JPS63123377A - 本質的にタンパク質性の生物学的材料中に存在する汚染性微生物をオゾン分解によつて不活化する方法、この方法で得られる生成物、並びにこれら生成物の生物学的及び分析的使用 - Google Patents

本質的にタンパク質性の生物学的材料中に存在する汚染性微生物をオゾン分解によつて不活化する方法、この方法で得られる生成物、並びにこれら生成物の生物学的及び分析的使用

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JPS63123377A
JPS63123377A JP62231938A JP23193887A JPS63123377A JP S63123377 A JPS63123377 A JP S63123377A JP 62231938 A JP62231938 A JP 62231938A JP 23193887 A JP23193887 A JP 23193887A JP S63123377 A JPS63123377 A JP S63123377A
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ASSOC REJIONARU DE TORANSUFUYUJION SANGIINU
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、本質的にタンパク質性の生物学的材料中に存
在する汚染性微生物をオゾン分解によって不活化する方
法、この方法で得られる生成物、並びにこれら生成物の
生物学的使用及び分析での使用に係わる。
周知のように、動物又はヒトに由来する血液、器官又は
組織の抽出物又は粉砕物のようなタンパク質性の生物学
的材料は微生物を含んでおり、これらの材料を生物学的
に又は分析に使用する場合は前記微生物を不活化するこ
とが望まれる。
前記材料は特に、細菌学的見地からこれら材料を無菌化
する場合に通常使用される微孔フィルタを通り抜けるこ
とができるようなウィルスを含んでいる。
生物学的材料中に存在する微生物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで
不活化する公知の方法は、精製物の調製に好んで使用さ
れ、物理的又は化学的手法を使用する。
これらの手法のうち最も広く使用されているのは下記の
ものである。
−液体又は乾燥状態の材料に対する通常は６０℃の熱の
作用、この方法では、材料の１種以上のタンパク質を不
安定にし得る熱効果に対して防御を行う物質を使用しな
ければならない。
ゆ −溶媒存在下で洗剤の作用、この方法を用いると、処理
した調製物を治療に使用する場合又は細胞培養培地の形
成に使用する場合に洗剤を除去しなければならないが、
この除去操作は簡単ではない。
−高エネルギー放射線の使用。この方法は遊離基を発生
させ得、従って重合の問題を生じ得る。
−β−プロビオラクトーンの存在下での紫外線の作用。
β−プロビオラクトーンは特定の条件でしか使用できな
い化合物である。
−特に脂質エンベロープを持つウィルスの場合に使用し
得る疎水的相互作用クロマトグラフィー。
その実施にはしばしば技術上の問題が伴う。
これらの方法は通常、前記生物学的材料のタンパク質に
有害な効果（成る種の酵素の活性損失、重合、新抗原の
出現、部分的不溶解性）をもたらす。
更に、これらの方法では、抗ウイルス効果を持つ使用し
た生成物を補足的ステップを設けて除去しなければなら
ない。また、例えば何等かの治療に使用する前に、存在
する可能性のあるウイルス不活他剤残留物を測定しなけ
ればならグず、そのため実施コストが高くなる。
より簡単に実施できる微生物不活化方法を求めて、発明
者等は酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、過酢酸、
そして特にオゾンがもたらす作用を研究するに至った。
オゾンは、炭素−炭素二重結合を持つ有機化合物をオゾ
ン分解する作用を有し、その結果過酸化物のごとき副産
物が生じて、生物学的系の中に存在する酸化−還元酵素
（グルタチオン、オキシダ−ゼ、ペルオキシダーゼ）に
作用する。これらの副産物は細胞膜の主要成分たる脂質
構造体のレベルでも作用する。オゾンの作用は更に、ウ
ィルスの表面にしばしば存在するＮ−アセチルグルコサ
ミンレセプタの阻害も誘起する。この現象はウィルスの
標的細胞の表面に対するウィルス粒子の固定を阻止する
。
オゾンを間接的に作用させる方法もあり、この場合は、
ウィルスのエンベロープ内に存在するホスファチジルコ
リン上にオゾンを固定させることによって、前記エンベ
ロープを脆弱化させる。その結果、ウィルスのエンベロ
ープの耐性が低下し、汚染されたタンパク質媒質中に存
在する代謝産物及び酵素を通過させるようになるため、
ウィルスが不活化される。
前述のごときオゾンの効果は、水溶液又は緩衝液中のウ
ィルスに関して観察された（Ｓ、Ｒｉ！Ｉｉｎｇ。
Ｒ，Ｖｉｅｂａｈｎ　：　Ｐｒａｘｉｓ　ｄｅｓ　０ｚ
ｏｎ　５ａｕｅｒｓｔｏｆｆ　Ｔｈｅｒａ−ｐｉｅ；Ｅ
ｗａｌｄ　　Ｆｉｓｃｈｅｒ　　Ｖｅｒｌａｎｇ　　１
９８５）。
前記文献には、病原体の除去に係わる特定の酸化−還元
系を刺激すべく、凝固防止処理し、採取し且つ患者に再
注入する成る量の血液をオゾンを用いて過酸化処理する
方法も開示されている〈同上〉。
しかしながら前記用法ではオゾンが、気体の運搬を本質
的機能とする血液成分に対して非特異的に作用する。既
存の方法では評価が難しい病状の改善には、その疾患の
代謝反応が必要である。
そこでｉｎ　ｖｉｖｏの作用が問題になるが、これは本
発明が目指すようなｉｎ　ｖｉｔｒｏでの生物学的材料
不活化には適用できない。
窓外なことに、生物学的材料汚染微生物のオゾン分解に
よるｉｎ　ｖｉｔｒｏ不活化を実施するためには、オゾ
ンの酸化作用を阻害し得る酸化−還元系を除去及び／又
は不活化すべく、材料を予め処理しておかなければなら
ないことが判明した。
本発明の目的は、本質的にタンパク質性の生物学的材料
を汚染する微生物の不活化方法であって、タンパク質の
機能特性を保持しながら大きな効果をもたらすような方
法を提供することにある。
本発明はまた、公知の酸化剤即ちオゾンを使用して簡単
に実施できる方法を提供することも目的とする。
本発明は更に、生物学的に、もしくは分析に使用できる
生成物、又は汚染物貰、より特定的にはウィルスもしく
は菌類を含まない細胞培養培地の形成に使用できる生成
物を提供することも目的とする。
本発明の方法は、 ａ）汚染性微生物に対するオゾンの酸化作用を阻害し得
る酸化−還元系を除去及び／又は不安定化すべく、生物
学的出発材料を沈澱又は抽出により分別し、 ｂ　）　１０−’ｐｇ／ｍｌ〜１５０ｕｇ／＋　１、好
ましくは１０〜５ｈｇ／ｍｌのＯ３を含む調節した組成
の、酸素がら製造した０３１０２混合物を作用させるこ
とがら、ｐ前述のごとく酸化−還元系を除去すると、有
利なことに、微生物不活化剤としてのオゾンの特異的活
性を十分に利用できることが判明した。オゾンの活性を
中和する効果をもつこれらの酸化−還元系としては、例
えばオキシドレ、ダクターゼ又はペルオキシダーゼが挙
げられる。
本発明ではまた、生物学的出発材料を液体又は粉体状態
で使用する。
そこで、第１の補助ステップで、０ｓ１０２流を液体状
生物学的媒質内に流すか、又は粉体状生物学的媒質に吹
込んで、該媒質の０３を飽和させる。
有利には、液体又は粉体状生物学的媒質を冷却するが、
媒質が液体の場合には、０．の溶解度を高めるべく、液
相に適合した温度を使用する。
この冷却処理温度は、より特定的には、液体媒質の場合
が約０〜１５℃、固体媒質の場合が約−３０℃〜１５°
Ｃである。
最終生成惣の不活化及び安定化を完全にするためには、
処理した媒質を補助ステップで凍結乾燥させるか又は微
粒子化する。
本発明の特定実施例では、約４０〜１０００−の出力で
の約２０〜３７ＫＨｚの超音波周波数により処理するス
テップを、前記オゾン流通又は吹込み処理と同時に実施
する。この超音波処理はポリオウィルスＩのごときウィ
ルスのエンベロープを壊れ易くする。
本発明の方法で使用する生物学的出発材料は組織、特に
胎磐組織の抽出物からなるタンパク質性材料、精製した
器官粉砕物、血清、血漿のごとき血液誘導体又は完全血
液である。これらの材料はヒト又は動物に由来する。
本発明の好ましい実施例では、例えば血漿を約−２０℃
で凍結し、次いで２℃〜４℃まで緩慢に解凍することに
よって得られる低温沈澱フラクション及び／又は表面浮
遊フラクションを出発材料として使用する。この凍結−
解凍法は低温沈澱物（ｃｒｙｏｐｒ６ｃ　ｉｐ　ｉ　ｔ
ａ）と称する生成物を得るために広く使用されており、
Ｋｉｒｋ　ＲＥ、　Ｏｔｈｍｅｒ　ＤＦ編、Ｅｎｃｙｃ
ｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ
ｙ　＆　５ｏｎｓ　１９７８．２５〜６１のＳｔｒｉｋ
ｅｒＭＨ，Ｗａｌｄｍａｎｎ＾＾著Ｂｌｏｏｄ　Ｆｒａ
ｃｔｉｏｎａｔｉｏｎに記述されている。
この低温沈澱物は下記の成分を含む。
−フィブリノーゲン　１５ｇ／ｌ −因子ＸＩＩＩ　　２００±５０１／ｍｌ−　フィブロ
ネクチン　７．５±０．５ｇ／ｌ−総りタンパク質　２
５±５ｇ／ｌ −凝固性タンパク質　５０〜６０％ ５ｐ／ｍｌ　）ロンビンでの凝固時間は６０±１０秒で
ある。
血漿を凍結し次いで解凍する処理は、オゾンの酸化作用
を阻害し得る酸化−還元系のレベルに作用し得る。これ
らの系が除去されるか又は不安定になれば、汚染性微生
物に対するオゾンの特異的活性を得ることができる。
一般的には、微生物はウィルス又は菌類からなる。従っ
て、オゾンの殺ウイルス活性は特にウィルスＨＩＶ（エ
イズ＠原ウィルス）、ファージＴ４、ウィルスＶＳＶ　
（小胞形成口内炎ウィルス）に作用する。
本発明は、オゾン処理によって得られるような生物学的
材料にも係わる。この種の生成物はオゾンの作用を阻害
する酸化−還元系を含まない。これらの生成物は、汚染
性微生物を含まないという特徴を有し、そのため生成物
学的に又は分析に直接使用でき、あるいは細胞培養培地
の形成にも直接使用できる。
本発明の他の特徴及び利点は以下の実施例の説明から明
らかにされよう。これらの実施例は血漿の低温沈澱物及
び表面浮遊調製物に加えたウィルスの不活化に係わる。
これらの実施例では、結果の判断を容易にすべく、オゾ
ン処理してない汚染された対照グループ（陽性対照）と
、ウィルスを接種してない陰性対照とを導入した。
１１Ｌ 低温沈澱物の再懸濁によって得た、フィブリノーゲンと
フィブロネクチンと因子ＩＩＩとアルブミンとイムノグ
ロブリンＧとの混合物を含む濃度２０Ｆｉ／ｌのタンパ
ク質懸濁液に、ファージλを含むウィルス懸濁液を混合
物の最終濃度が７ｘｌＯ’ウィルス粒子／−１になるよ
うに添加する。
このようにして汚染した懸濁液を冷凍し、次いで凍結乾
燥させる。０！容器に接続した発生器で１２ｐｇ／ｎ＋
１のＯ３を含む０ｉ１０２混合物を形成し、乾燥、粉体
化処理し且つ１５分間Ｏ℃に冷却した低温沈澱物の入っ
たフラスコ内に前記混合物を吹込む。
前記低温沈澱物を緩衝媒質中に懸濁させて最初の体積ま
で戻し、次いでバクテリアＥ、Ｃｏ１１Ｑ３５８展開物
における細胞分解の範囲を調べる方法により残留ウィル
スを測定する。生存ウィルスの割合は０コ処理しなかっ
た凍結乾燥対照フラスコに対して２１ｏｇ＋。の減少を
示す。
及１匝よ 血液凝固防止剤で得た新鮮血漿を１．４ｘｌＯ’ｃｏ＋
ｐ／ポケツトの逆転写酵素（ＲＴ）活性に相当するレト
ロウィルスＩＩＴＶ懸濁液により感染させる（ＲＴはレ
トロウィルスの複製に不可欠な酵素である）。
汚染した血漿の一部分をオゾンで直接処理し、次いで凍
結し、そのｆ＆Ｍ漫に解凍する。これは低温沈澱物を得
るための一般的条件であるのにも拘わらず、低温沈澱物
は得られない。この血漿のウィルス残留物の測定をＲＴ
活性との比較によって行う。この活性はリンパ球培養物
中でのインキュベーション後１３８目で約１３０．ＯＯ
Ｏｃｍｐ／ｍ’ｌである。対照血漿のＲＴ活性値は１７
５．ＯＯＯｃｍｐ／ｍｌであるため、不活化は余り顕著
でないことがわかる。
汚染処理し次いで凍結した別の血漿部分を解凍して低温
沈澱物と該沈澱物から分離した表面浮遊物とを得る。こ
の表面浮遊物内に、Ｏ３を１２μｇｅｔａ　１含む０，
１０□混合物を０℃で３０分間流す。リンパ球培養物に
おいて測定したＲＴ活性は、オゾン処理しなかった対照
浮遊物（１３日日目１７６、ＯＯＯｃｐｍ／ｍｌ）に比
較してゼロである。
低温沈澱物はクエン酸塩−サリーン緩衝液に再懸濁し、
２つに分割する。
第１の部分は液体状態で、前述の方法により０ｚ１０□
気体混合物で処理し、次いで冷凍し、て凍結乾燥させる
。
乾燥生成物を１０ｍ１の蒸留水で戻し、０．６ｍｌ採取
して５ｐ／ｍｌ　）ロンビン０．６ｍｌと混合する。形
成された凝塊を、５ｘｌＯ５のリンパ球を含む媒質２０
ｍ１中でインキュベートする。
培養後２０日８でもＲＴ活性は全く認められない。
前記低温沈澱物の第２の部分を凍結乾燥し、次いで微粒
子化した後、１２μ／ｍｌの０３を含む０，１０□混合
物を０℃で３０分間吹込む。
処理した乾燥生成物を新たに溶解するが、培養後２０日
８でもＲＴ活性は認められない。
オゾンによる処理の効果を調べるために、下記ニンを含
むｌＩＩ街液に再溶解した低温沈澱物は、特定の粘着性
及び凝固性を有する０周知のように、この物質は生物学
的接着剤の形態で使用され、この接着剤の効果は、殺し
たネズミの背中に接着した部材をネズミの皮膚から剥ぎ
取るのに必要な引っ張り力の測定によって調べられる。
　無処理の場合、接着に使用した低温法澱物試料の平均
値は１１ＢＨ／ｃｍ２である。液体状態で処理した場合
の剥離力は１２２．５ｇ／ｃ醜２である。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）本質的にタンパク質性の生物学的材料中に存在す
    る汚染性微生物をオゾン分解によつて不活化する方法で
    あつて、 ａ）汚染性微生物に対するオゾンの酸化作用を阻害し得
    る酸化−還元系を除去及び／又は不安定化すべく、生物
    学的出発材料を沈澱又は抽出により分別し、 ｂ）１０＾−＾３〜１５０μｇ／ｍｌのＯ＿３を含む調
    節組成をもつ、酸素から製造したＯ＿３／Ｏ＿２混合物
    を作用させることを特徴とする方法。
  2. （２）生物学的出発材料を液体又は粉体状で使用し、Ｏ
    ＿３／Ｏ＿２混合物を前記液体又は粉体媒質が飽和する
    まで好ましくは撹拌下で吹込むことを特徴とする特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。
  3. （３）前記液体又は固体媒質を冷却する補助ステップを
    含み、この冷却温度が、液体媒質の場合には、液相状態
    を維持するのに適した温度、特に約０〜１５℃であり、
    固体媒質の場合には約−３０〜１５℃であることを特徴
    とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。
  4. （４）処理した前記媒質を凍結乾燥するか又は微粒子化
    する補助ステップを含むことを特徴とする特許請求の範
    囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。
  5. （５）約４０〜１０００Ｗの出力の約２０〜３７ＫＨｚ
    の超音波周波数により前記媒質を処理するステップを含
    み、このステップを前記吹込み処理と同時に実施するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項のいず
    れかに記載の方法。
  6. （６）ヒト又は動物に由来する精製した組織抽出物又は
    器官粉砕物からなる生物学的出発材料に適用されること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項から第５項のいずれ
    かに記載の方法。
  7. （７）血液又は血清のごとき血液誘導体からなる生物学
    的出発材料に適用されることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法。
  8. （８）凍結し次いで緩慢に解凍した血漿から得られる低
    温沈澱フラクション（ＣＰ）及び／又は表面浮遊フラク
    ション（ＰＤＣ）に適用されることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法。
  9. （９）媒質中に存在する微生物がウィルス又は菌類であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第８項の
    いずれかに記載の方法。
JP62231938A 1986-09-16 1987-09-16 本質的にタンパク質性の生物学的材料中に存在する汚染性微生物をオゾン分解によつて不活化する方法、この方法で得られる生成物、並びにこれら生成物の生物学的及び分析的使用 Pending JPS63123377A (ja)

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