JPH08319299A - 抗体結合物及びその製法 - Google Patents
抗体結合物及びその製法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 放射性核種金属イオンと錯化合物を形成でき
る抗体又はその断片と二官能価カップリング剤の結合物
を提供する。 【解決手段】 抗体結合物は、二官能価カップリング剤
を抗体または抗体断片中のリジン残基のε−アミノ基と
反応させることによってつくる。抗体結合物を形成する
抗体の抗原結合活性、すなわち免疫反応性は保育され
る。二官能価カップリング剤は、アシル化反応によって
抗体または抗体断片中のε−アミノ基と反応してアミド
結合を形成する活性化基を含む。二官能価カップリング
剤は、放射性核種金属イオンとキレート錯化合物を形成
することのできる基も含んでいる。この抗体結合物の錯
化合物は生体内診断および治療に有用である。
る抗体又はその断片と二官能価カップリング剤の結合物
を提供する。 【解決手段】 抗体結合物は、二官能価カップリング剤
を抗体または抗体断片中のリジン残基のε−アミノ基と
反応させることによってつくる。抗体結合物を形成する
抗体の抗原結合活性、すなわち免疫反応性は保育され
る。二官能価カップリング剤は、アシル化反応によって
抗体または抗体断片中のε−アミノ基と反応してアミド
結合を形成する活性化基を含む。二官能価カップリング
剤は、放射性核種金属イオンとキレート錯化合物を形成
することのできる基も含んでいる。この抗体結合物の錯
化合物は生体内診断および治療に有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、金属イオン、特に
テクネチウムおよびレニウムの放射性同位元素で標識化
された生物学的に有用な分子の製造に用いられる抗体結
合物及びその製法に関するものである。本発明の抗体結
合物を組み込んだ放射性標識抗体断片は、治療および生
体内診断の用途に用いられる。
テクネチウムおよびレニウムの放射性同位元素で標識化
された生物学的に有用な分子の製造に用いられる抗体結
合物及びその製法に関するものである。本発明の抗体結
合物を組み込んだ放射性標識抗体断片は、治療および生
体内診断の用途に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】放射性核種金属イオンの、治療的および
生体内診断の用途における使用はしばらく前から実際に
行われている。たとえば、テクネチウム−９９ｍを含む
ガンマ放射性核種金属イオンが、腫瘍発見のための診断
的シンチグラフィーに用いられている。レニウム−１８
６、レニウム−１８８およびレニウム−１８９を含むベ
ータ放射同位体は腫瘍治療に治療的に用いられる。
生体内診断の用途における使用はしばらく前から実際に
行われている。たとえば、テクネチウム−９９ｍを含む
ガンマ放射性核種金属イオンが、腫瘍発見のための診断
的シンチグラフィーに用いられている。レニウム−１８
６、レニウム−１８８およびレニウム−１８９を含むベ
ータ放射同位体は腫瘍治療に治療的に用いられる。
【０００３】放射性核種の生体内診断および治療への応
用における効率は、放射性核種を標的細胞部位まで運搬
できるかどうかによってきまる。放射性核種を標的細胞
部位に運搬する一つの方法は、放射性核種金属イオン
を、生物学的に有用な分子、たとえば抗体にカップリン
グすることを含む、その抗体は標的細胞と結合する特異
的配位子を選択的に確認し、これと結合する。たとえ
ば、診断的造影（ｉｍａｇｉｎｇ）目的で、または腫瘍
を照射してそれを破壊する目的で、悪性腫瘍細胞によっ
て又は関連して産生されることが知られている抗原を、
抗体と結合した放射性核種に結合させることができる。
用における効率は、放射性核種を標的細胞部位まで運搬
できるかどうかによってきまる。放射性核種を標的細胞
部位に運搬する一つの方法は、放射性核種金属イオン
を、生物学的に有用な分子、たとえば抗体にカップリン
グすることを含む、その抗体は標的細胞と結合する特異
的配位子を選択的に確認し、これと結合する。たとえ
ば、診断的造影（ｉｍａｇｉｎｇ）目的で、または腫瘍
を照射してそれを破壊する目的で、悪性腫瘍細胞によっ
て又は関連して産生されることが知られている抗原を、
抗体と結合した放射性核種に結合させることができる。
【０００４】ゴールデンベルグ等（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒ
ｇ ｅｔ ａ１）（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９８
巻，１３８４−１３８８ぺージ，１９７８）は、既知の
癌関連抗原である癌胚抗原（ＣＥＡ）〔ゴールド（Ｇｏ
ｌｄ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１巻，４３９−
４６２ぺージ，１９６５〕に対する抗体をヨード131で
標識化し、癌の病歴のある患者に注射するという実験を
報告した。４８時間後その患者をガンマーシンチレーシ
ョンカメラにより走査し、ガンマ放射パターンによって
癌を定位した。同様に英国特許出願第２，１０９，４０
７号は、金属性放射性核種で標識化した、癌関連抗原に
対するモノクローナル抗体を、生体内腫瘍検知および定
位のために使用することを記載している。
ｇ ｅｔ ａ１）（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９８
巻，１３８４−１３８８ぺージ，１９７８）は、既知の
癌関連抗原である癌胚抗原（ＣＥＡ）〔ゴールド（Ｇｏ
ｌｄ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１巻，４３９−
４６２ぺージ，１９６５〕に対する抗体をヨード131で
標識化し、癌の病歴のある患者に注射するという実験を
報告した。４８時間後その患者をガンマーシンチレーシ
ョンカメラにより走査し、ガンマ放射パターンによって
癌を定位した。同様に英国特許出願第２，１０９，４０
７号は、金属性放射性核種で標識化した、癌関連抗原に
対するモノクローナル抗体を、生体内腫瘍検知および定
位のために使用することを記載している。
【０００５】放射性標識された抗体断片は、放射性標識
された全抗体よりもしばしば生体内診断および治療への
応用に用いられることが示唆されている。その理由は、
断片の方が所望標的部位に浸透することができること、
および抗体断片は、全抗体と関係する免疫原性および交
叉反応性の問題を最小にすることである（例：米国特許
第４，０３６，９４５号；ランセット（Ｌａｎｃｅ
ｔ），ＩＩ巻，Ｎｏ．８０８７，４６２ぺージ（１９７
８）；ベリッキー（Ｂｅｌｉｔｓｋｙ）等，Ｊ．Ｎｕｃ
ｌ．Ｍｅｄ．，１９巻，４２９ぺージ，１９７８）。抗
体断片はいくつかの方法でつくることができる。抗体分
子を酵素的に処理してＨ鎖のカルボキシル末端部分（Ｆ
ｃ断片）を除去し、二価のＦ（ａｂ´）2 断片、すなわ
ちＨ鎖につながる１個以上のジスルフィド結合によって
結合している二つのＦａｂ´部分は残すことができる。
Ｆ（ａｂ´）2 断片をその後、Ｈ鎖につながっているジ
スルフィド結合のところで選択的に還元し、各々が一つ
の抗原結合部位を有する二つの一価Ｆａｂ´断片をつく
る。
された全抗体よりもしばしば生体内診断および治療への
応用に用いられることが示唆されている。その理由は、
断片の方が所望標的部位に浸透することができること、
および抗体断片は、全抗体と関係する免疫原性および交
叉反応性の問題を最小にすることである（例：米国特許
第４，０３６，９４５号；ランセット（Ｌａｎｃｅ
ｔ），ＩＩ巻，Ｎｏ．８０８７，４６２ぺージ（１９７
８）；ベリッキー（Ｂｅｌｉｔｓｋｙ）等，Ｊ．Ｎｕｃ
ｌ．Ｍｅｄ．，１９巻，４２９ぺージ，１９７８）。抗
体断片はいくつかの方法でつくることができる。抗体分
子を酵素的に処理してＨ鎖のカルボキシル末端部分（Ｆ
ｃ断片）を除去し、二価のＦ（ａｂ´）2 断片、すなわ
ちＨ鎖につながる１個以上のジスルフィド結合によって
結合している二つのＦａｂ´部分は残すことができる。
Ｆ（ａｂ´）2 断片をその後、Ｈ鎖につながっているジ
スルフィド結合のところで選択的に還元し、各々が一つ
の抗原結合部位を有する二つの一価Ｆａｂ´断片をつく
る。
【０００６】抗体分子は、放射性核種金属イオンが抗体
に結合するための付着部位として用いることのできる反
応性側鎖を多数含む。たとえば、放射性核種は、アスパ
ラギン酸残基またはグルタミン酸残基のカルボキシル
基，リジン残基のアミノ基，チロシン−またはヒスチジ
ン残基の芳香基、またはシステインのスルフヒドリル基
と反応するリンカー分子によって、抗体に結合すること
ができる。
に結合するための付着部位として用いることのできる反
応性側鎖を多数含む。たとえば、放射性核種は、アスパ
ラギン酸残基またはグルタミン酸残基のカルボキシル
基，リジン残基のアミノ基，チロシン−またはヒスチジ
ン残基の芳香基、またはシステインのスルフヒドリル基
と反応するリンカー分子によって、抗体に結合すること
ができる。
【０００７】先行技術の方法を用いて抗体−放射性核種
錯化合物をつくることはできるが、これらの方法でつく
られた錯化合物は、どれ一つとしてイメージングに使用
するために理想的な生体分布特性をもっていない。特
に、良いラジオグラフィック剤の望ましい特性である肝
臓および腎臓における放射性核種の速かなクリアランス
または低いとり込みは、先行技術の方法によってつくら
れる多数の抗体−放射性核種錯化合物では実現困難な問
題である。
錯化合物をつくることはできるが、これらの方法でつく
られた錯化合物は、どれ一つとしてイメージングに使用
するために理想的な生体分布特性をもっていない。特
に、良いラジオグラフィック剤の望ましい特性である肝
臓および腎臓における放射性核種の速かなクリアランス
または低いとり込みは、先行技術の方法によってつくら
れる多数の抗体−放射性核種錯化合物では実現困難な問
題である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、放射性核種
金属イオン、特にテクネチウムまたはレニウムの同位元
素と錯化合物を形成できる、生物学的に有用な蛋白質ま
たはポリペプチド分子、たとえば抗体と二官能価カップ
リング剤の結合物を提供して、生体内での診断および治
療への応用に使用できる物質を提供する。
金属イオン、特にテクネチウムまたはレニウムの同位元
素と錯化合物を形成できる、生物学的に有用な蛋白質ま
たはポリペプチド分子、たとえば抗体と二官能価カップ
リング剤の結合物を提供して、生体内での診断および治
療への応用に使用できる物質を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】二官能価カップリング剤
を抗体または抗体断片中のリジン残基のε−アミノ基と
反応させることによってつくられる本発明の抗体結合物
は、その抗体結合物を形成する抗体の抗原結合活性、す
なわち免疫反応性を保有する。二官能価カップリング剤
は、アシル化反応によって抗体または抗体断片中のε−
アミノ基と反応してアミド結合を形成する活性化基を含
む。二官能価カップリング剤は、放射性核種金属イオン
とキレート錯化合物を形成することのできる基も含んで
いる。カップリング剤を組み込んだ抗体結合物は、一般
式；
を抗体または抗体断片中のリジン残基のε−アミノ基と
反応させることによってつくられる本発明の抗体結合物
は、その抗体結合物を形成する抗体の抗原結合活性、す
なわち免疫反応性を保有する。二官能価カップリング剤
は、アシル化反応によって抗体または抗体断片中のε−
アミノ基と反応してアミド結合を形成する活性化基を含
む。二官能価カップリング剤は、放射性核種金属イオン
とキレート錯化合物を形成することのできる基も含んで
いる。カップリング剤を組み込んだ抗体結合物は、一般
式；
【化４】 によってあらわされ、ここでＡｂは抗体または抗体断片
の残基であり；Ｒ1 ，Ｒ2 およびＲ3 は同じであるかま
たは異なり、各々は１〜６個の炭素原子を有するアルキ
ル、６〜８個の炭素原子を有するアリールおよび７〜９
個の炭素原子を有するアルカリルから成る群から選ばれ
る基であって、そのいずれも１個以上のヒドロキシル，
アルコキシ，カルボキシ−またはスルフォネート基で置
換され得る基をあらわし；ｎは１または２；ＡＡはアミ
ド結合によって互いに結合するα−またはβ−アミノ酸
（互いに独立的に）であり；ｉは２から６までの整数で
ある。
の残基であり；Ｒ1 ，Ｒ2 およびＲ3 は同じであるかま
たは異なり、各々は１〜６個の炭素原子を有するアルキ
ル、６〜８個の炭素原子を有するアリールおよび７〜９
個の炭素原子を有するアルカリルから成る群から選ばれ
る基であって、そのいずれも１個以上のヒドロキシル，
アルコキシ，カルボキシ−またはスルフォネート基で置
換され得る基をあらわし；ｎは１または２；ＡＡはアミ
ド結合によって互いに結合するα−またはβ−アミノ酸
（互いに独立的に）であり；ｉは２から６までの整数で
ある。
【００１０】式ＩまたはＩＩを有する抗体結合物はキレ
ート化基によって放射性核種、たとえばテクネチウム−
またはレニウム同位元素と錯化合物を形成し、たとえば
悪性腫瘍の治療に治療用、または生体内診断用イメージ
ング剤として用いることのできる抗体−放射線核種結合
物を提供する。
ート化基によって放射性核種、たとえばテクネチウム−
またはレニウム同位元素と錯化合物を形成し、たとえば
悪性腫瘍の治療に治療用、または生体内診断用イメージ
ング剤として用いることのできる抗体−放射線核種結合
物を提供する。
【００１１】式ＩおよびＩＩの抗体結合物は、発明の二
官能価カップリング剤を抗体または抗体の断片、すなわ
ちＦ（ａｂ）´2 またはＦａｂ´断片と反応させること
によってつくられる。用いられるＦａｂ´断片は、全抗
体をＦａｂ´断片に変える酵素的および／または化学的
処理を受けた後でも抗原結合活性を保有することのでき
る抗体から誘導される。全抗体は２本のＨ鎖の部位特異
的切断をおこす酵素で先づ処理され、Ｈ鎖のカルボキシ
ル末端のところのＦｃ部分を除去する。生成したＦ（ａ
ｂ）´2 断片をその後、ジチオトレイトールのような還
元剤で処理する。還元剤は、２本のＨ鎖に連結するジス
ルフィド結合を含むジスルフィド結合を切断する。Ｈ−
Ｌ鎖ジスルフィド結合は切断されるとはいえ、Ｈ鎖とＬ
鎖とは相変らず関係している。こうして二つのＦａｂ´
断片がつくられ、その各々はそのＨ鎖から垂れ下った遊
離のスルフヒドリル基を最低１個有する。その遊離スル
フヒドリル基を、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセタ
ミドまたはヨード酢酸のような遮蔽剤でアルキル化する
ことができる。スルフヒドリル基を遮蔽することによ
り、それらは放射性核種との反応を全うすることに利用
できなくなる。リジン残基のε−アミノ基は、抗体断片
または全抗体がカップリング剤に結合して抗体結合物を
生成するその反応部位となる。
官能価カップリング剤を抗体または抗体の断片、すなわ
ちＦ（ａｂ）´2 またはＦａｂ´断片と反応させること
によってつくられる。用いられるＦａｂ´断片は、全抗
体をＦａｂ´断片に変える酵素的および／または化学的
処理を受けた後でも抗原結合活性を保有することのでき
る抗体から誘導される。全抗体は２本のＨ鎖の部位特異
的切断をおこす酵素で先づ処理され、Ｈ鎖のカルボキシ
ル末端のところのＦｃ部分を除去する。生成したＦ（ａ
ｂ）´2 断片をその後、ジチオトレイトールのような還
元剤で処理する。還元剤は、２本のＨ鎖に連結するジス
ルフィド結合を含むジスルフィド結合を切断する。Ｈ−
Ｌ鎖ジスルフィド結合は切断されるとはいえ、Ｈ鎖とＬ
鎖とは相変らず関係している。こうして二つのＦａｂ´
断片がつくられ、その各々はそのＨ鎖から垂れ下った遊
離のスルフヒドリル基を最低１個有する。その遊離スル
フヒドリル基を、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセタ
ミドまたはヨード酢酸のような遮蔽剤でアルキル化する
ことができる。スルフヒドリル基を遮蔽することによ
り、それらは放射性核種との反応を全うすることに利用
できなくなる。リジン残基のε−アミノ基は、抗体断片
または全抗体がカップリング剤に結合して抗体結合物を
生成するその反応部位となる。
【００１２】チオール活性化剤の存在下でパパインによ
って抗体を酵素的に切断するとＨ鎖間ジスルフィド結合
のないＦａｂ´断片が生成する、これらは、生成抗体断
片が遮蔽剤によってアルキル化する必要のある遊離スル
フヒドリル基を含まないという点で、本発明においては
特に有用である。
って抗体を酵素的に切断するとＨ鎖間ジスルフィド結合
のないＦａｂ´断片が生成する、これらは、生成抗体断
片が遮蔽剤によってアルキル化する必要のある遊離スル
フヒドリル基を含まないという点で、本発明においては
特に有用である。
【００１３】本発明の実施において有用な抗体は、生体
内腫瘍マーカーとして有効であることが知られている抗
原、たとえば癌胚抗原（ＣＥＡ），α−フェトプロテイ
ン、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンまたはそのベータ
・サブユニット、結腸特異抗原−ｐ、腫瘍特異糖蛋白質
等々のいずれに対する抗体をも含む。
内腫瘍マーカーとして有効であることが知られている抗
原、たとえば癌胚抗原（ＣＥＡ），α−フェトプロテイ
ン、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンまたはそのベータ
・サブユニット、結腸特異抗原−ｐ、腫瘍特異糖蛋白質
等々のいずれに対する抗体をも含む。
【００１４】使用する抗体は異種のものであってもよい
し、それらがモノクローナル抗体であってもよい。モノ
クローナル抗体は、コーラー（Ｃ．Ｋｏｈｌｅｒ）およ
びミルスタイン（Ｃ．Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ）の「ネイチ
ュア」（ロンドン），２５６巻，４９５−４９７ぺージ
（１９７５）に記載の方法にしたがってつくられる選択
されたハイブリドーマ細胞によってつくられる。本発明
の実施において用いられるＦａｂ´断片の生産に有用な
抗体の例は、癌関連抗原，ＣＥＡ，に対するモノクロー
ナル抗体である。このネズミ モノクローナル抗−ＣＥ
Ａ抗体は、パルハム（Ｐａｒｈａｍ）等の方法（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５３巻，１３３−１７
３ぺージ〔１９８２〕）によって、前活性化せるチオー
ル不存在パパインを用いて切断され、Ｈ鎖に結合する１
個のジスルフィド結合を有するＦ（ａｂ´）2 断片をつ
くることができる。その後鎖間ジスルフィド結合を還元
剤で処理して破壊し、Ｆａｂ´断片を得る。還元された
状態でも、Ｈ鎖およびＬ鎖は関係を保っており、そのた
め抗原結合活性は保有される。還元は、中性ｐＨまたは
それに近いｐＨで緩衝溶液中で培養（インキュベート）
することにより便利に行われる。インキュベーション温
度は決定的ではなく、室温が適当である。インキュベー
ションは概して約１〜２時間行われる。ジチオトレイト
ールは鎖間ジスルフィド結合を切断するための好ましい
還元剤である。
し、それらがモノクローナル抗体であってもよい。モノ
クローナル抗体は、コーラー（Ｃ．Ｋｏｈｌｅｒ）およ
びミルスタイン（Ｃ．Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ）の「ネイチ
ュア」（ロンドン），２５６巻，４９５−４９７ぺージ
（１９７５）に記載の方法にしたがってつくられる選択
されたハイブリドーマ細胞によってつくられる。本発明
の実施において用いられるＦａｂ´断片の生産に有用な
抗体の例は、癌関連抗原，ＣＥＡ，に対するモノクロー
ナル抗体である。このネズミ モノクローナル抗−ＣＥ
Ａ抗体は、パルハム（Ｐａｒｈａｍ）等の方法（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５３巻，１３３−１７
３ぺージ〔１９８２〕）によって、前活性化せるチオー
ル不存在パパインを用いて切断され、Ｈ鎖に結合する１
個のジスルフィド結合を有するＦ（ａｂ´）2 断片をつ
くることができる。その後鎖間ジスルフィド結合を還元
剤で処理して破壊し、Ｆａｂ´断片を得る。還元された
状態でも、Ｈ鎖およびＬ鎖は関係を保っており、そのた
め抗原結合活性は保有される。還元は、中性ｐＨまたは
それに近いｐＨで緩衝溶液中で培養（インキュベート）
することにより便利に行われる。インキュベーション温
度は決定的ではなく、室温が適当である。インキュベー
ションは概して約１〜２時間行われる。ジチオトレイト
ールは鎖間ジスルフィド結合を切断するための好ましい
還元剤である。
【００１５】式ＩおよびＩＩの抗体結合物は、全抗体ま
たは断片を、次式によってあらわされるカップリング剤
と反応させることによってつくられる。
たは断片を、次式によってあらわされるカップリング剤
と反応させることによってつくられる。
【化５】 式ＩＩＩおよびＩＶにおいて、Ｒ1 ，Ｒ2 およびＲ3 は
同じであっても異なっていてもよく、各々は１〜６個の
炭素原子を有するアルキル、６〜８個の炭素原子を有す
るアリール、および７〜９個の炭素原子を有するアルカ
リルから成る群から選ばれる基であって、そのいずれも
が１個以上のヒドロキシル，アルコキシ，カルボキシま
たはスルフォネート基によって置換され得る基をあらわ
し；ｎは１または２で；ＡＡに独立的に、アミド結合に
よって互いに結合したα−またはβ−アミノ酸であ
り、；ｉは２から６までの整数で；Ｘは抗体またはその
断片のε−アミノ基とアミド結合を形成し得る活性化基
である。
同じであっても異なっていてもよく、各々は１〜６個の
炭素原子を有するアルキル、６〜８個の炭素原子を有す
るアリール、および７〜９個の炭素原子を有するアルカ
リルから成る群から選ばれる基であって、そのいずれも
が１個以上のヒドロキシル，アルコキシ，カルボキシま
たはスルフォネート基によって置換され得る基をあらわ
し；ｎは１または２で；ＡＡに独立的に、アミド結合に
よって互いに結合したα−またはβ−アミノ酸であ
り、；ｉは２から６までの整数で；Ｘは抗体またはその
断片のε−アミノ基とアミド結合を形成し得る活性化基
である。
【００１６】Ｘは、ハロゲン、Ｎ3 、
【化６】 から成る群から選ばれる要素であることが好ましい。
【００１７】次のものは、抗体のε−アミノ基に放射性
核種金属イオンを付着するために用いられる式ＩＩＩの
カップリング剤の例である。
核種金属イオンを付着するために用いられる式ＩＩＩの
カップリング剤の例である。
【化７】
【化８】
【００１８】次のものは抗体のε−アミノ基に放射性核
種金属イオンを付着するために用いられる式ＩＶのカッ
プリング剤の例である。
種金属イオンを付着するために用いられる式ＩＶのカッ
プリング剤の例である。
【化９】
【化１０】
【００１９】エステル型の、式ＩＩＩのカップリング剤
は、式Ｘ−ＯＨの化合物と、式
は、式Ｘ−ＯＨの化合物と、式
【化１１】 を有するカルボキシル酸とを、カルボキシル基のエステ
ル化がおこる条件下で反応させることによって合成され
る。式Ｖの化合物は、それはそれでポリペプチド
ル化がおこる条件下で反応させることによって合成され
る。式Ｖの化合物は、それはそれでポリペプチド
【化１２】 からつくられる。このポリペプチドをクロロアシルクロ
リド，たとえばクロロアセチルクロリドと反応させる
と、式
リド，たとえばクロロアセチルクロリドと反応させる
と、式
【化１３】 の化合物が生成する。
【００２０】式ＶＩの化合物をその後式
【化１４】 の化合物と反応させて、式Ｖの化合物をつくることがで
きる。
きる。
【００２１】式Ｖの化合物を生成するための上記の反応
系列の単なる例として、Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセ
チルグリシルグリシルグリシン製造のための次の図式を
参照することができる。
系列の単なる例として、Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセ
チルグリシルグリシルグリシン製造のための次の図式を
参照することができる。
【化１５】
【００２２】Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシ
ルグリシルグリシネートをその後、たとえばＮ−ヒドロ
キシスルフォスクシンイミドナトリウムと反応させて、
式ＩＩＩの化合物、すなわちズルフォスクシンイミドイ
ル（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシ
ルグリシネート）ナトリウムを合成することができる。
チオ安息香酸ナトリウムの代わりにチオ酢酸ナトリウム
を用いる同様な反応図式は、スルフォスクシンイミドイ
ル（Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシル
グリシネート）ナトリウムを生成する。
ルグリシルグリシネートをその後、たとえばＮ−ヒドロ
キシスルフォスクシンイミドナトリウムと反応させて、
式ＩＩＩの化合物、すなわちズルフォスクシンイミドイ
ル（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシ
ルグリシネート）ナトリウムを合成することができる。
チオ安息香酸ナトリウムの代わりにチオ酢酸ナトリウム
を用いる同様な反応図式は、スルフォスクシンイミドイ
ル（Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシル
グリシネート）ナトリウムを生成する。
【００２３】エステル型の式ＩＶのカップリング剤は、
式Ｘ−ＯＨの化合物を、式
式Ｘ−ＯＨの化合物を、式
【化１６】 を有するカルボキシル酸と反応させることによってつく
ることができる。
ることができる。
【００２４】式ＶＩＩのカルボキシル酸は、２，３−ジ
アミノプロピオン酸から、フリッツェルグ（Ａ．Ｒ．Ｆ
ｒｉｔｙｅｒｇ）等がＪ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２３
巻，５９２−５９８ぺージ（１９８２）に記載される相
当エチルエステルのための製法に類似の方法によってつ
くることができる。その製法は次の反応図式によって説
明される；
アミノプロピオン酸から、フリッツェルグ（Ａ．Ｒ．Ｆ
ｒｉｔｙｅｒｇ）等がＪ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２３
巻，５９２−５９８ぺージ（１９８２）に記載される相
当エチルエステルのための製法に類似の方法によってつ
くることができる。その製法は次の反応図式によって説
明される；
【化１７】
【００２５】式ＩＩＩまたはＩＶのカップリング剤を抗
体またはＦａｂ´断片のε−アミノ基と反応させるとア
ミド結合によって、式ＩまたはＩＩの抗体結合物が生成
する。
体またはＦａｂ´断片のε−アミノ基と反応させるとア
ミド結合によって、式ＩまたはＩＩの抗体結合物が生成
する。
【００２６】反応は中性またはわずかに酸性の緩衝液、
たとえば２０ｍＭ燐酸塩溶液、ｐＨ７．０中で行われ
る。不都合な副反応を避けるために、アミン緩衝液は避
けるべきである。反応温度は決定的でなく、室温付近が
好ましい。室温ではその反応は約１時間で完了する。生
成物を一般的クロマトグラフィー手段、たとえばゲル濾
過クロマトグラフィーにより分離することができる。
たとえば２０ｍＭ燐酸塩溶液、ｐＨ７．０中で行われ
る。不都合な副反応を避けるために、アミン緩衝液は避
けるべきである。反応温度は決定的でなく、室温付近が
好ましい。室温ではその反応は約１時間で完了する。生
成物を一般的クロマトグラフィー手段、たとえばゲル濾
過クロマトグラフィーにより分離することができる。
【００２７】式ＩまたはＩＩの抗体結合物を、キレート
化条件下で放射性核種金属イオンと錯化合物を形成せし
め、抗体−放射性核種錯化合物をつくる。Ｔｃ−９９ｍ
またはレニウム同位元素とのキレート化は、抗体結合物
を所望同位元素の塩と共に緩衝溶液中でインキュベート
することによって達成できる。発明のカップリング剤
は、Ｔｃ９９との結合およびレニウム−１８６，レニウ
ム−１８８およびレニウム−１８９のようなレニウム同
位元素との結合に特に有用である。
化条件下で放射性核種金属イオンと錯化合物を形成せし
め、抗体−放射性核種錯化合物をつくる。Ｔｃ−９９ｍ
またはレニウム同位元素とのキレート化は、抗体結合物
を所望同位元素の塩と共に緩衝溶液中でインキュベート
することによって達成できる。発明のカップリング剤
は、Ｔｃ９９との結合およびレニウム−１８６，レニウ
ム−１８８およびレニウム−１８９のようなレニウム同
位元素との結合に特に有用である。
【００２８】抗体−放射性核種錯化合物は生理学的に受
け入れられる緩衝液中に処方され、治療用または生体内
診断用に使用することができる。本発明の一実施態様に
おいては、Ｆａｂ´断片はネズミ−抗ＣＥＡ−モノクロ
ーナル抗体である。ＣＥＡ−抗体結合物をＴｃ−９９ｍ
またはレニウム放射性同位元素とキレート化し、当業者
には公知の光走査法を用いる生体内腫瘍イメージング剤
として用いられる。ＣＥＡ−抗体−放射性核種錯化合物
を静脈注射し、その後対象を光走査して生体内における
放射性核種結合物のとり込み部位を決定する。本発明の
方法および組成物は、生体内または生体外診断または治
療の用途に使用するために放射性標識化することが所望
される抗体以外の蛋白質またはポリペプチド分子に、放
射性核種を結合するためにも用いることができる。
け入れられる緩衝液中に処方され、治療用または生体内
診断用に使用することができる。本発明の一実施態様に
おいては、Ｆａｂ´断片はネズミ−抗ＣＥＡ−モノクロ
ーナル抗体である。ＣＥＡ−抗体結合物をＴｃ−９９ｍ
またはレニウム放射性同位元素とキレート化し、当業者
には公知の光走査法を用いる生体内腫瘍イメージング剤
として用いられる。ＣＥＡ−抗体−放射性核種錯化合物
を静脈注射し、その後対象を光走査して生体内における
放射性核種結合物のとり込み部位を決定する。本発明の
方法および組成物は、生体内または生体外診断または治
療の用途に使用するために放射性標識化することが所望
される抗体以外の蛋白質またはポリペプチド分子に、放
射性核種を結合するためにも用いることができる。
【００２９】次の実施例は、発明の実施をさらに詳しく
説明するためのものであって、決してその範囲を制限す
るものではない。
説明するためのものであって、決してその範囲を制限す
るものではない。
【００３０】
実施例１ Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグ
リシンの製造 Ａ．クロロアセチルグリシルグリシルグリシンの製造 ５００ｍｌフラスコに、１．０Ｎ ＮａＯＨ ７５ｍｌ
中２．５ｇ（０．０１３ｍｏｌ）グリシルグリシルグリ
シン溶液を入れ、これに、攪拌しながら窒素気流中で０
℃で、エーテル１００ｍｌ中１３．０ｇ（０．１１５ｍ
ｏｌ）クロロアセチルクロリド溶液を一つの漏斗から滴
下し、それと同時に１．０Ｎ ＮａＯＨ１００ｍｌを別
の漏斗から滴下した。添加が終った後、反応混合物を０
℃で１．５時間攪拌した。その後混合物を冷却しながら
濃Ｈｃｌで酸性にした。さらに３０分間攪拌した後、混
合物を減圧下で４０℃で３分の１容量に濃縮した。残留
分を氷浴中で冷やして沈澱させた。固体を分離すると、
２回洗浄後に２．７５ｇ（７８．５％）が得られた。 Ｂ．Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシ
ルグリシンの製造 粗クロロアセタミド生成物（１．０ｇ，０．０３７ｍｏ
ｌ）を窒素気流下で無水メタノール３００ｍｌに溶解し
た。チオ安息香酸ナトリウム〔チオ安息香酸１．１０ｇ
（０．００７６ｍｏｌ）と、ナトリウム１７５ｍｇ
（０．００７６ｍｏｌ）を加えた乾燥メタノールとから
つくられる〕を加えた。反応混合物を１．５時間還流し
た。減圧下で溶媒を除去した後、攪拌しながら２Ｎ Ｈ
ｃｌを加えた。濾過により固体を分離し、ＣＨｃｌ3 で
洗った。メタノールから結晶化すると生成物１．２５ｇ
（９０％）が得られた。
リシンの製造 Ａ．クロロアセチルグリシルグリシルグリシンの製造 ５００ｍｌフラスコに、１．０Ｎ ＮａＯＨ ７５ｍｌ
中２．５ｇ（０．０１３ｍｏｌ）グリシルグリシルグリ
シン溶液を入れ、これに、攪拌しながら窒素気流中で０
℃で、エーテル１００ｍｌ中１３．０ｇ（０．１１５ｍ
ｏｌ）クロロアセチルクロリド溶液を一つの漏斗から滴
下し、それと同時に１．０Ｎ ＮａＯＨ１００ｍｌを別
の漏斗から滴下した。添加が終った後、反応混合物を０
℃で１．５時間攪拌した。その後混合物を冷却しながら
濃Ｈｃｌで酸性にした。さらに３０分間攪拌した後、混
合物を減圧下で４０℃で３分の１容量に濃縮した。残留
分を氷浴中で冷やして沈澱させた。固体を分離すると、
２回洗浄後に２．７５ｇ（７８．５％）が得られた。 Ｂ．Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシ
ルグリシンの製造 粗クロロアセタミド生成物（１．０ｇ，０．０３７ｍｏ
ｌ）を窒素気流下で無水メタノール３００ｍｌに溶解し
た。チオ安息香酸ナトリウム〔チオ安息香酸１．１０ｇ
（０．００７６ｍｏｌ）と、ナトリウム１７５ｍｇ
（０．００７６ｍｏｌ）を加えた乾燥メタノールとから
つくられる〕を加えた。反応混合物を１．５時間還流し
た。減圧下で溶媒を除去した後、攪拌しながら２Ｎ Ｈ
ｃｌを加えた。濾過により固体を分離し、ＣＨｃｌ3 で
洗った。メタノールから結晶化すると生成物１．２５ｇ
（９０％）が得られた。
【００３１】実施例２ Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）Ｓ−ベンゾイル
メルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネート・ナ
トリウム塩の製造 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２０ｍｌ中に１．１８ｇ
（３．２０ｍｍｏｌ）Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチ
ルグリシルグリシルグリシンおよび０．７０ｇ（３．２
０ｍｍｏｌ）Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミドを
溶かした混合物に、１．３−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド０．６７ｇ（３．２０ｍｍｏｌ）を加えた。混合
物をＮ2 気流中で一晩機械的に攪拌した。混合物を氷浴
中で冷やし、フリット材料を通して濾過することにより
固体を除去した。濾液を速く攪拌している酢酸エチル
（〜１７５ｍｌ）に滴下し、生成物であるエステルを沈
澱させ、それを濾過により集め、酢酸エチルで洗い、溶
媒と共にまだ水分が残っている間に真空デシケータに移
し、真空下で一晩乾燥した。生成物エステルはｌ．５６
２ｇであった。生成物エステルの活性を試験するため
に、水６ｍｌ中ベンジルアミン０．０８ｇの溶液に、生
成物エステル０．３３９ｇを加えた。混合物を１／２時
間攪拌し、沈澱を集めると、生成物０．２５ｇ（９３
％）が得られた、これはエステルが最低９３％活性であ
ることを示している。
メルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネート・ナ
トリウム塩の製造 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２０ｍｌ中に１．１８ｇ
（３．２０ｍｍｏｌ）Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチ
ルグリシルグリシルグリシンおよび０．７０ｇ（３．２
０ｍｍｏｌ）Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミドを
溶かした混合物に、１．３−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド０．６７ｇ（３．２０ｍｍｏｌ）を加えた。混合
物をＮ2 気流中で一晩機械的に攪拌した。混合物を氷浴
中で冷やし、フリット材料を通して濾過することにより
固体を除去した。濾液を速く攪拌している酢酸エチル
（〜１７５ｍｌ）に滴下し、生成物であるエステルを沈
澱させ、それを濾過により集め、酢酸エチルで洗い、溶
媒と共にまだ水分が残っている間に真空デシケータに移
し、真空下で一晩乾燥した。生成物エステルはｌ．５６
２ｇであった。生成物エステルの活性を試験するため
に、水６ｍｌ中ベンジルアミン０．０８ｇの溶液に、生
成物エステル０．３３９ｇを加えた。混合物を１／２時
間攪拌し、沈澱を集めると、生成物０．２５ｇ（９３
％）が得られた、これはエステルが最低９３％活性であ
ることを示している。
【００３２】実施例３ Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリ
シンの製造 Ａ．クロロアセチルグリシルグリシルグリシンの製造 ５００ｍｌフラスコに、１．０Ｎ ＮａＯＨ７５ｍｌ中
２．５ｇ（０．０１３ｍｏｌ）グリシルグリシルグリシ
ン溶液を入れ、これに攪拌しながら窒素気流下で０℃
で、エーテル１００ｍｌ中１３．０ｇ（０．１１５ｍｏ
ｌ）クロロアセチルクロリド溶液を一つの漏斗から滴下
し、同時にもう一つの漏斗から１．０ＮＮａＯＨ１００
ｍｌを滴下した。添加終了後、反応混合物を０℃で１．
５時間攪拌した。それから混合物を冷やしながら濃Ｈｃ
ｌで酸性にした。さらに３０分間攪拌後、混合物を減圧
下、４０℃で１／３容量に濃縮した。残留分を氷浴中で
冷やして沈澱させた。固体を分離すると、２回洗浄後
２．７５ｇ（７８．５％）を得た。 Ｂ．Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシル
グリシンの製法 粗クロロアセチルグリシルグリシルグリシン生成物
（１．０ｇ，０．００３７ｍｏｌ）を窒素下で無水メタ
ノール５０ｍｌに懸濁させた。チオ酢酸ナトリウム・メ
タノール溶液〔チオ酢酸０．５８ｇ（０．００７６ｍｏ
ｌ）と、ナトリウム１７５ｍｇ（０．００７６ｍｏｌ）
を加えた乾燥メタノールとからつくられる〕を加えた。
反応混合物を１．５時間還流した。減圧下で溶媒を除去
した後、２ＮＨｃｌを攪拌しながら加えた。固体を濾過
により分離し、ＣＨＣｌ3 で洗った。メタノール／水と
から結晶化すると生成物１．００ｇ（９０％）が得られ
た。
シンの製造 Ａ．クロロアセチルグリシルグリシルグリシンの製造 ５００ｍｌフラスコに、１．０Ｎ ＮａＯＨ７５ｍｌ中
２．５ｇ（０．０１３ｍｏｌ）グリシルグリシルグリシ
ン溶液を入れ、これに攪拌しながら窒素気流下で０℃
で、エーテル１００ｍｌ中１３．０ｇ（０．１１５ｍｏ
ｌ）クロロアセチルクロリド溶液を一つの漏斗から滴下
し、同時にもう一つの漏斗から１．０ＮＮａＯＨ１００
ｍｌを滴下した。添加終了後、反応混合物を０℃で１．
５時間攪拌した。それから混合物を冷やしながら濃Ｈｃ
ｌで酸性にした。さらに３０分間攪拌後、混合物を減圧
下、４０℃で１／３容量に濃縮した。残留分を氷浴中で
冷やして沈澱させた。固体を分離すると、２回洗浄後
２．７５ｇ（７８．５％）を得た。 Ｂ．Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシル
グリシンの製法 粗クロロアセチルグリシルグリシルグリシン生成物
（１．０ｇ，０．００３７ｍｏｌ）を窒素下で無水メタ
ノール５０ｍｌに懸濁させた。チオ酢酸ナトリウム・メ
タノール溶液〔チオ酢酸０．５８ｇ（０．００７６ｍｏ
ｌ）と、ナトリウム１７５ｍｇ（０．００７６ｍｏｌ）
を加えた乾燥メタノールとからつくられる〕を加えた。
反応混合物を１．５時間還流した。減圧下で溶媒を除去
した後、２ＮＨｃｌを攪拌しながら加えた。固体を濾過
により分離し、ＣＨＣｌ3 で洗った。メタノール／水と
から結晶化すると生成物１．００ｇ（９０％）が得られ
た。
【００３３】実施例４ Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）Ｓ−アセチルメ
ルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネート・ナト
リウム塩の製法 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１６ｍｌ中に１．００ｇ
（３．３０ｍｍｏｌ）Ｓ−アセチルメルカプトアセチル
グリシルグリシルグリシンおよび０．７１ｇ（３．３０
ｍｍｏｌ）Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミドナト
リウムを溶かした混合物に、０．６８ｇ（３．３０ｍｍ
ｏｌ）の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを加
えた。混合物をＮ2 気流下で一晩機械的に攪拌した。混
合物を氷浴中で冷やし、フリット材料を通して濾過する
ことにより固体を除去した。濾液を、速く攪拌している
酢酸エチル（２００ｍｌ）に滴下し、生成物エステルを
沈澱させ、それを濾過により集め、酢酸エチルで洗い、
溶媒と共にまだ水分が残っている間、真空デシケータ中
に移し、高真空下で一晩乾燥した。生成物エステルは
１．４９ｇであった。生成物の活性を、水６ｍｌ中０．
０８ｇベンジルアミン溶液にエステル０．３３８ｇ加え
ることによって試験した。１／２時間攪拌を続け、濾過
してベンザミドを集めると、０．２３８ｇの生成物が得
られた、これはエステルが少なくとも９０％活性である
ことを示すものである。
ルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネート・ナト
リウム塩の製法 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１６ｍｌ中に１．００ｇ
（３．３０ｍｍｏｌ）Ｓ−アセチルメルカプトアセチル
グリシルグリシルグリシンおよび０．７１ｇ（３．３０
ｍｍｏｌ）Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミドナト
リウムを溶かした混合物に、０．６８ｇ（３．３０ｍｍ
ｏｌ）の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを加
えた。混合物をＮ2 気流下で一晩機械的に攪拌した。混
合物を氷浴中で冷やし、フリット材料を通して濾過する
ことにより固体を除去した。濾液を、速く攪拌している
酢酸エチル（２００ｍｌ）に滴下し、生成物エステルを
沈澱させ、それを濾過により集め、酢酸エチルで洗い、
溶媒と共にまだ水分が残っている間、真空デシケータ中
に移し、高真空下で一晩乾燥した。生成物エステルは
１．４９ｇであった。生成物の活性を、水６ｍｌ中０．
０８ｇベンジルアミン溶液にエステル０．３３８ｇ加え
ることによって試験した。１／２時間攪拌を続け、濾過
してベンザミドを集めると、０．２３８ｇの生成物が得
られた、これはエステルが少なくとも９０％活性である
ことを示すものである。
【００３４】実施例５ Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）アセチルメルカ
プトアセチルグリシルグリシルグリシルグリシネート・
ナトリウム塩の製造 無水メタノール７５ｍｌ中Ｎ−クロロアセチルテトラグ
リシン１．５ｇ（４．６５ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸カ
リウム０．５４ｇ（４．７４ｍｍｏｌ）のスラリーを
６．５時間還流した。生成した混合物を氷浴中で１／２
時間冷やし、それから濾過した。白色固体を室温で１時
間、水１０ｍｌ中でスラリーにした。再濾過するとチオ
アセチル化合物１．１１ｇ（３．０７ｍｍｏｌ）が得ら
れる、これは13ＣＮＭＲによって特徴づけられた。Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｍｌ中チオアセチル化合
物１．０ｇ（２．７６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシ
スルフォスクシンイミドナトリウム０．６０ｇ（２．７
６ｍｍｏｌ）混合物に、１，３−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド０．５７ｇ（２．７６ｍｍｏｌ）を加えた。
生成スラリーを室温で１５時間攪拌した。アセトン１０
ｍｌを加え、その反応混合物を氷浴中で１／２時間冷や
した。固体を濾過し、すてた。濾液に乾燥エーテル１５
０ｍｌを加え、固体を濾取した。生成エステル物質を真
空下で乾燥すると、明黄褐色の固体０．３９ｇ（０．７
１ｍｍｏｌ）が得られた、それは13ＣＮＭＲによって特
徴づけられた。その後の誘導化は、生成物エステル１０
０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド１ｍｌ中０．０２ｍｌ（０．１８ｍｍｏｌ）ベ
ンジルアミンと２５℃で４時間反応させることによって
行われた。反応混合物を無水エーテル２０ｍｌで希釈
し、濾過した。真空下で乾燥後、白色結晶７７ｍｇ
（０．１７ｍｍｏｌ）が得られ、13ＣＮＭＲによって所
望生成物エステルであることが確認された。
プトアセチルグリシルグリシルグリシルグリシネート・
ナトリウム塩の製造 無水メタノール７５ｍｌ中Ｎ−クロロアセチルテトラグ
リシン１．５ｇ（４．６５ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸カ
リウム０．５４ｇ（４．７４ｍｍｏｌ）のスラリーを
６．５時間還流した。生成した混合物を氷浴中で１／２
時間冷やし、それから濾過した。白色固体を室温で１時
間、水１０ｍｌ中でスラリーにした。再濾過するとチオ
アセチル化合物１．１１ｇ（３．０７ｍｍｏｌ）が得ら
れる、これは13ＣＮＭＲによって特徴づけられた。Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｍｌ中チオアセチル化合
物１．０ｇ（２．７６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシ
スルフォスクシンイミドナトリウム０．６０ｇ（２．７
６ｍｍｏｌ）混合物に、１，３−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド０．５７ｇ（２．７６ｍｍｏｌ）を加えた。
生成スラリーを室温で１５時間攪拌した。アセトン１０
ｍｌを加え、その反応混合物を氷浴中で１／２時間冷や
した。固体を濾過し、すてた。濾液に乾燥エーテル１５
０ｍｌを加え、固体を濾取した。生成エステル物質を真
空下で乾燥すると、明黄褐色の固体０．３９ｇ（０．７
１ｍｍｏｌ）が得られた、それは13ＣＮＭＲによって特
徴づけられた。その後の誘導化は、生成物エステル１０
０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド１ｍｌ中０．０２ｍｌ（０．１８ｍｍｏｌ）ベ
ンジルアミンと２５℃で４時間反応させることによって
行われた。反応混合物を無水エーテル２０ｍｌで希釈
し、濾過した。真空下で乾燥後、白色結晶７７ｍｇ
（０．１７ｍｍｏｌ）が得られ、13ＣＮＭＲによって所
望生成物エステルであることが確認された。
【００３５】実施例６ リボヌクレアーゼＡ（ＲＮ）12−Ａ型およびＮ−（３−
スルフォスクシンイミジル）Ｓ−ベンゾイルメルカプト
アセチルグリシルグリシルグリシネートの結合物の製造 使用したリボヌクレアーゼＡ（ＲＮ）12−Ａ型（以後は
ＲＮと記す）はシグマ社（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．），
セントルイス、ミズリー、から市販されている。ｐＨ５
緩衝液（１００ｍＭクエン酸塩／１００ｍＭ燐酸塩から
調製）に溶かした１０ｍｇ／ｍｌＲＮ溶液２５０μｌを
やはりｐＨ５緩衝液に溶かした３０ｍＭＮ−（３−スル
フォスクシンイミドイル）Ｓ−ベンゾイルメルカプトア
セチルグリシルグリシルグリシネート・ナトリウム塩溶
液２５０μｌと共に室温で１／２時間インキュベートし
た。インキュベーション後、試料をｐＨ３−１０アガロ
ース等電点電気泳動（ＡＧＩＥＦ）によって分析した。
図１（ａ）はＡＧＩＥＦによって分析した結合物のレー
ザーデンシトメーター走査をあらわす。使用する緩衝液
のｐＨを６にして、上記の製法を繰返した。図１（ｂ）
はＡＧＩＥＦによって分析した結合物（ｐＨ６．０の緩
衝液を用いて製造）のレーザーデンシトメーター走査を
あらわす。対照として、ｐＨ５．０の緩衝液中の未反応
ＲＮをＡＧＩＥＦによって分析した。図１（ｃ）はＡＧ
ＩＥＦによって分析した未反応ＲＮ試料のレーザーデン
シトメーター走査をあらわす。図１（ａ）、ｐＨ５．０
で反応した蛋白質が未反応の対照（図１（ｃ））とは著
しく異なる電気泳動パターンを示すことを証明してい
る。これは、キレートのＲＮリジン基との反応が成功し
ているためである。正味の結果は蛋白質の全体的正電荷
の減少である、これはキレート反応試料の認められる陽
極移動によって示される。ｐＨ６．０で反応した試料
（図１（ｂ））もこれと同じ傾向を、より著しい程度で
示す。
スルフォスクシンイミジル）Ｓ−ベンゾイルメルカプト
アセチルグリシルグリシルグリシネートの結合物の製造 使用したリボヌクレアーゼＡ（ＲＮ）12−Ａ型（以後は
ＲＮと記す）はシグマ社（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．），
セントルイス、ミズリー、から市販されている。ｐＨ５
緩衝液（１００ｍＭクエン酸塩／１００ｍＭ燐酸塩から
調製）に溶かした１０ｍｇ／ｍｌＲＮ溶液２５０μｌを
やはりｐＨ５緩衝液に溶かした３０ｍＭＮ−（３−スル
フォスクシンイミドイル）Ｓ−ベンゾイルメルカプトア
セチルグリシルグリシルグリシネート・ナトリウム塩溶
液２５０μｌと共に室温で１／２時間インキュベートし
た。インキュベーション後、試料をｐＨ３−１０アガロ
ース等電点電気泳動（ＡＧＩＥＦ）によって分析した。
図１（ａ）はＡＧＩＥＦによって分析した結合物のレー
ザーデンシトメーター走査をあらわす。使用する緩衝液
のｐＨを６にして、上記の製法を繰返した。図１（ｂ）
はＡＧＩＥＦによって分析した結合物（ｐＨ６．０の緩
衝液を用いて製造）のレーザーデンシトメーター走査を
あらわす。対照として、ｐＨ５．０の緩衝液中の未反応
ＲＮをＡＧＩＥＦによって分析した。図１（ｃ）はＡＧ
ＩＥＦによって分析した未反応ＲＮ試料のレーザーデン
シトメーター走査をあらわす。図１（ａ）、ｐＨ５．０
で反応した蛋白質が未反応の対照（図１（ｃ））とは著
しく異なる電気泳動パターンを示すことを証明してい
る。これは、キレートのＲＮリジン基との反応が成功し
ているためである。正味の結果は蛋白質の全体的正電荷
の減少である、これはキレート反応試料の認められる陽
極移動によって示される。ｐＨ６．０で反応した試料
（図１（ｂ））もこれと同じ傾向を、より著しい程度で
示す。
【００３６】実施例７ 抗体二量体と、Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）
Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリ
シネートナトリウム塩との結合物の製造 乳癌抗原に対するモノクローナル抗体、ＭＡＢ７２．３
をパパインで消化して、Ｆ（ａｂ）′2 二重体を得た。
Ｂ７２．３二量体−キレート結合物の系列を、キレート
／蛋白質のモル比２０／１および１００／１で、ｐＨ
５．０および８．０で製造した。結合物を次のようにし
て製造した；ｐＨ５．０または８．０（１００ｍＭ ク
エン酸塩／１００ｍＭ燐酸塩から調製）中４．４６ｍｇ
／ｍｌＢ７２．３二量体の２０μｌを、所望ｐＨの緩衝
液に溶かした３．５７ｍＭまたは１７．８５ｍＭ Ｎ−
（３−スルフォスクシンイミジルＳ−アセチルメルカプ
ト−アセチルグリシルグリシルグリシネート・ナトリウ
ム塩の５０μｌと混合する。室温で１〜１／２時間イン
キュベーションを行い、その後試料を、ｐＨ３−１０Ａ
ＧＩＥＦによって分析した（実施例６で行ったよう
に）。対照として、ｐＨ５．０緩衝液中の未反応Ｂ７
２．３二量体をｐＨ３−１０ＡＧＩＥＦによって分析し
た。図２（ａ）はｐＨ５．０緩衝液中の未反応Ｂ７２．
３二量体のレーザーデンシトメーター走査を示す。図２
（ｂ）は、キレート／Ｂ７２．３のモル比が２０／１で
あるＢ７２．３二量体−キレート結合物（ｐＨ５．０）
のレーザーデンシトメーター走査をあらわす。図２
（ｃ）は、キレート／Ｂ７２．３二量体のモル比が２０
／１であるＢ７２．３二量体−キレート結合物（ｐＨ
８．０）のレーザーデンシトメーター走査をあらわす。
図２（ｄ）は、キレート／Ｂ７２．３二量体のモル比が
１００／１であるＢ７２．３二量体−キレート結合物
（ｐＨ５．０）のレーザーデンシトメーター走査をあら
わす。図２（ｅ）は、キレート／Ｂ７２．３二量体のモ
ル比が１００／１であるＢ７２．３二量体−キレート結
合物（ｐＨ８．０）のレーザーデンシトメーター走査を
あらわす。
Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリ
シネートナトリウム塩との結合物の製造 乳癌抗原に対するモノクローナル抗体、ＭＡＢ７２．３
をパパインで消化して、Ｆ（ａｂ）′2 二重体を得た。
Ｂ７２．３二量体−キレート結合物の系列を、キレート
／蛋白質のモル比２０／１および１００／１で、ｐＨ
５．０および８．０で製造した。結合物を次のようにし
て製造した；ｐＨ５．０または８．０（１００ｍＭ ク
エン酸塩／１００ｍＭ燐酸塩から調製）中４．４６ｍｇ
／ｍｌＢ７２．３二量体の２０μｌを、所望ｐＨの緩衝
液に溶かした３．５７ｍＭまたは１７．８５ｍＭ Ｎ−
（３−スルフォスクシンイミジルＳ−アセチルメルカプ
ト−アセチルグリシルグリシルグリシネート・ナトリウ
ム塩の５０μｌと混合する。室温で１〜１／２時間イン
キュベーションを行い、その後試料を、ｐＨ３−１０Ａ
ＧＩＥＦによって分析した（実施例６で行ったよう
に）。対照として、ｐＨ５．０緩衝液中の未反応Ｂ７
２．３二量体をｐＨ３−１０ＡＧＩＥＦによって分析し
た。図２（ａ）はｐＨ５．０緩衝液中の未反応Ｂ７２．
３二量体のレーザーデンシトメーター走査を示す。図２
（ｂ）は、キレート／Ｂ７２．３のモル比が２０／１で
あるＢ７２．３二量体−キレート結合物（ｐＨ５．０）
のレーザーデンシトメーター走査をあらわす。図２
（ｃ）は、キレート／Ｂ７２．３二量体のモル比が２０
／１であるＢ７２．３二量体−キレート結合物（ｐＨ
８．０）のレーザーデンシトメーター走査をあらわす。
図２（ｄ）は、キレート／Ｂ７２．３二量体のモル比が
１００／１であるＢ７２．３二量体−キレート結合物
（ｐＨ５．０）のレーザーデンシトメーター走査をあら
わす。図２（ｅ）は、キレート／Ｂ７２．３二量体のモ
ル比が１００／１であるＢ７２．３二量体−キレート結
合物（ｐＨ８．０）のレーザーデンシトメーター走査を
あらわす。
【００３７】実施例８ 抗−ＣＥＦ Ｆａｂ´とＮ−（３−スルフォスクシンイ
ミジル）Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグ
リシルグリシネート・ナトリウム塩との結合物の製造 癌胚抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体をパパ
インで処理してＦｃ部分を除去し、その後ジチオトレイ
トールで還元してＦａｂ´モノマー断片をつくる。Ｆａ
ｂ´の遊離スルフヒドリル基を、トリチウム化（Ｔｒｉ
ｔｉａｔｅｄ）Ｎ−エチルマレイミドで処理することに
よって遮蔽した。ｐＨ５．０または８．０緩衝液（１０
０ｍＭクエン酸塩／１００ｍＭ燐酸塩から調製される）
中４．５５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＥＡ Ｆａｂ´モノマー溶
液２０μｌを、キレート／蛋白質のモル比が１００／１
になるように適当なｐＨの緩衝液に溶解された１７．８
５ｍＭ Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）Ｓ−ベ
ンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネ
ート・ナトリウム塩溶液５μｌと共に１−１／２時間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、試料を寸法
排除（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ＨＰＬＣ（ＳＥ
Ｃ−ＨＰＬＣ）によって分析した。ＨＰＣＬの結果は、
抗体−カップリング剤結合物の形成を裏付けた。結合物
が抗原結合活性を保有しているかどうかを調べるため
に、懸濁ラジオイムノアッセーを、抗原としてＩ−125
標識ＣＥＡを用いて行った。得られた結合プロフィル
は、抗体として未結合−抗ＣＥＡ−Ｆａｂ´を用いて得
られるプロフィルとほぼ一致した。したがって結合Ｆａ
ｂ´断片は抗原結合能力を保有していた。
ミジル）Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグ
リシルグリシネート・ナトリウム塩との結合物の製造 癌胚抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体をパパ
インで処理してＦｃ部分を除去し、その後ジチオトレイ
トールで還元してＦａｂ´モノマー断片をつくる。Ｆａ
ｂ´の遊離スルフヒドリル基を、トリチウム化（Ｔｒｉ
ｔｉａｔｅｄ）Ｎ−エチルマレイミドで処理することに
よって遮蔽した。ｐＨ５．０または８．０緩衝液（１０
０ｍＭクエン酸塩／１００ｍＭ燐酸塩から調製される）
中４．５５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＥＡ Ｆａｂ´モノマー溶
液２０μｌを、キレート／蛋白質のモル比が１００／１
になるように適当なｐＨの緩衝液に溶解された１７．８
５ｍＭ Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）Ｓ−ベ
ンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネ
ート・ナトリウム塩溶液５μｌと共に１−１／２時間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、試料を寸法
排除（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ＨＰＬＣ（ＳＥ
Ｃ−ＨＰＬＣ）によって分析した。ＨＰＣＬの結果は、
抗体−カップリング剤結合物の形成を裏付けた。結合物
が抗原結合活性を保有しているかどうかを調べるため
に、懸濁ラジオイムノアッセーを、抗原としてＩ−125
標識ＣＥＡを用いて行った。得られた結合プロフィル
は、抗体として未結合−抗ＣＥＡ−Ｆａｂ´を用いて得
られるプロフィルとほぼ一致した。したがって結合Ｆａ
ｂ´断片は抗原結合能力を保有していた。
【００３８】実施例９ 抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´と、Ｎ−（３−スルフォスクシン
イミジル）Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグ
リシルグリシネート・ナトリウム塩との結合物の製造 遮蔽されたスルフヒドリル基を含む抗−ＣＥＡ Ｆａｂ
´断片を実施例６に記載したようにして製造した。ｐＨ
５．０および８．０緩衝液（１００ｍＭクエン酸塩／１
００ｍＭ燐酸塩から調製）中の４．５５ｍｇ／ｍｌの抗
−ＣＥＡ Ｆａｂ´溶液２０μｌを、キレート／蛋白質
のモル比が１００／１となるように適当なｐＨの緩衝液
に溶かした１７．８５ｍＭ Ｎ−（３−スルフォスクシ
ンイミジル）Ｓ‐アセチルメルカプトアセチルグリシル
グリシルグリシネート・ナトリウム塩溶液の５μｌと共
に１−１／２時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。Ｈ
ＰＬＣの結果は抗体−カップリング剤結合物の生成と一
致した。
イミジル）Ｓ−アセチルメルカプトアセチルグリシルグ
リシルグリシネート・ナトリウム塩との結合物の製造 遮蔽されたスルフヒドリル基を含む抗−ＣＥＡ Ｆａｂ
´断片を実施例６に記載したようにして製造した。ｐＨ
５．０および８．０緩衝液（１００ｍＭクエン酸塩／１
００ｍＭ燐酸塩から調製）中の４．５５ｍｇ／ｍｌの抗
−ＣＥＡ Ｆａｂ´溶液２０μｌを、キレート／蛋白質
のモル比が１００／１となるように適当なｐＨの緩衝液
に溶かした１７．８５ｍＭ Ｎ−（３−スルフォスクシ
ンイミジル）Ｓ‐アセチルメルカプトアセチルグリシル
グリシルグリシネート・ナトリウム塩溶液の５μｌと共
に１−１／２時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。Ｈ
ＰＬＣの結果は抗体−カップリング剤結合物の生成と一
致した。
【００３９】実施例１０ 抗体−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物の製造 実施例６に記載された、遮蔽スルフヒドリル基を含む抗
−ＣＥＡ Ｆａｂ´を、２５ｍＭ ＰＯ4 緩衝液，ｐＨ
７．４，中３ｍｇ／ｍｌの最終濃度にして、モル比（キ
レート／蛋白質）２５０／１〜１０／１を与えるような
種々の量の、１００ｍＭ ＮａＰＯ4 ，ｐＨ８．０，中
Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）Ｓ−ベンゾイル
メルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネートナト
リウム塩と反応させた。室温で２時間インキュベーショ
ンを行う。抗体をキレートと共にインキュベーションし
た後、過剰のアシル化試薬をスピン−カラム遠心分離に
よって除去する。４，５−ジヒドロキシ−１，３−ベン
ゼンジズルホン酸（ｔｉｒｏｎ）５０ｍｇ，飽和炭酸水
素ナトリウムでｐＨ７．０に調節した水１ｍｌおよびテ
クネチウム発生機からのＮａ−９９ｍ−ペルテクネテー
ト１ｍｌを含む電解質還元反応バイアルを密封し、５分
間アルゴンでパージ（ｐｕｒｇｅ）した。二本のジルコ
ニウム電極をバイアルに挿入し、バイアルを逆さにし、
１００ボルトで１００ｍＡの電流を２分間溶液に通し
た。生成したＴｃ−９９ｍ−ｔｉｒｏｎ錯化合物をキレ
ート−抗体結合物と共にインキュベートすると、Ｔｃ−
９９ｍ−キレート抗体錯化合物が生成する。
−ＣＥＡ Ｆａｂ´を、２５ｍＭ ＰＯ4 緩衝液，ｐＨ
７．４，中３ｍｇ／ｍｌの最終濃度にして、モル比（キ
レート／蛋白質）２５０／１〜１０／１を与えるような
種々の量の、１００ｍＭ ＮａＰＯ4 ，ｐＨ８．０，中
Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）Ｓ−ベンゾイル
メルカプトアセチルグリシルグリシルグリシネートナト
リウム塩と反応させた。室温で２時間インキュベーショ
ンを行う。抗体をキレートと共にインキュベーションし
た後、過剰のアシル化試薬をスピン−カラム遠心分離に
よって除去する。４，５−ジヒドロキシ−１，３−ベン
ゼンジズルホン酸（ｔｉｒｏｎ）５０ｍｇ，飽和炭酸水
素ナトリウムでｐＨ７．０に調節した水１ｍｌおよびテ
クネチウム発生機からのＮａ−９９ｍ−ペルテクネテー
ト１ｍｌを含む電解質還元反応バイアルを密封し、５分
間アルゴンでパージ（ｐｕｒｇｅ）した。二本のジルコ
ニウム電極をバイアルに挿入し、バイアルを逆さにし、
１００ボルトで１００ｍＡの電流を２分間溶液に通し
た。生成したＴｃ−９９ｍ−ｔｉｒｏｎ錯化合物をキレ
ート−抗体結合物と共にインキュベートすると、Ｔｃ−
９９ｍ−キレート抗体錯化合物が生成する。
【００４０】実施例１１ 抗体−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物およびＩ−125 非特異的Ｆ
ａｂ´断片の生体内分布 ハーリン・スプレーク・ドーリー社（Ｈａｒｌｉｎ Ｓ
ｐｒａｑｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｉｎｃ），インディアナ
ポリス，インディアナから入手した生後１２〜１６週の
スプレーク−ドーリー・ラットで、生体内での研究を行
った。各動物に、モノクローナル抗体、すなわち本発明
の抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物と、ク
ロラミンＴ法によってＩ−125 で標識化した抗−ＣＥＡ
Ｆａｂ´断片との一対を同時注射した。注入物の後者
は、各実験を標準化するためにすべての研究に含まれ
た。注射後２−４時間または１８−２４時間目に動物を
殺し、血液、尿、肝臓および腎臓の二重標識放射性核種
分析をガンマカウンターで行った。試験した第一の抗体
錯化合物は、抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´／Ｎ−（３−スルフ
ォスクシンイミジル）Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチ
ルグリシルグリシルグリシネート・ナトリウム塩／９９
ｍＴｃ錯化合物であった。以下の表ではこの化合物は、
＃１０／ＭＡｂ／Ｔｃとして記される。下のＩ表は、血
液、尿、肝臓および腎臓に残っている放射能の、注射線
量に対するパーセンテージを、時間の関数としてまとめ
たものである。
ａｂ´断片の生体内分布 ハーリン・スプレーク・ドーリー社（Ｈａｒｌｉｎ Ｓ
ｐｒａｑｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｉｎｃ），インディアナ
ポリス，インディアナから入手した生後１２〜１６週の
スプレーク−ドーリー・ラットで、生体内での研究を行
った。各動物に、モノクローナル抗体、すなわち本発明
の抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物と、ク
ロラミンＴ法によってＩ−125 で標識化した抗−ＣＥＡ
Ｆａｂ´断片との一対を同時注射した。注入物の後者
は、各実験を標準化するためにすべての研究に含まれ
た。注射後２−４時間または１８−２４時間目に動物を
殺し、血液、尿、肝臓および腎臓の二重標識放射性核種
分析をガンマカウンターで行った。試験した第一の抗体
錯化合物は、抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´／Ｎ−（３−スルフ
ォスクシンイミジル）Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチ
ルグリシルグリシルグリシネート・ナトリウム塩／９９
ｍＴｃ錯化合物であった。以下の表ではこの化合物は、
＃１０／ＭＡｂ／Ｔｃとして記される。下のＩ表は、血
液、尿、肝臓および腎臓に残っている放射能の、注射線
量に対するパーセンテージを、時間の関数としてまとめ
たものである。
【表１】
【００４１】実施例１２ Ｎ−（３−スルフォスクシンイミジル）２，３−ビス−
（アセチルメルカプトアセタミド）プロピオネートの製
造 無水ジメチルホルムアミド５ｍｌ中２，３−ビス（アセ
チルメルカプトアセタミド）−プロピオン酸（４３１．
７ｍｇ），Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミド（２
９３ｍｇ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（２７８ｍｇ）の混合物を室温で１８時間攪拌し
た。反応混合物をアセトン（１５ｍｌ）で希釈し、濾過
した。その後濾液をエーテル（２００ｍｌ）上に注入
し、沈澱物を濾過し、乾燥した（真空デシケータ）。極
めて吸湿性の大きかった生成物を常時デシケータ中に保
存した。収量３６０ｍｇ。
（アセチルメルカプトアセタミド）プロピオネートの製
造 無水ジメチルホルムアミド５ｍｌ中２，３−ビス（アセ
チルメルカプトアセタミド）−プロピオン酸（４３１．
７ｍｇ），Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミド（２
９３ｍｇ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（２７８ｍｇ）の混合物を室温で１８時間攪拌し
た。反応混合物をアセトン（１５ｍｌ）で希釈し、濾過
した。その後濾液をエーテル（２００ｍｌ）上に注入
し、沈澱物を濾過し、乾燥した（真空デシケータ）。極
めて吸湿性の大きかった生成物を常時デシケータ中に保
存した。収量３６０ｍｇ。
【００４２】実施例１３ 抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´とＮ−（３−スルフォスクシンイ
ミジル）２，３−ビス（アセチルメルカプトアセタミ
ド）−プロピオネートとの結合物の製造 ＣＥＡに対するモノクローナル抗体の二量体断片，Ｆ
（ａｂ´）2 をジチオトレイトールと反応させ、その後
トリチウム化Ｎ−エチルマレイミドでアルキル化してモ
ノマー種、Ｆａｂ´をつくった。それから実施例６に記
載したと同様な結合反応を用いて、抗−ＣＥＡ Ｆａｂ
´とＮ−（３−スルフォスクシンイミジル）２，３−ビ
ス−（アセチルメルカプトアセタミド）プロピオネート
に結合させた。結合物を未反応の対照と平行して、ＡＧ
ＩＥＦによって分析し、生成ゲルを染色し、蛋白質を調
べた。Ｂｉｏｓｃａｎ２００イメージング装置を用い
て、乾燥ゲルの放射能を調ベ、プロットを作成した。未
反応の対照に対して試料の漸増的陽極移動が認められ、
これは結合物の生成に一致した。
ミジル）２，３−ビス（アセチルメルカプトアセタミ
ド）−プロピオネートとの結合物の製造 ＣＥＡに対するモノクローナル抗体の二量体断片，Ｆ
（ａｂ´）2 をジチオトレイトールと反応させ、その後
トリチウム化Ｎ−エチルマレイミドでアルキル化してモ
ノマー種、Ｆａｂ´をつくった。それから実施例６に記
載したと同様な結合反応を用いて、抗−ＣＥＡ Ｆａｂ
´とＮ−（３−スルフォスクシンイミジル）２，３−ビ
ス−（アセチルメルカプトアセタミド）プロピオネート
に結合させた。結合物を未反応の対照と平行して、ＡＧ
ＩＥＦによって分析し、生成ゲルを染色し、蛋白質を調
べた。Ｂｉｏｓｃａｎ２００イメージング装置を用い
て、乾燥ゲルの放射能を調ベ、プロットを作成した。未
反応の対照に対して試料の漸増的陽極移動が認められ、
これは結合物の生成に一致した。
【００４３】実施例１４ 抗体−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物およびＩ−125 非特異的Ｆ
ａｂ´断片の生体内分布 実施例１３でつくられた抗体−カップリング剤結合物
を、実施例８に記載の方法と似た方法でＴｃ−９９ｍと
反応させた。実施例９に記載した方法と似た方法を用い
て、スプレイク−ドーリー・ラットで生体内分布研究を
行い、抗体−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物の２時間−および２
２時間分布を、クロラミンＴ法を用いてＩ−125 標識化
した抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´のそれと比較した。
ａｂ´断片の生体内分布 実施例１３でつくられた抗体−カップリング剤結合物
を、実施例８に記載の方法と似た方法でＴｃ−９９ｍと
反応させた。実施例９に記載した方法と似た方法を用い
て、スプレイク−ドーリー・ラットで生体内分布研究を
行い、抗体−Ｔｃ−９９ｍ錯化合物の２時間−および２
２時間分布を、クロラミンＴ法を用いてＩ−125 標識化
した抗−ＣＥＡ Ｆａｂ´のそれと比較した。
【表２】
【００４４】上記の発明を、明確にし理解する目的で例
証および実施例によって或る程度詳細に説明したが、添
付請求の範囲内で変更および変形が行われ得ることは当
然である。
証および実施例によって或る程度詳細に説明したが、添
付請求の範囲内で変更および変形が行われ得ることは当
然である。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、放射性核種金属イオン
と錯化合物を形成できる生体内での診断および治療に有
用な抗体又はその断片と二官能価カップリング剤の結合
物を提供できる。
と錯化合物を形成できる生体内での診断および治療に有
用な抗体又はその断片と二官能価カップリング剤の結合
物を提供できる。
【図１】（ａ）は、ｐＨ５．０緩衝液を用いて実施例６
でつくられた結合物のＩＥＦゲルのレーザーデンシトメ
ーター走査チャート図、（ｂ）は、ｐＨ６．０緩衝液を
用いて実施例６でつくられた結合物のＩＥＦゲルのレー
ザーデンシトメーター走査チャート図、（ｃ）は、ｐＨ
５．０緩衝液中の未反応リボヌクレアーゼＡ（ＲＮ）12
−Ａ型のＩＥＦゲルのレーザーデンシトメーター走査チ
ャート図である。
でつくられた結合物のＩＥＦゲルのレーザーデンシトメ
ーター走査チャート図、（ｂ）は、ｐＨ６．０緩衝液を
用いて実施例６でつくられた結合物のＩＥＦゲルのレー
ザーデンシトメーター走査チャート図、（ｃ）は、ｐＨ
５．０緩衝液中の未反応リボヌクレアーゼＡ（ＲＮ）12
−Ａ型のＩＥＦゲルのレーザーデンシトメーター走査チ
ャート図である。
【図２】（ａ）は、ｐＨ５．０緩衝液中の未反応モノク
ローナル抗体Ｂ７２．３のＩＥＦゲルのレーザーデンシ
トメーター走査チャート図、（ｂ）は、ｐＨ５．０緩衝
液を用いて実施例５でつくられた結合物のＩＥＦゲルの
レーザーデンシトメーター走査チャート図、（ｃ）は、
ｐＨ８．０で実施例５でつくられた結合物のＩＥＦゲル
のレーザーデンシトメーター走査チャート図、（ｄ）
は、ｐＨ５．０で、キレート／Ｂ７２．３二量体のモル
比１００／１で、実施例５でつくられた結合物のＩＥＦ
ゲルのレーザーデンシトメーター走査チャート図、
（ｅ）は、ｐＨ８．０で、キレート／Ｂ７２．３二量体
のモル比１００／１で、実施例５でつくられた結合物の
ＩＥＦゲルのレーザーデンシトメーター走査チャート図
である。
ローナル抗体Ｂ７２．３のＩＥＦゲルのレーザーデンシ
トメーター走査チャート図、（ｂ）は、ｐＨ５．０緩衝
液を用いて実施例５でつくられた結合物のＩＥＦゲルの
レーザーデンシトメーター走査チャート図、（ｃ）は、
ｐＨ８．０で実施例５でつくられた結合物のＩＥＦゲル
のレーザーデンシトメーター走査チャート図、（ｄ）
は、ｐＨ５．０で、キレート／Ｂ７２．３二量体のモル
比１００／１で、実施例５でつくられた結合物のＩＥＦ
ゲルのレーザーデンシトメーター走査チャート図、
（ｅ）は、ｐＨ８．０で、キレート／Ｂ７２．３二量体
のモル比１００／１で、実施例５でつくられた結合物の
ＩＥＦゲルのレーザーデンシトメーター走査チャート図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｇ０１Ｎ 33/534 Ｇ０１Ｎ 33/534 Ａ６１Ｋ 49/02
Claims (16)
- 【請求項１】 式 【化１】 を有し、ここでＡｂは抗体またはその断片の残基であ
り；Ｒ1 ，Ｒ2 およびＲ3は同じかまたは異なり、各々
が１〜６個の炭素原子を有するアルキル、６〜８個の炭
素原子を有するアリールおよび７〜９個の炭素原子を有
するアルカリルから成る群から選ばれた基であってその
いずれもが１個以上のヒドロキシル、アルコキシ、カル
ボキシまたはスルフォネート基で置換され得る基であ
り；ｎは１または２で；ＡＡは独立的に、アミド結合に
よって互いに結合したα−またはβ−アミノ酸であり；
ｉは２から６までの整数である、抗体結合物。 - 【請求項２】 Ａｂがモノクローナル抗体のＦ（ａｂ
´）2 断片の残基である請求項１記載の抗体結合物。 - 【請求項３】 Ａｂが腫瘍関連抗原に対するモノクロー
ナル抗体のＦａｂ´断片の残基である請求項１記載の抗
体結合物。 - 【請求項４】 ＡｂがＣＥＡに対するモノクローナル抗
体のＦａｂ´断片の残基である請求項１記載の抗体結合
物。 - 【請求項５】 ｉが３または４である請求項１記載の抗
体結合物。 - 【請求項６】 Ｒ1 がメチルまたはフェニルである請求
項５記載の抗体結合物。 - 【請求項７】 Ｒ2 およびＲ3 がいずれもフェニルであ
る請求項１記載の抗体結合物。 - 【請求項８】 Ｒ2 およびＲ3 がいずれもメチルである
請求項１記載の抗体結合物。 - 【請求項９】 生体内での診断または治療に使用するた
めの抗体結合物の製法であって、（ａ）腫瘍関連抗原に
対する抗体からＦｃ断片を酵素的に切断し、Ｆ（ａｂ）
´2 二量体をつくり、（ｂ）Ｆ（ａｂ）´2 二量体を還
元して二つのＦａｂ´断片をつくり、（ｃ）Ｆａｂ´断
片を、式 【化２】 を有し、ここでＲ1 ，Ｒ2 およびＲ3 は同じであるかま
たは異なり、各々が１〜６個の炭素原子を有するアルキ
ル、６〜８個の炭素原子を有するアリールおよび７〜９
個の炭素原子を有するアルカリルから成る群から選ばれ
た基であって、そのいずれもが１個以上のヒドロキシ
ル、またはアルコキシ、カルボキシまたはスルフォネー
ト基で置換され得る基をあらわし；ｎは１または２であ
り、ＡＡは独立的に、アミド基によって互いに連結した
α−またはβ−アミノ酸であり；ｉは２から６までの整
数で；ＸはＦａｂ´断片のε−アミノ基とアミド結合を
形成することができる活性化基であるカップリング剤と
反応させる、ことから成る製法。 - 【請求項１０】 【化３】 から成る群から選ばれたものである請求項９記載の方
法。 - 【請求項１１】 抗体が前活性化パパインによって切断
される請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】 抗体がＣＥＡに対するモノクローナル
抗体である請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】 ｉが３または４である請求項９記載の
方法。 - 【請求項１４】 Ｒ1 がメチルまたはフェニルである請
求項９記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｒ2 およびＲ3 がいずれもフェニルで
ある請求項９記載の方法。 - 【請求項１６】 Ｒ2 およびＲ3 が両方共メチルである
請求項９記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/868,800 US4861869A (en) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | Coupling agents for joining radionuclide metal ions with biologically useful proteins |
| US868800 | 1986-05-29 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62130023A Division JP2571226B2 (ja) | 1986-05-29 | 1987-05-28 | 放射性標識蛋白質のためのカツプリング剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08319299A true JPH08319299A (ja) | 1996-12-03 |
Family
ID=25352342
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62130023A Expired - Lifetime JP2571226B2 (ja) | 1986-05-29 | 1987-05-28 | 放射性標識蛋白質のためのカツプリング剤 |
| JP8095573A Pending JPH08325297A (ja) | 1986-05-29 | 1996-04-17 | 抗体−放射性核種錯化合物及びそれを用いた腫瘍の発見定位方法 |
| JP8095572A Pending JPH08319299A (ja) | 1986-05-29 | 1996-04-17 | 抗体結合物及びその製法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62130023A Expired - Lifetime JP2571226B2 (ja) | 1986-05-29 | 1987-05-28 | 放射性標識蛋白質のためのカツプリング剤 |
| JP8095573A Pending JPH08325297A (ja) | 1986-05-29 | 1996-04-17 | 抗体−放射性核種錯化合物及びそれを用いた腫瘍の発見定位方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0247866B1 (ja) |
| JP (3) | JP2571226B2 (ja) |
| AT (1) | ATE58297T1 (ja) |
| AU (1) | AU629172B2 (ja) |
| CA (1) | CA1333265C (ja) |
| DE (1) | DE3766157D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5175343A (en) * | 1985-01-14 | 1992-12-29 | Neorx Corporation | Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy |
| US5556982A (en) * | 1985-01-14 | 1996-09-17 | Neorx Corporation | Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy |
| US5242679A (en) * | 1985-01-14 | 1993-09-07 | Neorx Corporation | Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy |
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| US5091514A (en) * | 1987-03-26 | 1992-02-25 | Neorx Corporation | Metal-radionuclide-labeled proteins and glycoproteins for diagnosis and therapy |
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| GR1002475B (el) * | 1988-12-05 | 1996-11-26 | Novartis Ag (Novartis Sa) (Novartis Inc.) | Μεθοδος παρασκευης πεπτιδικων παραγωγων. |
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| US5164176A (en) * | 1989-06-16 | 1992-11-17 | Neorx Corporation | Radionuclide metal chelates for the radiolabeling of proteins |
| US5250666A (en) * | 1989-06-16 | 1993-10-05 | Neorx Corporation | Radionuclide metal chelates for the radiolabeling of proteins |
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