RU2812633C1 - Комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией her2/neu и способ его получения - Google Patents
Комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией her2/neu и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812633C1 RU2812633C1 RU2023106804A RU2023106804A RU2812633C1 RU 2812633 C1 RU2812633 C1 RU 2812633C1 RU 2023106804 A RU2023106804 A RU 2023106804A RU 2023106804 A RU2023106804 A RU 2023106804A RU 2812633 C1 RU2812633 C1 RU 2812633C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- her2
- complex
- technetium
- neu
- solution
- Prior art date
Links
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 title description 9
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 title description 7
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 title 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- GZNAASVAJNXPPW-UHFFFAOYSA-M tin(4+) chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Sn+4] GZNAASVAJNXPPW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 6
- FWPIDFUJEMBDLS-UHFFFAOYSA-L tin(II) chloride dihydrate Substances O.O.Cl[Sn]Cl FWPIDFUJEMBDLS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 4
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 10
- 102100028047 Large proline-rich protein BAG6 Human genes 0.000 claims 1
- 101710132553 Protein G3 Proteins 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 4
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- IFNDNURGTWBECU-UHFFFAOYSA-N 6-[bis(pyridin-2-ylmethyl)amino]hexanoic acid Chemical compound C=1C=CC=NC=1CN(CCCCCC(=O)O)CC1=CC=CC=N1 IFNDNURGTWBECU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 3
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- -1 glycyl-glycyl-glycyl-seryl-cysteine Chemical compound 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YEORLXJBCPPSOC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneazaniumyl)-2-(difluoromethyl)pentanoate Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O YEORLXJBCPPSOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001235027 Elysia Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 101150074790 G3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- CDMADVZSLOHIFP-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane;decahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 CDMADVZSLOHIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- BWUXDKMMCZJFAB-UHFFFAOYSA-N oxotechnetium Chemical compound [Tc]=O BWUXDKMMCZJFAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- VZOPRCCTKLAGPN-ZFJVMAEJSA-L potassium;sodium;(2r,3r)-2,3-dihydroxybutanedioate;tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O VZOPRCCTKLAGPN-ZFJVMAEJSA-L 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PKIDNTKRVKSLDB-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PKIDNTKRVKSLDB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретения относятся к медицине, онкологии, фармацевтической химии и фармакологии, в частности к радиофармацевтическим лекарственным препаратам. Предложен комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулой [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C и представляющий собой аминокислотную последовательность
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADV
NAKDEYGLPLYLATAHGHLEIVEVLLNGA
DVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLK
HGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNEDLAE
ILQKLNGGGSGGGSG-Х,
где Х - ,
где Тс представляет собой 99mTc. Также предложен способ получения указанного комплекса, в котором к лиофилизированной смеси олова (II) хлорида дигидрата, натриевой соли глюконовой кислоты и натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в массовом соотношении (0,5-1,25):67:1,3 соответственно добавляют раствор натрия пертехнетата, 99mТс с активностью 300-1000 МБк и перемешивают, затем смешивают с 500-4000 мкг раствора белка G3-(G3S)3C, инкубируют при 40-60°С в течение 20-40 мин, добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр. Технический результат: расширение арсенала средств для диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, онкологии, фармацевтической химии и фармакологии, в частности к радиофармацевтическим лекарственным препаратам на основе рекомбинантных молекул белковой природы с анкириновыми повторами (DARPin) для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, содержащих 99mTc и способам их получения.
Известен способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu [RU 2684289 C1, МПК A61K 51/04 (2006.01), опубл. 05.04.2019], который заключается в том, что на первой стадии получают аквакарбонильный технеций-99м [99mTc(ОН)3(СО)3]+, используя лиофилизат натрия тетрабората декагидрата, натрия карбоната, динатрия боранокарбоната, который также может содержать калия натрия тартрата тетрагидрат или натрия цитрата моногидрат, далее к лиофилизату добавляют 1-3 мл раствора натрия пертехнетата, 99mTc с активностью 0,74-3,7 ГБк и нагревают на кипящей водяной бане 20-30 мин, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1М HCl до рН 7,4 или 300-900 мкл 1М раствора натрия фосфата с рН 7,4, далее проводят присоединение хелатирующего агента сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноат (DPAH) к DARPin в фосфатном буфере рН 8,3-8,5 с получением DPAH-DARPin, затем проводят связывание аквакарбонильного технеция-99м [99mTc(ОН)3(СО)3]+ с DARPin или DPAH-DARPin, для чего к DARpin или DPAH-DARPin в количестве 100 мкг в фосфатно-буферном растворе при рН 7,4 добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [99mTc(ОН)3(СО)3]+, далее инкубируют при 40 °С в течение 30-60 мин, очистку проводят гель-фильтрацией на колонке.
Известен способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu [RU 2655965 C2, МПК G01N33/534 (2006.01), опубл. 30.05.2018], включающий связывание технеция-99м с мини-антителами DARPin, отличающийся тем, что на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом в Tris-буферном растворе, в растворе ДМСО или ДФМА, при этом, используют растворы мини-антител DARPin в Tris-буфере или фосфатном буфере с pH 8,3-8,5, синтез проводят при перемешивании 4 часа при комнатной температуре, далее выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С, далее модификацию проводят при соотношении мини-антител к сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноату - 1:5 - 20, очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75, на втором этапе способа проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin в количестве 50 мкг в буферном растворе при pH 8,3-8,5 последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м 300-1200 МБк и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией 100 мг/мл и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией 7 мг/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
Недостатками этих способов являются предварительная конъюгация с коммерчески недоступным хелатирующим агентом, многостадийность, длительный по времени процесс, и требуется очистка гель-фильтрацией, что существенно усложняет способы получения.
Известен способ получения инъекционной формы радиофармпрепарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 [RU 2702294 C1, МПК (2006.01) A61B 6/03, A61K 51/00, A61K 103/10, A61P 43/00, опубл. 07.10.2019], который изготавливают непосредственно перед введением пациенту, для чего в асептических условиях 1 мл элюата 99mTcO4- 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100 °С в течение 30 минут. После инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/мл и инкубируют при температуре 40 °С в течение 60 минут. Далее выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с помощью очистительных колонок. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБк разбавляют в 10 мл физиологического раствора и фильтруют через стерилизующий фильтр.
К недостаткам описанного способа можно отнести несколько стадий, использование двух флаконного набора, использование коммерчески малодоступного кита для приготовления трикарбонильного технеция-99м, в совокупности длительный по времени процесс получения препарата, требующей очистки, что является ограничением для изготовления в медицинской организации.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение арсенала комплексов технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами и способов их получения для диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu.
Предложен комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулы [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C и представляющий собой аминокислотную последовательность
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLPLYLATAHGHLEIVEVLLN
GADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNED
LAEILQKLNGGGSGGGSG-Х,
где Х -, где Тс представляет собой 99mTc.
Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулой[99mTc]Tc-G3-(G3S)3C и представляющий собой аминокислотную последовательность
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLPLYLATAHGHLEIVEVLLN
GADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNED
LAEILQKLNGGGSGGGSG-Х,
где X - , где Тс представляет собой 99mTc,
заключается в том, что к лиофилизированной смеси олова (II) хлорида дигидрата, натриевой соли глюконовой кислоты и натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в массовом соотношении (0,5÷1,25):67:1,3 соответственно, добавляют раствор натрия пертехнетата, 99mТс с активностью 300÷1000 МБк и перемешивают, затем смешивают с 500-4000 мкг раствора белка G3-(G3S)3C, инкубируют при 40÷60°С в течение 20-40 мин, добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр. (0,
Повышение селективности предложенного способа достигается за счет сайт-специфического связывания технеция-99м (в виде [99mTc(O)]3+) с аминокислотной последовательностью глицил-глицил-глицил-серил-цистеин ((G3S)3C), расположенной на С-конце DARPin G3, что обеспечивает образование стабильного комплекса оксотехнеция пятивалентного с DARPin G3.
Радиохимический выход получения комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C составляет 95,8 – 98,8%. Достигаемый высокий выход не требует трудоемкой очистки, что существенно упрощает способ получения и снижает потери белка при очистке.
На фиг. 1 представлены результаты определения специфичности связывания комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C in vitro. Концентрация была 2 нМ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n=3).
На фиг. 2 показаны результаты определения константы диссоциации (KD) комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C с помощью HER2-экспрессирующих клеток SKOV-3 in vitro.
На фиг. 3 показано накопление комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C в ксенотрансплантатах SKOV-3 (высокая экспрессия HER2) и PC-3 (низкая экспрессия HER2) у мышей Nu/j, 4 часа после введения, 10 мкг белка/на мышь. Данные представлены как среднее значение%ID/g ± стандартное отклонение для четырех мышей.
В таблице 1 представлены условия и результаты получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами.
Для осуществления способа использовали белок DARPin G3, содержащий аминокислотную последовательность глицил-глицил-глицил-серил-цистеин ((G3S)3C) на C-конце белка, полученный в несколько этапов с использованием Escherichia coli и последующей очисткой [Vorobyeva A. Comparison of tumor-targeting properties of directly and indirectly radioiodinated designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 variants for molecular imaging of HER2 // International journal of oncology. – 2019. – Vol. 54, №. 4. – P. 1209-1220].
Нуклеотидная последовательность гена DARPin G3 была выведена из аминокислотной последовательности DARPin G3, депонированной в PDB (номер доступа PDB: 2JAB) с учетом использования кодонов в высокоэкспрессируемых генах Escherichia coli с помощью свободно распространяемой программы DNABuilder (http://www.innovationsinmedicine.org/software/DNABuilder/). Геном был собран методом ПЦР из химически синтезированных олигонуклеотидов длиной 50 п.н., имеющих частично комплементарные последовательности.
Белок DARPin G3 с (G3S)3C-хелатором был получен в Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen-EMD Millipore, Madison, WI 53719, USA) как С-концевые расширения малого модификатора SUMO, связанного с убиквитином [Malakhov M. P. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins // Journal of structural and functional genomics. – 2004. – Vol. 5, №. 1-2. – P. 75.].
Во флакон, содержащий лиофилизированную смесь 75 мкг олова (II) хлорида дигидрата, 5 мг натриевой соли глюконовой кислоты и 100 мкг натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭDTA), добавляли 0,5 мл раствора натрия пертехнетата, 99mТс с активностью 700 МБк и перемешивали. Содержимое флакона переносили во флакон с 3500 мкг раствора белка G3-(G3S)3C, перемешивали и инкубировали при 60 °С в течение 30 мин. Далее во флакон добавляли стерильный раствор 0,9% натрия хлорида до общего объема 10 мл. После перемешивания полученный раствор пропускали через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм с помощью шприца в стерильный флакон.
Эффективность способа получения комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C оценивали по величине радиохимического выхода, который определяли методом тонкослойной радиохроматографии с использованием полоски из стекловолокна со слоем силикагеля iTLC (Aglient Technologies, Inc. Folsom, США) и системы фосфатно-буферного раствора (PBS) в качестве подвижной фазы. Распределение радиоактивности по полоске iTLC измеряли с помощью сканера miniGITA Single (Elysia Raytest, Германия).
На линию старта полоски iTLC-бумаги (Agilent, США) наносили 2 мкл полученного соединения. Полоску с нанесенной пробой сушили на воздухе, помещали в камеру с 0,01 М фосфатным буферным раствором с рН 7,4 и хроматографировали восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы прошел около 90% длины полоски бумаги от линии старта, ее вынимали из камеры, сушили на воздухе и распределение активности 99mТс на радиохроматограмме регистрировали радиометрическим методом.
Комплекс [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C остался на линии старта (Rf = 0,0-0,2), а примеси свободные пертехнетат-ионы 99mTcO4 - и другие формы технеция-99м продвинулись с фронтом растворителя (Rf = 0,9-1,0).
Радиохимический выход (РХВ) полученного комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C составил 98,2%.
Другие примеры получения комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C представлены в таблице 1. Из приведённых в таблице 1 экспериментальных данных следует, что во всех примерах достигается заявленный технический результат.
Эффективность комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C и способа его получения для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu подтверждается исследованиями in vitro и in vivo с использованием клеточных культур с экспрессией HER2/neu.
Оценку специфичности связывания комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C с мишенью HER2/neu, проводили на клеточных линиях с различным уровнем экспрессии HER2/neu: SK-BR-3 (клетки рака молочной железы) > SKOV-3 (клетки рака яичника человека) > PC-3 (клетки рака предстательной железы) по методике, описанной [Wållberg, H.; Orlova, A., Slow internalization of anti-HER2 synthetic affibody monomer 111In-DOTA-ZHER2:342-pep2: implications for development of labeled tracers. Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals 2008, 23, (4), 435-42. http://DOI:10.1089/cbr.2008.0464.]. Эксперимент проводили с блокированием рецепторов немеченым DARPin G3. Изучение специфичности [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C продемонстрировало, что связывание с SKOV-3, SK-BR-3 и PC-3 является насыщаемым (специфичным) на высоком уровне и пропорционально уровню экспрессии HER2/neu в клетках, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого белка отмечается значительное снижение связывания во всех группах клеток (фиг. 1).
Оценку аффинности связывания с HER2/neu комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C проводили методом насыщения [Velikyan I, Sundberg AL, Lindhe O, Höglund AU, Eriksson O, Werner E, Carlsson J, Bergström M, Långström B, Tolmachev V. Preparation and evaluation of (68)Ga-DOTA-hEGF for visualization of EGFR expression in malignant tumors. J Nucl Med. 2005 Nov;46(11):1881-8. PMID: 16269603.] в диапазоне концентраций от 0,2 до 40 нМ. Установлено, что комплекс [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C, полученный по заявляемому способу, связывается с рецепторами HER2/neu на поверхности клеток SKOV-3 с KD в наномолярном значении (4,1±0,6 нмоль) (фиг. 2).
Для оценки таргетных свойств комплекса [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C in vivo использовали мышей Nu/j, несущих ксенотрансплантаты SKOV-3 с высокой экспрессией HER2/neu. Чтобы оценить, зависит ли поглощение опухоли от уровня экспрессии HER2/neu, поглощение [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C также измеряли в ксенотрансплантатах PC-3 с низкой экспрессией HER2. Самкам мышей Nu/j подкожно имплантировали 107 клеток SKOV-3 или такое же количество клеток PC-3 в 100 мкл среды.
Результаты исследования [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C in vivo в ксенотрансплантатах SKOV-3 с высокой экспрессией HER2/neu и PC-3 с низкой экспрессией HER2/neu представлены на фиг. 3. Поглощение в ксенотрансплантатах SKOV-3 было значительно (p <0,005, однофакторный дисперсионный анализ) выше, чем в ксенотрансплантатах PC-3. Это показывает, что уровень поглощения коррелирует с уровнем экспрессии HER2/neu, комплекс функционально пригоден для диагностики опухолей с экспрессией HER2/neu.
Таким образом, предложенный комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами DARPin G3 позволяет расшить арсенал таргетных соединений для диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, поскольку специфически и с высокой аффинностью связывается с раковыми клетками с экспрессией HER2/neu и может различать опухоли с высоким и низким уровнем экспрессии рецепторов. Предложенный способ получения комплкса технеция-99м с рекомбинантными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами DARPin G3-(G3S)3C проводится в одну стадию в течении короткого промежутка времени, обеспечивает высокий выход до 98,8%, что не требует очистки, аффинность к рецепторам HER2/neu находится в наномолярном диапазоне (4,1±0,6 нмоль).
| Таблица 1 | ||||||
| № | Количество белка DARPin G3-(G3S)3C, мкг |
Содержание олова (II) хлорида дигидрата, мкг |
Активность 99mTc, МБк |
Время, в течение которого ведут инкубирование, t, мин |
Температура, при которой ведут инкубирование, T, °C |
Радиохи- мический выход, % |
| 1 | 500 | 75 | 700 | 30 | 60 | 97,0 |
| 2 | 1000 | 75 | 700 | 30 | 60 | 98,5 |
| 3 | 2000 | 75 | 700 | 30 | 60 | 98,2 |
| 4 | 3500 | 75 | 700 | 30 | 60 | 98,8 |
| 5 | 4000 | 75 | 700 | 30 | 60 | 98,7 |
| 6 | 3500 | 75 | 300 | 30 | 60 | 97,5 |
| 7 | 3500 | 75 | 1000 | 30 | 60 | 98,8 |
| 8 | 3500 | 50 | 700 | 30 | 60 | 98,2 |
| 9 | 3500 | 100 | 700 | 30 | 60 | 98,1 |
| 10 | 3500 | 75 | 700 | 20 | 60 | 96,8 |
| 11 | 3500 | 75 | 700 | 40 | 60 | 98,6 |
| 12 | 3500 | 75 | 700 | 30 | 40 | 95,8 |
| 13 | 3500 | 75 | 700 | 30 | 50 | 98,3 |
Claims (6)
1. Комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулой [99mTc]Tc-G3-(G3S)3C и представляющий собой аминокислотную последовательность
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLPLYLATAHGHLEI
VEVLLNGADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGK
TAFDISIGNGNEDLAEILQKLNGGGSGGGSG-Х,
где Х - , где Тс представляет собой 99mTc.
2. Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu по п. 1, отличающийся тем, что к лиофилизированной смеси олова (II) хлорида дигидрата, натриевой соли глюконовой кислоты и натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в массовом соотношении (0,5-1,25):67:1,3 соответственно добавляют раствор натрия пертехнетата, 99mТс с активностью 300-1000 МБк и перемешивают, затем смешивают с 500-4000 мкг раствора белка G3-(G3S)3C, инкубируют при 40-60°С в течение 20-40 мин, добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812633C1 true RU2812633C1 (ru) | 2024-01-30 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2655965C2 (ru) * | 2016-10-12 | 2018-05-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) | Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu |
| RU2684289C1 (ru) * | 2018-03-21 | 2019-04-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu |
| RU2702294C1 (ru) * | 2019-01-18 | 2019-10-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Способ радионуклидной диагностики операбельного рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2655965C2 (ru) * | 2016-10-12 | 2018-05-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) | Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu |
| RU2684289C1 (ru) * | 2018-03-21 | 2019-04-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu |
| RU2702294C1 (ru) * | 2019-01-18 | 2019-10-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Способ радионуклидной диагностики операбельного рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VOROBYEVA A. et al., Optimal composition and position of histidine-containing tags improves biodistribution of 99mTc-labeled DARPin G3, Scientific Reports, 2019, v. 9, article number 9405. GOLDSTEIN R. et al., Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular, Eur J Nucl Med Imaging, 2015, v. 42, no. 2, p. 288-301. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zeglis et al. | Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand diels–alder click chemistry | |
| US5183653A (en) | Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds | |
| JP6223962B2 (ja) | トランス−シクロオクテンジエノフィル及びジエンを有するイメージング又は治療用プレターゲティングキット | |
| US5202451A (en) | Anchimeric radiometal chelating compounds | |
| JP2021513979A (ja) | エバンスブルー誘導体の化学結合体ならびに前立腺癌を標的とするための放射線療法および造影剤としてのその使用 | |
| JP2023546525A (ja) | 前立腺特異的膜抗原を標的とする化合物及びその調製方法と応用 | |
| CN114369084B (zh) | 一种截短型伊文思蓝修饰的成纤维细胞活化蛋白抑制剂及其制备方法和应用 | |
| JP2023076712A (ja) | 放射標識生体分子およびその使用 | |
| JP2024038107A (ja) | 放射性核種錯体を調製するための方法およびキット | |
| JP2023519247A (ja) | Ｆａｐ標的化放射性医薬品およびイメージング剤、ならびにそれらに関連する使用 | |
| WO2022218409A1 (zh) | 七甲基碳菁染料-交联四环胺螯合剂偶联物、复合物及其用途 | |
| JP2008531988A (ja) | 放射性標識ガリウム錯体、その合成法並びに悪性腫瘍におけるｅｇｆｒ発現のｐｅｔイメージングにおける使用 | |
| CA3154302A1 (en) | Stable, concentrated radiopharmaceutical composition | |
| JP7447300B2 (ja) | 放射性金属と複合するＤＺ－１－Ｌｙｓ－ＤＯＴＡコンジュゲート及び使用 | |
| CN110496233B (zh) | 一种spect显像剂及其标记前体及其制备方法、组合物和用途 | |
| EA010653B1 (ru) | Нацеливание на опухолевую сосудистую сеть при использовании меченного радиоактивным изотопом антитела l19 к ed-b фибронектину | |
| RU2812633C1 (ru) | Комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией her2/neu и способ его получения | |
| WO2023236778A1 (zh) | 一种三功能化合物及其用途 | |
| RU2684289C1 (ru) | Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu | |
| JP2009292815A (ja) | 腫瘍診断に使用するための抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体、そのフラグメントおよび誘導体、対応する組成物およびキット | |
| JPH07505621A (ja) | 外科手術中における腫瘍組織の検出および探知法 | |
| PL239934B1 (pl) | Pochodne inhibitorów PSMA do znakowania ⁹⁹ᵐTc poprzez HYNIC, zestaw radiofarmaceutyczny, preparat radiofarmaceutyczny oraz ich zastosowanie w diagnostyce raka prostaty | |
| CA2522148A1 (en) | Thorium-227 for use in radiotherapy of soft tissue disease | |
| RU2815777C1 (ru) | Способ получения радиохимического соединения на основе меченных иодом-123 рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами для визуализации рака с гиперэкспрессией her2/neu | |
| JP2024500181A (ja) | 繊維芽細胞活性化タンパク質阻害剤 |