JPS63183598A - 抗生物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、式 〔式中、Ｒは水素、ハロゲン原子、低級アルキル基また
はヒドロキシメチル基を示す〕で表わされる化合物また
はその酸塩の製造法に関する。

本発明者らは、種々研究を重ねた結果、ストレプトヴア
ーテインリウム属に属するミルディオマイシン生産菌を
、式 〔式中、Ｒは水素、ハロゲン原子、低級アルキルまたは
ヒドロキシメチル基を示す〕で表わされる化合物を含有
する培地に培養すると、上記式（Ｉ）で表わされる化合
物（以下、化合物（１）と称することがある。）または
その酸塩が得られること、とりわけＮ−メチル化合物を
３ｍＭ以上含有する培地で培養すると化合物（Ｉ）また
はその酸塩の生成が良好であること、さらに化合物（ｒ
）が優れた植物用殺菌殺ダニ作用を有していることを見
出し、これらに基づいて本発明を完成した。

即ち、本発明は、 （１）ストレプトヴアーテイシリウム属に属するミルデ
ィオマイシン生産菌を、化合物（ＩＩ）を含有する培地
に培養して、培養物中に化合物（Ｉ）またはその酸塩を
生成蓄積せしめることを特徴とする化合物（Ｉ）または
その酸塩の製造法及び（２）Ｎ−メチル化合物を３ｍＭ
以上含有する培地で培養することを特徴とする上記（１
）記載の製造法に関するものである。

２−上記式中、Ｒで示されるハロゲン原子としては、臭
素、塩素、ヨウ素、フッ素が用いられる。また、アルキ
ル基としては、炭素数１ないし４の直鎖状または分枝状
のものが好ましく、たとえばメチル。

エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル
などが繁用される。化合物（Ｉ）中Ｒが水素原子である
ものは、低廉に製造することができ工業生産上有利であ
る。また、本発明の化合物としては、遊離の化合物（Ｉ
）のみならずその酸塩も含まれる。

このような酸塩としては、たとえば塩酸、硫酸、硝酸な
どの無機酸またはたとえばギ酸、酢酸、酪酸などの有機
酸との塩が用いられ、なかでも塩酸、硫酸、ギ酸などと
の塩が好ましい。不整炭素原子を有しているので種々の
立体構造をとりうると考えられるが、本発明の化合物（
Ｉ）はテトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）Ｎｏ、　　４４　。

ＰＰ４２７７−４２８０に記載のミルディオマイシン（
ｍｉ　ｌｄｉｏｍｙｃｉｎ）と同じ立体構造を示す。

化合物（Ｉ）の生産に供されるミルディオマイシン生産
菌としては、放線菌ストレプトヴアーテイシリウム　リ
モファシエンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉ−１
１ｉｕｍ　　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ　）に属する菌株
、とりわけＩＦｏ　　１３５９２（ＦＥＲＭ−Ｐ　　２
５４９）が著名であり〔ザ・ジャーナル・オブ・アンテ
ィバイオティックス（Ｔ　ｈｅ　　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　
　ｏｆＡ　ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、第３１巻第６号　
５１１−５１８頁、１９７８年〕、本発明実施の目的に
もっとも有効に用いられる菌の一例である。このような
放線菌は、一般的性状として蘭学上の性質あるいは生理
学上の性質が容易に変異するので、人工的にも、自然的
にも種々の変異株または種が容易に得られるが、これら
の変異株、変異種も化合物（１）またはその酸塩を生産
する性質を失っていないかぎり本発明の目的に使用する
ことができる。

化合物（１）またはその酸塩の製造に当っては、ミルデ
ィオマイシン生産菌を化合物（ｎ）を含有する培地に培
養して行うが、培地としては、一般に微生物が同化しう
る炭素源、窒素源および無機塩、要すれば微量栄養素、
発育促進因子などの微量有効物質のほかに、化合物（ｆ
ｆ）を添加した培地が用いられる。一般に、炭素源とし
ては、たとえばグルコース、シュクロース、糖蜜、でん
ぷん、デキストリン、グリセリン、ソルビットなどが用
いられ、また窒素源としては、たとえば肉エキス、大豆
粉、コーン・ステイープ・リカー、カゼイン、ペプトン
。

綿実粕などの有機窒素源のほか、アンモニウム塩。

硝酸塩などの無機塩が用いられ、これらは単独もしくは
組合せて使用される。

化合物（ＩＩ）としては、Ｒ＝Ｈの場合すなわちシトシ
ンまたは培地中で分解してシトシンを生成するたとえば
シチジン、シチジル酸などの他、核酸またはその加水分
解物など、あるいはそれらを含む多くの微生物菌体、農
畜水産資源が用いられる。

Ｒ＝ハロゲン原子の場合すなわち５−ハロゲノシトシン
または培地中で分解し５−ハロゲノシトシンを生成する
たとえば５−ハロゲノシチジン、５−ハロゲノシチジル
酸などが用いられる。Ｒ−アルキル基の場合すなわち５
−アルキルシトシンまたは培地中で分解して５−アルキ
ルシトシンを生成するたとえば５−アルキルシチジン、
５−アルキルシチジル酸などが用いられるほか、５−ヒ
ドロキシメチルシトシンまたは培地中でそれを生成する
化合物などが用いられる。化合物（ｎ）を添加する場合
、あるいはこれら化合物（Ｉｆ）を培地中で生成する化
合物などを添加する場合の添加濃度は、・　　　化合物
（ＩＩ）として０．０１〜１．０％（重量／容量）が望
ましいが、さらに望ましくは０．０３〜０．５％（重量
／容量）で用いられる。これらを培地？こ添加する時期
は、培養の開始以前に加えるのが最も有効であるが培養
途中経時に添加しても差支えない。

さらに、化合物（Ｉ）の生成を良好なものとするために
、培地中にＮ−メチル化合物を存在せしめるのがよい。

このようなＮ−メチル化合物としては、分子内にＩない
し４個のメチル基で置換された窒素原子を１個以上有す
る化合物が用いられる。

なかでも、たとえば分子内にメチル基で置換された窒素
原子を１個有するものなどがよく、とりわけ３個のメチ
ル基で置換された窒素原子のトリ＋ メチルアムモニオ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）基ニーＮ（ＣＨ３）３を有する第四アンモニウム塩が
好適である。また培地中で＞Ｎ　　ＣＨ３に変りうるち
の、たとえばＮ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミドなど
も、Ｎ−メチル化合物として用いられる。Ｎ−メチル化
合物の分子量は、通常５０〜１０００好ましくは９０〜
１３０である。水溶性、非水溶性にかがイつらず用いら
れるが、易水溶性のＮ−メチル化合物が利用しやすい。

具体例としては、たとえばＮ−メチル酸アミド、Ｎ−メ
チルアミノ化合物、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−メチルアム
モニウムあるいはＮ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド
などが用いられる。Ｎ−メチル酸アミドとしては、たと
えばＮ、Ｎ−ジメチルアセタミド、Ｎ−メチルアクリル
アミドなどが、Ｎ−メチルアミノ化合物としてはＮ−メ
チル尿素、ｊ、１，３．３−テトラメチル尿素、２−ジ
メチルアミノエタノールなどが、Ｎ−メチルアミンとし
ては、たとえばトリメチルアミン、ジメチルアミンなど
が、またＮ−メチルアムモニウムとしては、たとえばレ
シチン、コリン、ベタイン、テトラメチルアムモニウム
などが有利に用いられる。Ｎ−メチルアムモニウムとり
わけコリン、ベタイン、テトラメチルアムモニウムを用
いた場合に、好結果が得られる。これらのＮ−メチル化
合物は、単独または２種以上を混じて用いてもさしつか
えない。またＮ−メチル化合物の含有物、たとえばベタ
インを含有するてんさい糖蜜、レシチンを含有する大豆
粉またはコリンとレシチンを含有する鶏卵等を多量培地
中に添加し、Ｎ−メチル化合物として３ｍＭ以上含有さ
せる方法も本発明方法に含まれる。培地に含有されるＮ
−メチル化合物の濃度は、用いる微生物の発育を抑制し
ない範囲で適宜選択すればよく、通常３ｍＭ以上含有さ
せられる。望ましくは４ｍＭないし２００ｍＭ、さらに
好ましくは７〜５０ｍＭの添加が効果的であり、２００
ｍＭを越えると効果の伸＝８一 層重が鈍化する。またＮ−メチル化合物を含有する天然
物の添加量は、含有されるＮ−メチル化合物の濃度が前
述の範囲になるように選択すればよいが、従来の添加量
を越える多量を用いることになるので、天然物の単独添
加では他の成分の影響により微生物の発育が著しく影響
をうけ、ミルディオマイシンの生産が阻害される場合も
あり、その場合にはＮ−メチル化合物を併用するのがよ
い。

また、これらのＮ−メチル化合物を培地に含有させる時
期は、培地に微生物を接種する以前に添加するのが最も
容易かつ効果的な方法であるが培養の間に適宜添加する
こともできる。

培養は表面培養法によってもよいが、通常、深部通気培
養法によるのが合理的である。深部培養法による場合、
培地の液性は微酸性ないし微アルカリ性がよく、また培
養の温度は１５〜４０℃、とりわけ２４〜ｂ し、これらの培養条件は、使用する菌株の種類や外部の
条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜、
選択することは言うまでもない。通常４日〜１４日培養
すれば、化合物（１）を著量含有する培養液が得られる
が、培養液からこの化合物（丁）を採取するには、微生
物の代謝産物をその培養液から採取ずろのに通常用いら
れる分離、採取の手段が適宜使用される。たとえばこの
化合物（Ｄは水溶性塩基性の物質で主として培養液中に
含まれるので、まずろ過、遠心分離などの手段で菌体を
除去する。得られた上清液を適当な吸着剤、たとえば活
性炭、吸着性樹脂、陽イオン交換樹脂。

活性アルミナ、シリカゲルあるいは分子篩の如き吸着剤
と接触させて目的物質を吸着させたのち、たとえばアセ
トン、メタノール、エタノール、プロパツール、ブタノ
ールなどの水溶性有機溶媒の含水液、あるいは酸、アル
カリ、緩衝液もしくは無機塩、存機塩の水溶液を溶剤と
して、目的物質を溶離することかできる。これらの分離
手段を適宜組合せて実施したのち、有効画分を濃縮、粉
末化を行えば、化合物（’Ｉ）を遊離の状態もしくは塩
の状態で採取することができる。

なお、原料として用いられる化合物（ｎ）は、たとえば
ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイ
エティ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅＡｍｅｒ
ｉｃａｎ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔｙ）第
５６巻１３４頁〜１３９頁およびジャーナル・オブ・ラ
ベルド・コンパウンド（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｌ
ａｂｅｌｌｅｄＣｏｍｐｏｕｎｄｓ）第９巻３号４７５
頁〜４８２頁などに記載されている方法またはそれに準
じた方法により製造できる。

本発明の植物用殺菌殺ダニ剤には、化合物（Ｉ）を有効
成分として含有せしめる。

化合物（１）は、単独でも、あるいは植物に適用されう
るその他の薬剤と共存させてもよい。

剤型としては、公知の植物用殺菌剤の種々の剤型を適宜
採用しうる。たとえば、液状担体（たとえば溶剤）に溶
解するかあるいはこれに分散させ、または適当な固体担
体（たとえば希釈剤、増量剤）と混合するかあるいはこ
れに吸着させ、所要の場合はさらにこれらにたとえば乳
化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、粘漿
剤、安定剤などを添加し、油剤、乳剤、水和剤、粉剤、
錠剤、＝１１＝ 粒剤、噴霧剤などの剤型として使用する。

主要有効成分（＋）の濃度は、乳剤、水和剤などとして
は１〜７０％程度が適当であり、油剤、粉剤などとして
は、０．０１−１０％程度が適当であるが使用目的によ
ってはこれらの濃度を適宜変更してもよい。なお、乳剤
、水和剤などは使用に際して水などで適宜希釈、増量（
たとえば１００〜ｒｏｏｏｏ倍）して撒布するのがよい
。

本発明の植物用殺菌殺ダニ剤に使用する溶剤には、たと
えば水、アルコール類（たとえばメチルアルコール、エ
チルアルコール、エチレングライコールなど）、エーテ
ル類（たとえばジオキサン、テトラハイドロフラン、セ
ロソルブなど）、脂肪族炭化水素類（たとえばガソリン
、ケロセン、灯油、燃料油、機械油など）、芳香族炭化
水素類（たとえばベンゼン、トルエン、キシレン、ソル
ベントナフザ、メチルナフタレンなど）やその他有機塩
基類（たとえばピリジン、アルデヒドコリジンなど）、
ハロゲン化炭化水素類（たとえばクロロホルム、四塩化
炭素など）、酸アミド類（たとえばジメチルホルムアミ
ドなど）、エステル類（たとえば酢酸エチルエステル、
酢酸ブチルエステル、脂肪酸のグリセリンエステルなど
）、ニトリル類（たとえばアセトニトリルなど）などの
溶媒が適当であり、これらの１種または２種以上の混合
物を使用する。

希釈、増量剤としては植物性粉末（たとえば大豆粉、タ
バコ粉、小麦粉、木粉など）、鉱物性粉末（たとえばカ
オリン、ベントナイト、酸性白土などのクレー類、滑石
粉、ロウ石粉などのタルク類、珪藻土、雲母粉などのシ
リカ類など）、さらにアルミナ、硫黄粉末、活性炭など
も用いられ、これらの１種または２種以上の混合物を使
用する。

また、乳化剤、展着剤、浸透剤、分散剤などとして使用
される界面活性剤としては、たとえば石けん類、高級ア
ルコールの硫酸エステル、アルキルスルホン酸、アルキ
ルアリールスルホン酸、第４級アンモニウム塩、オキシ
アルキルアミン、脂肪酸エステル、ポリアルキレンオキ
サイド系、アンヒドロソルビトール系等が広く使用され
うる。

また、必要に応じてカゼイン、ゼラチン、でん粉、アル
ギン酸、寒天、ポリビニルアルコール、松根油、糠油、
ベントナイト、クレゾール石けん等を用いることもでき
る。

また、化合物（Ｉ）以外に他種の殺菌剤（たとえば銅系
殺菌剤、水銀系殺菌剤、有機イオウ系殺菌剤、フェノー
ル系殺菌剤など）、除草剤、殺虫剤（有機塩素系殺虫剤
、有機リン系殺虫剤、天然殺虫剤など）その他殺ダニ剤
、殺線虫剤、植物生長調整剤、共力剤、誘引剤、忌避剤
、香料、植物栄養剤、肥料などを配合し、混合使用する
こともできる。

本発明の植物用殺菌殺ダニ剤の使用量あるいは他種の薬
剤との混合の組み合わせおよびこれらの配合比などは、
適用作物の種類、生育段階、生育状況、栽培方法、疾病
の種類、発病の状態、薬剤の施用の時期およびそれに伴
う環境条件、施用方法、薬剤の経済的使用などの諸条件
によって異なるが、普通ｌＯアール当たり１〜３００ｇ
程度でもよい。使用濃度としては本発明の化合物（Ｉ）
を含有した終末濃度が１μｇ／ｙｄ〜］Ｏｍｇ／滅の範
囲であるのが適当である。又、本発明の殺菌殺ダニ剤の
使用方法としては、直接作物の表面に散布あるいは土壌
に潅注してもよい。

すなわち、作物に安全かつ有効に使用されるならばそれ
がどのような使用量、使用濃度または使用方法であろう
と本発明になんらの制約を加えるものではない。

本発明の方法によって得られる化合物（Ｉ）またはその
酸塩は例えば植物用殺菌殺ダニ剤として用いられ、種々
の植物の疾病に有効で、さらに殺ダニ効果も併有する有
用なものである。たとえば、食用作物（例、オオムギ）
、時用作物（例、タバコ）、果樹（例、リンゴ）、林木
（例、アラカシ）、野菜（例、キウリ、マクワウリ、ピ
ーマン、トマト）、花弁（例、バラ）などのうどんこ病
、たとえばトマト。

ジャガイモ等の疾病に対し特に有効である。そして、毒
性（例、急性毒性、眼粘膜および皮膚刺激作用、魚毒等
）も何ら問題はなく、極めて安全なものである。

一１ｂ＝ 実施例１ ２ρ容坂ロフラスコにグルコース１％、酵母エキス０．
３％、ペプトン０．５％（重量／容量）からなる培地５
００Ｍｌを２０％苛性ソーダ水溶液でｐＨ７に調整した
後に分注、滅菌し、これにストレプトパーティシリウム
・リモファシエンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔＯＶｅｒｔｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ　　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）　Ｉ　Ｐ　Ｏ
＋３５９２（ＦＥＲＭ−Ｐ　　２５４９）の斜面培養物
を接種したのち、２８℃で４８時間往復振盪培養機上で
培養した。５０σ容発酵槽にグルコース１０％、プロフ
ロ（トレーラーズ社製）３％、コーンステイープリカー
１％、食塩０，５％、炭酸カルシウム０．５％、第１硫
酸鉄０００１％、消泡剤（アクトコール、武田薬品製）
０．０５％（重量／容量）からなる培地３０ρを２０％
苛性ソーダ水溶液でｐＨ７に調整、滅菌し、先に培養し
た坂ロフラスコ培養液５００滅を接種、通気量ＩＶＶＭ
（単位液容量当りの毎分の通気容量）、攪拌回転数１０
　Ｏｒｐｍで２８℃、４８時間培養して種培養とした。

２００Ｑ容発酵槽にシトシン１．ＯＯｇを加え＝１６− た上記種培地１００ρを調製、滅菌したのち、上記種培
養１０Ｉ２を移植し、通気量０．５ＶＶＭ、攪拌回転数
２０　Ｏｒｐｍ、温度２８℃で５日間培養した。

かくして得られた培養液から３０ｇをとり、これに水２
０Ｉ２とハイフロスーパセル（ジョンズ・マンビル社製
）１ｋｇを加えてろ過し４５Ｑ、のる液を得、これを６
Ｑのクロマトグラフィー用活性炭（武田薬品製）を充填
したカラムに通液した。カラムを２０１２の水で洗った
のち、７％イソブタノール水３０Ｉ２を用いて溶出し、
有効画分を集め６１２のイオン交換樹脂、アンバーライ
トＪ　ＲＣ５，０（ローム・アンド・ハース社製）Ｈ型
のカラムに通じて、カラムを２０σの水で洗浄後、２％
アンモニア水で溶出した。溶出液の有効画分を集めて、
減圧下に濃縮し０．４Ｑの濃縮液を得、含まれる不溶物
をろ去した。ろ液を３．５１２のエタノール中に滴下し
、生じた沈澱を集め、乾燥するとＲ＝Ｈの化合物（１）
の粗粉末１５ｇが得られた。

実施例２ 実施例１で得た化合物の粗粉末５ｇを水３０滅に溶解し
、これをイオン交換樹脂アンバーライトＣ（、−５０（
ローム・アンド・ハース社製）１ｇを充填し、０，３Ｍ
ホウ酸リチウム緩衝液（ｐＨ８、８）で緩衝化したカラ
ムに通じ、ついで同緩衝液を用いて、有効画分を流出し
た。得られた有効画分を５０−のクロマトグラフィー用
活性炭（武田薬品製）のカラムに通じて吸着させ、２０
０ｄの水でカラムを洗った後、５％イソブタノール水で
溶出した。有効画分を集めて減圧下に濃縮し、濃縮液を
エタノール中に滴下して沈澱を析出させた。この沈澱を
集めて乾燥したところ１．２ｇのＲ−Ｈの化合物（Ｉ）
が得られた。

実施例３ 実施例Ｉで得た化合物の粗粉末４ｇを水に溶解し、イオ
ン交換樹脂アンバーライトＣＧ−５０１，８ｆ２のカラ
ムを用いて、実施例２と同様にクロマトグラフィーを行
い有効画分を集めた。これを４０ｇのクロマトグラフィ
ー用活性炭のカラムに通液して吸着させ、１５０ｇの水
で洗浄したのち、０５％ギ酸を含む２０％アセトン水（
いずれも重量／容量）で溶出し、有効画分を集め、これ
を減圧下に濃縮して、エタノール中に滴下した。析出し
た沈澱を集めて乾燥し、Ｒ＝Ｈの化合物（１）のギ酸塩
１．０ｇを得た。このものの代表的理化学的性状は次の
通りであった。

融点　２２７℃（分解） 旋光度　［α冷−＋７１．３°（ｃｍ０．５．水）Ｈ２
Ｏ− 紫外部吸収　λ　　−２６８ｎｍ、　Ｅ　”　＝　１６
３ｍａｘ　　　　　　　ｌ　ｃｍ 元素分析値　Ｃ＝３９．１２％、　Ｈ＝６．４７％。

Ｎ＝１８．’９３％ 実施例４ 実施例１の方法で培養するとき、培地にシトシンを下表
１に記載の種々の濃度で添加した場合、Ｒ−Ｈの化合物
（Ｉ）は表１の生成量で得られた。

シトシン添加濃度　　　Ｒ＝Ｈの化合物（Ｉ）０．０１
　　　　　　　　２５０ ０．０５　　　　　　　１０５０ ０．１　　　　　　　　１６５０ ０．２　　　　　　　　１２００ 実施例５ 実施例１と同様の方法でストレプトノく−テイシリウム
、リモ７７シエンス（Ｓ　ｔｒｅｌ）ｔｏｖｅｒｔｉ−
ｃｉｌｌｉｕｍ　　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）　Ｉ　Ｆ
　０　１３５９２　（Ｆ　ＥＲＭ−Ｐ　　２５４９）を
種菌としてタンク培養を実施するが、実施例１では２０
０ρ容発酵槽にシトシンを添加したのに対し、本実施例
では５−ブロモシトシンを１００ｇ添加した。

実施例１と同様な条件で２００ρ容発酵槽を用いる培養
を実施し、およそ１００ρの培養液を得た。かくして得
られた培養液から３０１２をとり、これに水２０１２と
ハイフロスーパセル（ジョンズ・マンビル社製）１ｋｇ
を加えてろ過４５ρのろ液を得、これを６１２のクロマ
トグラフィー用活性炭（武田薬品製）を充填したカラム
に通液した。カラムを２０Ｃの水で洗ったのち、７％イ
ソブタノール水３０ｉ２をを用いて溶出し、有効画分を
集め、６ｇのイオン交換樹脂、アンバーライトＪＲＣ−
５０（ローム・アンド・ハース社製）Ｈ型のカラムに通
じて、カラムを２０Ｑの水で洗浄後、２％アンモニア水
で溶出した。溶出後の有効画分を集めて減圧下に濃縮し
０．４ａの濃縮液を得、含まれる不溶物をろ去した。ろ
液を３．５Ｃのエタノール中に滴下し、生じた沈澱を集
め、乾燥すると粗粉末１０．５ｇが得られた。この粗粉
末５ｇを実施例２と同様の方法で再精製を行ったところ
１．８ｇのＲ＝Ｂｒの化合物（Ｔ）が得られた。

実施例６ 実施例Ｉと同様な方法でストレプトパーティシリウム・
リモファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉ−ｃｉｌ
ｌｉｕｍ　　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ１
３５９２（Ｆ’　ＥＲＭ−Ｐ　　２５４．９）を種菌と
してタンク培養を実施するが、実施例１で添加されるシ
トシンの代りに、本実施例においては５−メチルシトシ
ンを１００ｇ添加した。

実施例１と同様な条件で２００ρ容発酵槽を用いる培養
を実施し、およそ１００ρの培養液を得た。かくして得
られた培養液から３００．をとり、実施例５で示した精
製法と同様な精製操作を実施し、Ｒ＝　ＣＨ３の化合物
（１）粉末１．５ｇが得られた。

上記の実施例２，５．６で得られた遊離型の化合物（Ｉ
）は次の諸性質を示した。

（１）溶解性 水に易溶であるが、その他の有機溶媒には難溶である。

（２）呈色反応 坂口反応、過マンガン酸カリウム試薬反応は陽性、フタ
ール酸・アニリン試薬、ニンヒドリン試薬反応は疑陽性
、エーリッヒ反応、ドラーゲンドルフ反応、バートン反
応は陰性である。

（３）薄層クロマトグラフィー 実施例２，５．６で得られた化合物の薄層クロマトグラ
フィーＲｆ値は表２に一括して示した。

表２　薄層クロマトグラフィーＲｆ値 火：溶媒１〜４は次の混合溶媒を示す。

溶媒ｌ；ｎ−プロパツール・水（３ニア）溶媒２；メタ
ノール：水（４：６） 溶媒３；クロロポルム：メタノール＝１７％アンモニア
水（２・２：１）の上層 溶媒４；ｎ−プロパツール：ピリジン：氷酢酸：水（＋
　５：ｌ　Ｏ：３：１０） （４）融点 いずれの化合物も２３０℃付近より徐々に炭化し、明瞭
な融点を示さない。

（５）比旋光度 一括して表３に示した。

表３　比旋光度 （６）含有元素および元素分析値 一括して表４に示した。それぞれの化合物の元素分析値
が示されているが、実測値はほとんど計算値と一致した
。

（７）紫外部吸収スペクトラム 水、１／１０　Ｎ　ＮａＯＨ，１／１０　Ｎ　ＨＣＱを
それぞれ溶剤とした場合のスペクトラムを得、その極１
％ 大値λ　　および水を溶媒としたときのＥ１ｃｍａｘ を表５に一括して示した。

１％ 表５　紫外部吸収極大値とＥｌｃｍ （８）核磁気共鳴スペクトラム 重水中で測定した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムから得ら
れるδ値（ｐｐｍ）を表６に示した。

（以　下　余　白） 表６　　Ｉ３０−ＮＭＲスペクトラムδ値（ｐｐｍ）（
９）高速液体クロマトグラフィー カラム；内径２　、　］　ｍｍＸ’４５０　ｍｍ、充填
剤１日立イオン交換樹脂１２６　］　０．移動槽、０．
３Ｍホウ酸リチウム緩衝液（ｐＨ９，０２）を用い、温
度４５℃、圧力９０〜Ｉ　ｌ　Ｏｋｇ／ｃｍ２．流速０
　、６　ｔ、７１／　ｍｉｎてクロマトグラフィーを行
い、２５４．　ｎｍの吸収を検出するとき、実施例２の
化合物の保持時間は９．５分、実施例５の化合物の保持
時間は１２．５分、実施例６の化合物の保持時間は１０
．５分である。

（１０）生物活性 寒天希釈法（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ）による化合物（Ｉ）
の抗菌スペクトラムは表７に示すとおりである。すなわ
ち、化合物（１）はある種の細菌、植物病原性真菌、一
部の酵母などに対して抗菌力を示すことがわかる。とく
に実施例５の化合物は一部の細菌に対して著しく強い抗
菌活性を示した。

く ｆｉ へ で 区 堀 來 検定培地 Ａ：ンヨ糖３．０％、Ｌ−アスパラギン０．２％。

ＮＨ４ＮＯ３０，３％、Ｋ）（、Ｐｏ、　　０．１％。

Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ３００，１％、ヴエルセノール（ダウ
・ケミカル社製鉄キレート化合物、アイアン・ソディウ
ム：エタノール・エチレンディアミントリアセテート５
７．０４％含有）０．００１％、粉末寒天１５％（ｐＨ
７） 使用前に下記のビタミンをそれぞれ記載した最終濃度と
なるように培地に添加する。

サイアミンＩ　Ｂ　ｇ／７ｎ１．リボフラビンＩμｇ／
７ｎ１゜パントテン酸カルシウム１μｇ／ｙｄ　、ニア
シンＩμｇ／滅、ビオヂン０．００５μｇ／旋１葉酸０
．５μｇ／＋Ｊ、ピリドキンン塩酸塩２μｇ／Ｍｌ、パ
ラアミノ安息香酸０．５μｇ／ｙＪ、ジアノコバラミン
０．０００２μｇ／πＪ Ｂ：エールリッヒ肉エキス０．５％、ポリペプトン０．
５％、ＮａＣ（７０，５％、粉末寒天１５％（１）Ｉ−
１７） Ｃ：グリセリン３．０％、エールリッヒ肉エキス０．５
％、ポリペプトン０．５％、ＮａＣＱＯ６５％、粉末寒
天１．５％（ｐＨ７）（１１）毒性 実施例２，５．６の化合物についてのマウスを用いた急
性毒性は、いずれも次のとおりである。

Ｌ　Ｄ　ｓｏ　　（ｍｇ／ｋｇ）　　静脈注射　　〉１
００腹腔内投与　〉２００ 皮下投与　　〉２００ 実施例７ 実施例１と同様に、ストレプトパーティシリウム・リモ
ファシエンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉ
ｕｍｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）ＩＰＯ１３５９２（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ２５４９）を接種し、種培養液を得る。グルコ
ースＩＯ％、綿実胚芽粉（商品名プロフロ、トレーラー
ズ社製）３％、コーンステイープリカー１％。

食塩０．５％、炭酸カルシュラム０．５％、第一硫酸鉄
０．００１％、消泡剤（商品名アクトコール、底円薬品
製）０．０５％（重量／容量）の組成を有する培地を基
本培地としてこれに以下述べる各種の添加物を加え、２
０％苛性ソーダ水溶液でｐＨ７に調整したのち２５成ず
つ２００成容三角フラスコに分注する。表８に示すごと
くに、化合物（ＩＩ）におけるＲ−１（、Ｂ　ｒ、　　
ＣＨ３，Ｉ　　に相当、する４種の化合物をそれぞれ添
加し、おのおのの場合にＮ−メチル化合物としてコリン
を添加する場合はまた添加しない場合を設定し、計８種
の培地を作成する。種培養液１旙を各８種の培地に移植
し、２８℃、５日間、ロータリーシェーカー上（回転速
度２０　Ｏｒｐｍ）で培養する。培養液を５０００ｇの
条件で遠心分離し、菌体を険き、上清液を得、これを５
０倍希釈して高速液体クロマトグラフィーに供し、培養
液中の生成物、すなわち化合物（ＩＩ）におけるＲ　＝
　Ｈを添加した場合は、化合物（１）（Ｒ＝Ｈ）、化合
物（Ｂ）における３＝Ｂｒを添加した場合は化合物（Ｉ
　ＸＲ＝　Ｂ、ｒ）、化合物（ＩＩ）におけるＲ＝ＣＨ
３を添加した場合は化合物０）（Ｒ＝ＣＨ３）、化合物
（ＩＩ）におけるＲ−Ｉを添加した場合は化合物（ＩＸ
Ｒ＝Ｉ）をそれぞれ以下述べる方法で定量する。

陽イオン交換樹脂、　日立２６ＩＯを４−５ｃｍのカラ
ムに充填し、高速液体クロマトグラフィー装置（ウォー
ターズ社製、６０００Ａ型）に設置し、４５℃にカラム
を保温しつつ、毎分０．６雁の速度で０．３Ｍホウ酸−
水酸化リチウム緩衝液（ｐＨ９，０２）を流出させる。

これに培養希釈液２５μρを注入すると、化合物（１）
（Ｒ＝Ｈ）は９．５分、化合物（ＩＸＲ＝Ｂｒ）は１２
．５分、化合物（Ｄ（Ｒ−＝　ＣＨ３）は１０００分、
化合物（ＩＸＲ−１）は２０．５分の保持時間で流出さ
れ、ＵＶ検出器に２５４−　ｎｍの紫外部波長吸収が検
出され、自記記録装置に記録される吸収曲線極大値より
定量される。

（以　下　余　白） 表８　Ｎ−メチル化合物（コリン）の効果７　高速液体
クロマトグラフィーにより、化合物（１）の２５４−　
ｎｍ紫外部吸収曲線極大値から算出した定量値 樹脂：日立２６ＩＯ陽イオン交換樹脂、カラム長さ　４
５ｃｍ、カラム保温１４５°Ｃ１溶出液：０．３Ｍホウ
酸−水酸化リチウム緩衝液（ｐＨ９，０２）流出速度：
毎分０．６ｄ この条件で生成物の高速液体クロマトグラフィー、保持
時間は次のとおりである。生成物、化合物（Ｉ）（それ
ぞれＲ＝Ｈ，Ｂｒ、ＣＨ３および■）Ｒ＝Ｈ９，５分；
　Ｒ＝Ｂｒ　　］　２’、５分、　Ｒ＝ＣＨ３１０，５
分、Ｒ＝Ｉ　　、２’０．５分実施例８ 実施例７と同様な方法で、コリンの代りにＮ−メチル化
合物として、トリメチルアミンを用い、その添加効果を
測定しその結果を表９に示した。

表９　　Ｎ−メチル化合物（トリメチルアミン）の効果
′　高速液体クロマトグラフィーにより、化合物（Ｉ）
の２５４ｎｍ紫外部吸収曲線極大値から算出した定量値 条件は実施例７に記載されるものに準じる。

実施例９ 実施例１と同様に、ストレプトパーティシリウム・リモ
ファシエンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉ
ｕｍｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）ｒ　ＦＯＩ　３５９２（
ＦＥＲＭ−Ｐ２５４９）を接種し、種培養液を得る。２
００ｇ容三角フラスコに、グルコース１０％、綿実胚芽
粉（商品名プロフロ、トレーラーズ社製）３％、コーン
ステイープリカーＩ％、食塩０．５％、炭酸カルシュラ
ム０．５％、第一硫酸鉄０．００１％、消泡剤（商品名
アクトコール、底円薬品製）０．０５％（重量／容量〕
の組成を有する培地２５顧を２０％苛性ソーダ水溶液で
ｐＨ７に調整し分注して、これを基本培地とする。表Ｉ
Ｏに示すごとくに、化合物（ｎ）におけるＲ＝ＣＨ２０
Ｈに相当するもの、すなわち５−ヒドロキシメチルシト
シンを添加物として、これを添加する場合と添加しない
場合の培養比較試験をした。種培養液１滅を移植したの
ち、２８℃、５日間、ロータリーシェーカー上（回転速
度２０　Ｏｒｐｍ）で培養し、生成物である化合物（Ｉ
）におけるＲ＝ＣＨ，ＯＨに相当する化合物、すなわち
ミルディオマイシン（テトラヘドロン争しターズ、Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　　Ｎ。

４４．４２７７−４２８０（１９７８）に記載の化合物
に相当する）を実施例８と同様な方法で高速液体クロマ
トグラフィーにより定量した。ミルディオマイシンは本
条件の高速液体クロマトグラフィーでは保持時間５．６
分に検出され、定量結果を表１０に示した。

６　高速液体クロマトグラフィーによりミルディオマイ
シン紫外部（２５４ｎｍ）吸収曲線極大値から算出した
定量値。条件は実施例７に記載されたものに準じる。

実施例１０ 実施例２の化合物１０部、リグニンスルホン酸ナトリウ
ム２部、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル
３部およびクレイ８５部を混合して水和剤を得る。末剤
を水で５００倍〜１０００倍に希釈してＩＯａ当り１０
０〜２００ｆｆの割合で農園芸作物に均一に噴霧する。

実施例１１ 実施例２の化合物０．５部およびクレイ９９．５部を混
合して粉剤を得る。本則をｌＯａあたり３〜５ｋｇ直接
に散布する。

実施例１２ 実施例３の化合物１０部、ポリオキシエチレンアルキル
アリールエーテル５部および乳糖８５部を混合攪拌して
水溶剤とし水で所望濃度に稀釈して１０ａ当り１００ａ
農園芸作物に均一に散布する。

実施例１３ 実施例５の化合物５０部１メタノール５部、アミンステ
アレート５部および水４０部を混合してなる水溶液剤で
、本則を水で稀釈し実施例１Ｏと同様に噴霧する。

実施例１４ 実施例６の化合物Ｏ゛、５部、アラビアゴム５部。

ベントナイト３０部およびタルク６４．５部を混合造粒
してなる粒剤を１０ａあたり３〜５ｋｇを直接に施用す
る。

試験例１ トマト疫病防除試験を実施した。トマト（品種大型副刃
）を１２ｃｍ鉢で栽培し、その３０日苗を供試した。１
区４鉢の２反復の試験を行った。薬液を充分量噴霧し、
２日後にトマト疫病菌の遊走子懸濁液を噴霧接種した。

４日間温室に保ちその後（第３および４葉）の病斑面積
率を調査した。その結果を表１１に示した。

表１１　トマト疫病に対する効果 Ｉ　無処理を１００（％）とする。

試験例２ 岩佐ら〔ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオティッ
クス（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ａｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｓ）、第３１巻、第６号、５１２頁、１９７
８年〕の方法に従って、大麦のウドノコ病に対する防除
効果を調べた。実施例２．５　、６の化合物のいずれに
おいても、著しく有効であることが認められた。

試験例３ 殺ダニ効果試験を実施した。鉢（直径９　ｃｍ）植えし
たインゲンの実生苗（発芽後５日）の木葉上にナミハダ
＝（Ｔｏｔｒａｎｙｃｈｕｓ　　ｕｒｔｉｃａｅ）の雌
成虫５０頭前後を接種したのち、供試薬液をスプレーガ
ンを用いて鉢当り２０−散布した。散布後鉢をファイト
トロン（２８°Ｃ）中に置き、５日目および７日目の葉
上の生存ダニ数を調査し、散布直前のダニ数に対する減
少率 いずれも著しく有効であることを表１２に示した。

同時にインゲンに対する薬害を観たが総ての場合におい
て認められなかった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）、ストレプトヴアーテイシリウム属に属するミル
   ディオマイシン生産菌を、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒは水素、ハロゲン原子、低級アルキルまたは
   ヒドロキシメチル基を示す〕で表わされる化合物を含有
   する培地に培養して、培養物中に式▲数式、化学式、表
   等があります▼ 〔式中の記号は前記と同意義〕で表わされる化合物また
   はその酸塩を生成蓄積せしめることを特徴とする該化合
   物の製造法。
2. （２）、Ｎ−メチル化合物を３ｍＭ以上含有する培地で
   培養することを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記
   載の製造法。