミン酸残基のカルボキシル基、リジン残基の
アミノ基、チロシン−またはヒスチジン残基の芳香基、
またはシスティンのズルフヒドリル基と反応するリンカ
−分子によって、抗体に結合することができる。
先行技術の方法を用いて抗体−放射性核種錯化合物をつ
くることはできるが、これらの方法でつくられた錯化合
物は、どれ一つとしてイメージングに使用するために理
想的な生体分布特性をもっていない。特に、良いラジオ
グラフィック剤の望ましい特性である肝臓および腎臓に
おける放射性核種の速かなりリアランスまたは低いとり
込みは、先行技術の方法によってつくられる多数の抗体
−放射性核種錯化合物では実現困難な問題である。
本発明は、放射性核種金属イオン、特にテクネチウムま
たはレニウムの同位元素と錯化合物を形成できる、生物
学的に有用な蛋白質またはポリペプ千ト分子、たとえば
抗体と結合物を形成するのに役立つ二官能価カップリン
グ剤を提供して、生体内での診断および治療への応用に
使用できる物質を提供する。本発明の二官能価カップリ
ング剤を抗体または抗体断片中のりジン残基のε−アミ
ノ基と反応させることによってつくられる本発明】３ の抗体結合物は、その抗体結合物を形成する抗体の抗原
結合活性、すなわち免疫反応性を保有する。
二官能価カップリング剤は、アシル化反応によって抗体
または抗体断片中のε〜ルアミノと反応してアミド結合
を形成する活性化基を含む。二官能価カップリング剤は
、放射性核種金属イオンとキレート錯化合物を形成する
ことのできる基も含んでいる。
発明のカップリング剤を組み込んだ抗体結合物は、−般
式； ％式％ こ＼でＡｂは抗体または抗体断片の残基であり；Ｒ３゜
Ｒ２およびＲ３は同じであるかまたは異なり、各々は１
〜６箇の炭素原子を有ずろアルキル、６〜８箇の炭素ハ
；是了をイＪ−・ｊろアリルおよび７〜９箇の炭素原ｒ
をイＪ−ツろアルカリルから成る群から選ばわる基てあ
って、そのいづれも１箇以−１のヒドロキシル、−どル
コキシ、カルボキシ−またはスルフメネ−１・、１１Ｉ
＞で置換され得ろ基をあらわし、ｎは１またｉ、＋　２
　、へへＩＩアミＩ・結合Ｑこよって互いに結合するα
−ｒｌたはβ　ア：ミノ酸（互いに独立的に）であり；
１ＬＩＪ：２から６までの整数である。
代１　ｉ＋、た！ｔ：　１１をイ１する抗体結合物はキ
レ−１〜化）１（によ−、て放射１）１核神、たとえば
テクネチウム−またｉ；Ｉ：　ｌ／二・：ノノ、同（＼
ン元素と１）化合物を形成し、た七えば悪１１Ｉ　Ｉｔ
中瘍の治療に治療用、または生体内診断用イメージンク
剤として用いることのできる抗体−放射線核種結合物を
提供する。
八ｌおよび１丁の抗体結合物は、発明の二官能価カップ
リング剤を抗体または抗体の断片、ずなわらＦ（ａｂ）
　′２またはＦａｂ　’断片と反応させることによって
つくられる。用いられるＦａｂ′断片は、全抗体をＦａ
ｂ′断片に変える酵素的および／または化学的処理を受
けた後でも抗原結合活性を保有することのできる抗体か
ら誘導される。全抗体は２木の■］鎖の部位特異的切断
をおごず酵素で先づ処理され、Ｉ−１鎖のカルボキシル
末端のところのＦｃ部分を除去する。生成したＦ（ａｂ
）　’　２断片をその後、ジチ第１〜レイ１−ルのよう
な還元剤で処理する。還元剤は、２木のＨ鎖に連結する
ジスルフィンド結合を含むシスルフィッド結合を切断す
る。
Ｈ−Ｉ−鎖　　ジスルフィソド結合は切断されるとｌＪ
いえ、■（鎖と１．鎖とは相変らず関係している。こう
して二つのＦａｂ　′断片がつくられ、その各々はその
ＨＩ’ｆから垂れ下った遊離のズルフヒドリル基を最低
１箇有する。その遊離スルフヒドリル基を、Ｎ−エチル
マレイミド、ヨードアセタミドまたはヨード酢酸のよう
な遮蔽剤でアルキル化することができる。ズルフヒトリ
ル基を遮蔽することにより、それらは放射性核種との反
応を全うすることに利用できなくなる。リジン残基のε
−アミノ基は、抗体断片または全抗体がカップリング剤
に結合して抗体結合物を生成するその反応部位となる。
チオール活性化剤の存在下でパパインによって抗体を酵
素的に切断すると　Ｈ鎖間ジスルフィット結合のないＦ
ａｂ　’断片が生成する、これらは、生成抗体断片が遮
蔽剤によってアルキル化する必要のある遊離スルフヒド
リル栽を含まないという点で、本発明においては特に有
用である。
本発明の実施において有用な抗体は、生体内腫瘍マーカ
ーとして有効であることが知られている抗原、たとえば
癌胚抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロティン、ヒＩ−絨
毛膜性生殖腺刺激ホルモンまたはそのヘータ・サブユニ
ント、結腸特異抗原−Ｐ、腫瘍特異糖蛋白質等々のいづ
れに対する抗体をも含む。
使用する抗体は異種のものであってもよいし、それらが
モノクローナル抗体であってもよい。モノクロ−ナル抗
体は、コーラ−（Ｇ　、　Ｋｏｈ　］　ｅｒ）およびミ
ルスタイン（Ｃ，Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ）の「ネイチュア
」（トＩントン）、２５６巻４９５−４９７ページ（１
９７５）に記載の方法にしたがってつくられる選択され
たハイブリトーマ細胞によってつくられる。本発明の実
施において用いられるＦａｂ　’断片の生産に有用な抗
体の例は、癌関連抗原、　ＣＥＡ、に対するモノクロー
ナル抗体である。このネズミ　モノクローナル抗−ＣＥ
Ａ抗体は、パルハム（Ｐａｒｈａｍ）等の方法（Ｊ−、
ｊ−ｍ−ｍ−ｕ−ｎＯＬ」北頃り声、５３巻、１３３−
１７３ページ（１９８２）　）によって、前活性化せる
チオール不存在パパインを用いて切断され、Ｈ鎖に結合
ずろ１箇のジスルフィッド結合を有するＦ（ａｂ　′）
２断片をつくることができる。その後鎖間ジスルフィッ
ト”結合を還元剤で処理して破壊し、Ｆａｂ　’断片を
得る。還元された状態でも、Ｈ鎖およびＬ鎖は関係を保
っており、そのため抗原結合活性は保有される。還元は
、中性ｐｉ（またはそれに近いｐ＋＋で緩衝溶液中で培
養（インキュベート）することにより便利に行われる。
インキュヘーション温度は決定的ではなく、室温が適当
である。インキュベーションは１既して約１〜２時間行
われる。ジチオトレイトールは鎖間ジスルフインド結合
を切断するだめの好ましい還元剤である。
式Ｉおよび■１の抗体結合物は、全抗体または断片を、
次式によってあられされる本発明のカップリング剤と反
応させることによってつくられる。
または ｌＩＩ 式■および■において、Ｒ，、ＲＺおよびＲ３は同じで
あっても異なっていてもよく、各々は１〜６箇の炭素原
子を有するアルキル、６〜８箇の炭素原子を有するアリ
ル、および７〜９箇の炭素原子を有するアルカリルから
成る群から選ばれる基であって、ぞのいづれもが１箇以
」二のヒドロキシル。
アルコ；トシ、カルボキソまたはズルフォネート基によ
って置換され得る基をあらわし；ｎは１またｂ：１２で
；面は独立的に、アミド結合によって互いに結合したα
またはβ−アミノ酸であり；ｉは２から６までの整数で
；Ｘは抗体またはその断片のε−アミノ基とアミド結合
を形成し得る活性化基である。
Ｘは、ハロゲン、Ｎ３゜ い。
次のものは、抗体のε−アミノ基に放射性核種金属イオ
ンを付着するために用いられる式■のカップリング剤の
例である。
目　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　冨次のも
のは抗体のε−アミノ基に放射性核種金属イオンを付着
するために用いられる弐■のカップリング剤の例である
。
ｌ ０＝Ｃｃ＝。
Ｉ ＣｂＨｓ　　ＣｂＨｓ ｏ＝ｃ　　　　　　ｃ＝。
Ｉ Ｈ３ＣＨ３ エステル型の、式■のカップリング剤は、式Ｘ−０ｆ（
の化合物と、式 をイ１′するカルボキシル酸とを、カルボキシル基のニ
スう−ル化がおこる条イ′１−トて反応させることによ
、って合成される。ｊ（Ｘｌの化合物は、それはくれで
ボリベブ千ト１１４：八八）ｉＣＣｈ　Ｉｆからつくら
れる。このポリペゾチ１をりｌ−１１’：Ｉアシルクロ
リド、たとえばノー目「１アセチルクロリドと反応させ
ると、式の化合物がイ１゛成ずろ。
式■の化合物をその後代 Ｎ、　ｓ　（：　Ｉ？。
の化合物よ反応さ−Ｕて、式■の化合物を・つくること
力辷ごきる。
式Ｖの化合物を什成するだめの上記の反応系列のｌ’Ｂ
　ｌ（、Ｈる例として、Ｓ−ヘンヅイルメルカブＩ・チ
ー１１千ルグリソルグリシルグリジン製造のための次の
図式を参照することができる。
Ｓ−ヘンヅイルメル力プトアセチルグリシルグリシルグ
リシネートをその後、たとえば　Ｎ−ヒトロキシスルフ
ォスクシンイミトナトリウムと反応させて、弐■の化合
物、すなわちスルフォスフシンイミドイル（Ｓ−ヘンゾ
イルメル力ブトアセチルグリシルグリシルグリシネ−１
・）すトリウムを合成することができる。チオ安息香酸
すトリウムの代わりにチオ酢酸す）・リウムを用いる同
様な反応図式は、スルフォスフシンイミドイル（Ｓ−ア
セチルメルカブトアセチルグリシルグリシルグリシ不一
ト）ナトリウムを生成する。
エステル型の弐■のカップリング剤番よ、式Ｘ−０１１
の化合物を、式 ％式％ を有するカルホキシル酸と反応させることによってつく
ることかできる。
代■のソＪＪレボ二１−シル酸は、２，３−ジアミノプ
ロピメン酸から、フリッツエルグ（Ａ、Ｒ，Ｆｒｉｔｙ
ｅｒｇ）等が、！　、Ｎ１１−ｐ、　ｊ　、’ｈ吋、、
２３巻５９２−５９８ページ（１９ｇ２）に記載される
相当エチルエステルのための製法に類催の方法によって
つくることができる。その製法は次の反応図式によって
説明される； ＣＩＣｌｈＣＯＮＨＣ１ｌｚＣＨＣＯ７ＩｔＲ−Ｃ−５
−ＣＨｚＣＯＮＨＣＩＩｚＣＩＩＣＯｚｌ＋Ｒ−Ｃ−５
−ＣＩＩ□ＣＯＮ　Ｉ＋ 弐■または■のカップリング剤を抗体またはＦａｂ′断
片のε−アミノ基と反応させるとアミド結合によって、
式ＩまたはＨの抗体結合物が生成する。
反応は中性またはわづかに酸性の緩衝液、たとえば２０
ｍＭ燐酸塩溶液、ｐＨ７，０，中で行われる。不都合な
副反応を避けるために、アミン緩衝液は避げるべきであ
る１反応温度は決定的でなく、室温伺近が好ましい。室
温ではその反応は約１時間で完了する。生成物を一般的
クロマ１−グラフィー手段、たとえばゲル濾過クロマト
グラフィーにより分離することができる。
式Ｉまたは■の抗体結合物を、キレート化条件下で放射
性核種金属イオンと錯化合物を形成せしめ、抗体−放射
性核種錯化合物をつくる。Ｔｃ−９９ｍまたはレニウム
同位元素とのキレート化は、抗体結合物を所望同位元素
の塩と共に緩衝溶液中でインキユヘートすることによっ
て達成できる。発明のカップリング剤は、Ｔｃ９９との
結合およびレニウム−１８６，レニウム−１８８および
レニウム−１８９のようなレニウム同位元素との結合に
特に有用である。
抗体−放射性核種錯化合物は生理学的に受は入れられる
緩衝液中に処方され、治療用または生体内診断用に使用
することができる。本発明の一実施態様においては、Ｆ
ａｂ　′断片はネズミー抗ＣＥＡ−モノクローナル抗体
である。ＣＥＡ−抗体結合物をＴｃ−９９ｍまたはレニ
ウム放射性同位元素とキレート化し、当業者には公知の
光走査法を用いる生体内腫瘍イメージング剤として用い
られる。ＣＥＡ−抗体一放射性核種錯化合物を静脈注射
し、その後対象を光走査して生体内における放射性核種
結合物のとり込み部位を決定する。本発明の方法および
組成物は、生体内または生体外診断または治療の用途に
使用するために放射性標識化することが所望される抗体
以外の蛋白質またはポリペプチド分子に、放射性核種を
結合するためにも用いることができる。
次の実施例は、発明の実施をさらに詳しく説明するため
のものであって、決してその範囲を制限するものではな
い。
Ａ、クロロアセチルグリシルグリシルグリジンの製造 ５（１０ｍＩ！、フラスコに、１．ＯＮ　Ｎａ０１１１
５ｍ１中２．５ｇ（０，０１３ｍｏｌ）グリシルグリシ
ルグリジン溶液を入れ、これに、撹拌しながら窒素気流
中で０°Ｃで、エーテル１（１０ｄ中１３．０ｇ（０，
１１５ｍｏｌ）クロロアセチルクロリド溶液を一つの漏
斗から滴下し、それと同時に１、ＯＮ　ＮａＯ８１（１
０ｍＲを別の漏斗から滴下した。
添加が終った後、反応混合物を０°Ｃで１．５時間撹拌
した。
その後混合物を冷却しながら１Ｈｃｌで酸性にした。
さらに３０分間撹拌した後、混合物を減圧下で４０’Ｃ
で３分の１容量に濃縮した。残留分を水浴中で冷やして
沈澱させた。固体を分離すると、２回洗浄後に２．７５
ｇ（７８，５χ）が得られた。
Ｂ、Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシ
ルグリシンの製造 ！’Ｊｌりｔｒｒ＋７セタミド生成物（１，０ｇ、　０
．０３７ｍｏｌ）を窒素気流下で無水メタノール３（１
０ｍＲに溶解した。
チオ安息香酸すトリウム〔チオ安息香酸１．１０ｇ（０
゜（１０７（ｉｍｏｌ）と、ナトリウム１７５ｍｇ（０
，（１０７６ｍｏｌ）を加えた乾燥メタノールとからつ
くられる〕を加えた。
反応混合物を１．５時間還流した。減圧下で溶媒を除去
した後、撹拌しながら２Ｎ　Ｈｃｌを加えた。濾過によ
り固体を分離し、ＣＨｃ１３で洗った。メタノールから
結晶化すると生成物１．２５ｇ（９０χ）が得られた。
一ト・ナトリウム声の＋１貫 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２０ｍ！中に１．１８ｇ
（３，２０ｍｍｏｌ）　Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセ
チルグリシルグリシルグリシンおよび０．７０ｇ（３，
２０ｍｍｏｌ）　Ｎ−ヒドロキシズルフォスクシンイミ
ドを溶かした混合物に、１．３−ジシクロへキシルカル
ボジイミド０．６７ｇ（３，２０ｍｍｏｌ）を加えた。
混合物をＮ２気流中で一晩機械的に撹拌した。混合物を
水浴中で冷やし、フリット材料を通して濾過することに
より固体を除去した。濾液を速く撹拌している酢酸エチ
ル（〜１７５ｓＪ）に滴下し、生成物であるエステルを
沈澱させ、それを濾過により集め、酢酸エチルで洗い、
溶媒と共にまだ水分が残っている間に真空デシケータに
移し、真空下で一晩乾燥した。生成物ニス　′チルは１
．５６２ｇであった。
生成物エステルの活性を試験するために、水６ｍｌ中ベ
ンジルアミン０．０８ｇの溶液に、生成物エステル０．
３３９ｇを加えた。混合物を１７２時間撹拌し、沈澱を
集めると、生成物０．２５ｇ（９３χ）が得られた、こ
れはエステルが最低９３％活性であることを示しζいる
。
実ｊＪ笛−例−」− 一β二−ア中プ〉フ１イノーー刀イーカ　ツー−上−と
一±−ｊ１２つ名−丈ｐｔ５擾て一す−２火グーＶ−シ
ーンの製−造 Δ、クロ１ｊアセーｆ−ルグリシルグリシルグリシンの
製造 ５（１０ｍＥフラスコに、１．ＯＮ　Ｎａ０１１７Ｓｍ
Ｒ中２．５ｇ（０，０１３ｍｏｌ）グリシルグリシルグ
リジン溶液を入れ、これに撹拌しながら窒素気′流下で
０°Ｃで、エーテルＪ　ＯＯｍｌ、中１３．０ｇ（０，
１１５ｍｏｌ）りｏロアセチルクロリｌ溶液を−・つの
漏斗から滴干し、同時にもう一つの漏斗から１．ＯＮ　
ＮａＯＩｌｌｏｏｍＲを滴下した。添加終了後、反応混
合物を（）°Ｃで１．５時間撹拌した。それから混合物
を冷やしながら濃１（ｃｌで酸性にした。
さらに３０分間撹拌後、混合物を減圧下、４０°Ｃで１
／３容量に濃縮した。残留分を水浴中で冷やして沈澱さ
せた。固体を分離すると、２回洗浄後２．７５ｇ（７８
，５χ）を得た。
１３．３−アセデルメルカプトアセチルグリシルクリシ
ルグリジンの製法 粗クロロアセチルグリシルグリシルグリジン生成物（１
，０ｇ、　０．（１０３７ｍｏｌ）を窒素下で無水メタ
ノール５０ｍ１に懸濁させた。チオ酢酸ナトリウム・メ
タノール溶液〔チオ酢酸０．５８ｇ　（０，（１０７６
ｍｏｌ）と、ナトリウム１７５ｍｇ（０，（１０７６ｍ
ｏｌ）を加えた乾燥メタノールとからつくられる〕を加
えた。反応混合物を１．５時間還流した。減圧下で溶媒
を除去した後、２Ｎ１１ｃｌを撹拌しながら加えた。固
体を濾過により分離し、ＣｌＩＣｌ３で洗った。メタノ
ール／水とから結晶化すると生成物１．ＯＯｇ（９０χ
）が得られた。
ｎ％＝−傷 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルＪ、アミド１６滅中ニ１．ＯＯｇ
（３，３０ｍｍｏｌ）　Ｓ−アセチルメルカプトアセチ
ルグリシルグリシルグリシンおよび０．７１ｇ（３，３
０ｍｍｏｌ）　Ｎ−ヒドロギシズルフォスクシンイミド
ナＩ−リウムを？容がした混合物に、０．６８ｇ（３，
３０ｍｍｏｌ）の１，３−ジシクロへキシルカルボジイ
ミドを加えた。混合物をＮ２気流下で−・晩機械的に撹
拌した。混合物を水浴中で冷やし、フリソｌ−ＫＡ料を
通して濾過することにより固体を除去した。濾液を、速
く撹拌している酢酸エチル（２（１０ｍｕ）に滴下し、
生成物エステルを沈澱さ−ｌ、それを濾過により集め、
酢酸エチルで洗い、溶媒と共にまだ水分が残っている間
、真空デシケータ中に移し、高真空下で一晩乾燥した。
生成物エステルは１．４９ｇであった。
生成物の活性を、水６　ｍｐ、中０．０８ｇヘンシルア
ミン溶液にエステル０．３３８ｇ加えることによって試
験した。１７２時間撹）１≧を続け、濾過してヘンザミ
ドを集めると、０．．２３８ｇの生成物が得られた、こ
れはエステルが少なくとも９０％活性であることを示す
ものである。
’ＸｊＵｔ！！Ｊ／Ｉ］−−覆 Ｎ　−（３−不−）監Ｚオー不クーシーや一イー梃−２
ノとつ一二とご（ｊ１火！ルカプ−１・−η」フッに久
界−λ少グ）ノー忽乃優ｎＩＪじこ少りユリクーネー＝
、、、−，！ｒ、−で−す十−リーウム１Ｖρ−γ員貴
−無水メタノール７５瀬中Ｎ−クロロアセチルテトラグ
リシン１．５ｇ（４，６５ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸カ
リウム０．５４ｇ（４，７４ｍｍｏｌ）のスラリーを６
．５時間還流した。
生成した混合物を水浴中で１７２時間冷やし、それから
濾過した。白色固体を室温で１時間、水１０ｍ！中でス
ラリーにした。再濾過するとチオアセチル化合物１．１
１ｇ（３，（１７ｍｍｏｌ）が得られる、これは１３ｃ
ＮＭＲによって特徴づけられた。Ｎ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド２５ｍ１中チオアセチル化合物１　、０ｇ　（
２，７６ｍｍ。
１）およびＸ−ヒドロキシスルフォスフシンイミドナト
リウム０．６０ｇ（２，７６ｍｍｏｌ）の混合物に、１
．３−ジシクロへキシルカルボジイミド０．５７ｇ（２
，７６ｍｍｏｌ）を加えた。生成スラリーを室温で１５
時間撹拌した。
アセトン’１．ＯｍＱを加え、その反応混合物を水浴中
で１χ２時間冷やした。固体を濾過し、すてた。濾液に
乾燥エーテル１５０ｍ１を加え、固体を濾取した。
生成エステル物質を真空下で乾燥すると、明黄褐色の固
体０．３９ｇ（０，７１ｍｍｏｌ）が得られた、それは
Ｉ′ＩＣｎｍｒによって特徴づけられた。
その後の誘導化は、生成物エステル１（１０ｍｇ（０，
１８ｍｍｏｌ）を、Ｎ、Ｎ−ジメチルポルムアミド１　
ｍｌ中０．０２ｍ１　（０，１８ｍｍｏｌ）　ヘンシル
アミンと２５’Ｃで４時間反応さセることによって行わ
れた。反応混合物を無水エーテル２０ｍβで希釈し、濾
過した。真空下で乾燥後、白色結晶７７ｍｇ（０，１７
ｍｍｏｌ）が得られ、＋３Ｃｎｍｒニよって所望生成物
エステルであることが確認された。
１勿９−製造 使用したりボヌクレアーゼＡ（ＲＮ）ＸＩＩ−Ａ型（以
後ＬＳＩ：ＲＮと記す）はシグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ
ｒｐ、）＋セントルイス、ミズリー、から市販されてい
る。ｐｉ（５緩衝液（１（１０ｍＭクエン酸塩／１（１
０ｍＭ燐酸塩から調製）に？容かしたｌｏｍｇ　／　ｍ
ＱＲＮ？容液２５０μｆｆをやはりｐｎ５ｆｆｔ街液に
溶かした３０ｍＭ　Ｎ−（３−スルフォスフシンイミド
イル）Ｓ−ヘンジイルメルカプトアセチルグリシルグリ
シルグリシネート・ナトリウム塩溶液２５０／／Ｅと共
に室扁で】／２時間インキユヘートした。
インキュヘーション後、試料をｐｔｔ３−１０アガロー
ス等電点電気泳動（ＡＧ　ｒＥＦ）によって分析した。
第１ａ図はＡＧＩＲＦによって分析した結合物のレーザ
ーデンシトメーター走査をあられず。
使用する緩衝液のｐｔｔを６にして、上記の製法を繰返
した。第１ｂ図はＡＧＩＥＦによって分析した結合物（
ｐＨ６，０の緩衝液を用いて製造）のレーザーデンシト
メーター走査をあられず。
対照として、ｐ）ｌ　５．０の緩衝液中の未反応ＲＮを
ＡＧＩＥＦによって分析した。第１Ｃ図は八ＧＩＥＦに
よって分析した未反応ＲＮ試料のレーザーデンシトメー
ター走査をあられず。
第１ａ図、ｐｔｔ　５．０で反応した蛋白質が未反応の
対照（第１ｃ図）とは著しく異なる電気泳動パターンを
示すことを証明している。これは、キレ−１・のＲＮリ
ジン基との反応が成功しているためである。
正味の結果は蛋白質の全体的正電荷の減少である、これ
はキレート反応試料の認められる陽極移動によって示さ
れる。ｐｔｔ　６．０で反応した試料（第１ｂ図）もこ
れと同じ傾向を、より著しい程度で示す。
実施±−ユ 乳癌抗原に対するモノクローナル抗体、ＭＡＲ７２゜３
をパパインで消化して、Ｆ（ａｂ）　’　ｚ二重体を得
た。Ｉ（７２，３二量体〜キレート結合物の系列を、キ
レ−１／蛋白質（Ｄ−Ｅル比２０／Ｉおよび１（１０／
１テ、ｐＨ５，０および８．０で製造した。結合物を次
のようにり、　７１Ｊ造シタ；　ｐＨ１５，０マタハ８
．０（１（１０ｍＭ　’）　Ｉ　７酸塩／１（１０＋ｎ
Ｍ燐酸塩から調製）中４．４６ｍｇ／ｍＡ　Ｂ７２．３
二景体の２０μｌを、所望ｐＨの緩衝液に溶かした３゜
５７ｍＭまたは１７．８５ｍＭ　　Ｎ−（３−スルフォ
スフシンイミジルＳ−アセチルメルカプト−アセチルグ
リシルグリシルグリシネート・ナトリウム塩の５０μｌ
と混合する。室温で１〜１７２時間インキュヘーション
を行い、その後試料を、ｐｔｔ３−１０　ＡＧＩＥＦに
よって分析した（実施例６で行ったように）。
対照として、ｐｎ　ｓ’、ｏ緩衝液中の未反応８７２．
３二量体をｐＨ３−１０ＡＧＩＥＦによって分析した。
第２ａ図はｐｔｔ　５．０緩衝液中の未反応８７２．３
二量体のレーザーデ ンシトメーター 第２ｂ図は、キレート／　Ｂ７２．３のモル比が２０／
１であるＢ７２．３二量体ーキレート結合物（ｐｔｔ５
．０）のレーザーデンシトメーター走査をあられす。
第２ｃ図は、キレート、／　Ｂ７２．３二量体のモル比
が２０／１であるＢ７２．３二量体ー４ーレート結合物
（ｐＨ８．　０）のレーザーデンシトメーター走査をあ
６わす。
第２ｄ図は、キレ−１−／　８７２．３二量体のモル比
が１（１０／ｌである８７２．３二量体ーキレート結合
物（ｐ）１５。
０）のレーザーデンシトメーター走査をあられす。
第２ｅ図は、キレート／　８７２．３二景体のモル比が
１（１０／１である８７２．３二景体ーキレー１・結合
物（ｐｉ（８。
０）のレーザーデンシトメーター走査をあられす。
■ 癌胚抗原（ＣＥ＾）に対するモノクローナル抗体をパパ
インで処理してＦｃ部分を除去し、その後ジチオＩ・レ
イ１−−ルで還元（７てＦａｈ　′モノマー断片をつく
る。　Ｆａｂ　’の遊離スルマヒ１′リル基を、トリチ
ウ１１化（Ｔｒｉｔｉ、１ｔｃｄ）　Ｎ−工千ルマレイ
ミドで処理する、二とによって遮ｉ？ｉ　シた。ｐＨ５
，０または８．０緩（ｌｉ　液（ｔｏ（ｌｔｎＭクゴン
酸塩、７１（１０ｍＦ　燐酸塩から調製される）中４．
５５ｍＥＸ／ｍｉｌの抗Ｃ′Ｆ、へｔ’ａｂ′モノマー
溶液２０／ｌＥを、キレ−１・／蛋白質のモル比が１．
（１０／１になるように適当なｐＨの緩衝液に溶解され
た１７．８５ｍＭＮ　（３スルソオスクシンイミジル）
Ｓヘンゾイルメルカブトアセチルグリシルグリシルグリ
シネート・すトす・′ノＪ、塩溶液５μ！と共に１１７
２時間インキ−１・・、−１した。インキュヘーション
後、試料を寸法刊除（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）
ｔｌＩ’Ｌｃ（ＳＥＣ−ＨＰｌ、Ｃ）によって分析しま
た。ｉｔ　Ｐ　ＣＩ、の結果は、抗体−カノブリング剤
結合物の形成を裏付ジノた。
結合物が抗原結合活性を保有しているかどうかを調べる
ために、愁濁うジオイムノアソセーを、ｂ’を原として
Ｉ　　１２’ｌ標識ＣＲΔを用いて行った。得られた結
合プロフィルは、抗体とし２で未結合−抗ＣＥＡ−Ｆ；
＋ｈ　′を用いて得られるプロフィルとは一一致した。
したがって結合Ｆａｂ　’断片は抗原結合能力を保有し
ていた。
実７ｕｌ＋−−−−尤 抗−」下Ｌｌ■−′ユと−Ｎ−ユ（、−３−、ス刀タ久
木入り一ンーンイーミーうぞ□−ル−Ｌ３−ぐアー冬チ
ノト−イイ、シ↓て□シ！□ブ　Ｉ−（（世ｆ二、リイ
？（１−リークルメクー刀−身フとＬ−１２り−を二Ｌ
・す−トナーヴソ（塩−と迎−結−合間のし 遮蔽されたスルフヒドリル基を含む抗ＣＥＡ　Ｆａｂ′
断片を実施例６に記載したようにし、て製造した。
ｐＨ５，０および８．０緩衝液（１（１０ｍＭクエン酸
塩／１（１０ｍＭ燐酸塩から、１ＪＡＩ製）中の４．５
５ｍｇ／ｍＱの抗−ＣＥＡ　Ｆａｂ　’溶液２０μＩを
、キレ−１−／蛋白質のモル比が１（１０／１となるよ
う乙こ適当なｐＨの緩衝液に溶かした１７．８５ｍＭ　
Ｎ−（３−スルフォスフシンイミジル）Ｓ−アセチルメ
ルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネート・ナト
リウム塩溶液の５〃！と共に１−１／２１Ｌ５間インキ
ュへ−１・した。インキュヘーション後、試料を５ＥＣ
−１１１’ＬＣによって分析した。Ｈ円、Ｃの結果は抗
体−力ンブリング剤結合物の生成と一致した。
実う１）Ｌ−イ多１［−１，０ 一抗体−二Ｔ−（−９−恒ｔＷ化治物の装是−実施例６
に記載された、遮蔽スルフヒドリル基を含む抗−ＣＥΔ
ｈ＋１］′を、２５ｍＭ　Ｉ〕（１４緩街液、　ｐＨ７
，４゜中３ｍｇ／ｍＱの最終濃度にして、モル比（キレ
−１・／蛋白質）　２５０／１〜１０／１を与えるよう
な種々の量の、］、（１００ｍＭＮａＰＯ４，ｐｌ＋８
．０．中Ｎ−（３スルフオスクシンイミジル）Ｓ−・＼
ンヅイルメルカブトアセチルグリシルグリシルグリシネ
ートナトリウム塩と反応さ一已た。室温で２時間インキ
ュヘーションを行う。
抗体をキレートと共にインキュベーションした後、過剰
のアシル化試薬をスピン−カラム遠心分離によって除去
する。４，５ジヒドロキシ−１，３−ベンゼンジズルポ
ン酸（ｔｉｒｏｎ）５０ｍｇ、飽和炭酸水素すトリウム
でｐ、ｌ＋７．０に、！ｔｉｌ１節した水１雌およびテ
クネチウｊ、発生機からのＮａ−９９ｍ−ペルテクネテ
ート１　ｍｌを含む電解質還元反応バイアルを密封し、
５分間アルゴンでパージ（ｐｕｒｇｅ）　した。二本の
ジルコニウム電極をバイアルに挿入し、バイアルを逆さ
にし、１（１０ポル１〜で１（１０ｍＡの電流を２分間
溶液に通した。
４１：成したＴｃ−９９ｍ−ｔｉｒｏｎ錯化合物をキレ
ート−抗体結合物と共にインキュベートすると、Ｔｃ９
９ｍ−キレ−１・　抗体錯化合物が生成する。
−１例−−−↓↓ バーリン・スプレーク・ドーリ−社（ｌｌａｒｌｉｎ　
５ｐｒａｑｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ　Ｉｎｃ）、インデイア
ナポリス、インデイアナ、から入手した生後１２〜１６
週のスプレークードーリ−ラットで、生体内での研究を
行った。
各動物に、モノクローナル抗体、すなわち本発明の抗−
ＣＥＡ　Ｆａｂ　′−Ｔｃ、−９９ｍ錯化合物と、クロ
ラミンＴ法によって■ヨウ５で標識化した抗−ＣＥＡ　
Ｆａｂ　′断片との一対を同時注射した。注入物の後者
は、各実験を標準化するためにすべての研究に含まれた
。
注射後２−４時間または１８−２４時間目に動物を殺し
、血液、尿、肝臓および腎臓の二重標識放射性核種分析
をガンマカウンターで行った。
試験した第一の抗体錯化合物は、抗−ＣＥＡ　Ｆａｂ　
′バー（３−スルフボスクシンイミジル）Ｓ−へンヅイ
ルメルカブトアセチルグリシルグリシルグリソネ−１・
・ナトリウム塩／９９ｍＴｃ　　錯化合物であった。以
下の表ではこの化合物は、１１０／ＭＡｂ／Ｔｃとして
記される。
下の１表は、血液、尿、肝臓および腎臓に残っている放
射能の、注射腺量に対するパーセンテージを、時間の関
数としてまとめたものである。
実施例　１２ 一トの製造 無水ジメチルホルムアミド５戚中２，３−ビス（アセデ
ルメルカプトアセタミド）−プロピオン酸（４３１，７
＋ｎｇ）　、　Ｎ−ヒドロキシスルフォスフシンイミド
（２９３ｍｇ）および１．３−ジシクロへキシルカルボ
ジイミド（２７８ｍｇ）の混合物を室温で１８時間撹拌
した。反応混合物をアセトン（１５ｍＮ）で希釈し、濾
過した。
その後濾液をエーテル（２（１０ｄ）上に注入し、沈澱
物を濾過し、乾燥した（真空デシケータ）。極めて吸湿
性の大きかった生成物を常時デシケータ中に保存した。
収量３６０ｍｇ　。
ＣＥＡに対するモノクローナル抗体の二量体断片。
Ｆ（ａｂ　′）ｔ、をジチオトレイトールと反応させ、
その後トリチウム化Ｎ−エチルマレイミドでアルキル化
してモノマー種、Ｆａｂ　′をつくった。それから実施
例６に記載したと同様な結合反応を用いて、抗−ＣＥＡ
　Ｆａｂ　’とＮ−（３−スルフォスフシンイミジル）
２．３−ビス−（アセチルメルカプトアセタミド）プロ
ピオネートに結合させた。結合物を未反応の対照と平行
して、ＡＧＩＥＦによって分析し、生成ゲルを染色し、
蛋白質を調べた。Ｂｉｏｓｃａｎ２（１０イメージング
装置を用いて、乾燥ゲルの放射能を調べ、プロットを作
成した。未反応の対照に対して試料の漸増的陽極移動が
認められ、これは結合物の生成に一致した。
実施例　１４ 実施例１３でつくられた抗体−カツブリング剤結合物を
、実施例８に記載の方法と似た方法でＴｃ−９９ｍと反
応させた。実施例９に記載した方法と似た方法を用いて
、スプレィクードーリ−・ラットで生体内分布研究を行
い、抗体−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物の２Ｌ’ｉ間−１、マ
よび２２時間分布を、クロラミンＴ法を用いてｌヨ２．
標識化した抗−Ｃ［ｉＡ　Ｆａｂ　′のぞれと比Φ交し
７た。
２時間　　　　　　２２時間 Ｍａ−ｈ、−／−Ｔｃ　−、、、、、、Ｌ−￥２５　　
　Ｍａ、、、、ｂ／ＴＣ１−１２−巨石腎臓　　１．９
６　　　］、、１３　　　５．４２　　０．２３左腎臓
　　２．１６　　１．２２　　　５．３４　　０．１６
肝臓　０．８７　０．６１　４．７３　０．５９血　　
ンｆｆｌ　　　　　１．８９　　　２．３５　　　　　
１．３１　　　　０．９７尿　　　　８．９２　　３．
５２　　　４３．１５　　６９．７８上記の発明を、明
確にし理解する目的で例証および実施例によって成る程
度詳細に説明したが、添（＝Ｊ請求の範囲内で変更およ
び変形が行われ得ることは当然である。
【図面の簡単な説明】
第１ａ図は、ｐｌ＋　５．０緩衝液を用いて実施例６で
つくられた結合物のＩＥＦゲルのレーザーデンジ１〜メ
ーター走査チヤー１・図である。 第１ｈ図は、ｐｌ＋　６．ＯｔＵ衝液を用いて実施例６
でつくられた結合物のＩＥＦゲルのレーザーデンシトメ
ーター走査チャー１−図である。 第１ｃ図は、ｐＨ５，ＨＵ街液液中未反応リボヌクレア
ーゼへ（ＩＩＮ）χＩ　１、−　Ａ型のＩＲＦゲルのレ
ーザーデンシトメーター走査チャート図である。 第２ａ図は、ｐｉ＋　５．０緩衝液中の未反応モノクロ
ーナル抗体Ｂ７２，３のＩＥＦゲルのレーザーデンジＩ
・メーター走査チャート図である。 第２ｂ図は、ｐＨ５，Ｏｉ街液を用いて実施例５でつく
られた結合物のＩＥＦゲルのレーザーデンシトメーター
走査チャー１・図である。 第２ｃ図は、ｐｉ　８．０で実施例５でつくられた結合
物のＴＥＦゲルのレーザーデンシトメーター走査チャー
ト図である。 第２ｄ図は、ｐｌ＋　５．０で、キレ−１−／Ｂ７２．
３　　：、量体のモル比１（１０／１で、実施例５でつ
くられた結合物のＩＥＦゲルのレーザーデンシトメータ
ー走査チャート回である。 第２ａｌｌ＆は、ｐｌ＋　８．０で、キレーｌ−／Ｒ７
２，３二量体のモル比１（１０／１て、実施例５でつく
られた結合物のＩＥＦゲルのレーザーデンジＩ・メータ
ー走査チャ−１・図である。 特許出願人　マリンクロット・イ 図面の浄書（内容に変更なし）

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）放射性核種金属イオンを生物学的に有用な蛋白質
    またはポリペプチド分子と結合させるためのカップリン
    グ剤であって、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、こゝでＲ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３は同じであ
    るかまたは異なり、各々が１〜６箇の炭素原子を有する
    アルキル、６〜８箇の炭素原子を有するアリルおよび７
    〜９箇の炭素原子を有するアルカリルから成る群から選
    ばれた基であって、そのいづれもが１箇以上のヒドロキ
    シル、アルコキシ、カルボキシまたはスルフォネート基
    で置換され得る基をあらわし；ｎは１または２であり、
    ＡＡは独立的に、アミド結合によって互いに結合するα
    −またはβ−アミノ酸であり；ｉは２から６までの整数
    であり；Ｘは上記の生物学的に有用な蛋白質またはポリ
    ペプチド分子のε−アミノ基とアミド結合を形成し得る
    活性化基である、 化合物から成るカップリング剤。
  2. （２）Ｘが、ハロゲン、Ｎ＿３、 ▲数式、化学式、表等があります▼　▲数式、化学式、
    表等があります▼および▲数式、化学式、表等がありま
    す▼ から成る群から選ばれたものである特許請求の範囲第１
    項記載のカップリング剤。
  3. （３）Ｘが ▲数式、化学式、表等があります▼ である特許請求の範囲第２項記載のカップリング剤。
  4. （４）ｉが３または４である特許請求の範囲第１項記載
    のカップリング剤。
  5. （５）Ｒ＿１がメチルまたはフェニルである特許請求の
    範囲第４項記載のカップリング剤。
  6. （６）Ｒ＿２およびＲ＿３がいづれもフェニルである特
    許請求の範囲第１項記載のカップリング剤。
  7. （７）Ｒ＿２およびＲ＿３がいづれもメチルである特許
    請求の範囲第１項記載のカップリング剤。
  8. （８）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、こゝでＡｂは抗体またはその断片の残基であり
    ；Ｒ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３は同じかまたは異なり、
    各々が１〜６箇の炭素原子を有するアルキル、６〜８箇
    の炭素原子を有するアリルおよび７〜９箇の炭素原子を
    有するアルカリルから成る群から選ばれた基であってそ
    のいづれもが１箇以上のヒドロキシル、アルコキシ、カ
    ルボキシまたはスルフォネート基で置換され得る基であ
    り；ｎは１または２で；ＡＡは独立的に、アミド結合に
    よって互いに結合したα−またはβ−アミノ酸であり；
    ｉは２から６までの整数である、 抗体結合物。
  9. （９）Ａｂがモノクローナル抗体のＦ（ａｂ′）＿２断
    片の残基である特許請求の範囲第８項記載の抗体結合物
    。
  10. （１０）Ａｂが腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗
    体のＦａｂ′断片の残基である特許請求の範囲第８項記
    載の抗体結合物。
  11. （１１）ＡｂがＣＥＡに対するモノクローナル抗体のＦ
    ａｂ′断片の残基である特許請求の範囲第８項記載の抗
    体結合物。
  12. （１２）ｉが３または４である特許請求の範囲第８項記
    載の抗体結合物。
  13. （１３）Ｒ＿１がメチルまたはフェニルである特許請求
    の範囲第１２項記載の抗体結合物。
  14. （１４）Ｒ＿２およびＲ＿３がいづれもフェニルである
    特許請求の範囲第８項記載の抗体結合物。
  15. （１５）Ｒ＿２、およびＲ＿３がいづれもメチルである
    特許請求の範囲第８項記載の抗体結合物。
  16. （１６）化合物Ｎ−（３−ズルフォスクシンイミジル）
    Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリ
    シルグリシン酸ナトリウム。
  17. （１７）化合物Ｎ−（３−ズルフォスクシンイミジル）
    Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリ
    シネートナトリウム塩。
  18. （１８）化合物Ｎ−（３−ズルフォスクシンイミジル）
    Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグ
    リシネートナトリウム塩。
  19. （１９）特許請求の範囲第８項記載の抗体結合物と、テ
    クネチウムおよびレニウムの放射性同位体から選ばれた
    放射性核種金属とから成る抗体−放射性核種錯化合物。
  20. （２０）放射性核種がＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６、Ｒ
    ｅ−１８８およびＲｅ−１８９から選ばれる特許請求の
    範囲第１９項記載の抗体−放射性核種錯化合物。
  21. （２１）Ａｂがモノクローナル抗体のＦ（ａｂ′）＿２
    断片の残基である特許請求の範囲第１９項記載の抗体錯
    化合物。
  22. （２２）Ａｂが腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗
    体のＦａｂ′断片の残基である特許請求の範囲第１９項
    記載の抗体錯化合物。
  23. （２３）ＡｂがＣＥＡに対するモノクローナル抗体のＦ
    ａｂ′断片の残基である特許請求の範囲第１９項記載の
    抗体錯化合物。
  24. （２４）ｉが３または４である特許請求の範囲第１９項
    記載の抗体錯化合物。
  25. （２５）Ｒ＿１がメチルまたはフェニルである特許請求
    の範囲第２４項記載の抗体錯化合物。
  26. （２６）Ｒ＿２およびＲ＿３がいづれもフェニルである
    特許請求の範囲第１９項記載の抗体錯化合物。
  27. （２７）Ｒ＿２およびＲ＿３がいづれもメチルである特
    許請求の範囲第１９項記載の抗体錯化合物。
  28. （２８）生体内で腫瘍を発見し定位するための方法であ
    って、特許請求の範囲第１９項記載の抗体−放射性核種
    錯化合物を対象に経口投与し、対象を光走査して生体内
    における抗体錯化合物の部位を決定することから成る方
    法。
  29. （２９）抗体−放射性核種錯化合物が静脈内に投与され
    る特許請求の範囲第２８項記載の方法。
  30. （３０）生体内での診断または治療に使用するための抗
    体結合物の製法であって、 （ａ）腫瘍関連抗原に対する抗体からＦｃ断片を酵素的
    に切断し、Ｆ（ａｂ）′＿２二量体をつくり、（ｂ）Ｆ
    （ａｂ）′＿２ 二量体を還元して二つのＦａｂ′ 断片をつくり、 （ｃ）Ｆａｂ′断片を、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ I または ▲数式、化学式、表等があります▼II を有し、こゝでＲ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３は同じであ
    るかまたは異なり、各々が１〜６箇の炭素原子を有する
    アルキル、６〜８箇の炭素原子を有するアリルおよび７
    〜９箇の炭素原子を有するアルカリルから成る群から選
    ばれた基であって、そのいづれもが１箇以上のヒドロキ
    シル、またはアルコキシ、カルボキシまたはズルフォネ
    ート基で置換され得る基をあらわし；ｎは１または２で
    あり、ＡＡは独立的に、アミド基によって互いに連結し
    たαまたはβアミノ酸であり；ｉは２から６までの整数
    で；ＸはＦａｂ′断片のεアミノ基とアミド結合を形成
    することができる活性化基である カップリング剤と反応させる、 ことから成る製法。
  31. （３１）Ｘがハロゲン、Ｎ＿３、 ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表
    等があります▼および▲数式、化学式、表等があります
    ▼ から成る群から選ばれたものである特許請求の範囲第３
    ０項記載の方法。
  32. （３２）抗体が前活性化パパインによって切断される特
    許請求の範囲第３０項記載の方法。
  33. （３３）抗体がＣＥＡに対するモノクローナル抗体であ
    る特許請求の範囲第３０項記載の方法。
  34. （３４）ｉが３または４である特許請求の範囲第３０項
    記載の方法。
  35. （３５）Ｒ＿１がメチルまたはフェニルである特許請求
    の範囲第３０項記載の方法。
  36. （３６）Ｒ＿２およびＲ＿３がいづれもフェニルである
    特許請求の範囲第３０項記載の方法。
  37. （３７）Ｒ＿２およびＲ＿３が両方共メチルである特許
    請求の範囲第３０項記載の方法。
  38. （３８）Ｎ−（３−ズルフォスクシンイミジル）２，３
    −ビス（アセチルメルカプトアセタミド）プロピオネー
    トナトリウム塩化合物。
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