RU2655965C2 - Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu - Google Patents
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu Download PDFInfo
- Publication number
- RU2655965C2 RU2655965C2 RU2016140287A RU2016140287A RU2655965C2 RU 2655965 C2 RU2655965 C2 RU 2655965C2 RU 2016140287 A RU2016140287 A RU 2016140287A RU 2016140287 A RU2016140287 A RU 2016140287A RU 2655965 C2 RU2655965 C2 RU 2655965C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- mini
- darpin
- technetium
- modified
- Prior art date
Links
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title abstract 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 title abstract 2
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 title 1
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- FWPIDFUJEMBDLS-UHFFFAOYSA-L tin(II) chloride dihydrate Substances O.O.Cl[Sn]Cl FWPIDFUJEMBDLS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 4
- GZNAASVAJNXPPW-UHFFFAOYSA-M tin(4+) chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Sn+4] GZNAASVAJNXPPW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- YEORLXJBCPPSOC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneazaniumyl)-2-(difluoromethyl)pentanoate Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O YEORLXJBCPPSOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 abstract 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 8
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- IFNDNURGTWBECU-UHFFFAOYSA-N 6-[bis(pyridin-2-ylmethyl)amino]hexanoic acid Chemical compound C=1C=CC=NC=1CN(CCCCCC(=O)O)CC1=CC=CC=N1 IFNDNURGTWBECU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- -1 (pyridin-2-ylmethyl) amino Chemical group 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 4
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 2
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 2
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.CCOC(C)=O LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 2
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 2
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- YUOWTJMRMWQJDA-UHFFFAOYSA-J tin(iv) fluoride Chemical compound [F-].[F-].[F-].[F-].[Sn+4] YUOWTJMRMWQJDA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- SCCCIUGOOQLDGW-UHFFFAOYSA-N 1,1-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1N(C(=O)N)C1CCCCC1 SCCCIUGOOQLDGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical class [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 description 1
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 description 1
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000005695 dehalogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 150000004694 iodide salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZIASHHAADPIIDO-UHFFFAOYSA-N methyl 6-iodohexanoate Chemical compound COC(=O)CCCCCI ZIASHHAADPIIDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами DARPin для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, включающего связывание технеция-99м с мини-антителами DARPin, где на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом, очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией. На втором этапе способа проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin последовательно добавляют раствор технеция-99м, свежеприготовленный раствор цитрата натрия, свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата и инкубируют при комнатной температуре. Изобретение обеспечивает получение целевого продукта с высокой радиохимической чистотой и выходом. 9 ил., 2 табл., 18 пр.
Description
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu.
Значительное место в диагностике занимают радиофармацевтические препараты на основе изотопа технеция-99 м, обладающие оптимальными периодом полураспада (6 часов) и типом излучения (γ-излучение, энергия 140 кэВ). При использовании препаратов для высокоточной доставки к мишени радиоизотопа Тс-99m возможно существенное снижение его концентрации, что обеспечит снижение дозовой нагрузки на пациента и медицинский персонал.
В настоящее время радиоизотоп технеция (99mTc), получаемый непосредственно в клиниках из генератора 99Мо/99mTc, является наиболее приемлемым по цене и идеальным по физико-химическим характеристикам для создания РФП с целью проведения диагностики с использованием доступных γ-камер в медицинской практике.
Одним из наиболее изученных и часто упоминаемых в литературе опухолевых антигенов является поверхностный рецептор HER2/neu. HER2/neu - ракоассоциированный антиген клеточной поверхности, который гиперэкспрессирован во многих человеческих карциномах, таких как рак молочной железы, легких, желудка, яичников, простаты. К этому антигену разработан ряд моноклональных антител, пригодных для применения в диагностических и терапевтических целях. Перспективными являются мини-антитела DARPin, являющиеся рекомбинантными гуманизированными мини-антителами, специфичными к раковоассоциированному антигену HER2/neu [1-3].
Известны некоторые методы мечения белковых молекул (в том числе моноклональных антител, мини-антител) радионуклидом технецием-99м. Наиболее эффективным считается мечение с использованием химической модификации биомолекул химическими соединениями - прекурсорами, содержащими хелатные центры для связывания металлов, которые способны образовывать достаточно прочные координационные связи.
Поэтому главным в разработке синтеза таких радиофармпрепаратов является введение в структуры пептидов прекурсоров - лиганд с высокой хелатирующей способностью для прочного связывания технеция-99м, в качестве которых успешно могут применяться ω-бис(пиридин-2-илметил)амино)алифатические кислоты.
Таким образом, разработка способа получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu является актуальной.
Известны способы радиомечения радионуклидами иодом-125 и индием-111 мини-антител DARPin (G3) для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu [2]. В данном способе получения используют DARPin (G3), коньюгированный с DOTA, для связывания с радионуклидом индия-111, мечение проводят в буферном растворе в присутствии индия-111 хлорида при инкубировании при 37°С в течение 2 часов. Радиохимическая чистота до очистки составляет 70-80%, после очистки более 95%. Мечение иодом-125 мини-антител DARPin (G3) проводят прямым способом - иодированием остатков тирозина при комнатной температуре в течение 10 мин. Радиохимическая чистота до очистки 60-70%, после очистки более 95%. Данные способы отличаются применением других радионуклидов и хелатирующего реагента (DOTA), однако не показана устойчивость к дегалогенированию в организме меченого иодом-125 DARPin (G3).
Известен способ получения комплекса [99mTc(СО)3]+ - G3DARPin-His6, который характеризуется в 3,5 раза выше уровнем поглощения в опухолевых клетках с гиперэкспрессией HER2/neu по сравнению с HER2/neu - отрицательными клетками in vivo [4]. Однако недостатком этого комплекса является то, что комплекс [99mTc(СО)3]+ - G3DARPin-His6 в организме не показал оптимальное соотношение опухоль-печень и опухоль-кровь. В данном способе получения используют прямое связывание аквакарбонильного комплекса технеция-99м ([99mTc(СО)3]+) с G3DARPin-His6 без хелатирующих реагентов, недостатком прямого мечения является низкая стабильность такого комплекса в плазме крови.
В способе получения комплекса технеция-99м со специфичными белками описан способ мечения с использованием другого реагента - олова фторида с добавлением хлористоводородной кислоты [5]. Радиохимическая чистота находится в пределах от 96 до 98%, радиохимический выход более 92%. В данном методе мечения использовали белки, не являющиеся мини-антителами, однако применение методики мечения технецием-99м белковых веществ в присутствии олова фторида характеризуется хорошими выходами, стабильными комплексами с высокой чистотой.
Также известен способ получения комплекса технеция-99м со специфичными белками (affibody molecules), в котором используют для мечения олова хлорид, кальция глюконат и эденат натрия [6]. Мечение проводят в фосфатном буфере после добавления элюата с генератора технеция-99м (400-500 МБк) при инкубировании смеси при 90°С 60 мин. В описанном способе указаны высокие выходы и чистота радиохимического продукта. Однако использованы иные белковые вещества, а не мини-антитела DARPin, а также условия мечения являются жесткими, высокая температура приводит к деструкции белковых веществ.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения комплекса [99mTc(СО)3]+ - DARPin, который заключается в прямом связывании 99mTc(СО)3]+ с мини-антителами DARPin [7]. В патенте предложен способ получения терапевтического радиоконъюгата, специфически связывающегося вещества с короткоживущим альфа-излучающим радиоизотопом для его доставки в патологические области. При этом осуществляют мечение рекомбинантных гуманизированных мини-антител, специфичных к раковоассоциированному антигену HER2/neu, диагностическим гамма-излучающим радиоизотопом, а именно аквокарбонильным комплексом Тс-99m, проводят конъюгирование мини-антител с человеческим сывороточным альбумином, очищают полученный конъюгат, вводят в состав конъюгата хелатирующий агент DOTA (1,4,7,10 - тетраазициклододекан тетрауксусной кислоты) или DTPA (диэтилентриамин пентауксусной кислоты), проводят мечение полученного конъюгата терапевтическими радиоизотопами, а именно короткоживущими альфа-излучающими радиоизотопами, и очищают полученный препарат. В указанном способе используют для мечения изотоп конъюгата аквокарбонильный комплекс Тс-99m, являющий труднодоступным. Также в указанном методе мечения используется прямой способ мечения мини-антител технецием-99м без использования хелатирующих агентов, что снижает устойчивость полученного комплекса мини-антител с радионуклидом в живом организме, поскольку радионуклид может переходить к белкам плазмы крови, образуя более прочные комплексы.
Новый технический результат - повышение селективности, универсальности доступности способа, повышение выходов устойчивых продуктов.
Для достижения нового технического результата в способе получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, заключающемся в связывании технеция-99м с мини-антителами DARPin, причем на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в Tris-буферном растворе, в растворе ДМСО или ДФМА, при этом используют растворы мини-антител DARPin в Tris-буфере или фосфатном буфере с pH 8,3-8,5, реакацию проводят при перемешивании 4 часа при комнатной температуре, далее выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С, модификацию проводят при соотношении мини-антител - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом - 1:5-20, далее очистку модифицированных мини-антител проводят с помощью гель-фильтрации на колонке с Superdex-75, на втором этапе проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin в количестве 50 мкг в буферном растворе при pH 8,3-8,5 последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м в количестве 300-1200 МБк и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией - 100 мг/мл (4 мг) и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией 7 мг/мл (0,21 мг) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
Получают комплекс технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами с радиохимической чистотой более 96%.
Пример 1. Получение метилового эфира ω-иодгексановой кислоты
К раствору циклогексанона в 10 мл метанола (6 ммоль, 0,588 г, ρ=0,946 г/см3) добавляют иод (3 ммоль, 0,762 г), катализатор меди (I) хлорида (0,6 ммоль, 0,06 г). Затем при перемешивании при комнатной температуре по каплям вносят раствор пероксида водорода в метаноле (12 ммоль, 1,275 г пергидроля (32%-ного Н2О2, ρ=1,125 г/см3) в 5 мл метанола) в течение 4 часов. Далее добавляют 12 ммоль (1,275 г) пергидроля и меди (I) хлорида (0,3 ммоль, 0,03 г), перемешивают при комнатной температуре 10 часов и после этого добавляют еще 6 ммоль (0,638 г) пергидроля при перемешивании еще 6 часов в тех же условиях.
К реакционной смеси добавляют насыщенный раствор натрия гидрокарбоната до прекращения выделения углекислого газа и натрия сульфит для окисления остатка иода. Далее реакционную смесь фильтруют, отбрасывая осадок, содержащий соли меди (I), хлориды и иодиды. Полученный фильтрат экстрагируют этилацетатом (2×10 мл). Этилацетатное извлечение осушают путем пропускания через натрий сульфат безводный и растворитель отгоняют. Полученную светло-желтую маслообразную массу сушат под вакуумом. Выход 1,248 г (81%). Спектр ЯМР 1Н (500 MHz, CDCl3, δ, м.д.): 3,67 (с, 3Н), 3,18 (т, 2Н), 2,32 (т, 2Н), 1,84 (кв, 2Н), 1,62 (кв, 2Н), 1,43 (кв, 2Н) (фиг. 5).
Пример 2. Получение метилового эфира 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты
К метиловому эфиру ω-иодгексановой кислоты (2,37 ммоль, 0,6068 г), полученному по примеру 1, добавляют 500 мкл (2,76 ммоль) 2-(дипикалил)амина, 2 мл изопропанола и 330 мкл (2,37 ммоль) триэтиламина. Реакционную массу перемешивают при 55°С в течение 24 часов. Конец реакции определяют методом тонкослойной хроматографии (элюент : этилацетат-этанол = 10:3).
После к реакционной массе добавляют 5 мл 10% раствора соды и экстрагируют этилацетатом (2×5 мл). Этилацетатное извлечение промывают рассолом, сушат с безводным натрия сульфатом и растворитель отгоняют. Полученный продукт подвергают очистке методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси гексан - этилацетат (1:1), постепенно повышая градиент последнего. Выход продукта составил 86%.
Для идентификации синтезированного метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата был получен 1Н-ЯМР-спектр, вид которого соответствует структуре синтезированного эфира (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц): 8,48 (д, 2Наром, J = 4,8 Гц), 7,61 (т, 2Наром), 7,48 (д, 2Наром, J=7,8 Гц), 7,11(т, 2Наром), 3,8 (с, СН2), 3,67 (с, СН3), 2,52 (т, СН2), 2,24 (т, СН2), 1,52 (м, СН2), 1,25 (м, СН2) (фиг. 6). MS (ESI)-m/z: (М+Н)+ - найдено: 328,2032, (М+Н)+- вычислено: 328,2020 (фиг. 6 и 7).
Пример 3. Методика синтеза 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты (фиг. 1)
Метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноат 0,053 г (0,16 ммоль) растворяют в 2 мл ацетонитрила и добавляют 50 мкл HCl (36%). Реакционную массу перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С. Конец реакции определяют методом тонкослойной хроматографии (элюент : этилацетат - этанол = 10:3). После окончания гидролиза растворители отгоняют при пониженном давлении. Выход продукта составил 96%. Для идентификации синтезированной 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты был получен 1Н-ЯМР-спектр, вид которого соответствует структуре синтезированной кислоты (300 МГц, H2O, δ, м.д., J, Гц): 8,65 (д, 2Наром, J=5,7 Гц), 8,4 (т, 2Наром), 7,97 (д, 2Наром, J=9,1 Гц), 7,89 (т, 2Наром), 4,24 (с, СН2), 2,20 (т, СН2), 1,40 (м, СН2), 1,10 (м, СН2) (фиг. 8). MS (ESI)-m/z для C18H24N3O2: (М+Н)+ - найдено: 314,1879; (М+Н)+ - вычислено: 314,1869 (фиг. 9).
Пример 4. Методика синтеза сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата (фиг. 2)
0,4 г (1,14 ммоль) 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты смешивают с 2 мл тетрагидрофурана, затем добавляют 160 мкл (1,14 ммоль) триэтиламина и перемешивают 30 минут. После добавляют 0,1575 г (1,4 ммоль) г N-гидроксисукцинимида и 0,2889 г (1,4 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиимида. Перемешивают 48 часов при комнатной температуре. Выпавший осадок N,N-дициклогексилмочевины отфильтровывают. В фильтрате отгоняют тетрагидрофуран, к полученному маслу добавляют 3 мл воды и экстрагируют метиленхлоридом (3×5 мл). Метиленхлоридное извлечение сушат над безводным натрия сульфатом и растворитель отгоняют. Полученную светло-коричневую маслообразную массу сушат под вакуумом. Выход продукта составил 83%.
Для идентификации синтезированного сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата был получен 1Н-ЯМР-спектр, вид которого соответствует структуре синтезированного эфира (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц): 8,49 (д, 2Наром, J=5,7 Гц), 7,67 (т, 2Наром), 7,51 (д, 2Наром, J = 7,8 Гц), 7,11 (т, 2Наром), 3,81 (с, 4Н, СН2), 2,81 (с, 4Н, СН2), 2,53 (т, 4Н, СН2), 1,50-1,71 (м, 4Н, СН2), 1,32-1,41 (м, 2Н, СН2) (фиг. 3). MS (ESI)-m/z для C22H27N4O4: (М+Н)+ - найдено: 411,2113; (М+Н)+ - вычислено: 411,2020 (фиг. 4).
Пример 5. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,1
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH=8,1) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 79%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 7,8%.
Пример 6. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,3
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,3) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 94%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 4,8%.
Пример 7. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при рН 8,5
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH=8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 97%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 2,8%.
Пример 8. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,7
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,7) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 89%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 8,8%.
Пример 9. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,9
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,9) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 75%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 10,5%.
Пример 10. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в 5 ммоль Tris-буфере
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH=8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в Tris-буфере (концентрация 6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 95%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 3,2%.
Пример 11. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в присутствии ДМСО
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМСО (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 96%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 3,1%.
Пример 12. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в фосфатном буфере
К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в фосфатном буфере (7 мМ NaH2PO4, 3 мМ Na2HPO4, 350 мМ NaCl, pH 8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (концентрация 6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 96%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 3,4%.
Пример 13. Методика мечения технецием-99 м модифицированных мини-антител DARPin
Во флакон вместимостью 10 мл вносят 100 мкл модифицированных мини-антител DARpin (50 мкг/мл) в буферном растворе (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,5). Затем последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией - 100 мг/мл (4 мг) и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией - 7 мг/мл (0,21 мг). Далее инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
Выход реакции мечения - радиохимическую чистоту (РХЧ) полученного продукта оценивают методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) путем снятия хроматограмм в двух подвижных фазах: в ацетоне и в смеси С2Н5ОН: 25% NH4OH : H2O (2:1:5) с использованием полосок силикагеля ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) с последующим изучением распределения активности 99mTc по длине радиохроматограмм.
Затем РХЧ рассчитывали по формуле:
РХЧ (%) = 100 - НТ-ГТ (%),
где РХЧ - радиохимическая чистота комплекса технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin, %;
НТ - процентное содержание не восстановленных пертехнетат ионов 99mTc(VII), %;
ГТ - процентное содержание гидролизованного технеция-99м (IV), связанного в коллоид, %.
Определение НТ
Для определения содержания невосстановленных пертехнетат ионов готовят пластины силикагеля ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) размером 150 мм длиной и 20 мм шириной. Пробу исследуемого раствора (3-5 мкл) наносят на линию старта, отступив от одного из краев на 20 мм (линия старта), наносят пробу в определенном количестве (около 5 мкл), так чтобы статистически достоверно зарегистрировать на радиометрической установке, по крайней мере 0,5% активности от нанесенной. После высушивания пятна на воздухе полоску помещают в камеру, предварительно насыщенную ацетоном, в течение 1 ч. Хроматографирование проводят в ацетоне в течение 10 мин. В указанных условиях пертехнетат - 99mTc-ионы продвигаются с фронтом растворителя и имеют Rf=0,95±0,05, а комплекс технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin и гидролизованный технеций-99м (99mTcO2, IV) остаются на линии старта. Полученную хроматограмму высушивают на воздухе при комнатной температуре и обклеивают с обеих сторон полиэтиленовой пленкой с липким слоем (ГОСТ 20477-86) и измеряют скорость счета от участка, содержащего пертехнетат - 99mTc-ионы, и от всей хроматограммы радиометрическим методом.
Определение ГТ
Для определения содержания гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV), связанного в коллоид, готовят пластины силикагеля ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) размером 150 мм длиной и 20 мм шириной. Пробу исследуемого раствора (3-5 мкл) наносят на линию старта, отступив от одного из краев на 20 мм (линия старта), наносят пробу в определенном количестве (около 5 мкл) так, чтобы статистически достоверно зарегистрировать на радиометрической установке, по крайней мере 0,5% активности от нанесенной. После высушивания пятна на воздухе полоску помещают в камеру, предварительно насыщенную смесью С2Н5ОН : 25% NH4OH : H2O (2:1:5), в течение 1 ч. Хроматографирование проводят в течение 40 мин. В указанных условиях пертехнетат - 99mTc-ионы и комплекс технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin продвигаются с фронтом растворителя, а гидролизованный технеций-99м (99mTcO2, IV) остается на линии старта и имеет Rf=0,05±0,05. Полученную хроматограмму высушивают на воздухе при комнатной температуре и обклеивают с обеих сторон полиэтиленовой пленкой с липким слоем (ГОСТ 20477-86) и измеряют скорость счета участка, содержащего гидролизованный технеций-99м, от всей хроматограммы радиометрическим методом.
Расчеты, сделанные по этим хроматограммам, показывают, что общее содержание примесей НТ (99mTc (VII)) и ГТ (гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV)) в препарате не превышает 3,7%, а его радиохимическая чистота составляет более 96%.
Приготовленный комплекс технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin имеет состав, приведенный в таблице 1.
Таблица 1
Пример 14. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin
Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что после смесь инкубировали при нагревании до 50°С на водяной бане в течение 30 мин.
Последующее изучение РХЧ препарата согласно методике, приведенной в Примере 13, показало, что радиохимическая чистота препарата составила 92,0%.
Пример 15. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin
Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,07 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 69%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 9,8%.
Пример 16. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin
Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,14 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 75,1%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 5,8%.
Пример 17. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin
Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,28 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 93%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 8,2%.
Пример 18. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin
Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,35 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 83%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 16,3%.
Обоснование режима
Как показали данные экспериментальных исследований, изложенные в вышеприведенных примерах, реакция активированного эфира с мини-антителами проявляет существенную зависимость от pH. При низких значениях pH (менее 8,1) происходит протонирование аминогрупп, в результате чего снижается эффективность реакции. При высоких значениях существенным становится процесс гидролиза активированного эфира (более 8,7). Оптимальным значением pH для модификации является 8,3-8,5 (примеры 5-9).
Поскольку активированный эфир имеет низкую растворимость в воде, в качестве сорастворителя использовали диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА) и 5 ммоль Tris-буфер (примеры 7, 10-11). Результаты мечения технецием 99m показали возможность применения всех указанных сорастворителей. Однако ДМФА может портиться при хранении, при этом в нем накапливается диметиламин, способный реагировать с активированными эфирами. Поэтому ДМФА для мечения должен быть хорошего качества или можно модификацию проводить в Tris-буфере или фосфатном буфере.
Для модификации мини-антител использовали фосфатный буфер и Tris-буфер (примеры 7 и 12). РХЧ в разных буферах имела высокое значение, следовательно, для модификации мини-антител можно проводить в указанных буферных растворах, однако, предпочтительнее фосфатный буфер.
Изменение температуры инкубирования при мечении технецием-99м модифицированных мини-антител показало, что повышение температуры приводит к снижению РХЧ, а содержание коллоида в пробе осталось на том же уровне, как и в примере 13, что говорит о нецелесообразности проведения инкубирования препарата с нагреванием на водяной бане до 50°С (примеры 13, 14).
Как известно [8], от количества хлорида олова (II) напрямую зависит радиохимическая чистота (РХЧ) получаемых радиофармпрепаратов и количество образующего в них коллоида типа (-O-TcO-O-SnCl2-O-TcO-)n, где n = 2, 3…- число, зависящее от pH раствора. Кроме того, высокая активность 99mTc, связанного на коллоиде (ГТ), приводит к нецелевому накоплению радиоактивности в печени.
В этой связи были проведены предварительные исследования для установления необходимого и достаточного количества Sn (II) в составе препарата, которое бы обеспечивало практически полное восстановление 99mTc (VII) при минимальном количестве образующегося коллоида в виде гидролизованного технеция-99м (примеры 13, 15-18).
Результаты этих исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2
Из представленных результатов следует, что оптимальной концентрацией SnCl2⋅2H2O в составе смеси является 0,21 мг (п. 3), при которой достигается максимальное значение радиохимической чистоты препарата при минимальном содержании гидролизованного технеция-99 м (табл. 2).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать целевой продукт с высокой радиохимической чистотой и выходом комплекса технеция-99 м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, также отличается простотой и доступностью выполнения, что является перспективным для производства в промышленном масштабе.
Изобретение поясняется чертежами, где:
Фигура 1 - Схема получения ω-бис(пиридин-2-илметил)амино)алифатических кислот - прекурсоров с хелатными центрами для связывания металлов.
Фигура 2 - Схема получения сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата прекурсора с хелатными центрами для связывания металлов.
Фигура 3 - 1Н-ЯМР-спектр сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц).
Фигура 4 - Элементный анализ сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата.
Фигура 5 - 1Н-ЯМР-спектр метил 6-иодгексаноата (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц).
Фигура 6 - 1Н-ЯМР-спектр метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц).
Фигура 7 - Элементный анализ метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата.
Фигура 8 - 1Н-ЯМР-спектр 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты (в виде гидрохлорида) (300 МГц, H2O, δ, м.д., J, Гц).
Фигура 9 - Элементный анализ 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты.
Источники информации
1) DARPins: A new generation of protein Therapeutics / Michael T. Stumpp, H. Kaspar Binz and Patrick Amstutz // Drug Discovery Today. Volume 13, Numbers 15/16. August 2008. P. 695-701.
2) Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin)G3 for HER2 molecular imaging / Robert Goldstein, Jane Sosabowski, Maria Livanos, Julius Leyton, Kim Vigor, Gaurav Bhavsar, Gabriela Nagy-Davidescu, Mohammed Rashid, Enrique Miranda, Jenny Yeung, Berend Tolner, Andreas Pluckthun, Stephen Mather, Tim Meyer, Kerry Chester // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2015) 42:288-301.
3) Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения / С.М. Деев, Е.Н. Лебеденко // Acta naturae. №1. 2009. С. 32-50.
4) Hofstrom С, Altai М, Honarvar Н, Strand J, Malmberg J, Hosseinimehr SJ, et al. HAHAHA, HEHEHE, HIHIHI, or HKHKHK: influence of position and composition of histidine containing tags on biodistribution of [(99m)Tc(CO)3](+)-labeled affibody molecules. J Med Chem. 2013; 56: 4966-74.
5) 99mTc-labeling and in vitro characterization of N4- and N3S-RGDS-derivative peptides / A. Perera Pintado, S.J. Mather, M.A. Stalteri, D. Allison, A. Prats Capote, A. Hernandez Cairo, O. Reyes Acosta, M. Bequet Romero // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 275, No.3 (2008). P. 619-626. Патент №2537175 от 31.10.2014.
6) Use of a HEHEHE Purification Tag Instead of a Hexahistidine Tag Improves Biodistribution of Affibody Molecules Site-Specifically Labeled with 99m-Tc, 111-In and 125-I / Camilla Hofstrom, Anna Orlova, Mohamed Altai, Fredrik Wangsell, Torbjorn Graslund and Vladimir Tolmachev // J. Med. Chem. 2011, 54, 3817-3826.
7) Патент 2537175. Способ получения радиоиммунного препарата для диагностики и терапии онкологических заболеваний / Чувилин Д.Ю., Загрядский В.А., Дубинкин Д.О., Бочагин Ф.С., Панченко В.Я., Деев С.М., Головаченко В.А., Решетов И.В.
Зайцева Л.Л., Величко А.В., Виноградов И.В. Соединения технеция и области их применения // Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ, 1984. - Т. 9. - С. 180.
Claims (1)
- Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами DARPin для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, включающий связывание технеция-99м с мини-антителами DARPin, отличающийся тем, что на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом в Tris-буферном растворе, в растворе ДМСО или ДФМА, при этом, используют растворы мини-антител DARPin в Tris-буфере или фосфатном буфере с pH 8,3-8,5, синтез проводят при перемешивании 4 часа при комнатной температуре, далее выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С, далее модификацию проводят при соотношении мини-антител к сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноату - 1:5 - 20, очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75, на втором этапе способа проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin в количестве 50 мкг в буферном растворе при pH 8,3-8,5 последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м 300-1200 МБк и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией 100 мг/мл и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией 7 мг/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016140287A RU2655965C2 (ru) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016140287A RU2655965C2 (ru) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016140287A RU2016140287A (ru) | 2018-04-12 |
| RU2655965C2 true RU2655965C2 (ru) | 2018-05-30 |
Family
ID=61974472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016140287A RU2655965C2 (ru) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2655965C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2692451C2 (ru) * | 2017-10-02 | 2019-06-24 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Способ радионуклидной диагностики опухолей головного мозга |
| RU2800864C1 (ru) * | 2022-02-07 | 2023-07-31 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Способ диагностики отдаленных метастазов у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией her2/neu |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008049866A1 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Affibody Ab | New chelating compound |
| RU2537175C2 (ru) * | 2013-03-26 | 2014-12-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Способ получения радиоиммунного препарата для диагностики и терапии онкологических заболеваний |
-
2016
- 2016-10-12 RU RU2016140287A patent/RU2655965C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008049866A1 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Affibody Ab | New chelating compound |
| RU2537175C2 (ru) * | 2013-03-26 | 2014-12-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Способ получения радиоиммунного препарата для диагностики и терапии онкологических заболеваний |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HOFSTROM C. et al. Use of a HEHEHE purification tag instead of a hexahistidine tag improves biodistribution of affibody molecules site-specifically labeled with (99m)Tc, (111) In, and (125)I. J Med Chem. 2011 Jun 9;54(11):3817-26. doi: 10.1021/jm200065e. Epub 2011 May 12. * |
| HOFSTROM C. et al. Use of a HEHEHE purification tag instead of a hexahistidine tag improves biodistribution of affibody molecules site-specifically labeled with (99m)Tc, (111) In, and (125)I. J Med Chem. 2011 Jun 9;54(11):3817-26. doi: 10.1021/jm200065e. Epub 2011 May 12. MIRONOVA KE. et al. Highly specific hybrid protein DARPin-mCherry for fluorescent visualization of cells overexpressing tumor marker HER2/neu.Biochemistry (Mosc). 2014 Dec; 79(12):1391-6. doi: 10.1134/S0006297914120141. * |
| MIRONOVA KE. et al. Highly specific hybrid protein DARPin-mCherry for fluorescent visualization of cells overexpressing tumor marker HER2/neu.Biochemistry (Mosc). 2014 Dec; 79(12):1391-6. doi: 10.1134/S0006297914120141. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2692451C2 (ru) * | 2017-10-02 | 2019-06-24 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Способ радионуклидной диагностики опухолей головного мозга |
| RU2800864C1 (ru) * | 2022-02-07 | 2023-07-31 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Способ диагностики отдаленных метастазов у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией her2/neu |
| RU2812633C1 (ru) * | 2023-03-22 | 2024-01-30 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией her2/neu и способ его получения |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016140287A (ru) | 2018-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2039218C (en) | Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds | |
| AU619738B2 (en) | Metal-radionuclide-labeled proteins and glycoproteins for diagnosis and therapy | |
| Zeglis et al. | Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand diels–alder click chemistry | |
| US5202451A (en) | Anchimeric radiometal chelating compounds | |
| US7674886B2 (en) | Bridged aromatic substituted amine ligands with donor atoms | |
| EP2533817B1 (en) | Targeted alpha-particle emitting complexes comprising thorium radionuclide and hydroxypyridinone containing ligand | |
| ES2953196T3 (es) | Radiotrazador de modo dual de unión a PSMA y terapéutico | |
| US20220306663A1 (en) | Metal Tricarbonyl Complexes Comprising Substituted Iminodiactic Acid Ligands and Uses as Radioisotope Tracers | |
| HUT73665A (en) | Bifunctional-chelating agents braked with calcogene atoms, pharmaceutical compositions containing them , and use of these compositions in radio- diagnosis and radiotherapy | |
| RU2684289C1 (ru) | Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu | |
| RU2655965C2 (ru) | Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu | |
| US11426395B2 (en) | PSMA inhibitor derivatives for labelling with 99mTc via HYNIC, a radiopharmaceutical kit, radiopharmaceutical preparations and their use in prostate cancer diagnostics | |
| JP5481673B2 (ja) | 放射性標識薬剤 | |
| Gniazdowska et al. | Synthesis, radiochemistry and stability of the conjugates of technetium-99m complexes with Substance P | |
| Iannone | DEVELOPMENT OF NEW “GENERAL PURPOSE” METHODS TO INTRODUCE FLUORINE-18 IN BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES | |
| Varvarigou et al. | Development of radioactively labelled cancer seeking biomolecules for targeted radiotherapy. Greece | |
| Varvarigou et al. | Development of radioactively labelled cancer seeking biomolecules for targeted radiotherapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181013 |