JP2003525915A

JP2003525915A - 蛍光膜インターカレーティングプローブおよびその使用方法

Info

Publication number: JP2003525915A
Application number: JP2001564805A
Authority: JP
Inventors: ブライアン・ディ・グレイ
Original assignee: Phanos Tech Inc
Current assignee: Phanos Tech Inc
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2001-03-05
Publication date: 2003-09-02
Also published as: DE60138531D1; US20100003196A1; ATE429932T1; CA2402352C; CA2402352A1; EP1265640B1; WO2001066153A1; US7462347B2; EP1265640A1; AU4542401A; US8029767B2; US20060193780A1; AU2001245424B2; EP1265640A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、スペクトルの遠赤および近赤外波長において蛍光を発し、好ましくは、親油性側鎖を有するシアニン色素のファミリーに関する。本発明の色素は、商業的に入手可能な膜染色ビヒクルに可溶性であり、細胞中のまたは細胞から単離された膜のごとき親油性構造を迅速に染色するためのプローブとして有用であり、そこによく保持される。また、イン・ビボおよびイン・ビトロ双方にて染色された細胞を検出するための色素に使用方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の相互参照本出願は、引用してここに一体化させる２０００年３月３日に出願された米国
仮特許出願シリアル番号第６０／１８６，６８２号に関連する。

【０００２】発明の分野本発明は、色素およびプローブとして有用な蛍光膜インターカレーティング化
合物に関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞、リポソーム、マイクロスフィ
アおよびウイルス粒子を含めた、種々の親油性粒子または親油性構造を含む物体
を迅速に標識するのに有用な増大したシグナル／ノイズ比を持つ親油性蛍光化合
物に関する。

【０００３】関連技術の記載蛍光色素は多くの用途を有し、蛍光の高い感度検出が望ましい生物学的適用に
特に適していることが知られている。試料中の特異的生物学的成分に結合させる
ことによって、蛍光色素を用いて、試料中の特異的成分の存在または量を示すこ
とができる。種々の蛍光色素は蛍光染色に利用でき、そのような色素は、例えば
、細胞、蛋白質、ＤＮＡおよびＲＮＡの定量で使用される。また、蛍光色素は、
種々の生理学的条件に応答した細胞トラフィッキングをモニターするのにも使用
される。そのような色素は、細胞ソーティングおよび細胞のトラフィッキング、
増殖その他の応答のモニタリングが望まれる臨床および研究の双方の適用におい
て広い範囲の適用性を有する。

【０００４】蛍光色素は、感度が高い検出試薬が望ましい生物学的適用に特に適しているこ
とが知られている。試料中の特異的生物学的成分または構成要素に優先的に結合
できる色素は、観察者が、その特異的成分または構成要素の存在、量または位置
を測定できるようにする。加えて、特異的生物学的系は、種々の環境においてそ
の空間的および時間的分布に関してモニターすることができる。シアニンは、そ
の高い消光係数、励起および発光特性において予測可能なシフトを生じる構造的
変化の系列的選択へのその適用性のため、そのような適用で特に有利である。そ
の結果、シアニン色素は、種々の生物学的適用で用いられてきた。生きた細胞を
標識し、染色された細胞をイン・ビボで追跡し、次いで、細胞の増殖速度を測定
する目的で、容量オスモル濃度調節剤と組合せた、ＤｉＩＣ_１８、ＤｉＯＣ_１８およびそれらのＣ_１２ないしＣ_２２ホモログを含めた、ある種のカチオン性親油
性シアニン色素の使用は以前より記載されてきた。

【０００５】ここに引用して一体化させる米国特許第４、７６２、７０１号は、スペクトル
の可視領域で蛍光を発するシアニン標識細胞を追跡するための、および対象に投
与された標識細胞中の色素が消失する速度を測定することによって細胞の寿命を
測定するためのイン・ビボ方法に関する。

【０００６】ここに引用して一体化される米国特許第４、７８３、４０１号は、とりわけ、
培養された細胞の増殖速度を測定するための、スペクトルの可視領域で蛍光を発
するシアニン色素を用いた細胞を標識する方法に関する。

【０００７】ここに引用して一体化させる米国特許第４、８５９、５８４号は、イン・ビト
ロおよびイン・ビボで増殖する、スペクトルの可視領域で蛍光を発するシアニン
標識細胞の増殖速度を測定する方法に関する。

【０００８】ここに引用して一体化させる米国特許第５、８０４、３８９号は、スペクトル
の可視領域で蛍光を発するシアニン色素で細胞膜を標識し、次いで、標識された
細胞が粘膜表面から脱落される速度を観察することによって、異常な細胞脱落速
度を測定する方法に関する。

【０００９】ここに引用してやはり一体化させるＬｅｕｎｇらに対する米国特許第６、００
４、５３６号は、好ましくは長さが等しく、反応性官能基、あるいは細胞または
組織中の膜、細胞、天然または人工リポソーム、リポ蛋白質またはポリマーから
単離された膜のような親油性構造を染色するのに有用なフェニル、スルホ、スル
ホフェニル、またはブロモもしくはクロロ置換基いずれかを取り込んだ２つの親
油性アルキル鎖を保有するシアニン色素に関する。Ｌｅｕｎｇらは、該色素が好
ましくは水性環境で可溶性であると述べている。

【００１０】フローサイトメトリーおよび蛍光活性化ソーティングを用いて、血液および骨
髄中の細胞集団における異なるクラスの細胞が広く分離されてきた。そのような
方法は、研究および治療用途のために、白血病およびリンパ腫のタイプ分けにお
けるツール（例えば、米国特許第５、２３４、８１６号参照）として、相互から
異なるタイプの白血球を分離し、他の細胞型から単離された血液幹細胞先祖画分
を得るのに（米国特許第５、１３７、８０９号、１９９２年８月１１日）特に有
用である。フローサイトメトリーは臨床研究用途で日常的になってきた。細胞の
いくつかのパラメーターは同時に測定することができ：前方散乱光を用いて細胞
のサイズを測定し：および、第２の散乱ディテクターは細胞質の顕粒性について
の情報を供する。これらの方法を用いて、種々のタイプの白血球を分化させるこ
とができる。その各々が特異的細胞標的分子に結合した種々の「フルオロクロー
ム」から発せられた蛍光はサイトメーターによって集光される。これらのパラメ
ーターは、色素−結合分子およびその標的の特異性および組合せに応じて広い範
囲の適用を生じる。

【００１１】今日、サイトメトリーは３日ないし４日のカラーデータの相関分析に依拠する
が、視野をより多くのプローブ／細胞の使用に向けて迅速に移動させ、（例えば
、免疫応答の発生におけるごとく）複合体混合物中の細胞の種々の亜集団の特徴
を分析することによって、複雑な細胞内および細胞外事象を解明する。フルオロ
クロームの励起および発光特徴の性質は、細胞に付着できる３または４を超える
目に見える発光フルオロクロームを選択するのを困難とし、これは、波長が十分
に分離された発光を供し、良好な空間的／またはスペクトル的区別を与える。

【００１２】また、安定な蛍光プローブでの細胞蛋白質または膜の一般的な標識は、例えば
、免疫系機能を分析する場合、複雑な細胞間相互作用を記載する強力な方法であ
る。しかしながら、ＣＦＳＥ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）およびＰＫ
Ｈ色素（Ｓｉｇｍａ）のごとき、現在入手可能な蛋白質および膜の標識は、イン
・ビボおよびイン・ビトロ双方において細胞の相互作用および応答を研究する場
合にかなりの制限を有する。それらはスペクトルの可視領域において励起され、
発光するので、高レベルの組織散乱および自己蛍光はそのような色素を、完全な
動物における光学イメージングにつき不適当なものとしかねない。加えて、細胞
自己蛍光は、達成できるシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を制限し、他の慣用的に
使用される可視フルオールとのかなりのスペクトル重複は、そのような色素をフ
ローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡で用いる場合に装置の設定を複雑なもの
とする。一般的な膜染色に適用できるＤｉＯおよびＤｉＩのより長い波長のアナ
ログは当該分野で知られているが、時間および濃度を変更して、これらの色素で
の最適な染色が達成されなければならない。

【００１３】複雑な細胞型、トラフィッキングおよび局在化のパターン、シグナリングメカ
ニズム、および先天的な免疫系を構成する調節フィードバックループは、特定の
抗原または病原体に対して高度に選択的に応答し、または、選択的に応答を増強
し、またはそれに干渉する能力を供することを可能とする。しかしながら、この
選択性は、組織特異的接着分子ならびにケモカインおよびサイトカインのごとき
分泌された分子メッセージの点で、抗原、抗原提示細胞およびリンパ球に関連す
る局在化された遭遇に基づいて一義的には達成される。従って、免疫救済および
応答プロセスにおける生産的な介入は、イン・ビトロ、エックス・ビボおよびイ
ン・ビボで複雑な細胞相互作用を解明しモニターする能力を要する。異なる細胞
型に選択的にタグを付し、その運命に従う能力は、免疫治療に関連する効果的な
治療戦略をデザインしそれを最適化するのに十分に詳細な免疫応答の理解に非常
に重要である。

【００１４】細胞膜に安定にインターカレートする蛍光親油性色素での一般的な膜標識は単
純であり、迅速であり、かつほとんどいずれの細胞型に対しても適用できる。こ
のタイプの現在入手可能なプローブは、特異的な細胞型を追跡しそれを同定する
目的で利用されており、それらは、そのような目的での一般的な蛋白質標識とは
対照的にいくつかの利点を提供する。標識は非共有結合的であって、脂質二重層
への分配によって起こるので、共有結合蛋白質標識（例えば、ＣＦＳＥ）に必要
とされるような、蛍光強度が安定化するための待ち時間はなく、細胞受容体―リ
ガンド相互作用および関連する応答に対する望まない効果は典型的には最小とな
る。

【００１５】細胞および生体分子を標識するのに用いられる最も普通のフルオロフォアーは
、元来顕微鏡のために開発され、利用できる光源およびヒトの目との適合性の理
由で、主としてスペクトルのＵＶおよび可視領域（ほぼ４００ないし６００ｎｍ
）において蛍光を発する。娘細胞の中での膜インターカレーティング色素の希釈
は、複雑な集団において種々の細胞増殖応答をモニターするのに、および抗原攻
撃のごとき刺激体に対する応答における細胞の追跡のために非常に有用であるこ
とが判明している。一般的な蛋白質の標識のように、膜色素の濃度は各細胞分裂
で半分となり、かくして、長期の追跡での用途を制限する。また、一般的な蛋白
標識および蛍光膜標識の双方において、高い標識強度（しばしば、明るい抗体標
識よりも一桁ないし二桁大きな大きさ）は、他のプローブと組合せて用いる場合
にフィルターの選択および色補償を複雑としかねない。

【００１６】前記挑戦および蛍光標識に対する制限は、ＦＲ（遠赤）およびＮＩＲ（近赤外
）波長で励起し発光するフルオールの開発において興味を増大させてきた。文献
における用法はかなり変動するが、本発明者らは約６００−７００ｎｍをＦＲと
定義し、および７００−９００ｎｍをＮＩＲと定義する。というのは、水による
吸収および熱的なバックグラウンドは９００−１０００ｎｍ以上で生物学的蛍光
の測定に干渉し始めるからである。ＦＲまたはＮＩＲフルオールの使用は、一般
に、生物学的系において、および特に細胞の分析で多数の重要な利点を有する。
これらは、ｉ）組織または蛋白質自己蛍光によって引き起こされたバックグラウ
ンドの減少、ｉｉ）ラーマン散乱によって引き起こされるバックグラウンドの減
少、ｉｉｉ）通常のＵＶまたは可視フルオールと組合せて用いた場合のより小さ
なスペクトル重複、および高価な励起源（例えば、ダイオードレーザー）および
ディテクター（例えば、アバランシェダイオード）の使用に適合する励起および
発光プロフィールを含む。ＦＲ蛍光発光アナログは、現存のフローサイトメトリ
ーおよび共焦点顕微鏡に用いることができる。というのは、これらの装置のうち
多くはＦＲ励起能力を有するからである（ＨｅＮｅ、６３５ｎｍダイオード、ま
たは６４７ｎｍＫｒ／Ａｒレーザー）。従って、ＦＲアナログの使用は、ｉ）
低下したバックグラウンドおよび改良されたシグナル／ノイズ比による、分裂す
る細胞の長期のイン・ビトロおよびイン・ビボ追跡を行う能力、およびｉｉ）低
下したスペクトル重複によるより単純な装置の設定を提供する。

【００１７】ＮＩＲ蛍光の利用は、完全な組織または動物のイン・ビボ光学イメージングの
ための均一なＦＲイメージングよりも重要な利点を有する。自己蛍光およびラー
マン散乱からの減少したバックグラウンドに加えて、ＮＩＲ光はイン・ビボで良
好に伝達され、かくして、リアルタイム蛍光イメージングは、数ミリないし数セ
ンチの組織を通じて実行することができる。事実、励起光またはＮＩＲ蛍光の波
長が長くなれば、低下した弾性散乱、およびこの領域で吸収する少数の生体分子
（ヘモグロビンおよびデオキシヘモグロビン）がわずかに弱くそうするという事
実のため、組織への進入は良好となる。ＦＲおよびＮＩＲ標識抗体またはポリマ
ーに、正常な組織および腫瘍の間のコントラストを増強することが示されている
。検出の現在の深さは０.５ないし１ｃｍであるが、ＮＲ光は５ないし６ｃｍ組
織を通過して移動することができる。

【００１８】芳香族基の組成およびシアニン色素の芳香族基を隔てるメチン基の数を調整す
ると、光の励起および発光パターンおよびこれらの色素の色の変化を引き起こす
ことが知られている。一般に、色素の芳香族成分を隔てるメチン基の数を増加さ
せると、発光スペクトルを赤色および近赤外波長にシフトさせる。しかしながら
、芳香族基の間のメチンブリッジの長さを増加させても、化合物の総じての親油
性を増加させ、かくして、そのような化合物の溶解度を低下させ、膜プローブと
してのそれらの利用性を制限する。もし、親油性物質に対する標準的な生理学的
媒体および塩の負のインパクトを最小化しつつ、感受性のある生物学的材料（例
えば、細胞）に適合するのに十分な水への溶解性を供する標識用の適当な組成物
が選択されれば、この制限を克服できる。

【００１９】発明の概要従って、本発明は、スペクトルの遠赤および近赤外セグメントにおいて蛍光を
発し、商業的に入手可能な膜染色希釈剤に可溶な新規な膜インターカレーティン
グ色素（「プローブ」とも本明細書内ではいう）に指向される。これらのプロー
ブは診断および治療適用で有用である。また、本発明は、生物学的材料を染色す
るのに適した医薬上許容される水性および非水性標識ビヒクル中にプローブを含
有する組成物に指向される。

【００２０】もう１つの態様において、本発明は、プローブを細胞および／または他の親油
性構造に接触させ、該プローブを該親油性構造とインターカレートさせ、次いで
、それから発せられた蛍光に基づいてイン・ビトロおよび／またはイン・ビボに
て該細胞または他の親油性構造を検出する方法を提供する。

【００２１】好ましい具体例において、本発明は、成熟上皮細胞内の異常な細胞脱落速度の
存在によって特徴付けられる病的状態を診断するためのイン・ビボ方法を提供す
るための、シアニン色素でもイン・ビボ上皮細胞を標識する方法に指向される。

【００２２】これらおよび他の目的を達成するために、標的部位において粘膜表面上皮細胞
をＦＲおよびＮＩＲプローブで標識し、しかる後、標識の存在または不存在につ
き該部位をモニターすることを特徴とする、温血動物の粘膜表面の上皮細胞のご
とき成熟上皮細胞内での異常な細胞脱落速度を検出するためのイン・ビボ方法を
提供する。本発明の好ましい具体例において、標識される細胞は粘膜表面に存在
し、とりわけ、胃腸管粘膜表面は特に好ましい標的を提供する。また、本発明は
、本発明のＦＲおよびＮＩＲプローブで成熟上皮細胞を標識し、標識された細胞
の脱落速度を測定し、次いで、同様な位置の健康な上皮細胞の既知の脱落速度に
対して標識細胞の脱落速度を測定することを特徴とする、温血動物の成熟上皮細
胞内での異常な細胞脱落速度によって特徴付けられる病的状態を診断する方法を
提供する。

【００２３】好ましい具体例の記載さて、本発明の現在好ましい具体例につき詳細に言及する。本発明は、スペク
トルの遠赤および近赤外セグメントにおいて蛍光を発する新規な膜インターカレ
ーティング色素（本明細書中においては「プローブ」ともいう）およびそれらの
使用方法を提供する。また、本発明は、標識ビヒクル中で可溶化されたプローブ
を含む標識組成物を提供する。該プローブは、標識すべき材料の生物学的および
／または溶媒感受性に適合するビヒクル中に可溶化される。該化合物は、いくつかの好ましい具体例ではＲはＲ’とは異なるが、いくつか
の具体例では長さが等しい親油性テイル（本明細書中では「Ｒ」および「Ｒ’」
という）を含む。

【００２４】本発明のプローブは、マルチパラメーター細胞追跡およびソーティング手法用
の他の標識技術および試薬と組合せて用いることもできると考えられる。色素と
その他のものとの組合せの有用性は、伝統的には、光エネルギー相互作用のスペ
クトルの２つの態様によって決定される。（１）単一の照射波長または波長の狭
いバンドによって色素分子が励起される程度および（２）各励起された色素分子
が他の色素から十分に異なる波長の光を発して、ユニークな色またはピークとし
て認識できる程度。該最初の態様は、使用者が、多重に染色された生物学的試料
を単一波長で照射するのを可能とし、第２の態様は、使用者が、発光の異なる色
を観察しそれを記録するのを可能とし、その各々は特定の細胞型または構造に関
連している。

【００２５】光の全スペクトルが収集され、次いで、各プローブの発光に特徴的な曲線が、
全スペクトルに渡って採取された集合シグナルから作成される発色の下での多数
の新しいディテクターがある。また、本発明のプローブはそのような装置を用い
て容易に検出されるであろうとも考えられる。

【００２６】本発明のプローブは、膜−インターカレーティング色素として用いた場合に、
細胞膜をイン・ビトロ、エックス・ビボおよびイン・ビボで選択的に染色し、細
胞の性質に望ましくなく影響しない。プローブ、かくして、それらが付着される
ようになった細胞または他の親油性構造は、それらが発する蛍光によって容易に
同定することができる。加えて、本発明の化合物は、適切な濃度で用いた場合、
細胞毒性ではなく、細胞膜において安定に保持され、細胞を迅速に染色する。プ
ローブは、バックグラウンド自己蛍光よりも１００ないし１０００倍大きな染色
強度を達成するためには、細胞に数分間適用させるので足りる。本発明の化合物
のもう１つの有利な態様は、それらが、希釈剤Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のごとき膜標識に適した等張塩フリー希釈剤に溶解
できることである。本発明のプローブは、細胞標識、細胞ソーティングおよび基
本的（研究所）および臨床的研究双方のためのイン・ビトロおよびイン・ビボで
の細胞追跡のための剤として一般には有用である。そのような用途の例について
は、ここに引用してその開示を一体化させる米国特許第５、３８５、８２２号；
第５、２５６、５３２号；ならびに米国特許第４、８５９、５８４号；第４、７
８３、４０１号および第４、７６２、７０１号を参照されたし。そのようなプロ
ーブは、例えば、ＦＲおよび／またはＮＩＲの能力を有する現存のフローサイト
メーターおよび共焦点イメージングシステムで用いられる研究試薬で有用であろ
う。

【００２７】本発明のプローブは、１）十分な数で細胞に結合して、自己蛍光と比較して良
好なシグナルを与え；２）そのレベルにおいて細胞に対して毒性ではなく、およ
び３）完了すべき細胞の特定のサブグループの追跡および／またはソーティング
に十分に長く細胞膜に保持される。

【００２８】本発明は、室温にて保存した場合、エタノール中での少なくとも１ヶ月におい
て、固体形態で少なくとも２ヶ月間ＨＰＬＣ純度の５％未満の変化を呈し、水性
ビヒクル中にて、少なくとも３０分間、エタノール対照中への６０％を超えるそ
の初期溶解度を維持する。

【００２９】本発明のＲＦ／ＮＩＲプローブは、インドア蛍光照射に典型的な雰囲気照射下
での２４時間後に、１０％未満の蛍光脱色を呈する。

【００３０】本発明のＦＲプローブの結果、１００を超える開始Ｓ／Ｎ比を与えるのに十分
な濃度で標識した後、培養したＹＡＣリンパ腫細胞の、細胞生存率の１０％未満
低下およびその集団倍加時間の１０％未満変化をもたらす。

【００３１】本発明のＮＭプローブは、１０を超える開始Ｓ／Ｎ比を与えるのに十分な濃度
で標識した後、培養したＹＡＣリンパ腫細胞の、細胞生存率の１０％未満低下お
よびその集団倍加時間の１０％未満変化をもたらす。

【００３２】本発明のＦＲプローブは、色素強度が細胞培養によって減少する条件下で培養
を行った場合でさえ、未標識細胞との２４時間共培養後に１００を超えるＳ／Ｎ
を維持するのに十分に細胞膜中に保持される。

【００３３】色素強度が細胞培養によって減少する条件下にて未標識細胞との２４時間共培
養後に、１０を超えるＳ／Ｎを保持するのに十分に細胞膜中で保持される。

【００３４】本発明のＦＲおよびＮＩＲプローブは、フローサイトメトリーによって評価し
て、フィコエリスリンチャネルにおいてスペクトル重複に対して４０％未満の修
正を必要とする。

【００３５】本発明のプローブの親油性性質は、細胞およびウィルス膜、リポソーム、マイ
クロスフィア等を含めた、疎水性構造を含む種々の脂質へのプローブの十分な取
り込みを提供する。プローブが細胞およびビリオンに取り込まれると、プローブ
および水性標識ビヒクルを含む標識組成物を、標識すべき標的と混合する。標識
組成物は、適用に安全であって、再現性のある細胞標識を供するビヒクル（希釈
剤）中にシアニン色素を含有する。シアニン色素が少なくとも標識に必要な程度
長く安定な領域を形成する容量オスモル濃度調節剤を用いることができる。許容
される容量オスモル濃度調節剤は、グルコース、フルクトース、ソルボース、キ
シロース、リポーズのごとき単糖、およびスクロースのごとき二糖を含めた糖類
；マンニトール、グリセロール、イノシトール、キシリトールおよびアドニトー
ルを含めた糖アルコール；グリシンおよびアルギニンを含めたアミノ酸；および
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチル−３−アミノプロパンスルホン酸のご
ときある種のグッズ緩衝液から選択することができる。少量の緩衝剤を標識媒体
に添加して、水素イオン濃度（ｐＨ）を生理学的および非毒性レベルに調節する
ことができる。抗生物質および防腐剤のごとき他の慣用的な剤もビヒクル中で使
用することができるが、色素のミセルまたは凝集体の迅速な形成を誘導する塩濃
度を生じさせない程度までである。

【００３６】有害な効果なくして、マイクロスフィアまたはリポソームおよび非水性標識ビ
ヒクルへの暴露を許容できる同様な物質へプローブを配合すると、プローブおよ
び非水性標識ビヒクルを含む標識組成物を、標識すべき標的と混合する。非水性
標識ビヒクルは、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等
のごとき極性有機溶媒を含む。

【００３７】その親油性にもかかわらず、本発明者らは、本発明のプローブが水性ビヒクル
に十分に可溶性であって、極性有機溶媒への暴露によって悪影響を受ける親油性
構造（膜等）の効果的かつ迅速な染色を可能とすることを見い出した。

【００３８】検出工程は、例えば、励起波長の散乱光の吸収用の、かつ検体と一緒に使用さ
れる特定の色素標識に対応する蛍光に対応する波長の通過用のフィルターを有す
る、シストスコープまたはエンドスコープのごときファイバー光学診断デバイス
のようなルミネセンス顕微鏡または他の光学イメージング装置を使用することが
できる。観察および分析の好ましい方法は、励起および発光波長に適切な光源お
よびフィルターを備えた顕微鏡での直接的可視化、および顕微鏡に取り付けたカ
メラの使用を含む。

【００３９】このクラスのプローブ試薬で適切に染色した細胞分離および計数用の本発明の
好ましい方法は、ソーティング能力を持つＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置および細
胞ソーティング能力を持つＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ装置を例とするごときフロー
サイトメトリー装置の使用による単離である。他の同様な装置は当該分野でよく
知られている。これらの装置は、アルゴンレーザー光源にて与えられた波長で混
合された細胞集団を照射し、緩衝液のごとき移動流体中で検出された各細胞から
の発光シグナルを用いて、当該分野でよく知られた技術を用いて発光した光の集
光用の種々のフィルターを用いて、細胞がディテクターを通過して流れる間に各
細胞を分ける。該装置は、放出光の測定を使用する計算に基づいて細胞集団を計
数しおよび／またはそれを収集し、さらなる分析および使用のためのデータおよ
び細胞画分双方を得ることができる。

【００４０】最近の技術の進歩により、微視的（細胞および細胞下）レベルにおけるのみな
らず巨視的（その組織または全身体）レベルにおいても蛍光イメージングを行う
ことができるようになった。本発明のプローブは、共焦点イメージングまたは他
の定量的顕微鏡技術を用いてマルチプローブ実験を行う場合に頻繁に遭遇する、
スペクトルの「汚染」または余分光の問題に対して有用な解決を与える。加えて
、ＮＩＲプローブは、巨視的イメージング方法と組合せると、完全な動物におけ
る免疫細胞トラフィッキング、局所化および再分布ならびに診断および／または
光療法で用いるための能力をモニターするための放射性標識の有用な代替物を提
供する。

【００４１】もう１つの好ましい具体例において、本発明のプローブは、米国特許第５、８
０４、３８９号に記載されているごとく、イン・ビボにて異常な上皮細胞脱落率
の検出のために対象に投与される。このプロセスにおいて温血動物中の上皮細胞
の異常な脱落が測定される。該プロセスは、標的部位において本発明の化合物で
成熟表面上皮細胞を標識し、該細胞を励起波長の光に暴露し、しかる後、標識の
存在または不存在につき該部位をモニターし、次いで、所定の時間にわたって検
出可能な標識の喪失を観察する工程を含む。または、本発明は、成熟上皮細胞を
標識し、標識された細胞の脱落速度を測定し、次いで、同様な位置の健康な上皮
細胞の既知の脱落速度と標識された細胞の脱落速度とを比較することを特徴とす
る、温血動物の成熟上皮細胞内でのそのような異常な細胞脱落速度によって特徴
付けられる病的状態を診断する方法を提供する。

【００４２】本発明のプローブは、身体のいずれの上皮表面の異常な脱落速度も測定するの
に利用することができる。表面は、胃、胆管、結腸、尿管血管、鼻腔を含めた肺
管、角膜、食道、膵臓管、小腸、膣および卵管を含めた生殖器、前立腺を含む。
好ましくは、溶液形態の組成物が、エンドスコープによる、表面に溶液をあふれ
させることによる、またはドリンクの形態で溶液を対象に経口投与することによ
る直接的視覚下で内皮粘膜の表面に直接的に適用することによって（例えばスプ
レイング）投与される。

【００４３】ヒトにおけるイン・ビボでの使用を考える場合、本発明の化合物のいずれかの
溶液は、有効量のプローブを、水および極性有機溶媒双方と混和性の等浸透圧で
水性かつ好ましくは塩を含まない溶媒に溶解させることによって調製することが
できる。本発明によるイン・ビボ用途の組成物における色素の濃度レベルは、そ
れらの色素の従前から知られているイン・ビボ細胞染色適用で用いられる濃度レ
ベルと同等であるか、またはそれよりも大きいであろう。投与すべき正確な濃度
は変化させることができ、容易に最適化することができる。投与すべきプローブ
組成物の容量は、組成物中のシアニン色素の濃度に応じて、および標的部位のサ
イズに応じて変動するであろう。投与容量は、例えば、約１ないし１００ｍｌで
変化させることができ、容易に最適化することができる。約１０ｍｌのプローブ
組成物の投与容量は多くの適用で用いることができる。投与経路は、標識すべき
細胞の型に応じて変動するであろう。前記で示されたごとく、上皮細胞の染色は
、経口投与または直接的適用によって最良に達成することができる。皮下、筋肉
内または静脈内注射のごとき他の投与経路も考えられる。

【００４４】本発明の好ましい方法によれば、シアニン色素標識は、標識細胞の部位を励起
光に暴露し、次いで、蛍光強度を観察および／または測定することによって検出
される。例えば、（実施例で議論する）化合物８は、６６７ｎｍにおける最大蛍
光の観察では約６３５ｎｍの励起光に応答し、他方、（やはり実施例で議論する
）化合物１３は、７１３ｎｍにおける最大蛍光の観察では、約６４７ｎｍの励起
光に応答する。後記する実施例で詳細に記載するごとく、本発明のプローブは合成することが
できる。

【００４５】本発明のＦＲプローブは、６００−７００ｎｍの範囲で吸収し、７００−８０
０ｎｍの範囲で発光するフルオールを励起する能力を持つ市販のサイトメトリー
装置（例えば、ＢＤＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅ
ｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＡｌｔｒａ、およびＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＭｏ
Ｆｌｏフローサイトメーター／ソーター、およびＢｉｏＲａｄ１０２４ＥＳま
たは１０２４ＭＰ共焦点イメージングシステム）によって検出することができる
。高価なダイオードレーザーおよびダイオード検出系を取り入れた小さなベンチ
トップサイトメーター（例えば、ＢｉｏｍｅｔｒｉｃＩｍａｇｉｎｇ／ＢＤに
よって開発された容量毛細管サイトメーター）の出現は、ＮＩＲ蛍光を定量する
ためのさらなる検出系を提供するであろう。

【００４６】また、この近赤外／遠赤波長は、この領域におけるバックグラウンド蛍光が生
物学的系において通常は低く、高感度が達成できる点で有利である。

【００４７】本発明の好ましい標識組成物は、式：

【００４８】

【化２１】

【００４９】 [式中、「−Ｙ＝」は、

【００５０】

【化２２】

【００５１】（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ _１１、Ｒ_１２およびＲ_１３の各々は独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の
炭素のアルキル基である）よりなる群から選択され；ＸはＨ、ハロゲン、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキルおよびＳ−ア
リールよりなる群から選択され；Ｚは生物学的に適合する対イオンであり；「Ａ−」は、

【００５２】

【化２３】

【００５３】よりなる構造式の群から選択される構造であり；「＝Ｂ］は、

【００５４】

【化２４】よりなる群から選択され；

【００５５】ここに、ＤおよびＥは、各々、独立してＯ、ＳまたはＣＲ_１４Ｒ_１５であり、こ
こに、同一または異なってもよいＲ_１４およびＲ_１５は、独立して、１ないし４
個の炭素を有するアルキル基であるか、あるいはＲ_１４Ｒ_１５は組み合わさって
５−または６−員の飽和環を完成し；

【００５６】ＲおよびＲ’は、各々、独立して７ないし３０個の炭素を有する直鎖状または
分岐鎖状の炭化水素であり、ただし、（ｉ）ＲおよびＲ’のうちの一方は少なく
とも１４個の炭素でなければならず、および（ii）ＲはＲ’とは等しくなく；

【００５７】Ｒ_１６ないしＲ_４７の各々独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の炭素原
子のアルキル基である］のシアニン色素を含む。あるいは、Ｒ_１４Ｒ_１５は組合されて５−または６−員
飽和環を完成する。好ましくは、ＤはＥに等しい（対称シアニンを生じる）。い
くつかの好ましい具体例において、ＤおよびＥはＣＲ_１４Ｒ_１５であり、ここに
、ＣＲ_１４Ｒ_１５はメチルまたはエチル、より典型的にはメチルである。Ｒ_１６−Ｒ_４７の各々は、独立して、Ｈ、ハロゲンまたは１ないし４個の炭素
原子のアルキル基である。

【００５８】ＲおよびＲ’は各々、独立して、７ないし３０個の炭素原子を有する直鎖状ま
たは分岐鎖状の炭化水素であり、ただし、ＲおよびＲ’の一方は少なくとも１４
個の炭素原子でなければならない。

【００５９】Ｚは、典型的には、シアニン色素の固有の正の電荷をバランスし、全体として
分子を電気的に中性とするような数および合計電荷にて存在するアニオンである
生物学的に適合する対イオンである。本明細書中で用いるごとく、生物学的に適
合する物質は使用に際して毒性ではなく、生体分子に対して実質的に有害な効果
を有しない。また、そのような化合物は、標識に必要な濃度において細胞の生存
率に望ましくなく影響するものであってはならない。従って、ヨウ化物塩以外の
シアニン色素の医薬上許容される形態は、他の医薬上許容される塩を含めて、い
くつかの場合において使用することができる。正味の正の電荷を有する色素につ
いての有用な対イオンの例は、限定されるものでないが、塩化物、臭化物、ヨウ
化物、スルフェート、アルカンスルホネート、アリールスルホネート、ホスフェ
ート、ペルクロレート、テトラフルオロボレート、ニトレートおよび芳香族また
は脂肪族カルボン酸のアニオンを含む。しかしながら、適当なアニオンの選択は
溶解性に対する特定のアニオンの影響によって制限されるであろう。というのは
、種々の親油性分子と会合したアニオンは化合物の溶解度に影響しかねないから
である。

【００６０】好ましい具体例において、対イオンはヨウ化物である。プローブのイン・ビボ
投与におけるごとくある状況では、ヨウ素に対してアレルギーの者もいるので、
ヨウ化物対イオンを塩化物で置き換えるのが好ましいであろう。

【００６１】さらに、本発明は、例示目的でのみ掲げ、限定的であると解釈されるべきでな
い以下の実施例で記載する。当該分野で知られた標準的な技術または後に具体的
に記載する技術を利用する。

【００６２】実施例１６６７ｎｍの発光を持つプローブ（８）の合成６６７ｎｍの発光を持つ膜プローブを、以下の合成反応のスキーム１に従って
調製した。スキーム１

【００６３】

【化２５】

【００６４】ヨウ化１−テトラデシル−２，３，３−トリメチルインドリニウム（化合物５
）の調製テトラデシル−１−（４−クロロベンゼンスルホネート）：室温のジクロロメ
タン（５００ｍｌ）中のテトラデカノール（２６.３ｇ、０.１２３モル、Ａｌｄ
ｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）および塩化
４−クロロベンゼンスルホニル（２８.４８ｇ、０.１２３モル、Ａｌｄｒｉｃｈ
）の攪拌溶液に、ジクロロメタン（２００ｍｌ）中のトリメチルアミン（２８ｍ
ｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を滴下する。得られた溶液を４８時間攪拌する。次いで、
反応混合物を水（３×４００ｍｌ）で洗浄し、ジクロロメタン層を硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、濃縮する。得られた粗製固体をメタノールから再結晶して、純粋な
テトラデシル−１（４−クロロベンゼンスルホネート）（２９.９ｇ、６２％）
を白色固体として得た。２００ＭＨｚプロトンＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：０.８８
（ｔ，Ｊ＝７.０Ｈｚ，３Ｈ），１.１０−１.８０（ｍ，２４Ｈ），４.０５（ｔ
，Ｊ＝７.０Ｈｚ，２Ｈ），７.５０−７.６０（ｍ，２Ｈ），７.８０−７.９０
（ｍ，２Ｈ）

【００６５】２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレイン（４）（６.３６ｇ、０.０
４モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびテトラデシル−１−（４−クロロベンゼンスル
ホネート）（１５.５２ｇ、０．０４モル）を１３０ないし１４０℃にて３時間
攪拌しつつ一緒に加熱する。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、エタノール
（２００ｍｌ）に溶解させる。ヨウ化カリウムの飽和溶液（２００ｍｌ）を添加
し、この混合物を３０分間攪拌する。次いで、１.５Ｌの蒸留水を添加し、さら
に１５分間攪拌した後、固体沈殿を収集し、水で洗浄し、真空下で乾燥する。粗
製物質を酢酸エチルから再結晶して、純粋な中間体化合物５（１１.９ｇ、６２
％）を得る。３００ＭＨｚプロトンＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：０.８８（ｔ，Ｊ＝
７Ｈｚ，３Ｈ），１.２５−１.５０（ｍ），１.６７（ｓ，６Ｈ），１.９３（ｍ
，２Ｈ），３.１３（ｓ，３Ｈ），４.７０（ｔ，Ｊ＝７.７０Ｈｚ，２Ｈ），７.
６０−７.６６（ｍ，４Ｈ）

【００６６】ヨウ化１−ドコサニル−２，３，３−トリメチルインドリニウム（６）の調製ドコサニル−１−（４−クロロベンゼンスルホネート）：室温のジクロロメタ
ン（５００ｍｌ）中のドコサノール（４７.８ｇ、０.１５モル）および塩化４−
クロロベンゼンスルホニル（３４.０１ｇ、０.１６ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）の攪
拌溶液に、ジクロロメタン（２００ｍｌ）中のトリエチルアミン（３３.５ｍｌ
、Ａｌｄｒｉｃｈ）を滴下する。得られた溶液を４８時間攪拌する。次いで、反
応混合物を水（３×４００ｍｌ）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、
〜４００ｍｌまで濃縮して、生成物の結晶化を開始させる。冷却およびエージン
グの後、濾過によって沈殿を収集し、真空下で乾燥して、純粋なドコサニル−１
−（４−クロロベンゼンスルホネート）（４８.９ｇ、７３％）を白色固体とし
て得る。３００ＭＨｚプロトンＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：０.８８（ｔ，Ｊ＝７.０
Ｈｚ，３Ｈ），１.１５−１.４０（ｍ），１.５５−１.７５（ｍ，２Ｈ），４.
０２（ｔ，Ｊ＝７.０Ｈｚ，２Ｈ），７.４８−７.６０（ｍ，２Ｈ），７.７８−
７.９０（ｍ，２Ｈ）

【００６７】２，３，３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレイン（６.３ｇ、０.０４モル、
Ａｌｄｒｉｃｈ）およびドコサニル−１−（４−キクロベンゼンスルホネート）
（２０.０ｇ、０.０４モル）を１３０ないし１４０℃にて３時間攪拌しつつ一緒
に加熱する。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、ワックス状の固体をエタノ
ール（２５０ｍｌ）に溶解させる。ヨウ化カリウム飽和溶液（２００ｍｌ）を添
加し、この混合物を３０分間攪拌する。次いで、１.０Ｌの蒸留水を添加し、さ
らに１５分間攪拌した後、固体沈殿を収集し、水で洗浄し、真空下で乾燥する。
粗製物質をジクロロメタン／ヘキサンから再結晶して、純粋な中間体化合物６（
１４.５ｇ、６１％）を得る。２００ＭＨｚプロトンＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：０.
８７（ｔ，Ｊ＝７.０Ｈｚ，３Ｈ），１.１５−１.５０（ｍ），１.６７（ｓ，６
Ｈ），１.８５−２.００（ｍ，２Ｈ），３.１０（ｓ，３Ｈ），４.７０（ｔ，Ｊ
＝７.７Ｈｚ，２Ｈ），７.５５−７.７０（ｍ，４Ｈ）

【００６８】ヨウ化１−ドコサニル−２−[（４−Ｎ−フェニル−Ｎ−アセチルアミノ）−
１，３−ブタジエニル］−３，３−ジメチルインドリニウム（７）の調製無水酢酸（３０ｍｌ）中の（６）（２.３８ｇ、４ｍｍｏｌ）およびマロンア
ルデヒドビスフェニリミン塩酸塩（１.１０ｇ、４.４ミリモル、ＴＣＩＡｍｅ
ｒｉｃａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）の溶液を１００ないし１１０℃にて１時間
加熱し、室温まで冷却し、濾過する。次いで、濾液を３００ｍｌの水で希釈し、
０ないし５℃の冷蔵庫に２４時間入れる。得られた沈殿を収集し、真空下で乾燥
して（７）（０.６５ｇ、２１％）を得る。３００ＭＨｚプロトンＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ_３）：０.８８（ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ，３Ｈ），１.２０−１.４０（ｍ），１
.７０（ｍ），１.８０（ｓ，６Ｈ），２.２４（ｓ，３Ｈ），４.３６（ｔ，Ｊ＝
７.５Ｈｚ，２Ｈ），５.７９（ｔ，Ｊ＝１２.８Ｈｚ，ＩＨ），６.７１（ｄ，Ｊ
＝１５.０Ｈｚ，ＩＨ），７.２５−７.７０（ｍ，９Ｈ）

【００６９】中間体化合物７（０.５４４ｇ、０.７１ミリモル）および中間体５（０.３４
３ｇ、０.７１ミリモル）を、十滴のトリエチルアミンを含む還流ジクロロメタ
ン（１０ｍｌ）中で３時間一緒に加熱する。反応はＴＬＣ（ジクロロメタン中の
５％メタノール）によってモニターする。次いで、反応混合物をロータリーエバ
ポレーションによって濃縮し、残渣を−２０℃にて一晩メタノールから結晶化さ
せる。固体を収集し、ジクロロメタン中の５−７.５％メタノールで溶出するシ
リカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによってさらに精製する。純粋な
画分を合わせ、濃縮して化合物８（２１０ｍｇ、３０％）を得る。ＨＰＬＣによ
ると純度は９７％を超える。３００ＭＨｚプロトンＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：０.
８８（ｔ，Ｊ＝６.３Ｈｚ，６Ｈ），１.２５−１.５５（ｍ），１.６６（ｍ），
１.８１（ｓ，１６Ｈ），４.０４（ｔ，Ｊ＝７.４Ｈｚ，４Ｈ），６.２９（ｄ，
Ｊ＝１３.６Ｈｚ，２Ｈ），６.７８（ｔ，Ｊ＝１２.４Ｈｚ，ＩＨ），７.０５（
ｄ，Ｊ＝７.８Ｈｚ，１Ｈｈ．），７.２０−７.７０（ｍ，２Ｈ），７.３３−７
.３８（ｍ，４Ｈ），８.３２（ｔ，Ｊ＝１３.０Ｈｚ，２Ｈ）電子スプレイ質量分析Ｍ’＝８６０．ＵＶ／ＶＩＳ（エタノール）：λｍａｘ
＝６４８ｎｍ、ｃ＝１８９、２７０Ｍ−１ｃｍ−１．蛍光（エタノール）：励起
最大＝６４７ｎｍ、発光最大＝６６７ｎｍ

【００７０】この発光波長を持つプローブを合成用に選択した。なぜならば、それは細胞標
識に用いるほとんどの他の可視蛍光プローブと比較して＞１００ｎｍだけ赤方シ
フトし、従って、最小スペクトル重複を有するからである。従って、このプロー
ブは、マルチプローブ標識が必要な場合にフローサイトメトリーおよび共焦点顕
微鏡で用いるのに適するであろう。

【００７１】実施例２−７１３ｎｍの発光を持つＦＲプローブ（１３）の合成化合物（８）について記載したのと同様なタイプの反応および条件を用い、以
下のスキーム２に示されたごとく、化合物９（Ｆｉｓｈｅｒ／ＡｃｒｏｓＣｈ
ｅｍｉｃａｌｓから入手できる）からこの化合物を調製した。スキーム２

【００７２】

【化２６】

【００７３】実施例３−６８２ｎｍ発光を持つＦＲプローブ（２５）の合成この化合物は、標準的な条件下で、反応スキーム１からの中間体７を反応スキ
ーム２の中間体１０とカップリングさせることによって合成した。該化合物を、
標準的な条件を用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。この化合物
は、化合物（８）および化合物（１３）に対して中間の吸光度および蛍光特性を
持つ遠赤発光プローブを提供する。この生成物についての最終の単離された収率
は、中間体７の二量体化によって形成された対称副生成物の除去の困難性のため
、化合物（８）および化合物（１３）についてよりもわずかに低かった（１１５
％）。化合物（２５）

【００７４】

【化２７】

【００７５】実施例４−８１４ｎｍ発光を持つＮＩＲプローブ（１５）の合成この化合物は、既に前記したものと同様なタイプの反応および条件を用い、以
下のスキーム３に示されたごとく調製した。該化合物は、標準な条件下で、反応
スキーム２の中間体１０を中間体１４とカップリングさせることによって合成し
た。再結晶またはクロマトグラフィーによって所望のプローブを精製した。スキーム３

【００７６】

【化２８】

【００７７】実施例５ａ−８３７ｎｍ発光を持つＮＩＲプローブ（１９）および（２６）の
合成化合物１９はスキーム４ａに示されたごとく調製する。スキーム４ａ化合物１９

【００７８】

【化２９】

【００７９】化合物１７は当該分野で知られた手法に従って〜２７％収率で調製される。化
合物（１１）を化合物１７と加熱して、良好な収率で中間体化合物１８が得られ
る。標準的な塩基カップリング条件下で化合物１８を化合物１０と反応させて化
合物１９を得る。このプローブは、８１０ｎｍの発光波長を持つ商業的に入手可
能なダイオードレーザーと密接にマッチする。一般に、低下した散乱およびＮＩ
Ｒ照射と関連する自己蛍光の利点を維持しつつ、これらの波長におけるヘモグロ
ビンおよびミオグロビンによる光吸収の低下のため、８００ｎｍを超える波長の
励起は、比較的大きな組織深さで観察される構造を標識する場合に用いられるべ
きである。化合物１５に関しては、化合物２６で標識した細胞は、当該分野でよ
く知られた技術を用いて容易に検出されるはずである。スキーム４ｂ化合物２６

【００８０】

【化３０】

【００８１】１７を２モル当量の１１とカップリングさせるための最適な条件は、酢酸ナト
リウムを含むエタノール中での還流である。得られた化合物をヨウ化カリウムで
処理し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。

【００８２】実施例６―９００ｎｍ発光を持つＮＩＲプローブ（２４）の合成ＩＲへのさらなる励起および発光は、巨視的イメージングを用いて検出可能な
組織進入および構造の深さを増加させるのに望ましい。この化合物は、前記した
のと同様な反応を用い、スキーム５に示されたごとく調製される。スキーム５

【００８３】

【化３１】

【００８４】実施例７−吸光度／発光スペクトルさて、表１を参照し、本発明のいくつかの例示的化合物の吸光度および発光特
性の代表例が示される。吸光度および蛍光スペクトルは、各々、Ｊａｓｃｏ，Ｉ
ｎｃ．ＵＶ−５３０ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計およびＦＰ７５０分光蛍光計にて
、エタノール中の０．２５μＭ溶液を用いて行った。近似的消光係数は、最大吸
光度を正規濃度（２５μＭ）で割ることによって吸光度スキャンから見積もった
。

【００８５】

【表１】

【００８６】実施例８−ＦＲ／ＮＩＲプローブの化学的安定性固体としてまたはエタノール中の１ｍＭ溶液として室温で貯蔵した場合の本発
明の実施例化合物の化学的安定性はＨＰＬＣによって測定した。２６０ｎＭにお
いて本発明の実施例化合物につき検出したピークの積分を用いて、化学的に安定
性を見積もった。全てのテストした化合物は、室温にて２ヶ月間固体として保持
した場合、および室温にて１ヵ月間無水エタノール中の１ｍＭ液体溶液として保
持した場合に、ＨＰＬＣ純度の５％未満の変化を呈した。

【００８７】実施例９−ＦＲ／ＮＩＲプローブの光安定性無水エタノール中の示されたプローブの１ｍＭ溶液を通常の蛍光室内光下に置
いた。調製直後に各試料から一部を採取し、実施例６におけるごとく各プローブ
につき吸収最大にて吸光度を測定した。雰囲気蛍光下、室温にて２４時間後に、
各試料の吸光度を再度測定した。全てのプローブは安定であり、各化合物につき
５％未満の光脱色を呈した。

【００８８】実施例１０−ＦＲ／ＮＩＲプローブの溶解度本発明の化合物の溶解度に対する非対称および対称アルキル鎖およびメチンブ
リッジの種々の組合せの影響を調べた。化合物８、２５、１３、１５および２６
は、全て、１ｍＭ以上の濃度にてエタノールに可溶性であった。しかしながら、
エタノール中での１ｍＭにおける溶解を達成するには、より親油性のプローブ１
５および２６は数分間の音波処理を必要とした。全ての実施例プローブは水に溶
解するのが困難であた。ストック１ｍＭプロ−ブ溶液の三連１：５０希釈をエタ
ノールまたはテスト希釈剤いずれか中で作成した。室温における３０分後、溶液
を１０，０００×ｇにて１０分間遠心して、いずれのミクロ凝集体も除去し、１
００ｍｌアリコットを吸光度測定のために２.０ｍｌのエタノールに移した。Ｌ
ｅｕｎｇらの教示および市販の希釈剤（３０分における希釈剤上清吸光度は３０
分後のエタノール上清吸光度の少なくとも６０％）についてのＳｉｇｍａＣｅ
ｒｔｉｆｉｃａｔｅｏｆＡｎａｌｙｓｉｓで見出される溶解度の明細に基づ
き、エタノール対照の少なくとも６０％の予備的明細を、１００を超えるＳ／Ｎ
比にて細胞標識を達成し、標識の明るさまたは再現性に伴う潜在的問題を最小化
するのに十分な溶解度についての代用物として設定した。ＰＫＨ２６（エタノー
ル対照の８６％±４％）としての希釈剤Ｃ中で３０分後に溶解したプローブはな
かった。しかしながら、本発明者らは、少なくとも化合物８、２５および１３に
ついては、希釈剤Ｃ中の色素の組成物を用いて染色した細胞はＰＫＨ２６につい
てのものよりも実質的に大きなＳ／Ｎ比を与え（表２）、これは、溶解度は細胞
標識についての制限的な因子ではないことを示す。３０分後、化合物８および１
５はＴ０においてほぼ６５％のその溶解度を保持し、化合物１３および２５はＴ
０において５５％を超えるその溶解度を保持し、および化合物２６はＴ０におい
てほぼ２０％の希釈剤Ｃ中の溶解度で保持した。この例は、Ｌｅｕｎｇらによっ
て教示されるごとく水への溶解度を増強させるための極性基または他の置換基の
付加が、これらの剤で標識された明るくかつ再現性のある細胞に対する必須の要
件ではないことを示す。加えて、それは、Ｈｏｒａｎらによって教示されるもの
よりも等浸透圧希釈剤への溶解度は小さい場合でさえ、細胞標識の有用なレベル
を得ることができるのを示す。

【００８９】実施例１１−細胞生存率、細胞増殖およびＳ／Ｎ比に対するＦＲおよびＮＩＲ
プローブの効果の特徴付け希釈剤Ｃに懸濁した２×細胞と希釈剤Ｃ中の２×プローブとを迅速に混合する
ことによって、増大させる濃度のプローブで１０^７細胞／ｍｌの濃度にて、ＹＡ
Ｃ−１ネズミ・リンパ腫細胞を染色した。室温でも５分後、細胞培養基の添加に
よって染色を停止させた。次いで、細胞を徹底的に洗浄し（ＲＰＭＩ１６４０＋
１０.０％ＦＢＳ）、次いで、標準的な条件下で２２ないし２４時間培養した。
細胞の数を、希釈剤単独で処理した対照培養中のそれと比較した。

【００９０】プローブの最大許容濃度（ＭＴＣ）は、（１）染色直後のトリパンブルー排除
による生存率が９０％を超え、および（２）２４時間後のＹＡＣ細胞培養が、希
釈剤単独中の細胞の増殖とを１０％以下しか異ならないプローブの最大濃度と定
義した。

【００９１】Ｓ／Ｎおよびスペクトル交差測定では、各プローブについてのＭＴＣを用いて
細胞を希釈剤Ｃ中で標識し、次いで、希釈剤のみで処理した等しい数の未標識細
胞と共に培養した。染色（Ｔ０）の直後に、細胞のアリコットを１％緩衝化メタ
ノールフリーのホルマリンで固定し、フローサイトメーターで分析した。フロー
サイトメーターでのＰＭＴ高電圧は、未標識細胞の全集団が４０ｌｏｇ強度スケ
ールの最初の１０の中になるように設定し、それにより、未標識細胞についての
真の平均値の測定が可能となる。染色された細胞の強度が余りにも多くて、分析
で用いる高電圧設定が、かなりの数の未標識細胞が第４番目の１０を超えるよう
にする場合、高電圧設定を低下させて、標識された細胞を十分にスケール上に持
っていった。次いで、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ（Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ、ＩＬ
）からのＭｕｌｔｉｌｅｖｅｌＲａｉｎｂｏｗビーズを双方のＰＭＴ設定で実
行し、それを用いて、最も明るいビーズピークについての強度のシフトに基づい
て、標識細胞についての調整された強度値を計算した。生存率の結果を以下の表
２にまとめる。

【００９２】

【表２】

【００９３】蛍光強度データを、スペクトル交差についてのいずれの補償なくして全ての装
置チャネルで累積した。Ｓ／Ｎは、同一共培養中の標識された希釈剤処理対照に
おける、細胞当たりの平均蛍光強度で割った標識された細胞についての細胞当た
りの平均蛍光強度の比率として計算した。パーセント保持は予測されたＭＦＩ％
として計算し、ここに、（増殖関連プローブ希釈につき修正するために）予測さ
れたＭＦＩ＝Ｔ２２−２４でのＴ０／倍増殖におけるＭＦＩである。パーセント
スペクトル重複（表３）は、与えられたプローブについての一次チャネルにおけ
るＭＦＩに対する、注目するチャネルにおける標識細胞についてのＭＦＩの比率
として見積もった。

【００９４】

【表３】

【００９５】実施例１２−ＦＲ／ＮＩＲプローブで標識したイン・ビトロイメージングＹＡ
Ｃ−１腫瘍細胞についてのシグナル：ノイズ見積もり対数的に増殖するＹＡＣ−１細胞を、各プローブについてのＭＴＣにおいて、
ＰＫＨ２６または本発明の実施例化合物で標識した。ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｈ
ｏｔ倒立蛍光顕微鏡を、ＣＣＤカメラおよび商業的に入手可能なフィルター組合
せと組合せた１００倍倍率で用いて、標識された細胞または未染色対照細胞をイ
メージした。これらの予備実験では、分析した全ての試料について、同様である
が飽和下シグナル強度を達成するために必要な時間を選択した。フィルター組合
せはデータの獲得のために用いた。ＣｈｒｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓか
ら入手可能なオフ−ザ−シェルフフィルターは本発明のプローブの励起および発
光スペクトルと最適にはマッチしなかったが、相対的に短い獲得時間（５−５０
０ミリ秒）を用い、新しいプローブの全てについて、良好なシグナル強度が容易
に得られた。標準的なローダミンフィルター（示さず）をＰＫＨ２６イメージの
獲得に用いた。というのは、これらはＰＫＨ２６に特徴的な励起−発光に対して
ほとんど最適な適合を有するからである。ＣｈｒｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｉｎｃ．からの慣用的フィルターの組は以下の通りであった：ＰＫＨ２６
−標準ローダミンフィルター組；化合物１３−励起ＨＱ６６５／４５、二色性Ｑ６９０ＬＰ、発光ＨＱ７２５／
５０；化合物１５−励起ＨＱ７５５／７５、二色性Ｑ８０５ＬＰ、発光ＨＱ８６０／
１００；化合物２６−励起ＨＱ７７５／５０、二色性Ｑ８０５ＬＰ、発光ＨＱ８４５／
５５；

【００９６】標識された細胞についてのシグナル：ノイズの見積もり４４任意単位の領域を有する９つの細胞−関連分析領域の各々について、平均
的な蛍光強度を測定し、重複する細胞を表す画素の測定を回避した。やはり４４
任意単位の領域を持つ、４つのさらなる非−細胞−関連分析領域を用いて、ノイ
ズレベルを見積もった。全ての細胞関連領域の平均強度を、すべての非−細胞関
連分析領域の平均強度（ノイズ、Ｎ）のごとく計算した（シグナル、Ｓ）。使用
したイメージング獲得時間の広い範囲にもかかわらず、全ての４つのプローブに
ついて、平均ノイズ値は同様であり、これは、そのノイズが経時的に平均化され
ていることを示す。獲得時間は広く変動したので（化合物１３では５ミリ秒、Ｐ
ＫＨ２６および化合物１５では５０ミリ秒、化合物２６では５００ミリ秒）、標
準化された５０ミリ秒獲得時間で予測されたＳ／Ｎの比較見積もりは以下のよう
に計算した：Ｓ／Ｎ（５０ミリ秒）Ｓ／Ｎ（観察）×＠（５０ミリ秒／ミリ秒で表した現実
の獲得時間）

【００９７】プローブおよびフィルターに特徴的なスペクトルは、本発明のプローブに対す
るよりもＰＫＨ２６に対してかなり良好にマッチしたという事実にもかかわらず
、励起−発光特徴が可視（ＰＫＨ２６）からＦＲ（化合物１３）まで、ＮＩＲ（
化合物１５）までシフトするに従い、正規化されたＳＮは増大した。理論に拘束
されるつもりはないが、化合物２６で観察された低い正規化ＳＮは、より低い染
色濃度および励起−発光フィルターのより低い効率の組合せによるものであろう
。

【００９８】未染色対照についての自己蛍光：バックグラウンド比より長い波長における測定はルーチン的には行われず、かつ本発明のプローブ
で用いたフィルターは非−標準組合せであったので、本発明者らは、標識された
細胞イメージの分析で用いた同一のフィルターウィンドウを用いて、細胞関連自
己蛍光および非−細胞関連バックグラウンドも見積もった。しかしながら、この
場合、５０００ミリ秒（５秒）の一定イメージ獲得時間を全てのフィルターウィ
ンドウで用いた。ＦＲ（化合物１３）およびＮＩＲ（化合物１５および２６）ウ
ィンドウで、低下した自己蛍光シグナルが観察された。加えて、バックグラウン
ドノイズは、可視（ＰＫＨ２６）およびＦＲ（１３）と比較してＮＩＲ（化合物
１５および化合物１６のフィルターウィンドウ）で低下した。

【００９９】実施例１３−ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＢｅｎｃｈｔｏｐＣｌｉｎｉ
ｃａｌＡｎａｌｙｚｅｒでの三色リンパ球サブセット分析を用いる化合物８お
よび化合物２５の適合性

【０１００】ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）は健康な個体の血液から単離し、ＰＫＨ２６で
の増殖モニタリングで用いたのと同様な濃度にて化合物８または化合物２５で標
識した。三色リンパ球免疫表現型分類でいうような種々のモノクローナル抗体試
薬およびフルオロクロームは当該分野で知られている。これらのうちいくつかは
、４番目の色としてのＦＲプローブの使用との適合性につき評価した。本発明の
化合物で染色した後、細胞をさらに示した蛍光抗−ＰＢＭＣ抗体マーカーの１つ
と共にインキュベートした。抗体標識に続き、実施例１０におけるごとくＢＤ
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ臨床アナライザーを用い、フローサイトメーター分析を
行った。染色後回収は、１０，０００ＣＤ３＋リンパ球を獲得するのに必要な
分析時間を比較することによって評価し、生存率は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ
）を排除することができるリンパ球の％として評価した。

【０１０１】さて、表４を参照し、三色リンパ球サブセット分析での化合物８および化合物
２５標識の効果の分析が示される。

【０１０２】

【表４】

【０１０３】実施例１４−無傷器官マイクロスコピーによるＦＲ標識細胞の可視化前記実施例におけるごとく、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ腫瘍細胞を５μＭ化合物
８で標識し、ラットに静脈内注入した。注入されたラットからの単離された灌流
無傷肺調製物は、ＢｉｏＲａｄＲａｄｉａｎｃｅ２０００共焦点顕微鏡を用い
て可視化した。単離された灌流肺調製物の表層微小血管の写真分析は、赤色領域
としての化合物８で標識した領域の検出を可能とし、他方、緑色領域は、ＣＭ−
フルオレセイン蛋白質標識または自己蛍光内皮細胞で標識された細胞を示す。こ
の実施例は、無傷器官調製物における標識された細胞の追跡の利用性を示した。

【０１０４】実施例１５−ＦＲ／ＮＩＲで標識した腫瘍細胞のイン・ビボ追跡およびイメー
ジングＮＩＲ標識抗体は腫瘍細胞に付着することができ、イメージでの腫瘍細胞の可
視化を通じて、ビデオカメラまたは冷却されたＣＣＤカメラ（４６）を強化する
のは先行技術で知られている。ＹＡＣ−１は、それらの各ＭＴＣ（５μＭにおけ
る化合物２６を除いて全てにつき１０μＭ）において、ＰＫＨ２６、化合物８、
１５および化合物２６で染色した。この実施例は、化合物１３、１５および化合
物２６で標識した細胞の明るい蛍光は、ヌードマウス皮膚を通じて検出できるこ
とを示した。２０μｌ用量中の１０^６ＹＡＣ−１細胞をヌードマウスに皮下注射
し、該マウスをペントバルビタールナトリウム（３０Ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、移
動ステージ上に設定した。励起は、適当な励起フィルターを備えた光ファイバー
イルミネーターで行った。発光は、[ＫＭＩ]発光フィルターを通じて、Ｎｉｋｏ
ｎレンズを備えたＣＣＤカメラの助けを借りて収集した。吸収性色素のスポット
を、注入部位１の領域の皮膚表面に適用した。部位１において、ＰＫＨ２６で標
識した細胞を、赤色卵形で仕切られた領域に注入し、１５秒露出に設定された標
準フィルターでイメージした。蛍光は、マーカー色素が適用された領域で消え、
これは、細胞が皮下にあることを示す。部位２において、化合物１３で標識した
細胞をマウスに注入し、汚染された低強度のバックグラウンド照明の有りまたは
無しにて、６.５秒露出に設定された化合物１３フィルターでイメージした。こ
の部位ではＰＫＨ２６蛍光は検出されなかったが、化合物１３蛍光は観察された
。部位３において、化合物１５で標識された細胞をマウスに注入し、４０秒露出
に設定されたフィルターでイメージした。この部位ではＰＫＨ２６または化合物
１３蛍光は検出されず、他方、化合物１５蛍光は観察された。部位４において、
化合物２６で標識された細胞を、黄色卵形で仕切られた領域に注入し、６０秒露
出に設定されたフィルターでイメージした。化合物１５および化合物２６双方の
蛍光はこの部位で検出された。

【０１０５】前記明細書および図面は、本発明の目的、構成および利点を達成する好ましい
具体例を説明するにすぎず、本発明がそれに限定されることを意図するものでは
ない。前記請求の範囲の精神および範囲内にある本発明のいずれの修飾も本発明
の一部であると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C085 GG02 GG03 GG04 GG08 HH13 JJ02 KA26 KB55 LL05 LL09 LL11 LL12 LL15 4C204 BB01 CB03 CB13 DB03 DB04 EB10 FB03 GB01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物の標的部位における成熟表面上皮細胞をシアニン色素で
標識し、次いで、該標識工程後に該標識の存在または不存在につき該部位をモニ
ターすることを含み、ここに、該シアニン色素が式、【化１】 [式中、「−Ｙ＝」は、【化２】（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ _１１、Ｒ_１２およびＲ_１３の各々は独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の
炭素のアルキル基である）よりなる群から選択される；ＸはＨ、ハロゲン、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキルおよびＳ−ア
リールよりなる群から選択され；Ｚは生物学的に適合する対イオンであり；「Ａ−」は、【化３】よりなる構造式の群から選択される構造であり；「＝Ｂ］は、【化４】よりなる群から選択され；ここに、ＤおよびＥは、各々、独立してＯ、ＳまたはＣＲ_１４Ｒ_１５であり、こ
こに、同一または異なってもよいＲ_１４およびＲ_１５は、独立して、１ないし４
個の炭素を有するアルキル基であるか、あるいはＲ_１４Ｒ_１５は組み合わさって
５−または６−員の飽和環を完成し；ＲおよびＲ’は、各々、独立して７ないし３０個の炭素を有する直鎖状または
分岐鎖状の炭化水素であり、ただし、（ｉ）ＲおよびＲ’のうちの一方は少なく
とも１４個の炭素でなければならず、および（ii）ＲはＲ’とは等しくなく；Ｒ_１６ないしＲ_４７の各々独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の炭素原
子のアルキル基である］のものであることを特徴とする、温血動物の成熟表面上皮細胞の異常な細胞脱落
速度を検出するイン・ビボ方法。
【請求項２】該シアニン色素が、【化５】よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】構造式：【化６】を有する化合物。
【請求項４】構造式：【化７】を有する化合物。
【請求項５】構造式：【化８】を有する化合物。
【請求項６】構造式：【化９】を有する化合物。
【請求項７】構造式：【化１０】を有する化合物。
【請求項８】構造式：【化１１】を有する化合物。
【請求項９】【化１２】を有する化合物。
【請求項１０】温血動物の標的部位における成熟表面上皮細胞をシアニン
色素で標識し；該標的部位を光源で励起し；次いで、それから得られる蛍光の存在または不存在につき該部位をモニターする工程を
含み；ここに、該シアニン色素が式、【化１３】 [式中、「−Ｙ＝」は、【化１４】（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ _１１、Ｒ_１２およびＲ_１３の各々は独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の
炭素のアルキル基である）よりなる群から選択され；ＸはＨ、ハロゲン、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキルおよびＳ−ア
リールよりなる群から選択され；Ｚは生物学的に適合する対イオンであり；「Ａ−」は、【化１５】よりなる構造式の群から選択される構造であり；「＝Ｂ］は、【化１６】よりなる群から選択され；ここに、ＤおよびＥは、各々、独立してＯ、ＳまたはＣＲ_１４Ｒ_１５であり、こ
こに、同一または異なってもよいＲ_１４およびＲ_１５は、独立して、１ないし４
個の炭素を有するアルキル基であるか、あるいはＲ_１４Ｒ_１５は組み合わさって
５−または６−員の飽和環を完成し；ＲおよびＲ’は、各々、独立して７ないし３０個の炭素を有する直鎖状または
分岐鎖状の炭化水素であり、ただし、（ｉ）ＲおよびＲ’のうちの一方は少なく
とも１４個の炭素でなければならず、および（ii）ＲはＲ’とは等しくなく；Ｒ_１６ないしＲ_４７の各々独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の炭素原
子のアルキル基である］のものであることを特徴とする、温血動物の成熟表面上皮細胞の異常な細胞脱落
速度を検出するイン・ビボ方法。
【請求項１１】該部位が粘膜表面である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】該粘膜表面が胃腸管、呼吸器管または尿生殖器の表面をラ
イニングする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】該部位が胃の粘膜表面である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】該部位が結腸の粘膜表面である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】細胞脱落が、該標識工程の後に予め選択された時点に該部
位における標識のレベルの変化を観察することによって検出される請求項１０記
載の方法。
【請求項１６】該励起光が約６００ｎｍないし約９００ｎｍの波長を有す
る請求項１０記載の方法。
【請求項１７】該上皮細胞は、標識組成物を該部位に直接適用することに
よって標識される請求項１０記載の方法。
【請求項１８】細胞を、式：【化１７】 [式中、「−Ｙ＝」は、【化１８】（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ _１１、Ｒ_１２およびＲ_１３の各々は独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の
炭素のアルキル基である）よりなる群から選択され；ＸはＨ、ハロゲン、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキルおよびＳ−ア
リールよりなる群から選択され；Ｚは生物学的に適合する対イオンであり；「Ａ−」は、【化１９】よりなる構造式の群から選択される構造であり；「＝Ｂ］は、【化２０】よりなる群から選択され；ここに、ＤおよびＥは、各々、独立してＯ、ＳまたはＣＲ_１４Ｒ_１５であり、こ
こに、同一または異なってもよいＲ_１４およびＲ_１５は、独立して、１ないし４
個の炭素を有するアルキル基であり、あるいはＲ_１４Ｒ_１５は組み合わさって５
−または６−員の飽和環を完成し；ＲおよびＲ’は、各々、独立して７ないし３０個の炭素を有する直鎖状または
分岐鎖状の炭化水素であり、ただし、（ｉ）ＲおよびＲ’のうちの一方は少なく
とも１４個の炭素でなければならず、および（ii）ＲはＲ’とは等しくなく；Ｒ_１６ないしＲ_４７の各々は独立してＨ、ハロゲンまたは１ないし４個の炭素
原子のアルキル基である］の標識組成物と接触させる工程を含むことを特徴とする細胞を標識する方法。
【請求項１９】該標識組成物が医薬上許容されるビヒクルを含む請求項１
８記載の方法。