JPS6135784A

JPS6135784A - 微生物によるセルラ−ゼの製造法

Info

Publication number: JPS6135784A
Application number: JP15832684A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Tokiwa; 豊常盤; Kiyoshi Takeda; 武田　潔; Michio Dazai; 太宰　宙朗; Akito Tsuchiya; 明人土屋; Koichi Shimotomai; 下斗米　孝一; Masahiro Yoshida; 正浩吉田
Original assignee: RAKUTOU KASEI KOGYO KK; Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: RAKUTOU KASEI KOGYO KK; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-07-28
Filing date: 1984-07-28
Publication date: 1986-02-20
Also published as: JPS6318473B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】再生産が可能なセルロース資源の糖化等の利用を目指し
て、セルラーゼ生産能の強い微生物の探索が盛んに行わ
れている。従来、一般に市販されているセルラーゼ標品
は、トリコデルマ属やアスペルギルス属、イルペックス
属などに属する糸状菌の生産するセルラーゼである。糸
状菌の場合、セルラーゼ生産のための培養日数が５〜１
４日と長いところが欠点である。また、微生物あるいは
微生物の生産する酵素剤等を利用する場合、本来使用す
る微生物自体が安全性の高いものであることが要求され
る。特に、食品加工の分野においては使用する微生物の
安全性は重要である。現在、に使用されているが、今後
は欧米と同じよう優と、それらを生産する微生物自体の
安全性が強く求められるようになると思われる。

そこで我々は、安全性の高い微生物による強力なセルラ
ーゼ標品を短時間の培養で得ることを目的に、バチルス
・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）
によるセルラーゼの生産について鋭意検討を加えた。そ
の結果、目的にかなうバチルス・ズブチルスの変異株Ｃ
−１２株を得ることができた。すなわち、本発明はバチ
ルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２株を培養し、培養物
からセルラーゼを採取することを特徴とする微生物によ
るセルラーゼの製造法に関するものである。

バチルス・ズブチルスは、古くから醗酵食品に用いられ
ており安全・性の高い細菌である。最近、その高い安全
性が確認されたため、組換えＤＮＡ実験の宿主・ベクタ
ー系にも用いられている。

バチルス・ズブチルスのセルラーゼ生産に関する報告は
少ない。東條らは「日本農芸化学会誌」％酵母抽出物、
１０％可溶性でん粉）でセルラーゼを生産することを発
表しているが、その生産量は十分でな（、また、その性
質については何も示されていない。

我々は、バチルス・ズブチルスＬＢ−５−Ａ株（微工研
菌寄第５７３２号）およびＬＢ−５−Ｂ株（微工研菌寄
第５７３３号）に変異操作を施しセルラーゼ生産能の強
い変異株数株を分゛離した。

そのうち代表法として変異株Ｃ−１２株を用いた。

本菌株は微工研菌寄４７６４７号として寄託されている
。変異操作としては化学薬剤を用いる方法や放射線・紫
外線を照射する方法、凍結・乾燥法など種々の方法が用
いられる。変異に用いる代表的な薬剤としては、ニトロ
ソグアニジン、エチルメタスルホン酸、マイトマイシン
Ｃ１亜硝酸があり、使用する濃度はそれぞれ５〜２００
０μｐ／ｍｔ、−アミノプリン、５−ブロモウラシル、
５−ブロモデオキシウリジン、エチルエタンスルホン酸
、メチルメタンスルホン酸、アクリジン類、プロフラビ
ン、アクリジンマスタード、ヒドロキシルアミン、４−
ニトロキノリン−１−オキシド等が知られている。また
、放射線では、１−１０万レントゲ：／（Ｒ）（ＤＸ線
、５００〜２０００Ｒ／時間）γ線、１００〜１０００
エルグ／ｍｄの紫外線などが用いられる。変異操作の方
法は、対数増殖期の菌を緩衝液（ｐＩ（６，０〜ｐＨ７
，５）中で、化学薬剤あるいは放射線により１秒〜６０
分間処理した後、菌体を洗浄し、必要に応じて２〜２４
時間栄養培養液で菌体を生育させる。洗浄後の菌体又は
栄養培養液で生育した菌体を寒天平板を用いて分離する
。分離した株を培養し、親株と比べ培養力価の高いもの
を変異株として得た。

変異株Ｃ−１２株は、培養２０〜７２時間で強力なセル
ラーゼを培地中に産生ずること、かつ安犀栴が高いこと
から、Ｃ−１２株又はそのセルラ医薬方面などの分野に
も広く利用することができる。例えば、食品加工の分野
では、味噌、醤油等の原料である大豆などの豆類や種々
の穀類、お茶の葉、寒天、人参、玉葱、トマト、甘しょ
、みかん等の植物細胞を柔軟化・破壊し、内容物を抽出
しやすくしたり、高濃度セルロース含有物の粘度を低下
させるのにＣ−１２株のセルラーゼを用いることができ
る。また、各種の野菜や海藻など繊維質に富む食品をＣ
−１２株のセルラーゼで処理し繊維質を柔軟化させるこ
とにょうて、料理の味付けや煮焚などを促進することが
できる。クロレラやセネデスムスなどの単細胞藻類の消
化性の改善にもＣ−１２株セルラーゼは使用できる。さ
らには、セルロース粉末あるいはカルボキシメチルセル
ロース等の食品添加用に利用されているセルロース誘導
体にＣ−１２株のセルラーゼを作用すせて、低カロリー
の水あめを製造し、健康食品な堂避５の用途も考えられ
る。一方、変異株ｃ−１２株を直接味噌や納豆などの原
料に生育させ、それらの消化性、栄養化、風味等改善お
よび製造時間の短縮を行なうことができる。飼料加工に
おいては、変異株Ｃ−１２株あるいはそのセルラーゼを
木粉、餌料′Ｒ類等に作用させ、それらの軟化や可溶化
を促進することにより消化率の向上、糖・窒素含量を高
め栄養価の改善ができる。医薬では、Ｃ−１２株のセル
ラーゼは単独あるいは他の酵素剤などとの複合で消化剤
として使用できる。以上に示したように、安全性が高く
、かつ、強力なバチルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２
株のセルラーゼが開発されたことにより、従来実用化さ
れなかった食品加工等の分野へセルラーゼの用途を拡大
する道を開くことになる。

バチルスｅズブチルスの変異株Ｃ−１２株の菌学的性質
を親株のものと共に以下に示す。

七陽性　　　−：陰性　　　傘培養液１−当りの単位数
−培地、同一培養条件で親株に比べ著しく高い値を示す
。

当該酵素の生産に使用される培地の炭素源としては、各
種のセルロース標品やその誘導体、種々植物ａｍ質、セ
ルビオースなどの他に、デキストリン、でん粉、小麦ふ
すま、ガラクトマンナン含有物など一般的なものも使用
できる。窒素源としては、無機アンモニウム塩、硝酸塩
、尿素の他に大豆粉、大豆カゼイン、ミルクカゼインや
それらの分解物など一般的な有機窒素源も使用できる。

その他に、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム
、塩化ナトリウムなどの無機塩類を含む培地が使用され
る。

変異株Ｃ−１２株の培養は、液体培養および固体培養の
いずれでも出来、上記の培地を使用して培養温度２０〜
４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、培養ｐＨ６，０〜
８．５、好ましくはｐＨ６，５〜７．５で好気的に培養
すれば、培養２０〜７２時間温度４０℃で３０分間反応
させ、還元糖の増加をソモギー・ネルラン法で求める方
法で測定した。

この条件で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する
還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

培養終了後、培養液を遠心分離、または濾過等暑こより
菌体を分離して得られる培養液は、そのまま粗酵素液と
して使用することもできるが、有機溶剤や塩析剤で沈で
んさせて、強力な活性を有する粗酵素剤を得ることもで
きる。仁のようにして得られた粗酵素標品は次のような
性質を有する。

（１）作用カルボキシメチルセルロースをはじめ、結晶セルロース
や濾紙粉末等の各種セルロース標品、バルブやバガス等
の種々の植物繊維質に作用し、これを溶解せしめグルコ
ース等の還元糖を生成する。

粗酵素標品の濾紙糖化活性はカルボキシメチルセ（２）
　　至適ｐＨおよび安定性４０℃における至適ｐＨは７付近である（第１図）。ま
たｐＨ４〜８の範囲で安定であり、この範囲では５℃、
２４時間で９０％以上の活性が残存する（第２図）。

（３）至適作用温度および安定性３０分反応での至適作用温度は６０℃であり、ｐＨ５，
０と７．０で差は見られない（第３図）。熱安定性につ
いては、５０℃まで安定である（第４図）。

（４）保存安定性粗酵素液を２００＠に希釈し、３７℃、ｐＨ７，０のリ
ン酸緩衝液中、８日間で８０９６の活性が残存している
（第５図）。

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１０２２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）でバチルス・ズブ
チルスＬＢ−５−Ａ株（微工研菌寄第５７３２号）およ
びＬＢ−５−８株（微工研菌寄第５７３３の結果、ブイ
ヨン培地に生育するコロニー数は無処理と比べて約百分
の−になっていた。致死率は９９．８％であった。多数
の変異株を分離した中でＣ−１２株（微工研菌寄第７６
４７号）が特に強いセルラーゼ生産能を示した。Ｃ−１
２株をＳＢ培地を用いて、初発ｐＨ６，５に調節し３７
℃　２４時間液体培養した結果、第１表に示したような
活性値を示した。この２４時間培養の活性値は、バチル
ス・ズブチルスのセルラーゼに関する今までの文献に発
表された最高値の約８．５倍の大きさである。ＳＢ培地
は、大豆抽出液（５９６大豆を０．０１５％苛性ソーダ
液で蒸煮抽出）１ノ当り、でん粉３０ｔ１小麦ふすま６
０ｆ１リン酸アンモニウム１０ｆ１硫酸マグネシウム０
．２Ｆ、塩化カルシウム０．２ｆおよび苛性カリ０．２
ｇを含む。

第　　１　　表実施例２変異株Ｃ−１２株（微工研菌寄第７６４７号）を用いて
固体培養によるセルラーゼの生産について検討した。３
００ｍｇ容三角フラスコに、第２表に示したような種々
の組成の固型培地１０ｔＩと無機塩基本液体培地ｌＯ−
を加えて均一に混合し、１２０℃で１時間殺菌後、前培
養液ｉｙを接種し３７℃で４８時間培養を行った。無機
塩基本液体培地は、蒸留水！当り、Ｋ２ＨＰＯ４：ｌ、
　ＫＨ？０４０．４ｐ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｆ
、ＮａＣ１Ｏ，１ｌＦｅＳＯ４・７Ｈρ０．０１　ｆｌ
ｓ　（ＮＨ４）　４０４１　ｌｌｌＮａ４ｇ０４　Ｇ、
５　Ｍ！？　、Ｎａ２ＷＯ４０，５岬、ＭｎＳＯ４０，
５岬を含み　ｐＨ７，５である。

固体培養の粗酵素液は、４０°０で風乾させた培養筒　
　２　　表変異株Ｃ−１２株（微工研菌寄第７６４７号）の液体培
養によるセルラーゼ生産において、培地の初発ｐＨの影
響について検討した。実施例２で示した無機塩基本液体
培地！当り、大豆抽出物ｉ。

ｆ、ローカストビーンガムｌｏｇを含む培地を用い、３
７°０で４８時間振とり培養を行った。除菌後の培養液
のセルラーゼ活性を第３表に示した。

第　　３　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨを示す。第２図はほん酵素の
ｐＨ安定性を示す。第３図は本酵素を至適温度を示す。第４図は本酵素の熱安定性を示す。第５図は、３７℃ｐＨ７における本酵素の保存安定性を
示す。第１図至適ｐＨ８，０４，０６，０６，０７，０８，ＯＨ第２図　ｐＨ安定性保存処理溶液ｐＨ第３固型適温度温度ω）第４１熱安定性温度（至）処理条件：各温度に３０分保持後残留酵素力を測定第５図保存安定性呆存日数

Claims

【特許請求の範囲】

バチルス・ズブチルスの変異株Ｃ−１２株を培養し、培
養物からセルラーゼを採取することを特徴とする微生物
によるセルラーゼの製造法