JPS6318473B2

JPS6318473B2 -

Info

Publication number: JPS6318473B2
Application number: JP15832684A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Tokiwa; Kyoshi Takeda; Michio Dazai; Akito Tsucha; Koichi Shimotomai; Masahiro Yoshida
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-07-28
Filing date: 1984-07-28
Publication date: 1988-04-19
Also published as: JPS6135784A

Description

【発明の詳細な説明】

再生産が可能なセルロース資源の糖化等の利用
を目指して、セルラーゼ生産能の強い微生物の探
索が盛んに行われている。従来、一般に市販され
ているセルラーゼ標品は、トリコデルマ属やアス
ペルギルス属、イルペツクス属などに属する糸状
菌の生産するセルラーゼである。糸状菌の場合、
セルラーゼ生産のための培養日数が５〜14日と長
いところが欠点である。また、微生物あるいは微
生物の生産する酵素剤等を利用する場合、本来使
用する微生物自体が安全性の高いものであること
が要求される。特に、食品加工の分野においては
使用する微生物の安全性は重要である。現在、我
国では種々の微生物起源の酵素剤が食品加工等に
使用されているが、今後は欧米と同じように、そ
れらを生産する微生物自体の安全性が強く求めら
れるようになると思われる。そこで我々は、安全性の高い微生物による強力
なセルラーゼ標品を短時間の培養で得ることを目
的に、バチルス・ズブチルス（Bacillus
subtilis）によるセルラーゼの生産について鋭意
検討を加えた。その結果、目的にかなうバチル
ス・ズブチルスの変異株Ｃ−12株を得ることがで
きた。すなわち、本発明はバチルス・ズブチルス
の変異株Ｃ−12株を培養し、培養物からセルラー
ゼを採取することを特徴とする微生物によるセル
ラーゼの製造法に関するものである。バチルス・ズブチルスは、古くから醗酵食品に
用いられており安全性の高い細菌である。最近、
その高い安全性が確認されたため、組換えDNA
実験の宿主・ベクター系にも用いられている。バチルス・ズブチルスのセルラーゼ生産に関す
る報告は少ない。東條らは「日本農芸化学会誌」
57（1983）P717〜724に形質転換および突然変異
法によつて作出したバチルス・ズブチルス2633株
がABY培地（１％肉エキス、２％ポリペプトン、
0.4％塩化ナトリウム、0.4％酵母抽出物、10％可
溶性でん粉）でセルラーゼを生産することを発表
しているが、その生産量は十分でなく、また、そ
の性質については何も示されていない。我々は、バチルス・ズブチルスLB−５−Ａ株
（微工研菌寄第5732号）およびLB−５−Ｂ株（微
工研菌寄第5733号）に変異操作を施しセルラーゼ
生産能の強い変異株数株を分離した。そのうち代
表株として変異株Ｃ−12株を用いた。本菌株は微
工研菌寄第7647号として寄託されている。変異操
作としては化学薬剤を用いる方法や放射線・紫外
線を照射する方法、凍結・乾燥法など種々の方法
が用いられる。変異に用いる代表的な薬剤として
は、ニトロソグアニジン、エチルメタスルホン
酸、マイトマイシンＣ、亜硝酸があり、使用する
濃度はそれぞれ５〜2000μg／ml、10〜40mg／ml、
0.1〜300μg／ml、10〜100mMである。その他の
変異誘起物質としては、２−アミノプリン、５−
ブロモウラシル、５−ブロモデオキシウリジン、
エチルエタンスルホン酸、メチルメタンスルホン
酸、アクリジン類、プロフラビン、アクリジンマ
スタード、ヒドロキシルアミン、４−ニトロキノ
リン−１−オキシド等が知られている。また、放
射線では、１〜10万レントゲン（Ｒ）のＸ線、
500〜2000R／時間のγ線、100〜1000エルグ／mm²
の紫外線などが用いられる。変異操作の方法は、
対数増殖期の菌を緩衝液（PH6.0〜PH7.5）中で、
化学薬剤あるいは放射線により１秒〜60分間処理
した後、菌体を洗浄し、必要に応じて２〜24時間
栄養培養液で菌体を生育させる。洗浄後の菌体又
は栄養培養液で生育した菌体を寒天平板を用いて
分離する。分離した株を培養し、親株と比べ培養
力価の高いものを変異株として得た。変異株Ｃ−12株は、培養20〜72時間で強力なセ
ルラーゼを培地中に産生すること、かつ安全性が
高いことから、Ｃ−12株又はそのセルラーゼはセ
ルロース含有物の糖化や糊抜き、セルロース系繊
維の表面加工以外にも、食品工業、飼料医薬方面
などの分野にも広く利用することができる。例え
ば、食品加工の分野では、味噌、醤油等の原料で
ある大豆などの豆類や種々の穀類、お茶の葉、寒
天、人参、玉葱、トマト、甘しよ、みかん等の植
物細胞を柔軟化・破壊し、内容物を抽出しやすく
したり、高濃度セルロース含有物の粘度を低下さ
せるのにＣ−12株のセルラーゼを用いることがで
きる。また、各種の野菜や海藻など繊維質に富む
食品をＣ−12株のセルラーゼで処理し繊維質を柔
軟化させることによつて、料理の味付けや煮焚な
どを促進することができる。クロレラやセネデス
ムスなどの単細胞藻類の消化性の改善にもＣ−12
株セルラーゼは使用できる。さらには、セルロー
ス粉末あるいはカルボキシメチルセルロース等の
食品添加用に利用されているセルロース誘導体に
Ｃ−12株のセルラーゼを作用させて、低カロリー
の水あめを製造し、健康食品などへの用途も考え
られる。一方、変異株Ｃ−12株を直接味噌や納豆
などの原料に生育させ、それらの消化性、栄養
化、風味等改善および製造時間の短縮を行なうこ
とができる。飼料加工においては、変異株Ｃ−12
株あるいはそのセルラーゼを木粉、飼料穀類等に
作用させ、それらの軟化や可溶化を促進すること
により消化率の向上、糖・窒素含量を高め栄養価
の改善ができる。医薬では、Ｃ−12株のセルラー
ゼは単独あるいは他の酵素剤などとの複合で消化
剤として使用できる。以上に示したように、安全
性が高く、かつ、強力なバチルス・ズブチルスの
変異株Ｃ−12株のセルラーゼが開発されたことに
より、従来実用化されなかつた食品加工等の分野
へセルラーゼの用途を拡大する道を開くことにな
る。バチルス・ズブチルスの変異株Ｃ−12株の菌学
的性質を親株のものと共に以下に示す。

【表】

【表】＊培養液１ml当りの単位数
以上の如く、変異株Ｃ−12株は親株と同じ菌学
的性質を示すが、セルラーゼ活性については、同
一培地、同一培養条件で親株に比べ著しく高い値
を示す。当該酵素の生産に使用される培地の炭素源とし
ては、各種のセルロース標品やその誘導体、種々
植物繊維質、セルビオースなどの他に、デキスト
リン、でん粉、小麦ふすま、ガラクトマンナン含
有物など一般的なものも使用できる。窒素源とし
ては、無機アンモニウム塩、硝酸塩、尿素の他に
大豆粉、大豆カゼイン、ミルクカゼインやそれら
の分解物など一般的な有機窒素源も使用できる。
その他に、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カル
シウム、塩化ナトリウムなどの無機塩類を含む培
地が使用される。変異株Ｃ−12株の培養は、液体培養および固体
培養のいずれでも出来、上記の培地を使用して培
養温度20〜40℃、好ましくは30〜37℃で、培養PH
6.0〜8.5、好ましくはPH6.5〜7.5で好気的に培養
すれば、培養20〜72時間でセルラーゼ活性は最高
に達する。当該セルラーゼの活性は、0.625％カルボキシ
メチルセルロース溶液（0.2M緩衝液10％を含む）
４mlに酵素液１mlを加え、PH5.0、反応温度40℃
で30分間反応させ、還元糖の増加をソモギー・ネ
ルソン法で求める方法で測定した。この条件で１
分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生
成する酵素量を１単位とした。培養終了後、培養液を遠心分離、または濾過等
により菌体を分離して得られる培養液は、そのま
ま粗酵素液として使用することもできるが、有機
溶剤や塩析剤で沈でんさせて、強力な活性を有す
る粗酵素剤を得ることもできる。このようにして
得られた粗酵素標品は次のような性質を有する。 (1) 作用カルボキシメチルセルロースをはじめ、結晶セ
ルロースや濾紙粉末等の各種セルロース標品、パ
ルプやバガス等の種々の植物繊維質に作用し、こ
れを溶解せしめグルコース等の還元糖を生成す
る。粗酵素標品の濾紙糖化活性はカルボキシメチ
ルセルロース糖化活性の約1/12である。 (2) 至適PHおよび安定性 40℃における至適PHは７付近である（第１図）。
またPH４〜８の範囲で安定であり、この範囲では
５℃、24時間で90％以上の活性が残存する（第２
図）。 (3) 至適作用温度および安定性 30分反応での至適作用温度は60℃であり、PH
5.0と7.0で差は見られない（第３図）。熱安定性
については、50℃まで安定である（第４図）。 (4) 保存安定性粗酵素液を200倍に希釈し、37℃、PH7.0のリン
酸緩衝液中、８日間で80％の活性が残存している
（第５図）。次に実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１ 0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）でバチルス・ズブ
チルスLB−５−Ａ株（微工研菌寄第5732号）お
よびLB−５−Ｂ株（微工研菌寄第5733号）の菌
体を洗浄した後混合し、30cmの上方から15W紫外
線ランプを10秒間照らし、セルラーゼ生産能の強
い変異株を検索した。紫外線照射の結果、ブイヨ
ン培地に生育するコロニー数は無処理と比べて約
百分の一になつていた。致死率は99.8％であつ
た。多数の変異株を分離した中でＣ−12株（微工
研菌寄第7647号）が特に強いセルラーゼ生産能を
示した。Ｃ−12株をSB培地を用いて、初発PH6.5
に調節し37℃ 24時間液体培養した結果、第１表
に示したような活性値を示した。この24時間培養
の活性値は、バチルス・ズブチルスのセルラーゼ
に関する今までの文献に発表された最高値の約
8.5倍の大きさである。SB培地は、大豆抽出液
（５％大豆を0.015％苛性ソーダ液で蒸煮抽出）１
当り、でん粉30g、小麦ふすま60g、リン酸ア
ンモニウム10g、硫酸マグネシウム0.2g、塩化カ
ルシウム0.2gおよび苛性カリ0.2gを含む。

【表】実施例２変異株Ｃ−12株（微工研菌寄第7647号）を用い
て固体培養によるセルラーゼの生産について検討
した。300ml容三角フラスコに、第２表に示した
ような種々の組成の固型培地10gと無機塩基本液
体培地10mlを加えて均一に混合し、120℃で１時
間殺菌後、前培養液１mlを接種し37℃で48時間培
養を行つた。無機塩基本液体培地は、蒸留水当
り、K₂HPO₄ 3g、KH₂PO₄ 0.4g、MgSO₄・
7H₂O 0.2g、NaCl 0.1g、FeSO₄・7H₂O 0.01g、
（NH₄）₂SO₄ 1g、Na₂M₀O₄ 0.5mg、Na₂WO₄ 0.5
mg、MnSO₄ 0.5mgを含みPH7.5である。固体培養
の粗酵素液は、40℃で風乾させた培養物5gに蒸
留水50mlを加え、40℃ 30分間抽出した後、抽水
液を遠心分離して沈でん物を除き調整した。

【表】実施例３変異株Ｃ−12株（微工研菌寄第7647号）の液体
培養によるセルラーゼ生産において、培地の初発
PHの影響について検討した。実施例２で示した無
機塩基本液体培地当り、大豆抽出物10g、ロー
カストビーンガム10gを含む培地を用い、37℃で
48時間振とう培養を行つた。除菌後の培養液のセ
ルラーゼ活性を第３表に示した。

【表】

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適PHを示す。第２図は本酵
素のPH安定性を示す。第３図は本酵素の至適温度
を示す。第４図は本酵素の熱安定性を示す。第５
図は、37℃PH７における本酵素の保存安定性を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】

１バチルス・ズブチルスの変異株Ｃ−12株を培
養し、培養物からセルラーゼを採取することを特
徴とする微生物によるセルラーゼの製造法。