JPS63122955A - 細胞増殖速度測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の分野 本発明は、ｉｎ　　ｖｉｖｏおよびｉｎ　　ｖｉｔｒｏ
における細胞増殖速度を測定するための新規な方法に関
する。 発明の背景 現在、２種類の一般的な細胞増殖測定方法が存在する。 １つの方法は、分析期間の最初に細胞の数を計数し、つ
いで、その期間の最後に細胞の数を計数して細胞数の増
加を測定するものである。 細胞計数は、ヘモサイトメーターによる顕微鏡法を用い
て、また、コールタ−カウンターまたは他のフローサイ
トメーターを用いた計器ｈ「助力法により行なうことが
できる。もう１つの細胞増殖測定方法は、ベータ計数方
法を用いるトリチウム化チミジンの消費を測定するもの
である。この方法においては、細胞数を実験の最初に測
定し、ついで、トリチウム化チミジンを該細胞とと乙に
入れる。一定間隔にて、該培養の一部を取り、計数し、
かつ、遊離の非結合トリチウム化チミジンを洗浄する。 ついで、これらの洗浄した一部をトリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）沈澱、ついで、放射性標識固体沈澱物のシンチレー
ション計数に付してＤＮＡ中に取り込まれたトリチウム
化チミジンを測定する。 この方法は、ＤＮＡ合成速度を測定するにすぎず、細胞
増殖自体を測定しない。しかし、この方法は比較的容易
であるため、細胞刺激を調べる場合に一般に選択される
方法である。細胞増殖活性を測定するために用いられる
もう１つの方法は、試験するいずれかの組織における細
胞１００１当たりの有糸分裂の数を調べるものである。 この方法は、調製方法が細胞の損失を引き起こすためそ
れほど正確ではない。一般に、これらの検定は、　１ｎ
ｖｉｔｒｏでは十分に機能するが、ｉｎ　　ｖｉｖｏに
て細胞増殖の測定に適用することは困難である。 組織の増殖速度は、該組織を取り、かつ、１ｎｖｉｔｒ
ｏにて取り込まれたトリチウム化チミジンのパルスをモ
ニターすることによって算定できる。 該組織を３０μ薄片に切断し、３０分間トリチウム化チ
ミジンに暴露させる。取り込まれなかったトリチウム化
チミジンを洗浄し、放射性アイソトープ崩壊が該フィル
ムを暴露する薄片上に核乳剤を置く。該乳剤を現像して
定着し、該組織をヘマトキシリンおよびエオシン染料に
て染色し、ついで、該薄片を顕微鏡にて調べて標識画分
を測定する。この方法は、非常に手間を要し、かっ、時
間がかかる。 シアニン染料は、種々の生物学的適用に用いられている
。ジオキサカルボンシアニン染料が、白血球識別計数を
行なうに際し用いられている「ギュンター・パレット、
マックス・ブランク・ゲス・ヴイッシェンシュ（Ｇｕｎ
ｔｅｒ　Ｖａｌｅｔ、Ｍａｘ　ＰｌａｎｃｋＧ　ｅｓ　
　Ｗ　１ｓｓｅｎｓｃｈ）　：特許照会番号第８４−１
０２３０７７１７号、選択的染色および容積測定および
蛍光による血液の同特定備分析 （Ｓ　ｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉ
ｖｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ１０ｎｏｆ　　Ｂｌｏｏｄ
　　Ｃｅ１ｌｓ　　ｂｙ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｓｔａ
ｉｎｉｎｇａｎｄ　　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　　Ｖｏｌｕ
ｍｅ　　ａｎｄ　　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」。し
かしながら、これらの研究に用いられた染料は、短鎖カ
ルボシアニン染料（１０以下）であり、かつ、膜電位の
変化に応答する。さらに、該短鎖カルボシアニン染料は
、細胞ミトコンドリアに侵入し、細胞毒であり、かつ、
該細胞を洗浄した場合、これら染料は、該細胞の膜電位
が変化しようじとしまいと該細胞から容易に流出する。 他の短鎖脂肪族シアニン染料が、多くの他の生物検定に
用いられている。しかし、該短鎖分子は、膜電位に応答
し、かつ、該細胞膜を横断してミトコンドリア中に浸透
する「エッチ・エム・シャピロ（Ｈ。 Ｍ、　５ｈａｐｉｒｏ）、米国特許第４３４３７８２号
」。 該短鎖シアニン染料も細胞に対して毒性であり、細胞増
殖速度を測定するために用いることはできない。 トリカルボシアニン染料［フォックス、アイ・ジェイら
、プロシーディンゲス・イブ・マヨ・クリニク（ＦＯＸ
、　　ＩＪ、　ｅｔ　　ａｌ、　　、　　Ｐｒｏｃ、　
Ｍａｙ。 Ｃ１１ｎｉｃ）、　　３２．　４７８〜４８４（１９５
７）Ｊおよびエバンズーブルー染料「シアッド、エッチ
ら、プフレガーズ・アルカイブ−ヨーロピアン・ジャー
ナル・イブ善フィジオロジー（Ｐ　ｒ　ｌｕｅｇｅｒｓ
　。 Ａｒｃｈ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓ１０ｌ、　）、
　３７０（２）、　　１３９〜ｌ　４４（１９７７）ｊ
がｉｎ　ｖｉｖｏにて希釈法により心臓出力を測定する
ために用いられている。 ダウ［ダウ、ピー、フィジオロジカル・レビューズ（Ｄ
ｏｗ、　Ｐ、　、　Ｐｈｙｓ１０ｌ、　Ｒｅｖ、　）、
　３６　、７７〜１０２（１９５６）Ｊは、既知量のあ
る種の血管内指示薬を肺の静脈側に注入し、該指示薬の
動脈濃度を経時的に測定して注入時およびサンプリング
時の間の容積を測定するような方法を記載している。こ
れらの染料は、細胞を染色するために用いられない。 発明の要約 本発明は、細胞増殖速度の新規な測定方法に関する。本
発明によれば、まず生育可能細胞をシアニン染料にて標
識する。シアニン染料標識親細胞に由来する娘細胞の原
形質膜中のシアニン染料の濃度の変化を測定することに
より細胞増殖速度を測定する。増殖を測定するだめの本
発明方法は、例えばｉｎ　　ｖｉｖｏにて角膜上皮の回
復および移植骨髄細胞の癒着をモニターするために用い
られる。 本発明方法のｉｎ　　ｖｉｔｒｏでの使用は、種々の化
学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性の測定を包含する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、時間の関数としての細胞蛍光強度減少を示す
グラフである。第２図は、染色細胞および非染色細胞の
増殖曲線を示すグラフである。第３図は、染色細胞から
非染色細胞への染料移動の欠如を示すグラフである。第
４図は、細胞および蛍光動力学を比較したグラフである
。 発明の詳説 細胞増殖速度を測定する本発明方法においては、該細胞
をシアニン染料にて標識する。 つぎの構造を有する化合物： ［式中、Ｙは酸素、硫黄、メチレンまたはアルキル置換
メチレン；ｍは０〜３；およびｎは１２〜２２を意味す
るコ を本明細書においてシアニン染料と称する。 本明細書にて用いられているように、アルキル置換メチ
レンは、メチル、エチルまたはプロピル置換基のいずれ
かの組合せを有するモノ−またはジー置換メチレンを意
味する。 前記構造の化合物は、つぎの一般的に知られた簡略式： ％式％） により表わされる［シムズ、ビー・ジエイら、バイオケ
ストリー（Ｓｉｍｓ、　Ｐ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂ１
０ｃｈｅｍ。 ）、１３．３３１５（１９７４）Ｊ。すなわち、例えば
Ｙが硫黄であり、鎖環を架橋する３個の炭素および１４
個の炭素の脂肪族鎖を２つ有する化合物をＤｉＳＣ＋−
（３）と称する。同様に、ＤｉＩＣ１４（５）は、Ｙが
イソプロピルであり、鎖環を架橋する５個の炭素および
１４個の炭素の脂肪族鎖を２つ有する化合物を示す。 ｌまたはそれ以上の置換を有する前記構造の化合物は、
そのような置換化合物が、少なくとも標識に必要な間細
胞標識培地に溶解し、かつ、十分に高い細胞膜分配係数
を有し、依然として標識細胞膜に結合している場合に、
本明細書にてシアニン染料と称する化合物に包含される
。そのような化合物は、また、標識に必要な濃度にて細
胞生育力に顕著な影響を及ぼしてはならない。細胞標識
培地中の溶解度は、該標識培地中にシアニン染料を分散
し、かつ、標準分光蛍光法により細胞の蛍光強度を期間
中測定することにより以下に示すように決定する。蛍光
強度の減少は、染料の沈澱および容器壁への付着を示し
ている。該染料が依然として細胞膜に結合しているかど
うかは、例えば、公知のフローサイトメトリー法を用い
て、標識後供血動物中に再注入した赤血球の蛍光強度を
モニターして決定する。本質的に、再注入後の標識細胞
の一定蛍光強度は、細胞膜中の該染料の安定性を決定す
る。 本発明にて用いられるシアニン染料は、モレキュラー・
ブローブズ・インコーボレーティッド、ニージーン、オ
レゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｐ　ｒｏｂｅｓ、　　
Ｉ　ｎｃ。 、　Ｅｕｇｅｎｅ、　Ｏｒｅｇｏｎ）のような種々の源
から購入でき、かつ、公知の合成法を用いて入手可能な
出発物質から製造できる「ハマー、エフ・エム、ザ・シ
アニン・タイプ・アンド・リレーティラド・カンバウン
ズ、インターサイエンス・パブリッシャーズ（Ｈａｍｅ
ｒ、　Ｆ、Ｍ、、　Ｔｈｅ　　Ｃｙａｎｉｎｅ　　Ｄｙ
ｅｓａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
、　　ＩｎＬｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰ　ｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓＸ　１９６４　）Ｊ。 本発明方法を用いれば、いずれの生育可能細胞もシアニ
ン染料にて標識できる。本明細書にて用いられているよ
うに、「細胞」なる語は、白血球、種々の腫瘍細胞、他
の哺乳動物細胞（例えば、組織培養細胞）、酵母および
細菌のような有核細胞を包含する。細胞は、それが、そ
の種の細胞に対して予期されるように本質的に増殖また
は機能しうる場合に生育可能である。 細胞標識は、細胞に対して致命的でなく、かつ、再現可
能な標識を供給する培地中にて行なわれる。 必要な特性を該培地に付与するため、シアニン染料が、
少なくとも標識に要する間安定な溶液を形成する浸透圧
調節剤を用いる。許容可能な浸透圧調節剤は、糖、例え
ば、グルコース、フルクトース、ソルボース、キシロー
ス、リボースのような単糖類およびシュークロースのよ
うな三糖類、マンニトール、グリセロール、イノシトー
ル、キシリトールおよびアドニトールのような糖−アル
コール、グリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸、
ならびにＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−
アミノプロパンスルホン酸のようなある種のグツド緩衝
剤ならびに以下の第２表に挙げたもののような薬剤を包
含する［グツド、エヌ・イーら、バイオケミストリー（
Ｇｏｏｄ、　Ｎ、　Ｅ、　、　ｅｔａｌｌ、　Ｂ１０ｃ
ｈｅｍ、　）、　　１５．　４６　’７−４７７（１９
６６）、　グツド、エヌ・イーおよびニス・イザワ、メ
ソッズ・イブ・エンザイモロジ−（Ｇ　ｏｏｄ　。 Ｎ、　Ｅ、　ａｎｄ　　Ｓ、　　Ｉｚａｗａ、　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ。 ）、■、パートＢ、５３（１９６８）、フェグソン、ダ
ブリュー・ジェイら、アナリティヵル・バイオケミスト
リー（Ｆｅｇｕｓｏｎ、　Ｗ、　　Ｊ、　、　ｅｔ　　
ａｌ。 、　Ａｎａｌ、　Ｂ１０ｃｈｅｍ、　）、上隻工、３０
１〜３１０（１９８０）Ｊ。しかしながら、いくつかの
細胞系は、Ｉまたはそれ以上の浸透圧調節剤、特に、糖
−アルコールに対して感受性である。したがって、標識
前に標準試験を行って、該細胞が予定した浸透圧調節剤
中にて生育可能であるということを確かめる。さらに、
少量の緩衝剤を該標識培地に加えて水素イオン濃度を調
節する。 種々の浸透圧調節剤に対する暴露の細胞生育力に対する
影響は、該細胞を種々の浸透圧調節剤に３０分間暴露し
た後のＹａｃ細胞の倍加時間を測定することにより決定
した。Ｙａｃ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから公に入手できるマウスリンパ腫組織
培養細胞系であり、キースリング、アール、ヨーロピア
ン・ジャーナル・イブ・イムノロジー（Ｋｉｅｓｓｌｉ
ｎｇ、　Ｒ，。 Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
、　　５．　１１２Ａ＋１１７（１９７５）により記載
されている。第１表に示したデータが示すように、リン
酸塩緩衝生理食塩水と比較した場合、シュークロース、
グルコースおよびグツド緩衝剤、ＴＡＰＳ　　ＣＡＰＳ
ｌＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびＤＩＰＳＯに対する暴
露は、細胞倍加時間に対して無視できる影響しか生じず
、暴露に関係した細胞毒性が存在しないことを示してい
る。 第１表 浸透圧調整剤　　　　　　　　　倍加時間（時間）リン
酸緩衝生理食塩水　　　　　　　　　３■、０シユーク
ロース　　　　　　　　　　　　　４１．０グルコース
　　　　　　　　　　　　　　　３４，５Ｔ　Ａ　Ｐ　
Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　３２．７ＣＡＰ
Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　４５．８ＥＰＰ
Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　３２．２ＨＥＰ
ＰＳＯ２３，４ 第１表（続き） 浸透圧調整剤　　　　　　　　　倍加時間（時間）ＤＩ
ＰＳＯ３６，７ ３−アミノ−１−プロパンスルホン酸　　　　　９９．
６３−（Ｎ−モノホリノ）プロパンスルホン酸　　　Ａ
ナトリウム（ＭＯＰＳ） ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン　　　　　
Ｂジオール ２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール　　　　Ｂ
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル　　　　Ｂアミ
ノエタンスルホン酸（ＴＢＳ） Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−Ａアミノ
エタンスルホン酸（ＢＥＳ） ３−（シクロへキシルアミノ）−２−ヒドロ　　　Ａキ
シ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ’Ｏ）トリエタ
ノールアミン　　　　　　　　　　Ｂトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノ　　　　　Ｂメタン（ＴＲＩＺＭＡ） Ａ−非増殖または部分的細胞毒 Ｂ−急性細胞毒 第１表（続き） 浸透圧調整剤　　　　　　　　　倍加時間（時間）ビス
−トリスプロパン　　　　　　　　　　Ｂ２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）　　８３−［ジ
メチル（ヒドロキシメチル）　　　　　Ａメチルアミノ
コ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ） Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）　　　　　　　
５７．７グリシン（ＢＩＣＩＭＥ） ３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル　　　　　Ｂ
アンモニオ］−１〜プロパンスルホネート（ＣＩＡＰＳ
） ３−［Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）　　　　　　６
３．６メチルアミノコ〜２−ヒドロキシプロパンスルホ
ン酸（ＴＡＰＳＯ） ３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシ　　　　　１
７８．４プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ） 八−非増殖または部分的細胞毒 Ｂ−急性細胞毒 第１表（続き） 浸透圧調整剤　　　　　　　　　倍加時間（時間）２−
［２−アミノ−２−オキソエチル）アミノ］、　　ＬＯ
３８，４エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリ　　Ａスー
（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂ　＋５−ＴＲ＋５）２
−（Ｎ−シクロへキシルアミノ）エタン　　　　５１．
５スルホン酸（ＣＨＥＳ） Ｎｉリス−（ヒドロキシメチル）メチル　　　Ａグリシ
ン（ＴＲＩＣＩＭＥ） グルコサミン　　　　　　　　　　　　　　２８８．４
イミダゾール　　　　　　　　　　　　　Ｂグリシルグ
リシン　　　　　　　　　　　６６．９Ａ−非増殖また
は部分的細胞毒 Ｂ〜急性細胞毒 第２表は、シアニン染料溶解性について調べた種々の浸
透圧調節剤を示している。濃度の測定は、全て、逮心分
離により沈澱を除去し、かつ、分光蛍光分析のためにシ
アニン染料を含有する浸透圧調節剤の少量をエタノール
中に溶解した後に行った。用いた染料はＤｉｓ　Ｃ＋４
（５）およびＤ　１０　Ｃ＋４（３）であり、かつ、該
浸透圧調節剤は等浸透圧濃度であった。エタノール溶液
標準からの蛍光強度の減少は、シアニン染料溶解度の減
少と直接相関している。 第２表 相対蛍光強度（ＣＤＮＣ） 浸透圧調節剤　　　　　　Ｄ＋ＳＣ＋−（５）　　Ｄ＋
０Ｃ１４（３）エタノール　　　　　　　　　１００　
　　　１００グルコース　　　　　　　　　３１　　　
　１００フルクトース　　　　　　　　３５　　　　１
００ソルボース　　　　　　　　４０　　　　１００シ
ユークロース　　　　　　　４１　　　　１００キシロ
ース　　　　　　　　　３８　　　　１９−５２リボー
ス　　　　　　　　　２４　　　　　ｔｏ。 リキソース　　　　　　　　　　０．１２　　　　　Ｌ
、Ｓグリシン　　　　　　　　　３１９３ アルギニン　　　　　　　　１７　　　　１７．２グリ
セロール　　　　　　　３９　　　　９９．５第２表（
続き） 相対蛍光強度（ＣＤＮＣ） ａ送圧ｇ節剤　　　　　　ＤｉＳＣ１４（５）　　Ｄ＋
ＯＣ＋４（３）イノシトール　　　　　　　４２９２ キシリトール　　　　　　　　３４　　　　７８．４マ
ンニトール　　　　　　　２９＊ アドニトール　　　　　　　３４　　　　　ＮＤトリス
（ヒドロキシメチル）１８ＮＤ メチルアミノプロパンスル ホン酸（ＴＡＰＳ） ３−（シクロへキシルアミノ）４ＯＮＤ−Ｉ−プロパン
スルホン酸（ＣＡＰＳ）Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
１８ＮＤピペラジン−Ｎ’−３−プロパン スルホン酸（ＮＰＰＳ） Ｎ−２−ヒドロキシエチル　　　　２０　　　　　ＮＤ
ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシ プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ） ＊：エタノール中にて沈澱し、データ得られず。 ＮＤ：測定せず。 第２表（続き） 相対蛍光強度（ＣＤＮＣ） ゛′透座圧調節剤　　　　　ＤｉＳＣＩ−（５）　　Ｄ
ｉＯＣ＋４（３）３−［Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
　　４３＊＊＊　　ＮＤエチル）アミノクー２−ヒドロ
キシ プロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ） ＮＡＣ１６１，７ リン酸塩緩衝生理食塩水　　　２．１　　　　６．５Ｎ
ａｔＳ　ｏ、　　　　　　　　　　７．４　　　　１．
６ＮａＩ　　　　　　　　　　　　　１．１　　　　０
．１４塩化コリン　　　　　　　　１１＊＊　　　　６
Ｊヨウ化コリン　　　　　　　　０．１６　　　２．３
＊＊：ペレットにならず大結晶のために人為結果＊＊＊
：エタノール中にて沈澱（データ疑問あり）ＮＤ：測定
せず。 第２表から明らかなように、シアニン染料は、リキソー
スを除く糖、糖−アルコール、アミノ酸およびグツド緩
衝剤、ＴＡＰＳＳＨＥＰ’ＰＳＯ。 ＤＩＰＳＯｌＣＡＰＳおよびＥＰＰＳの存在下より古典
的塩の存在下にて極めて溶解しにくい。さらに、グルコ
ース、フルクトース、リボース、ソルボース、シューク
ロースおよびキシロースのような糖、グリセロール、イ
ノシトール、キシリトールおよびアドニトールのような
糖−アルコールならびにグリシンおよびアルギニンのよ
うなアミノ酸中のＤｉＳＣＩ４（５）溶液の安定性を測
定した。 該シアニン染料は、再現可能な標識のために十分な時間
である少なくとも２０分間試験溶液中で安定であり、か
つ、多くの該薬剤において、溶液中のシアニン染料の量
は、６０分では著しい減少を示さなかった。 さらに、シアニン染料が溶解可能である古典的塩および
浸透圧調節剤を含有する培地中のシアニン染料の溶解度
を調べた。等浸透圧性グルコース溶液中のｐｉｓｃ、４
（５）の溶解度は、蒸留水での希釈によって顕著な影響
を受けなかった。しかし、等浸透圧性グルコース溶液中
のＤＩＳＣ１４（５）の溶解度は、約２０％等浸透圧性
塩化ナトリウム溶液のみにて希釈することにより顕著に
減少した。 すなわち、シアニン染料を用いた再現可能な細胞標識は
、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢
酸ナトリウム、酢酸カリウム、硫酸ナトリウム、ヨウ化
ナトリウム、塩化コリンまたはヨウ化コリンのような古
典的塩の極く少量を含有する培地中にて行うことができ
、好ましくは、古典的塩を用いずに浸透圧を調節した培
地中にて行う。 本発明方法を用いて標識した細胞シアニン染料を分析し
て細胞生育力に対する標識の影響を測定した。アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、
メリーランド（ｔｈｅＡ１４＋ｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐ
ｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔ１０ｎ。 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手で
き、がっ、ブレスコツト、ディー・エム、アナルズ・イ
ブ・ニューヨーク・アカデミ−・イブ・サイエンシーズ
（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ、　Ｄ、Ｍ、、　Ａｎｎ、　Ｎｅｗ
　　Ｙｏｒｋ　　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、）、３９７．ｆ０１〜１０９（１９８２）に記
載されているＶ７９細胞を、ｌｏｌまたは４×１０−１
１Ｍの濃度にてＤ　１０　Ｇ　、４（３）を含有する溶
液を用いて標識し、該染色細胞の増稙動力受、＋−非染
色細胞ならびに染色および非染色細胞の等積混合物と比
較した。細胞倍加時間は、シアニン染料標識により影響
されなかった。すなわち、標識は、細胞増殖に影響しな
かった。また、トリパンブルー排除およびヨウ化プロピ
ジウム排除のようないくつかの他の細胞生育力の標準試
験は、前記方法によるシアニン染料標識の細胞生育力に
対する影響の欠如を確認した。 本発明方法により標識した細胞シアニン染料のｉｎ　　
ｖｉｖｏ安定性を試験するため、ウサギ赤血球を採取し
、Ｄ　ｉＳ　Ｃ１４（５）にて標識し、再注入した。そ
の後定期的に血液試料を採取し、標識細胞百分率および
該標識細胞の蛍光強度を分析した。 循環赤血球の数は、時間の関数として１次的に減少し、
測定した標識細胞の５２日の寿命は、ウサギ赤血球につ
いて報告されている４０〜６０日の平均寿命と密接に相
関していた。すなわち、シアニン染料標識は、赤血球の
クリアランス率に影響を及ぼさなかった。 試験した５匹のウサギのうち１匹を除き全てにおいて、
染色細胞の蛍光強度は、標識および再注入後６０日の間
実質的に未変化であった。５番目の動物においては、該
シアニン染料の２０％以下が、ウサギの循環において６
０日後に該標識細胞から移動した。これらのデータは、
標識細胞から非標識細胞への染料の移動がないことを示
す組織培養からのデータと合わせて、該細胞が該染料に
て安定に標識されるということを示している。 シアニン染料−標識生育可能細胞が、細胞増殖速度を測
定するため本発明方法において用いられる。増殖速度は
、細胞の原形質膜中のシアニン染料の濃度の変化を測定
することにより測定される。 細胞が分裂する度に、原形質膜に結合したシアニン染料
は、娘細胞間に等しく分配される。すなわち、標識した
増殖細胞の原形質膜シアニン染料濃度の連続的測定値を
用いて増殖速度を計算する。 標準的方法を用いるフローサイトメトリー法は、非付着
細胞またはその増殖基質から取り去り、かつ、単一細胞
として懸濁できる細胞の原形質膜シアニン染料濃度を測
定するのに好ましい。付着細胞サイトメーター（メリデ
ィアン（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）Ａ　ＣＡＳ４７０）は、増
殖基質からの取り出しが困難であるか不可能である場合
に好ましい。 細胞増殖速度の測定は、種々の応用に用いられる。例え
ば、組織培養細胞の増殖速度を測定して増殖条件を最適
化する。化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性は、これ
らの薬剤を含有する培地中の細胞増殖速度を測定するこ
とにより決定する。 同様に、種々の抗真菌剤に対する酵母細胞の感受性は、
抗真菌剤含有培地中の酵母細胞の増殖速度を測定するこ
とにより決定する。 本発明の方法は、また、ｉｎ　　ｖｉｖｏにて組織細胞
の増殖速度をモニターするために用いられる。例えば、
骨髄移植物癒着は、移植後の骨髄細胞増殖速度を測定す
ることにより決定する。角膜上皮細胞のような他のｉｎ
　　ｖｉｖｏ細胞の増殖速度を測定して、外傷後または
手術後の回復を決定する。 実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。 実施例１ 組織培養細胞の染色方法 ■、細胞の調製 最良の結果を得るために対数期組織培養細胞を用いる。 懸濁培養物を培養容器から取り出し、ポリプロピレン遠
沈管に入れる。 単層培養を用いる場合、上清を除去し、カルシ６ムおよ
びマグネシウム不含リン酸塩緩衝生理食塩水溶液にて付
着細胞を洗浄して、該フラスコから血清タンパクを除去
しなければならない。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ギブ
コ・ラボラトリーズ、グランド・アイランド、ニューヨ
ーク（Ｇｉｂｃ。 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　　ｌ５ｌａ
ｎｄ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）＃６１Ｏ〜５３００）を
加えて該フラスコの底をおおい、該細胞単層が移動し、
かつ、分離するまで室温にてインキュベートする。得ら
れた細胞懸濁液をポリプロピレン遠沈管に移し、ｌＯ％
胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ハラエルトン（Ｈａｚｅｌｔ
ｏｎ））を含有する等容量の培地を加えてトリプシンの
酵素作用を抑制する。 細胞を室温にて１０分間４００　Ｘ９にて遠心分離する
。上清を吸引し、等容量の等浸透圧性マンニトールを該
細胞ベレットの再懸濁のために取り替える。このマンニ
トール洗浄は、血漿タンパクを該細胞懸１Ｂ液から除去
し、かつ、染色用細胞を調製するためである。再度、細
胞を室温にて１０分間４００　Ｘ９にて遠心分離する。 上清を吸引し、得られた細胞ベレットを染色のため２Ｘ
ｉＯ−’細胞／ｆｆ１２の濃度にてマンニトール溶液中
で再懸濁する。しかし、いくつかの細胞系は、糖−アル
コール（マンニトール）の使用に対して感受性であり、
そのような場合、等浸透圧性グルコース溶液（ＭＷ１８
０．＋６．５４．０５９／ｆｆ）を用イルコトカできる
。 ■、貯蔵染料溶液の調製 ２　ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ貯蔵溶液は、以下のように無水エ
タノール中にて調製する。 Ｄ　ｉＯ−Ｃ，４（３）　　　　ＭＷ８００（１，６０
０ｍｇ／ｌｌ１２）ＤｉＳ−Ｃ１４（５）　　　　　Ｍ
Ｗ８１４（１，６２８朽／ｚのＤ　１０　　Ｃ、ｓ（３
）　　　　　ＭＷ９３６（１，８７２３１９／ｆｆ１２
）ＤｉＩ−Ｃ，４（５）　　　　　ＭＷ８５０（１，７
０ｈ９＃ＩＱ、）全ての染料は、モレキュラー・ブロー
ブス、ニージーン、オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐ
ｒｏｂｅｓ、　Ｅｕｇｅｎｅ。 Ｏｒｅｇｏｎ）から得られる。 染料貯蔵物を音波処理して該染料の完全溶解を確実にし
、かつ管に対する付着を最小限にする。 貯蔵溶液の調製のためにポリスチレン管を用いるので該
染料の溶解性を観察できる。しかし、水性雰囲気下にお
けるシアニン染料は、ポリスチレンと比較した場合ポリ
プロピレンに対する付着が極めて少ないためポリプロピ
レン管を用いて細胞を染色する。 ■、細胞染色 細胞を等浸透圧性マンニトール中２Ｘ１０６細胞／ＩＩ
Ｑの濃度に調整する。細胞を染色するために、２　Ｘ　
１０−’Ｍ貯蔵染料溶液を細胞懸濁液１酎当たり染料５
μρにて該染色溶液に加え、ＩＯμＭの最終濃度にする
。染色する試料をピペットで分注するか、または撹拌し
て該試料を十分に混合する。 細胞と該染料を１０分間インキュベートし、その後蛍光
顕微鏡下での試験用に少量を取って強く、かつ、均一な
染色が生じていることを確実にする。 ＤｉＯ染料系列は、４８８ｎｍ励起光に対して選択的な
顕微鏡フィルターを用い、一方、ＤｉＳおよびＤｉｌ染
料系列は、蛍光観察のために５７５ｎｍ付近にて励起を
必要とする。 インキュベーション期間後、等容量のＰＢＳを該染色細
胞懸濁液に加える。該細胞を２０℃にて１０分間４ｏｏ
ｘｙにて遠心分離する。該上清を吸引し、ベレットをＰ
ＢＳ中で再懸濁する。該遠心分離操作を繰り返し、染料
の存在について得られた上清を観察する。染料が上清中
に見られる場合、分光蛍光計により測定した時に該上清
が遊離染料を有しなくなるまで洗浄を繰り返す。最終洗
浄後、上清を除去し、ペレットを適当な培地中にて所望
の濃度に再懸濁する。全ての操作は、滅菌条件下にて行
なう。 実施例２ 組織培養細胞の増殖速度の測定 Ｖ７９細胞を前記実施例Ｉと同様にＤ　ｒｏ　Ｃ＋４（
３）にて染色する。蛍光強度は、ＥＰ　Ｉ　ＣＳ　７５
３フローサイトメーター（コールタ−・エレクトロニク
ス・インコーボレーティッ）’　（ＣｏｕｌｔｅｒＥｌ
ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　　Ｉ　ｎｃ、　））を用いて測
定する。染色後直ちに、染色細胞の一部の蛍光強度を測
定する。 残存細胞を標準完全増殖培地中３７℃にて加湿空気−〇
　〇　、（７、５％Ｇｏ、）中にて増殖する。染色後１
，２および３日月に蛍光強度測定のために細胞の一部を
取る。 第１図は、増殖Ｖ７９細胞の★す数蛍光強度特性を示し
ている。各ピーク上の数値は、それぞれの日の平均対数
蛍光強度である。第１図が示すように、平均対数蛍光強
度は、該細胞が培養にて増殖するにつれ日々減少する。 蛍光測定から、増殖速度は、時間に対する対数蛍光強度
のプロットの直線部に適合した回帰線の勾配から測定す
る。 該細胞の染色が増殖速度に影響を及ぼさないことを明確
にするため、染色および非染色Ｖ７９細胞の増殖速度を
比較する。第２図に示した結果は、非染色細胞が、１０
−５Ｍ染料または４ＸＩＯ−’Ｍ染料にて染色した細胞
または染色および非染色細胞の等量混合物と同等の速度
にて増殖することを示している。 染色細胞から非染色細胞への染料移動は、誤った増殖速
度測定をもたらすと思われるので、染色および非染色細
胞を同時に培養中にて増殖する。 ｐ＋ｏｃ１４（３）にて染色したアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド
（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔ１０ｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可能であり、かつ、ジ
ェイ・ホブおよびジー・トレンプ、ヒユーマン・チュー
７・セルズ・イン−ビトロ、１１５〜１５９頁、プレナ
ム・プレス、ニューヨーク　（Ｊ、　Ｆｏｇｈ　　ａｎ
ｄ　　Ｇ、　Ｔｒｅｍｐ。 Ｈｕｍａｎ　　Ｔｕｍｏｒ　　Ｃｅ１ｌｓ　　Ｉｎ　　
Ｖｉｔｒｏ、　ｐｐ、　　１１５−１５９　、　Ｐｌｅ
ｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）（１９
７５）に記載されているヒト結腸癌細胞系ＨＴ２９およ
びアメリカン・タイプ・カルチャー・“コレクション・
ロックビル、メリーランドから人手可能であり、かつ、
コリンズ、ニス・ノエイら、ネイチ’ｒ　−（Ｃｏ１１
ｉｎｓ、　Ｓ、　　Ｊ、　、　ｅｔ　　ａｌ、　。 Ｎａｔｕｒｅ）、２７０，３４７〜３４９　（１９７７
）に記載されている非染色ヒト前骨髄細胞性白血病細胞
ＨＬ６０を１：１の染色細胞対非染色細胞の比にて同時
に増殖するこれらの結果を第３図に示す。 第３図において、単独にて培養した染色Ｉ−ＩＴ２９細
胞の蛍光強度（菱形）は、培養時間の関数として蛍光強
度の特有の減少を示す。非染色１４Ｌ６０細胞は４日間
非常に僅かの蛍光しか有さす、その後蛍光強度のある適
度な増加を示す。さらに、■４Ｌ６０細胞と共培養した
染色ＨＴ２９細胞（四角形）は、約５８目まで非混合Ｈ
Ｔ２９細胞と丁度同様に蛍光強度を失い、さらにある程
度のしかし最小の蛍光強度の減少を示す。これらの結果
から、おそら＜ＨＥ、６０の細胞は、ＨＴ２９細胞と共
に４日間培養した後いくらかの蛍光を獲得することは明
らかである。しかし、ＨＬ６０細胞は、前骨髄細胞性で
あり、細胞および破片を食作用する能力を幾分有するこ
とに注意すべきである。実際に、混合培養の非染色部分
母集団における実験４日後の蛍光強度の増加は、蛍光破
片の食作用の結果である。さらに重要なことには、培養
の４日間、非染色Ｉ（Ｌ６０細胞の蛍光強度は増加して
いない。 さらに、同一混合物中の染色ＨＴ２９細胞は、混合して
いないＨＴ２９細胞と同様の蛍光動力学を有していると
考えられる。すなわち、細胞間染料移動は、誤った増殖
速度測定をもたらさない。 実施例３ 腫瘍細胞の増殖速度の測定 試験する腫瘍細胞が、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ培養条件にて
採用される組織培養系である場合、実施例１および２に
て概要を示したように該細胞を染色し、評価する。試験
する腫瘍細胞が腫瘍組織エクスプラントである場合、そ
れらを標準方法により単一細胞に分離し、ラボ−チク（
Ｌ　ａｂ　−Ｔ　ｅｃｈ）組織培養チャンバースライド
上に平板塗布する。該細胞を実施例１にて概要を示した
ようにシアニン染料を用いて染色する。ついで、それら
を３７℃にて加湿空気−ＣＯ，インキュベーター中に入
れ、平衡にする。一定間隔にて、該スライドを付着細胞
サイトメーター（すなわち、メリディアン（Ｍｅｒｉｄ
ｉａｎ）ＡＣＡＳ４７０）の顕微鏡載物台上に置き、蛍
光強度の測定を行う。蛍光強度の連続的測定を行うこと
ができるようにインデックスマークに関する該細胞の位
置をコンピューターにより測定する。 スライドをインキュベーターに戻し、該細胞を継続して
増殖させる。該顕微鏡スライドは、蛍光強度が培養時間
とともに変化しないコールタ−完全透明ポリスチレンミ
クロスフイア（コールタ−・エレクトロニクス、バイア
レア、フロリダ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｉｃｓ、　Ｈｉａｌｅａｈ、　Ｆｌｏｒｉｄａ）のよう
な蛍光標準を含有する。この標準は、蛍光強度の比較測
定を行うために用いられる。 腫瘍細胞は、顕微鏡による位相光学を用いた形態計測パ
ラメーターまたは腫瘍細胞にに特異的な蛍光モノクロー
ナル抗体に基づいて通常の基質細胞から同定する。細胞
増殖の測定は、各細胞が分裂した時の腫瘍細胞中のシア
ニン蛍光の希釈をモニターし、実施例９の方程式を適用
することにより行う。 蛍光強度の測定は、また、フローサイトメーターを用い
て行うことができる。しかし、該細胞は、フローサイト
メトリー分析を行う前に顕微鏡スライドから移動する。 この方法は、何日間も同一細胞による染料希釈の連続的
定量を許容しない。しかしながら、白血病細胞のような
いくつかの場合には、この方法が好ましい。 ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ細胞増殖の測定方法は、最適増殖培
地にてまたは腫瘍を治療するために用いられる薬剤の種
々の濃度の存在下にて培養させた細胞を用いて行われる
。蛍光強度減少の抑制により測定されるような腫瘍細胞
増殖を抑制するための治療剤の活性は、腫瘍細胞を死滅
させるその薬剤の有効性の尺度である。 実施例４ 白血球増殖速度の測定 リンパ球は、標準方法を用いて静脈穿刺または線繊切開
により採取する。浸透圧維持媒質としてマンニトールの
代わりにグルコースまたはシュークロースを用いる以外
実施例１に挙げた方法を用いてシアニン染料にて該細胞
を標識する。ついで、ｌウェル当たり５Ｘ１０’細胞の
濃度にて該染色細胞を微量滴定皿中に等分しくマツムダ
−、ニー、グリム、イー・ニー、ツァング、エッチ・ゼ
ットおよびローゼンベルグ、ニス・ニー、キャンサー・
リサーチ（Ｍｚｕｎｄｅｒ、　Ａ、　Ｇｒｉｍｍ、　Ｅ
、　Ａ、　。 Ｚｈａｎｇ、　Ｈ，Ｚ、　ａｎｄ　　Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ、　Ｓ、　Ａ、　。 Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、　）、　４２．９１８（１９
８２））、インターロイキン−２、過ヨウ素酸ナトリウ
ム（ＩＯ，−）、フィトヘマグルチニン、コンカナバリ
ンＡ１アメリカヤマゴボウ−有糸分裂促進物質およびＢ
細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）のような適当な有糸分裂促進
物質とともにインキュベートする。該細胞を３７℃加湿
空気−ＣＯ，インキュベーター中に入れ、増殖させる。 一定間隔にて細胞を培養容器から採取し、フローサイト
メトリー法により調べる。得られた結果は、実施例２の
方法により得られた結果と同じであり、実施例９の方程
式を用いて分析する。 実施例５ 細菌増殖速度の測定 浸透圧維持媒質としてマンニトールの代わりにグルコー
スまたはシュークロースを用いる以外実施例１に挙げた
方法を用いて該細胞をシアニン染料にて標識する。つい
で、該染色細胞を栄養ブロス中ｌウェル当たり５Ｘ１０
’細胞の濃度にて微ｍ滴定皿中に等分する。該細胞を３
７℃加湿インキュベーター中に入れ、増殖させる。一定
間隔にて、細胞を培養容器から採取し、フローサイトメ
トリー法により調べる。得られた結果は、実施例２の方
法にて得られた結果と同じであり、実施例９の方程式を
用いて分析する。 ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ細胞増殖の測定方法は、最適増殖培
地にてまたは抗細菌剤として試験される抗生物質の種々
の濃度の存在下にて培養した細胞を用いて行われる。細
胞蛍光強度減少の抑制により測定されるような細菌細胞
増殖を抑制する殺菌剤の活性は、細菌を死滅させるその
薬剤の有効性の尺度である。 実施例６ 酵母増殖速度の測定 浸透圧維持媒質としてマンニトールの代わりにグルコー
スまたはシュークロースを用いる以外実施例１に挙げた
方法を用いて該細胞をシアニン染料にて標識する。つい
で、該染色細胞を栄養ブロス中１ウェル当たり５Ｘ１０
’細胞の濃度にて微量滴定皿中に等分する。該細胞を３
７℃加湿インキュベーター中に入れ、増殖させる。一定
間隔にて、細胞を培養容器から採取し、フローサイトメ
トリー法または付着細胞サイトメトリー法（メリディア
ン（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）Ａ　ＣＡ　Ｓ　４７０　）によ
り調べる。得られた結果は、実施例２の方法より得られ
た結果と同じであり、実施例９の方程式を用いて分析す
る。 ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ細胞増殖の測定方法は、最適増殖培
地にてまたは抗真菌剤として試験される化合物の選択さ
れた濃度の存在下にて培養した細胞を用いて行われる。 細胞蛍光強度減少の抑制により測定されるような真菌細
胞増殖を抑制する殺真菌剤の活性は、真菌を死滅させる
その薬剤の有効性の尺度である。 実施例７ 骨髄細胞の増殖速度の測定 骨髄細胞は、胸骨または腸骨稜から吸引（イリノイ針）
により、またはコアバイオプシー（ジャムシティー針）
により採取する。浸透圧維持媒質としてマンニトールの
代わりにグルコースまたはシュークロースを用いる以外
実施例１に挙げた方法を用いて該細胞をシアニン染料に
て標識する。該細胞をフローサイトメトリー分析に付し
、被験者中への該骨髄細胞の注入前に蛍光強度の濃度を
測定する。標識細胞を静脈内注射し、゛末梢血液および
骨髄を採取する前に適当な間隔の時間を経過させる。血
液および骨髄を被験者から採取し、抗凝血剤と混合し、
標準方法によりフローサイトメトリー分析の準備をする
。これらの試料は、増殖している細胞および細胞サイク
ル停止状態の細胞を含有している。ヒストグラムは複雑
であるか、実施例２の方法にて得られた結果と同様の細
胞増殖について実施例９の方程式を適用することにより
分析する。 追跡染料が緑色蛍光であるため、モノクローナル抗体に
結合した他の染料が、骨髄中に見出される細胞系統のそ
れぞれから細胞を同定するために用いられる。赤血球お
よびその前駆体を染色するモノクローナル抗体を用いる
場合、この系統を同定し、ついで赤血球系統中の該細胞
の緑色蛍光の減少（ゆえに細胞増殖）をモニターするた
めに赤色蛍光が用いられる。 同様の２色法が、リンパ性、骨髄および単核白血球細胞
骨髄を評価するために用いられる。 実施例８ 角膜上皮増殖速度の測定 この方法は、移植後の角膜上皮細胞の増殖をモニターす
るために用いられ、細胞増殖に対して無毒であるか、ま
たは細胞増殖をモニターする場合眼に対して痛みを与え
ない手法を用いる。移植直後、６８０ｎｍより長波長の
光を吸収するシアニン染料の眼科用処方中に眼を入れる
。該方法は、６８０ｎｍより短波長の光を吸収する染料
を用いても実施されるが、該励起光線は、該組織を試験
する際、激しい頭痛をひき起こす。 ０時間目に、角膜に結合したシアニン染料を励起しなが
ら赤外線写真を撮る（染料の吸収極大より長波長）。蛍
光強度水準は、０時間目の細胞染色の尺度である。その
後、眼を写真撮影し、該像を０時間目の写真と比較する
。細胞増殖が存在する領域において、該細胞の蛍光強度
が減少する。 該蛍光強度の定量的評価を用いて細胞倍加数を求める。 実施例９ 細胞増殖速度の計算 っぎの数式： ［式中、ＴＤは細胞倍加時間、ｔ、および（、は対数期
細胞増殖の間のいずれかの時間、ｒ；’（ｔｔ）および
Ｆ（ｔυは、それぞれ、時間り、および【、の平均細胞
蛍光強度ならびにＩｎは０数対数（底ｅ）を意味する］
を用いて細胞倍加時間を計算する。 増殖期の間に生じる細胞倍加数は、式：［式中、Ｎは細
胞倍加数、Ｆｏは初期蛍光強度およびＦ　（ｔ）は細胞
増殖期後のいずれかの時間の蛍光強度を意味する］ により求める。細胞倍加数の測定のために、細胞増殖の
対数期の間に蛍光測定を行う必要はない。 つぎの導関数は、前記式が細胞倍加時間および細胞倍加
数を正確に定量することおよび数学モデルにより予想さ
れる増殖細胞中の原形質膜シアニン染料濃度の挙動が実
際に測定したものと近似していることを示している。 該導関数は、つぎの仮定に基づいている。 夏、細胞は、初期細胞数（Ｎｏ）、平均初期蛍光強度（
Ｆ　ｏ）および細胞サイクル時間（Ｔ、）により低密度
にて培養を始める。 ２、染料は、細胞分裂の際娘細胞に均一に分配する。 ３、培養時に遅延時間は存在しない。 ４、細融死は無視できる。 ５、染色は永続し、細胞間染料移動は存在しない。 前記の２番目の仮定に基づくと、平均母集団蛍光は、い
ずれかの時間ｔにおける母集団の細胞数に逆比例するは
ずである。この関係は、式（１）：％式％（１） ［式中、Ｆ　（ｔ）およびＮ　（ｔ）は、それぞれ、時
間（における平均母集団蛍光および細胞数を意味する］
にて規定される。Ｋは比例定数と定義する。０時間口に
この式を計算する場合、Ｋ＝Ｆ、Ｎ、となる。 これを式（１）に代入して、Ｆ（ｔ）’について解いて
Ｆ（ｔ）＝ｒｏＮｏ（１／Ｎ（ｔ））　　　　（２）［
式中、ＦｏおよびＮ。は前記と同意義である］を得る。 用いる染料が理想態様にて作用する場合、蛍光動力学は
、増殖動力学と直接関係するはずであるということが式
（２）から明らかである。該蛍光動力学を明確にする関
係式をつぎに求める。 式（２）の細胞数は、以下に定義した一般的増殖動力学
： ｄＮ（ｔ）／ｄｔ＝ＡＮ（ｔ）　　　　　　（３）［式
中、Ａは母集団増殖速度を母集団の細胞数と関連づける
比例定数である］ になる。 式（４）〜（７）は、式（３）の単純群である。 ｄＮ（ｔ）／ｄＮ（ｔ）＝ｄｌｎＮ（ｔ）＝Ａｄｔ　　
（４）Ｎ（ｔ）＝ｅｘｐ（Ａｔ＋　ｃ）　　　　　　　
　（！５　）Ｎ（ｔ）＝Ｎｏｅｘｐ（Ａｔ）　　　　　
　　　　（６）Ｎ　（ｔ）　−Ｎ　０ｅＸｐ（０，６９
３ｔ／　Ｔ　ｔ）　　　　（７）式（７）の結果を式（
２）に代入してＦ　（ｔ）について解くことができる。 これは直接式： ％式％（９） に換算する。 この式の解釈には、注意深い考察が必要である。 第１に、本発明者らは、細胞死を無視できると仮定して
いるので、Ｔ、は、細胞倍加時間ではなく細胞サイクル
時間を示す。この点を以下に注意深く考察する。細胞死
が存在する場合、死亡細胞に結合した染料が生存細胞に
より再吸収されない間は、この式は、なお有効である。 再吸収が生じる場合を以下に取り扱う。該母集団の一部
が増殖していない場合には、式（９）は、増殖画分に対
してのみ有効である。したがって、ＦｏおよびＮ。は、
増殖画分に対してのみ適用する。 蛍光動力学に対する細胞死の影響 細胞死が感知でき、かつ、生存細胞への染料移動が迅速
に生じる場合について考察する。細胞死の動力学を式（
１０）に示す。 （ｄＮ　（ｔ）／ｄｔ）　ｌ　＝　Ｂ　Ｎ　（Ｌ）　　
　　　　（１０）前記にて、Ｂは該母集団からの細胞の
損失速度を該母集団の大きさと関連づける比例定数であ
る。 導関数に下付き文字を付す。すなわち、■は細胞死の過
程に相当する。同じ方法にて式（３）を書き直す。 （ｄＮ（ｔ）／ｄｔ）、＝ＡＮ（ｔ）　　　　　　（３
）ここに、２は、細胞増殖の過程に相当する。増殖過程
および死亡過程を結合して式： ％式％） を得る。この式は、単に２つの独立した過程の重ね合わ
せの結果である。代入により、それは、式％式％（１２
） 式（４）〜（６）から類推して、この式を式：Ｎ（ｔ）
＝Ｎ、ｅｘｐ（（Ａ＋Ｂ）ｔ）　　　　（１３）に換算
する。 Ａは、式（７）において０．６９３／Ｔ、と決定される
。 同様の方法にて、Ｂは−０，６９３／Ｔ＋／ｌに等しい
ことが示されうる。−記号は、細胞死が減少過程である
という事実に相当する。また、Ｔ、八は、本発明者らが
、母集団の平均細胞半減期と称する減少定数を意味する
。代入により、式（１３）は、式： Ｎ（Ｌ）＝ＮｏｅＸＰ（（０，６９３／Ｔｚ−０，６９
３／Ｔ＋／１）Ｅ）　（１４）となる。式（３）および
（１４）を結合することにより、蛍光動力学について解
くことができる。 Ｆ（ｔ）＝Ｆｏｅｘｐ（（０，６９３／Ｔ＋／＊−０，
６９３／Ｔｚ）ｔ）　（１５）前記式において、定数Ｔ
、およびＴ１／、を以下に示すように結合である。 １／ＴＤ＝１／Ｔｔ　　＋／’ｒ、／ｌ　　　（１６）
式（１６）の関係を式（１４）および（Ｉ５）に組み入
れて以下に示す細胞および蛍光動力学式を得る。 Ｎ（ｔ）＝Ｎｏｅｘｐ（（０，６９３ｔ／ＴＤ）　　　
（１７ａ）Ｆ（ｔ）＝Ｆｏｅｘｐ（（０，６９３ｔ／Ｔ
Ｄ）　　　（１７ｂ）式（１７ａ）および（１７ｂ）に
おいて、パラメーターＴＤ　　は、時間の単位を有し、
細胞サイクル時間よりむしろ実際の細胞倍加時間を表わ
す。式（１７ｂ）は、細胞死が顕著であり、かつ、染料
再吸収が迅速である培養における蛍光分布を規定する。 これらの条件のいずれかが適合しない場合、式（９）を
適用する。式（１７ａ）および（１７ｂ）の比較は、細
胞および蛍光動力学が逆の関係にあり、細胞増殖曲線の
図および蛍光動力学曲線の逆関数が重なり合いうろこと
を示している。この事実を第４図に明確に示す。 細胞増殖遅延時間の組込み 細胞を培養中に入れる際に遅延時間が存在すると仮定す
る。また、さらに該母集団が、１段階にて増殖速度０か
らその最大速度まで達すると仮定することにより処理を
簡略化する。これらの条件下にて、細胞増殖を規定する
関係が、 Ｎ（ｔ）　＝　Ｎｏ　　　　　　　　　　　ｔ　＞　ｔ
ｌ、　　（１８ａ）Ｎ（ｔ）＝Ｎｏｅｘｐ（０，６９３
（ｔ−ｔｌ、）／ＴＤ）　ｔ＜ｔｌ　　（１８ｂ）であ
ることを容易に示される。 ここに、Ｊ、は、遅延時間と定義する。式（３）および
前記関係を結合して Ｆ（ｔ）　＝　Ｆｏ　　　　　　　　　　　ｔ　＞　Ｊ
、　（１９ａ）Ｆ（ｔ）＝Ｆｏｅｘｐ（−０，６９３（
ｔ−ｔ４．）／ＴＤ）　ｔ＜ｔｌ　（１９ｂ）を得る。 これらの式を用いて、Ｆｏを知り、かつ、指数的増殖の
間３または４回Ｆ　（ｔ）を測定することにより倍加時
間および遅延時間の両方を求めることができる。 増殖画分の測定 該母集団の一部分が増殖していない場合を考察する。初
めに、遅延時間が存在しないと仮定する。 その後、遅延時間を後に加える。この導関数のために、
定義が必要である。式（２１）において、Ｎ　ｏ　＝　
（Ｎ　ｏ）ｇ　＋　（Ｎ　ｏ）ｎ　　　　　　（２０）
下付き文字ｇおよびｎは、それぞれ増殖および非増殖画
分を表わす。いずれもの時間ｔにおいて、母集団中の細
胞数は、増殖および増殖母集団の合計である。 Ｎ（ｔ）＝（Ｎｏ）ｎ＋（Ｎｏ）ｇｅｘｐ（０，６９３
ｔ／ＴＤ）　　　（’２１）しかし、この式は、以前行
ったように式（３）中に代入できない。この場合、増殖
および非増殖画分は、別々に取り扱わなければならない
。このため、式（３）は、つぎのように書き直さなけれ
ばならない。 Ｆ　（ｔ）　−（Ｆ　ｏ）ｎ（Ｎ　ｏ）ｎ　（１／　Ｎ
　（ｔ））ｎ＋（Ｐａ）ｇ（Ｎｃ＋）ｇ（１／Ｎ（ｔ）
）ｇ　　　　（２２）式（２２）において、（１／　Ｎ
　（ｔ））ｎは、（１／（Ｎｏ）ｎ）に等しい。したが
って、該式は、以下に示すように換算される。 Ｆ（ｔ）＝（Ｆｏ）ｎ＋（Ｐａ）ｇ　（Ｎｏ）ｇ　（１
／Ｎ（ｔ））ｇ　　（２３）Ｆ（ｔ）＝（Ｆｏ）ｎ＋（
Ｆｏ）ｇ　ｅｘｐ（−０，６９３ｔ／ＴＤ）　　（２４
）また、式（１９ｂ）から類推により遅延時間を導入で
きる。 Ｆ（ｔ）＝　（Ｆｏ）ｎ＋（Ｆｏ）ｇ　ｅｘＪ）（−０
，６９３（ｔ−ｔＬ）／ＴＤ）式（２５）を用いて該母
集団中の増殖細胞の両分を求めることができる。部分母
集団が包含されているため、測定は、以前の場合より複
雑である。増殖画分を測定するためには、部分母集団が
識別できるまで待たなければならない。この時点におい
て、非増殖画分の蛍光強度を直接測定することができる
。増殖画分の時間についての蛍光強度の変化をＯ時間目
に外挿して０時間目の増殖画分の蛍光強度を算出するこ
とができる。すなわち、該増殖画分は、単に全母集団蛍
光強度に対する０時間目の増殖画分の蛍光強度の割合で
ある。

【図面の簡単な説明】 第１図は、時間の関数としての細胞蛍光強度減少を示す
グラフである。第２図は、染色細胞および非染色細胞の
増殖曲線を示すグラフである。第３図は、染色細胞から
非染色細胞への染色移動の欠如を示すグラフである。第
４図は、細胞および蛍光動力学を比較したグラフである
。 特許出願人　スミスクライン・ベックマン・、コーポレ
イション 代理人弁理士青山　葆　ほか１名 第２１ ｆ０方・５び非栄色ｖ７ｑ−唸の贈オＩ初力学時団（Ｂ
ｌ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）シアニン染料にて標識した親細胞に由来する娘細
   胞の原形質膜中のシアニン染料の濃度の変化を測定する
   ことを特徴とする細胞増殖速度の測定方法。
2. （２）蛍光を用いてシアニン染料の濃度の変化を測定す
   る前記第（１）項の方法。
3. （３）該細胞が組織培養細胞である前記第（２）項の方
   法。
4. （４）該細胞がヒト腫瘍細胞である前記第（３）項の方
   法。
5. （５）ヒト腫瘍細胞を癌治療剤含有培地中にて増殖して
   これらの薬剤に対する腫瘍細胞感受性を測定する前記第
   （４）項の方法。
6. （６）該細胞が白血球である前記第（３）項の方法。
7. （７）該シアニン染料がＤｉＳＣ＿１＿４（５）または
   ＤｉＯＣ＿１＿４（３）である前記第（３）項の方法。
8. （８）該細胞が細菌である前記第（２）項の方法。
9. （９）該細菌を抗細菌剤含有培地中にて増殖してこれら
   の薬剤に対する細菌感受性を測定する前記第（８）項の
   方法。
10. （１０）該シアニン染料が、ＤｉＳＣ＿１＿４（５）ま
    たはＤｉＯＣ＿１＿４（３）である前記第（９）項の方
    法。
11. （１１）該細胞が酵母である前記第（２）項の方法。
12. （１２）該酵母を抗真菌剤含有培地中にて増殖してこれ
    らの薬剤に対する感受性を測定する前記第（２）項の方
    法。
13. （１３）該シアニン染料が、ＤｉＳＣ＿１＿４（５）ま
    たはＤｉＯＣ＿１＿４（３）である前記第（１２）項の
    方法。
14. （１４）該細胞が、ｉｎ　ｖｉｖｏ組織細胞である前記
    第（２）項の方法。
15. （１５）該ｉｎ　ｖｉｖｏ組織細胞が移植細胞である前
    記第（１４）項の方法。
16. （１６）該移植細胞が骨髄細胞である前記第（１５）項
    の方法。
17. （１７）該ｉｎ　ｖｉｖｏ組織細胞が角膜上皮細胞であ
    る前記第（１４）項の方法。
18. （１８）該シアニン染料がＤｉＳＣ＿１＿４（５）また
    はＤｉＯＣ＿１＿４（３）である前記第（２）項の方法
    。
19. （１９）該シアニン染料が、６８０ｎｍより長波長にて
    光を吸収する前記第（２）項の方法。
20. （２０）該シアニン染料が、６８０ｎｍより長波長にて
    光を吸収する前記第（１７）項の方法。