JPS6135784A - 微生物によるセルラ−ゼの製造法 - Google Patents
微生物によるセルラ−ゼの製造法Info
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- JPS6135784A JPS6135784A JP15832684A JP15832684A JPS6135784A JP S6135784 A JPS6135784 A JP S6135784A JP 15832684 A JP15832684 A JP 15832684A JP 15832684 A JP15832684 A JP 15832684A JP S6135784 A JPS6135784 A JP S6135784A
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- Japan
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- cellulase
- strain
- medium
- culture
- mutant
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
再生産が可能なセルロース資源の糖化等の利用を目指し
て、セルラーゼ生産能の強い微生物の探索が盛んに行わ
れている。従来、一般に市販されているセルラーゼ標品
は、トリコデルマ属やアスペルギルス属、イルペックス
属などに属する糸状菌の生産するセルラーゼである。糸
状菌の場合、セルラーゼ生産のための培養日数が５〜１
４日と長いところが欠点である。また、微生物あるいは
微生物の生産する酵素剤等を利用する場合、本来使用す
る微生物自体が安全性の高いものであることが要求され
る。特に、食品加工の分野においては使用する微生物の
安全性は重要である。現在、に使用されているが、今後
は欧米と同じよう優と、それらを生産する微生物自体の
安全性が強く求められるようになると思われる。
て、セルラーゼ生産能の強い微生物の探索が盛んに行わ
れている。従来、一般に市販されているセルラーゼ標品
は、トリコデルマ属やアスペルギルス属、イルペックス
属などに属する糸状菌の生産するセルラーゼである。糸
状菌の場合、セルラーゼ生産のための培養日数が５〜１
４日と長いところが欠点である。また、微生物あるいは
微生物の生産する酵素剤等を利用する場合、本来使用す
る微生物自体が安全性の高いものであることが要求され
る。特に、食品加工の分野においては使用する微生物の
安全性は重要である。現在、に使用されているが、今後
は欧米と同じよう優と、それらを生産する微生物自体の
安全性が強く求められるようになると思われる。
そこで我々は、安全性の高い微生物による強力なセルラ
ーゼ標品を短時間の培養で得ることを目的に、バチルス
・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）
によるセルラーゼの生産について鋭意検討を加えた。そ
の結果、目的にかなうバチルス・ズブチルスの変異株Ｃ
−１２株を得ることができた。すなわち、本発明はバチ
ルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２株を培養し、培養物
からセルラーゼを採取することを特徴とする微生物によ
るセルラーゼの製造法に関するものである。
ーゼ標品を短時間の培養で得ることを目的に、バチルス
・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）
によるセルラーゼの生産について鋭意検討を加えた。そ
の結果、目的にかなうバチルス・ズブチルスの変異株Ｃ
−１２株を得ることができた。すなわち、本発明はバチ
ルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２株を培養し、培養物
からセルラーゼを採取することを特徴とする微生物によ
るセルラーゼの製造法に関するものである。
バチルス・ズブチルスは、古くから醗酵食品に用いられ
ており安全・性の高い細菌である。最近、その高い安全
性が確認されたため、組換えＤＮＡ実験の宿主・ベクタ
ー系にも用いられている。
ており安全・性の高い細菌である。最近、その高い安全
性が確認されたため、組換えＤＮＡ実験の宿主・ベクタ
ー系にも用いられている。
バチルス・ズブチルスのセルラーゼ生産に関する報告は
少ない。東條らは「日本農芸化学会誌」％酵母抽出物、
１０％可溶性でん粉）でセルラーゼを生産することを発
表しているが、その生産量は十分でな（、また、その性
質については何も示されていない。
少ない。東條らは「日本農芸化学会誌」％酵母抽出物、
１０％可溶性でん粉）でセルラーゼを生産することを発
表しているが、その生産量は十分でな（、また、その性
質については何も示されていない。
我々は、バチルス・ズブチルスＬＢ−５−Ａ株（微工研
菌寄第５７３２号）およびＬＢ−５−Ｂ株（微工研菌寄
第５７３３号）に変異操作を施しセルラーゼ生産能の強
い変異株数株を分゛離した。
菌寄第５７３２号）およびＬＢ−５−Ｂ株（微工研菌寄
第５７３３号）に変異操作を施しセルラーゼ生産能の強
い変異株数株を分゛離した。
そのうち代表法として変異株Ｃ−１２株を用いた。
本菌株は微工研菌寄４７６４７号として寄託されている
。変異操作としては化学薬剤を用いる方法や放射線・紫
外線を照射する方法、凍結・乾燥法など種々の方法が用
いられる。変異に用いる代表的な薬剤としては、ニトロ
ソグアニジン、エチルメタスルホン酸、マイトマイシン
Ｃ１亜硝酸があり、使用する濃度はそれぞれ５〜２００
０μｐ／ｍｔ、−アミノプリン、５−ブロモウラシル、
５−ブロモデオキシウリジン、エチルエタンスルホン酸
、メチルメタンスルホン酸、アクリジン類、プロフラビ
ン、アクリジンマスタード、ヒドロキシルアミン、４−
ニトロキノリン−１−オキシド等が知られている。また
、放射線では、１−１０万レントゲ：／（Ｒ）（ＤＸ線
、５００〜２０００Ｒ／時間）γ線、１００〜１０００
エルグ／ｍｄの紫外線などが用いられる。変異操作の方
法は、対数増殖期の菌を緩衝液（ｐＩ（６，０〜ｐＨ７
，５）中で、化学薬剤あるいは放射線により１秒〜６０
分間処理した後、菌体を洗浄し、必要に応じて２〜２４
時間栄養培養液で菌体を生育させる。洗浄後の菌体又は
栄養培養液で生育した菌体を寒天平板を用いて分離する
。分離した株を培養し、親株と比べ培養力価の高いもの
を変異株として得た。
。変異操作としては化学薬剤を用いる方法や放射線・紫
外線を照射する方法、凍結・乾燥法など種々の方法が用
いられる。変異に用いる代表的な薬剤としては、ニトロ
ソグアニジン、エチルメタスルホン酸、マイトマイシン
Ｃ１亜硝酸があり、使用する濃度はそれぞれ５〜２００
０μｐ／ｍｔ、−アミノプリン、５−ブロモウラシル、
５−ブロモデオキシウリジン、エチルエタンスルホン酸
、メチルメタンスルホン酸、アクリジン類、プロフラビ
ン、アクリジンマスタード、ヒドロキシルアミン、４−
ニトロキノリン−１−オキシド等が知られている。また
、放射線では、１−１０万レントゲ：／（Ｒ）（ＤＸ線
、５００〜２０００Ｒ／時間）γ線、１００〜１０００
エルグ／ｍｄの紫外線などが用いられる。変異操作の方
法は、対数増殖期の菌を緩衝液（ｐＩ（６，０〜ｐＨ７
，５）中で、化学薬剤あるいは放射線により１秒〜６０
分間処理した後、菌体を洗浄し、必要に応じて２〜２４
時間栄養培養液で菌体を生育させる。洗浄後の菌体又は
栄養培養液で生育した菌体を寒天平板を用いて分離する
。分離した株を培養し、親株と比べ培養力価の高いもの
を変異株として得た。
変異株Ｃ−１２株は、培養２０〜７２時間で強力なセル
ラーゼを培地中に産生ずること、かつ安犀栴が高いこと
から、Ｃ−１２株又はそのセルラ医薬方面などの分野に
も広く利用することができる。例えば、食品加工の分野
では、味噌、醤油等の原料である大豆などの豆類や種々
の穀類、お茶の葉、寒天、人参、玉葱、トマト、甘しょ
、みかん等の植物細胞を柔軟化・破壊し、内容物を抽出
しやすくしたり、高濃度セルロース含有物の粘度を低下
させるのにＣ−１２株のセルラーゼを用いることができ
る。また、各種の野菜や海藻など繊維質に富む食品をＣ
−１２株のセルラーゼで処理し繊維質を柔軟化させるこ
とにょうて、料理の味付けや煮焚などを促進することが
できる。クロレラやセネデスムスなどの単細胞藻類の消
化性の改善にもＣ−１２株セルラーゼは使用できる。さ
らには、セルロース粉末あるいはカルボキシメチルセル
ロース等の食品添加用に利用されているセルロース誘導
体にＣ−１２株のセルラーゼを作用すせて、低カロリー
の水あめを製造し、健康食品な堂避５の用途も考えられ
る。一方、変異株ｃ−１２株を直接味噌や納豆などの原
料に生育させ、それらの消化性、栄養化、風味等改善お
よび製造時間の短縮を行なうことができる。飼料加工に
おいては、変異株Ｃ−１２株あるいはそのセルラーゼを
木粉、餌料′Ｒ類等に作用させ、それらの軟化や可溶化
を促進することにより消化率の向上、糖・窒素含量を高
め栄養価の改善ができる。医薬では、Ｃ−１２株のセル
ラーゼは単独あるいは他の酵素剤などとの複合で消化剤
として使用できる。以上に示したように、安全性が高く
、かつ、強力なバチルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２
株のセルラーゼが開発されたことにより、従来実用化さ
れなかった食品加工等の分野へセルラーゼの用途を拡大
する道を開くことになる。
ラーゼを培地中に産生ずること、かつ安犀栴が高いこと
から、Ｃ−１２株又はそのセルラ医薬方面などの分野に
も広く利用することができる。例えば、食品加工の分野
では、味噌、醤油等の原料である大豆などの豆類や種々
の穀類、お茶の葉、寒天、人参、玉葱、トマト、甘しょ
、みかん等の植物細胞を柔軟化・破壊し、内容物を抽出
しやすくしたり、高濃度セルロース含有物の粘度を低下
させるのにＣ−１２株のセルラーゼを用いることができ
る。また、各種の野菜や海藻など繊維質に富む食品をＣ
−１２株のセルラーゼで処理し繊維質を柔軟化させるこ
とにょうて、料理の味付けや煮焚などを促進することが
できる。クロレラやセネデスムスなどの単細胞藻類の消
化性の改善にもＣ−１２株セルラーゼは使用できる。さ
らには、セルロース粉末あるいはカルボキシメチルセル
ロース等の食品添加用に利用されているセルロース誘導
体にＣ−１２株のセルラーゼを作用すせて、低カロリー
の水あめを製造し、健康食品な堂避５の用途も考えられ
る。一方、変異株ｃ−１２株を直接味噌や納豆などの原
料に生育させ、それらの消化性、栄養化、風味等改善お
よび製造時間の短縮を行なうことができる。飼料加工に
おいては、変異株Ｃ−１２株あるいはそのセルラーゼを
木粉、餌料′Ｒ類等に作用させ、それらの軟化や可溶化
を促進することにより消化率の向上、糖・窒素含量を高
め栄養価の改善ができる。医薬では、Ｃ−１２株のセル
ラーゼは単独あるいは他の酵素剤などとの複合で消化剤
として使用できる。以上に示したように、安全性が高く
、かつ、強力なバチルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２
株のセルラーゼが開発されたことにより、従来実用化さ
れなかった食品加工等の分野へセルラーゼの用途を拡大
する道を開くことになる。
バチルスｅズブチルスの変異株Ｃ−１２株の菌学的性質
を親株のものと共に以下に示す。
を親株のものと共に以下に示す。
七陽性 −：陰性 傘培養液１−当りの単位数
−培地、同一培養条件で親株に比べ著しく高い値を示す
。
−培地、同一培養条件で親株に比べ著しく高い値を示す
。
当該酵素の生産に使用される培地の炭素源としては、各
種のセルロース標品やその誘導体、種々植物ａｍ質、セ
ルビオースなどの他に、デキストリン、でん粉、小麦ふ
すま、ガラクトマンナン含有物など一般的なものも使用
できる。窒素源としては、無機アンモニウム塩、硝酸塩
、尿素の他に大豆粉、大豆カゼイン、ミルクカゼインや
それらの分解物など一般的な有機窒素源も使用できる。
種のセルロース標品やその誘導体、種々植物ａｍ質、セ
ルビオースなどの他に、デキストリン、でん粉、小麦ふ
すま、ガラクトマンナン含有物など一般的なものも使用
できる。窒素源としては、無機アンモニウム塩、硝酸塩
、尿素の他に大豆粉、大豆カゼイン、ミルクカゼインや
それらの分解物など一般的な有機窒素源も使用できる。
その他に、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム
、塩化ナトリウムなどの無機塩類を含む培地が使用され
る。
、塩化ナトリウムなどの無機塩類を含む培地が使用され
る。
変異株Ｃ−１２株の培養は、液体培養および固体培養の
いずれでも出来、上記の培地を使用して培養温度２０〜
４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、培養ｐＨ６，０〜
８．５、好ましくはｐＨ６，５〜７．５で好気的に培養
すれば、培養２０〜７２時間温度４０℃で３０分間反応
させ、還元糖の増加をソモギー・ネルラン法で求める方
法で測定した。
いずれでも出来、上記の培地を使用して培養温度２０〜
４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、培養ｐＨ６，０〜
８．５、好ましくはｐＨ６，５〜７．５で好気的に培養
すれば、培養２０〜７２時間温度４０℃で３０分間反応
させ、還元糖の増加をソモギー・ネルラン法で求める方
法で測定した。
この条件で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する
還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
培養終了後、培養液を遠心分離、または濾過等暑こより
菌体を分離して得られる培養液は、そのまま粗酵素液と
して使用することもできるが、有機溶剤や塩析剤で沈で
んさせて、強力な活性を有する粗酵素剤を得ることもで
きる。仁のようにして得られた粗酵素標品は次のような
性質を有する。
菌体を分離して得られる培養液は、そのまま粗酵素液と
して使用することもできるが、有機溶剤や塩析剤で沈で
んさせて、強力な活性を有する粗酵素剤を得ることもで
きる。仁のようにして得られた粗酵素標品は次のような
性質を有する。
（１）作用
カルボキシメチルセルロースをはじめ、結晶セルロース
や濾紙粉末等の各種セルロース標品、バルブやバガス等
の種々の植物繊維質に作用し、これを溶解せしめグルコ
ース等の還元糖を生成する。
や濾紙粉末等の各種セルロース標品、バルブやバガス等
の種々の植物繊維質に作用し、これを溶解せしめグルコ
ース等の還元糖を生成する。
粗酵素標品の濾紙糖化活性はカルボキシメチルセ（２）
至適ｐＨおよび安定性 ４０℃における至適ｐＨは７付近である（第１図）。ま
たｐＨ４〜８の範囲で安定であり、この範囲では５℃、
２４時間で９０％以上の活性が残存する（第２図）。
至適ｐＨおよび安定性 ４０℃における至適ｐＨは７付近である（第１図）。ま
たｐＨ４〜８の範囲で安定であり、この範囲では５℃、
２４時間で９０％以上の活性が残存する（第２図）。
（３）至適作用温度および安定性
３０分反応での至適作用温度は６０℃であり、ｐＨ５，
０と７．０で差は見られない（第３図）。熱安定性につ
いては、５０℃まで安定である（第４図）。
０と７．０で差は見られない（第３図）。熱安定性につ
いては、５０℃まで安定である（第４図）。
（４）保存安定性
粗酵素液を２００＠に希釈し、３７℃、ｐＨ７，０のリ
ン酸緩衝液中、８日間で８０９６の活性が残存している
（第５図）。
ン酸緩衝液中、８日間で８０９６の活性が残存している
（第５図）。
次に実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例１
０２２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）でバチルス・ズブ
チルスＬＢ−５−Ａ株（微工研菌寄第５７３２号）およ
びＬＢ−５−８株（微工研菌寄第５７３３の結果、ブイ
ヨン培地に生育するコロニー数は無処理と比べて約百分
の−になっていた。致死率は９９．８％であった。多数
の変異株を分離した中でＣ−１２株（微工研菌寄第７６
４７号）が特に強いセルラーゼ生産能を示した。Ｃ−１
２株をＳＢ培地を用いて、初発ｐＨ６，５に調節し３７
℃ ２４時間液体培養した結果、第１表に示したような
活性値を示した。この２４時間培養の活性値は、バチル
ス・ズブチルスのセルラーゼに関する今までの文献に発
表された最高値の約８．５倍の大きさである。ＳＢ培地
は、大豆抽出液（５９６大豆を０．０１５％苛性ソーダ
液で蒸煮抽出）１ノ当り、でん粉３０ｔ１小麦ふすま６
０ｆ１リン酸アンモニウム１０ｆ１硫酸マグネシウム０
．２Ｆ、塩化カルシウム０．２ｆおよび苛性カリ０．２
ｇを含む。
チルスＬＢ−５−Ａ株（微工研菌寄第５７３２号）およ
びＬＢ−５−８株（微工研菌寄第５７３３の結果、ブイ
ヨン培地に生育するコロニー数は無処理と比べて約百分
の−になっていた。致死率は９９．８％であった。多数
の変異株を分離した中でＣ−１２株（微工研菌寄第７６
４７号）が特に強いセルラーゼ生産能を示した。Ｃ−１
２株をＳＢ培地を用いて、初発ｐＨ６，５に調節し３７
℃ ２４時間液体培養した結果、第１表に示したような
活性値を示した。この２４時間培養の活性値は、バチル
ス・ズブチルスのセルラーゼに関する今までの文献に発
表された最高値の約８．５倍の大きさである。ＳＢ培地
は、大豆抽出液（５９６大豆を０．０１５％苛性ソーダ
液で蒸煮抽出）１ノ当り、でん粉３０ｔ１小麦ふすま６
０ｆ１リン酸アンモニウム１０ｆ１硫酸マグネシウム０
．２Ｆ、塩化カルシウム０．２ｆおよび苛性カリ０．２
ｇを含む。
第 １ 表
実施例２
変異株Ｃ−１２株（微工研菌寄第７６４７号）を用いて
固体培養によるセルラーゼの生産について検討した。３
００ｍｇ容三角フラスコに、第２表に示したような種々
の組成の固型培地１０ｔＩと無機塩基本液体培地ｌＯ−
を加えて均一に混合し、１２０℃で１時間殺菌後、前培
養液ｉｙを接種し３７℃で４８時間培養を行った。無機
塩基本液体培地は、蒸留水！当り、Ｋ２ＨＰＯ４：ｌ、
ＫＨ？０４０．４ｐ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｆ
、ＮａＣ１Ｏ，１ｌＦｅＳＯ４・７Ｈρ０．０１ ｆｌ
ｓ （ＮＨ４） ４０４１ ｌｌｌＮａ４ｇ０４ Ｇ、
５ Ｍ！？ 、Ｎａ２ＷＯ４０，５岬、ＭｎＳＯ４０，
５岬を含み ｐＨ７，５である。
固体培養によるセルラーゼの生産について検討した。３
００ｍｇ容三角フラスコに、第２表に示したような種々
の組成の固型培地１０ｔＩと無機塩基本液体培地ｌＯ−
を加えて均一に混合し、１２０℃で１時間殺菌後、前培
養液ｉｙを接種し３７℃で４８時間培養を行った。無機
塩基本液体培地は、蒸留水！当り、Ｋ２ＨＰＯ４：ｌ、
ＫＨ？０４０．４ｐ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｆ
、ＮａＣ１Ｏ，１ｌＦｅＳＯ４・７Ｈρ０．０１ ｆｌ
ｓ （ＮＨ４） ４０４１ ｌｌｌＮａ４ｇ０４ Ｇ、
５ Ｍ！？ 、Ｎａ２ＷＯ４０，５岬、ＭｎＳＯ４０，
５岬を含み ｐＨ７，５である。
固体培養の粗酵素液は、４０°０で風乾させた培養筒
２ 表 変異株Ｃ−１２株（微工研菌寄第７６４７号）の液体培
養によるセルラーゼ生産において、培地の初発ｐＨの影
響について検討した。実施例２で示した無機塩基本液体
培地！当り、大豆抽出物ｉ。
２ 表 変異株Ｃ−１２株（微工研菌寄第７６４７号）の液体培
養によるセルラーゼ生産において、培地の初発ｐＨの影
響について検討した。実施例２で示した無機塩基本液体
培地！当り、大豆抽出物ｉ。
ｆ、ローカストビーンガムｌｏｇを含む培地を用い、３
７°０で４８時間振とり培養を行った。除菌後の培養液
のセルラーゼ活性を第３表に示した。
７°０で４８時間振とり培養を行った。除菌後の培養液
のセルラーゼ活性を第３表に示した。
第 ３ 表
第１図は本酵素の至適ｐＨを示す。第２図はほん酵素の
ｐＨ安定性を示す。第３図は本酵素を至適温度を示す。 第４図は本酵素の熱安定性を示す。 第５図は、３７℃ｐＨ７における本酵素の保存安定性を
示す。 第１図至適ｐＨ ８，０４，０６，０６，０７，０８，ＯＨ 第２図 ｐＨ安定性 保存処理溶液ｐＨ 第３固型適温度 温度ω） 第４１熱安定性 温度（至） 処理条件：各温度に３０分保持後残留酵素力を測定 第５図保存安定性 呆存日数
ｐＨ安定性を示す。第３図は本酵素を至適温度を示す。 第４図は本酵素の熱安定性を示す。 第５図は、３７℃ｐＨ７における本酵素の保存安定性を
示す。 第１図至適ｐＨ ８，０４，０６，０６，０７，０８，ＯＨ 第２図 ｐＨ安定性 保存処理溶液ｐＨ 第３固型適温度 温度ω） 第４１熱安定性 温度（至） 処理条件：各温度に３０分保持後残留酵素力を測定 第５図保存安定性 呆存日数
Claims (1)
- バチルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２株を培養し、培
養物からセルラーゼを採取することを特徴とする微生物
によるセルラーゼの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15832684A JPS6135784A (ja) | 1984-07-28 | 1984-07-28 | 微生物によるセルラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15832684A JPS6135784A (ja) | 1984-07-28 | 1984-07-28 | 微生物によるセルラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6135784A true JPS6135784A (ja) | 1986-02-20 |
| JPS6318473B2 JPS6318473B2 (ja) | 1988-04-19 |
Family
ID=15669192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15832684A Granted JPS6135784A (ja) | 1984-07-28 | 1984-07-28 | 微生物によるセルラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6135784A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005099481A1 (ja) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | Yugengaisha Chima | 加工大豆およびその製造方法 |
-
1984
- 1984-07-28 JP JP15832684A patent/JPS6135784A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005099481A1 (ja) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | Yugengaisha Chima | 加工大豆およびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6318473B2 (ja) | 1988-04-19 |
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