JPS63123391A - ラブダン型ジテルペンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クチビルパナ（Ｌａｍｉａｃｅａｅ　）科に属しインＰ
に生息する植物であるコレウス・フォルスコリン（Ｃｏ
ｌｅｕｓ　ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ　Ｂｒ１ｑ、）はラブ
ダン型のいく種類かのジテルペンを含有する。最も多量
に存在するものは１．９−ジデオキシフォルスコリン（
ＤＤＦ　）およびフォルスコリンである［　ＢＨＡＴ他
によるｒ　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　Ｊ
　１９　（１９７７）　１６６９〜１６７２〕。乾燥時
重量に基づくフォルスコリン含量は、植物全体の約０．
０５１、根の約０．１チである（　８ＨＡＨ他によるｒ
　Ｐｌａｎｔ、ａ　Ｍｅｄｉｃａ　Ｊ　３９（１９８０
）、１８３〜１８５〕。

フォルスコリン（ニアβ−アセトキシ−８，１３−エポ
キシ−１α、６β、９α−トリヒＰロキシラプＰ−１４
−二ンー１１−オン）は次の構造式を有する： Ｃｏ１ｅｕｓ　ｆｏｒａｋｏｈｌｉｉ植物の重要性はフ
ォルスコリンの顕著な薬理作用によって決定される。そ
れは正の変力作用を有し、心拍数を高め、そして血圧を
下げる（　ＬＩＮＤＮＥＲ他によるｒ　ＡｒＺｎｅｉｍ
、−Ｆｏｒｓｃｈ、／ｂｒｕｇ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ
　２Ｂ（１）　Ａ　２　（１９７８）、２８４〜２８９
〕。この作用およびその他多くの作用には、メンプレン
のアデニルサイクラーゼの活性化が介在しており、それ
Ｋよって環状アデノシン−燐酸（ＣＡＭＰ　）が増加す
る［：　ＭＥ’ｒＺＧＥＲＨ，、他による。

ｒ　Ａｒｚｎｅｉｍ、−Ｆｏｒｓｃｈ、／Ｄｒｕｇ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ　３１（ＩＩ）　ａ　Ａ　８（１９
８１）　１２４８〜１２５０　；　８ＥＡＭＯＮ　Ｋ、
Ｂ、他によるｒ　Ｊ、　Ｃｙｃｌ、　Ｎｕｃｌ、Ｒｅｓ
、　７（４）　（１９８１）、　２０１〜２２４　；　
ｌ　５ＯＵＺＡ　Ｎ、他による。ｒ　Ｍｅｄ、　Ｒｅｓ
、　Ｒｅｖ。

Σ（１９８３）、２０１〜２１９〕。従ってフォルスコ
リンの重要性は二重である：すなわち、一方において医
薬として重要であシ、他方において第２メツセンジヤと
してのｃＡＭＰを介して惹き起されるホルモン作用の研
究のだめの優れた助剤として重要である。

これまで、フォルスコリンは主として野生、および場合
によっては栽培されたＣｏ１ｅｕｓ　ｆｏｒｓｋｏｈＬ
ｉｉから、乾燥根を抽出することによ２て得られている
。

今般後述する本発明方法は各種テルペン、特にフォルス
コリンの新しい取得方法を提供する。

このために、Ｃｏ１ｅｕｓ　ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ細胞
培養物を懸濁培養物として維持する。いわゆる維持培地
で行われるフォルスコリン誘導体の形成は皆無であるか
ほんのわずかである。産生を刺激するためには、それら
細胞凝集物を、特に植物ホルモン含量の点で維持培地と
は異なる「誘導培地」Ｋ移す。ジテルペン形成は、２〜
６週間で最大となり、そして乾燥細胞材料に基づき０．
ｏｏｓ〜０．０６％濃度のフォルスコリンが得られる。

この新しい製造方法の長所は季節的および天候的な要因
に関係なく物質を製造することができ、インＰに生息す
るという条件に拘束されず、そして更に経済的、政治的
危険が低下する点である。

本発明の方法を以下に詳述する。まず、Ｃｏ１ｅｕＳｆ
ｏｒｓｋｏｈｌｉｉ植物のカルス培養物を既知の方法に
より調製する。寒天で固化した栄養培地で何代か継代に
培養期）後、細胞凝集物を液体培地に移しそしてそれら
をそこで懸濁培養物として維持することができる。

維持培養に適した培養条件は次のとおりであるニガラス
容器（例えばエルレンマイヤー・フラスコ）内貯蔵、オ
ービタル振盪機上で８０〜１５０　ｒｐｍ　（回転７分
）で振盪することによシ通気、温度１８〜３８℃、 連続照光、連続暗黒または照光／暗黒リズム。

植物ホルモン、例えばオーキシン類、例えば２．４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）　、インｆ−／Ｌ
／−３−酪ｅ　（ＩＢＡ）またはす７チル酢酸（ＮＡＡ
）を適切濃度例えば０．２〜５８９／ｌ　、好ましくは
α５〜２■／ｌで添加し、および／またはサイトカイニ
ン類例えばカイネチンまたは６−ベンジルアミノプリン
（ＢＡＰ　）を適切な濃度例えば０．０５〜２ｍｇ／ｌ
　、好ましくは０．１〜０．５　＃／ｌで添加する、慣
用の植物細胞培地、例えばＧａｍｂｏｒｇ　Ｂ　５培地
［Ｃ）ＡＭＢＯＲＧ　、　Ｄ、Ｌ、によるｒ　Ｐｌａｎ
ｔ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｊ　４５．３７２（１９７０
）］またはＭＳ培地（：　ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ　、Ｔ、
他によるｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｊ　２Ｂ、
４７３〜４９７　（１９６２））などを維持培地として
用いることができる。

フォルスコリン産生を刺激する重要な工程は、それら細
胞を「生産用または誘導培地」中に移すことよシ成る。

この培地は、 （ａ）　　植物ホルモンを全く含まないか、または（ｂ
）　　強い脱分化作用を有するオーキシン類、例えば２
．４−Ｄ、に代えて一種またはそれ以上の他のオーキシ
ン類、例えばＩＢＡまたはＮＡＡを含有するか、または （Ｃ）　　オーキシン類は全く含まずにサイトカイニン
類のみ含有するか、または （ｄ）　　オーキシン類および／またはサイトカイニン
類を維持培地よシも低濃度で含有する点で維持培地とは
異なる。

この誘導培地は７〜３０日間隔で更新し、そして各継代
後に、細胞材料の一部を収集してフォルスコリンを取得
する。この産生期中は、培養は連続暗黒で行うのが好ま
しい〇 第一誘導継代培養において、最初、培養増殖は依然とし
てほとんど変化が認められず、またフォルスコリン誘導
体の生成は通常少量の１，９−ジデオキシフォルスコリ
ン（ＤＤＦ　）および痕跡量の他のジテルペンに限られ
る。次いで第二または第三誘導継代培養という早い段階
で７オルスコリンおよびその誘導体含量は最大に達する
。

植物の根に認められる全範囲のジテルペンが形成される
。

産生期は数ケ月までの期間、エルレンマイヤー・フラス
コ中で続けることができる。しかしながら、フォルスコ
リン含量および培養増殖は。

そのプロセスがホルモン不含培地で行われるかどうか（
この場合産生期は約３代にわたる継代培Ｗ）あるいはオ
ーキシン／サイトカイニン組合せの形の植物ホルモンの
存在下に行われるかどうかに大きく依存する。例えば１
．　Ｏｌｖｌ　ＩＢＡおよび０．２Ｑ／ｌ　ＢＡＰを含
む培地が長期産生に適している。

よシ大規模にジテルペン含有細胞材料を得るには、培養
物を商業的に入手できる発酵槽中、誘導培地を用いて培
養する。このタイプの実験のための予備培養（すなわち
誘導実験開始前の継代培養）はエルレンマイヤー・フラ
スコ内で行うのが好ましいが、発酵槽に移入しそこから
維持培地を適当な方法で除去することができる。

産生実験完了後、細胞および栄養培地を分離し、そして
後者はほんの少量のジテルペンを含むにすぎないので捨
てる。細胞を乾燥し、そして根の場合と同様にして有機
溶媒（就中、トル二ン、ジクロロメタン、メタノール）
で抽出する（例えば西独特許第２，５５スフＢ４号参照
）。最後に、フォルスコリン、および適切な場合にはそ
の他のラブダン誘導体、例えば１．９−ジデオキシフォ
ルスコリンおよび１−デオキシフォルスコリンを粗抽出
液から、例えばシリカデルカラムでのクロマトグラフィ
によシ単離する。

定量は例えばＧＬＣ１ＨＰＬＣ（ＩＮＡＭＤＡＲ他によ
るｒ　Ｊ、Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、　Ｊ　６９　（１９
８０）、１４４９〜１４５１　　；ｒ　Ｐｌａｎもａ　
Ｍｅｄｉｃａ　５０Ｊ　（１９８４）、３０〜３４）ま
たはＴＬＣスキャニングによって行われる。

実施例　１ 照光懸濁液の誘導 連続照光下に維持されるＣｏ１ｅｕｓ　ｆｏｒｓｋｏｈ
ｌｉｉの懸濁培養物を用いる。

予備培養 初期重量：３００ｄの培地を含む１！エルレンマイヤー
・フラスコ中に１６ｆの細胞材料（新鮮時宜量） 培地：ｔＯダ／１２．４−ＤおよびＱ、２■／ｌカイネ
チンを含むＢ　５　ＣＧＡＭＢＯＲＧ　、　ｒ　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｊ４５　（１９７０）、３７
２の植物細胞培養培地〕温度：２４℃ 振盪速度：１１００ｒｐ 光　：連続照光 継代培養期間＝１４日間 倍率：１２ 誘導および産生期 培地＝０．４■７’ｌ　ＩＢＡを含有するＢ５培地光　
：連続暗黒 温度＝２４℃ 振盪速度：１１００ｒｐ さらに詳細について次の第１表を参照されたい。

仕上げ処理および定量 栄養培地除去後新たに収集した細胞を凍結乾燥する。そ
の細胞材料を磁器裏孔針内で粉砕する。非排気回転蒸発
器内で回転させながらジテルペンヲトルエンで抽出（２
時間、５０℃）。

濾過を行いそのν液を回転蒸発器内で濃縮乾個する（　
Ｔ＝５０℃）。

粗抽出液を超音波浴内のメタノールにとる。

フォルスコリン銹導体を、薄層クロマトグラムを展開し
、セしてＴＬＣスキャニングによシ検出することによシ
定量する。

移動相＝トルエン／酢酸エチル（８５：１５）展開＝２
Ｘ１５ｚ プレート＝プレコートされたシリカダル６０　Ｆ　２５
４プレート 検出＝ＳＴＡＨＬアニスアルデヒＰ／硫酸試薬、浸漬浴
；次いで１３０〜１４０℃で約５分間加熱する。

スキャナー＝　Ｄｅｓａｇａ社製８ｈｉｍａｄｚｕ　Ｄ
ｕａｌ　Ｃ８−９５０波長５００　ｎｍ 実施例　２ 照光懸濁液による発酵、ホルモン不含培地での産生 この実施例は誘導条件下でのｃｏｌｅｕｓ　ｆｏｒｓｋ
ｏｈｌｉｉ懸濁培養物の培養も大規模に行うことができ
ることを示している。使用される培養容器は２０１工ア
リフト発酵槽であり、培地中の溶存酸素含−１！ｌ　（
ｐ０２）を一定に維持する自動能を有する。

最初に、通常の維持培地での増殖継代培＠（実施例１参
照）をその発酵槽で行い、次に、細胞懸濁液を、４／を
残すほかは除去し、そしてその発酵槽を再びホルモン不
合Ｂ５培地を用いて１９１の作業容量となるまで補填す
る。

この後に続く第一誘導継代培養では培養物増殖は極めて
強力に続き、わずか約１３日間に９５チの堆積細胞容量
（ＰＣＶ）に達する。その後は、少量のＤＤＦが細胞中
に検出できるようだなるがフォルスコリンは全く検出で
きない。

実験を続行して、細胞懸濁液を再び、３．５１を残して
、除去しそして新鮮なホルモン不含Ｂ５培地で置き換え
る。この第二誘導継代培養において、実質的な量のジテ
ルペンの形成が始まり、そしてそれは９日目に０．００
５３％フォルスコリンおよび０．０１１６１　ＤＤＦの
最大値に達する。したがって９日目は細胞物質を収集す
るのに最適な時点である。発酵を続けると、ジテルペン
含量は培養物の一部が死滅するため連続的に減少する。

発酵に関するデータ 培養：　Ｃｏ１ｅｕｓ　ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉの照光懇
濁液フラスコ内予備培養：１５日間、Ｂ５維持培地３０
０ｄ中の初期重量１６〜１７２（新鮮時重量）（新鮮時
重量＝培地を排液した後の湿潤細胞の重量） 温度＝２４℃ 作業容量−１９１ スクロース／クルコース：残Ｗグルコース含量＞　Ｏ，
Ｓ　Ｓをスクロース溶液（３０％）の添加によシ維持す
る。

増殖継代培養（拡散日光） 培地：ＢＳ（１，０■／ｌ　２，４−　Ｄおよび０．２
ｍｇ／ｌカイネチン） 接種物：　２．４１　＝予備培養フラスコ８個（接種量
） 期間：１６日間 ｐｏｚ：３５ｔｓ、１４日目から５０係増に上げる。

第一誘導継代培養（連続暗黒） 培地＝Ｂ５．Ｂ５上ン不合 接種物：増殖継代培養からのＩＩ！ｌ濁液４１期間−１
３日間 ｐｏｚ：　３５幅 発泡抑制：全部で約２５０−の？リプロピレングリコー
ル溶液を添加。

第二誘導継代培養（連続暗黒） 培地二Ｂ５、ホルモン不含 接種物：第一誘導継代培養からの懸濁液６．５１期間：
２６日間 ｐｏｚ　：　７０チから４０壬に低減 通気速度：ｖｖ惧＝０．０６〜０．１０（＝１時間あた
りおよび作業容量１９１あたシフ０〜１１Ｃ１ｌ）ジテ
ルペン含量（重量％）　　　フォルスコリン　　　ＤＤ
Ｆ７日目　　　　　　　０．００３５　　０．００９２
８日目　　　　　　　０．００３２　　０．００９３９
日目　　　　　　０．００５３　　　α０１１６１１日
目　　　　　　　０．００１６　　０．０１０２実施例
　３ 照光懸濁液の誘導、ジテルペンの単離 連続照光下に維持されたＣｏ１ｅｕｓ　ｆｏｒｓｋｏｈ
ｌｉｉの懸濁培養物を用いる。

予備培養：実施例１と同様 誘導および産生期間：実施例１と同様 ただし以下の点で異なる。

培地二Ｂ５％ホルモン不合 初期重量：培地３００ｄ中に２２．５？および２９５？
（新鮮時宜量） （第二誘導継代培養） 継代培養期間：第一誘導継代培養　１５日間第二誘誘導
式培養　１１日間 第二誘導継代培養が終了するとジテルペン単離のために
細胞を収集する。

抽出：トルエン抽出により２．２６ｔの凍結乾燥細胞を
得る（実施例１参照） 粗抽出液：（５８，６呼＝ｉ０１（極一部がメタノール
に可溶） フォルスコリン誘導体をカラムクロマトグラフィにより
純粋に調製する。

カラム：　Ｌａｂｏｍａｔｉｃ　（約５０ＪＥ／）、３
０μ倶シリカｒルを充填 移動相ニジクロロメタン／酢酸エチル（８：１）抽出溶
液：溶媒として、メタノールを移動相により置き換える
。

分離用物質量：約２５！（すなわち当初の可溶性粗抽出
物の約５０％） 溶離可能な全物質量１２．８ηよシ次のものが得られる
： ０．７即のフォルスコリン １．０りの１，９−ジデオキシフォルスコリン（ＤＤＦ
）０．４９の１−デオキシフォルスコリン個々の両分の
同定はＧＬＣ、ＨＰＬＣまたは二次元薄層クロマトグラ
フィによシチェックする。

ＴＬＣ’プレ）　：　ＨＰＴＬＣ、シリカグル６０Ｆ２
５４１０Ｘ１０ａ１１ ９動相； ■、ジクロロメタン／酢酸エチル（８：１）■、フジイ
ソプロエーテルクロロホルム（７：３）特許出願人　　
ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）コレウス・フオルスコーリイ細胞の懸濁培養物を適
   当な植物ホルモンの存在下に維持培地で培養し、次いで
   該維持培地とは添加される植物ホルモンの性質および／
   または濃度の点で異なる栄養培地（誘導培地）に移すこ
   とにより細胞培養物中のジテルペン形成を誘導し、そし
   て該ジテルペンをそれ自体既知の方法で単離することよ
   りなるラブダン型ジテルペンの製法。 ２）使用される維持培地がオーキシン類を０．２〜５ｍ
   ｇ／ｌの濃度、および／またはサイトカイニン類を０．
   ０５〜２ｍｇ／ｌの濃度で添加した慣用の植物細胞培養
   培地である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）オーキシン類が０．５〜２ｍｇ／ｌの濃度、および
   ／またはサイトカイニン類が０．１〜０．５ｍｇ／ｌの
   濃度で維持培地に添加される特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ４）誘導培地が ａ）植物ホルモンを全く含まないか、またはｂ）強い脱
   分化作用を有するオーキシン類、例えば２，４−ジクロ
   ロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に代えて、一種または
   それ以上の他 のオーキシン類を含有するか、または ｃ）オーキシン類は全く含まず一種またはそれ以上のサ
   イトカイニン類のみを含有する か、または ｄ）一種またはそれ以上のオーキシン類および／または
   サイトカイニン類を維持培地よ りも低濃度で含有する 点で維持培地と異なる特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ５）維持培地に用いられるオーキシン類が２，４−ジク
   ロロフェノキシ酢酸および／またはナフチル酢酸であり
   、そして誘導培地ではこれらをインドール−３−酪酸ま
   たはより弱い脱分化作用を有するその他のオーキシン類
   で置き換えるか、またはすべて省く、特許請求の範囲第
   １〜４項のいずれか１項に記載の方法。 ６）誘導培地が植物ホルモンを全く含まない特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ７）用いられる誘導培地が（例えばビタミンまたはアミ
   ノ酸が添加されていない）簡単な培地であるかまたは純
   粋な炭水化物溶液（例えばスクロース、グルコース）で
   ある特許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の
   方法。 ８）深部培養物が用いられる特許請求の範囲第１〜７項
   のいずれか１項に記載の方法。 ９）当該方法が照光下、暗黒下または照光／暗黒リズム
   下に行われる特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項
   に記載の方法。 １０）当該方法が１８〜３８℃の温度で行われる特許請
   求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の方法。 １１）誘導期が７〜３０日間続く特許請求の範囲第１〜
   ９項のいずれか１項に記載の方法。 １２）いくつかの誘導期がジテルペンを産生するように
   刺激された細胞の一部を各場合において更に新鮮な誘導
   培地で培養することにより順次に行われる（反連続方法
   ）特許請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項に記載の
   方法。 １３）当該方法がガラス容器、例えばエルレンマイヤー
   ・フラスコ中で行われる（通気は軌道式振盪による）か
   、発酵槽中で行われる（通気は気体導入による）、特許
   請求の範囲第１〜１２項のいずれか１項に記載の方法。 １４）フオルスコリンが取得される特許請求の範囲第１
   〜１３項のいずれか１項に記載の方法。