JPS6255094A - ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、微生物を用いるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の
製造方法に関するもので、より詳細には、ポリ−β−ヒ
ドロキシ酪酸を高濃度で含有する菌体を、短時間の培養
時間でしかも高菌体＠度で製造する方法に関する。

従来の技術及び発明が解決１〜ようとする間頂点ポリー
β−ヒドロキシ酪酸（以下ｐ　／／　ＨとＦ＠記するこ
とがある）は、微生物が作るバイオポリマーの１種であ
り、種々の細菌が細胞内に炭素源、ちるいはエネルギー
源として蓄積する貯Ｍ、Ｉ＋！Ｉ質であり、生物分解可
能な熱可塑性樹脂と［７て、医薬や農薬類の配合剤や医
療材料等の多方面での応用が期待されている。

従来、比較的安価な炭素源と１７てメタノールを用いる
ＰＨ８の微生物学的製法も多数提案されており、例えば
英国特許１，３７０，８９２号明細書には、ハイフオミ
クロビウム・グア１１アビレ及びシュードモナス・ロゼ
ア種の内の特定の菌株がメタノールを炭素源として培養
するとＰＨ８を蓄積す。

ることか記載されている。また、ジャーナル・オブ・ゼ
ネラル・マイクロバイオロジー（／、Ｇｔｎ−ｅｒａＬ
　Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌｏｑｙ　）　１９７７．９８．２
６５−２７２には、メチロバクテリウム、オルガノフイ
ラム及びシュードモナスＡＡｆ−１が夫々メタノールか
らＰＨ８を製造することが記載されている。

更に、特開昭５／Ｓ−１１７７９３号公報には、メチロ
バクテリウム・オルガノフイラムの成る特定の菌株がメ
タノールを資化して高分子俄のＰＨＢを蓄積することが
記載されている。しかしながら、これらの方法では最終
的に得られる菌体製電が低く、また菌体中のＰＨ８の蓄
積濃度も低く、ｐＨ８の工業的製法としては未だ十分に
満足−得るものでない。

本発明者等は先に、シュードモナスｚｐ、にの流加培養
により、Δ体濃度を十分に高めた後、窒素源の併給を停
止Ｌ、窒素飢餓にすることによりＰｌｌＢを高Ｉ：１％
度で生曜することを提案した（日本発酵工学合唱、ｒ［
１５９年度大会講演要旨集第１１５頁）０この方法は、
従来認められない高ａ度でのＰＨ８の生産を可能とした
本のではあるが、第二段でのｐＨ８の生産連間が著しく
低下し、生産に長時間を要するという点で未だ十分満足
し得る本のではない。

発明の骨子及び目的 本発明者等は、メタノール資化性及びｐＨ８蓄積性を有
する成る種の細菌を流加培養して菌体濃度を高めた後、
この第１段階よりは少ない号のアンモニアをメタノール
と共に供給して流加培養を続行することにより、ポリ−
β−ヒドロキシ酪酸を高濃度で含有する１体を、短時間
の培養時間でしかも高菌体ａ兜で製造し得ることを見出
した。

即ち、本発明の目的は、従来のボ）−８−ヒドロキシ酪
酸の微生物的製造方法における前記欠点が解消された方
法を提供するにある。

本発明の他の目的は、ｐＨ８が高濃度で蓄積された菌体
を、比較的短時間の培養でしか本高薗体ｍ度で生産し得
る方法を提供するにある。

本発明の更だ他の目的は、細菌のｐＨ８合成の酵素活性
の低下を抑制することによって、ｐＨ８・の学童速度を
向上させることが可能な方法を提供するにある。

発明の構成 本発明によれば、メタノール資化性とポリ−β−ヒドロ
キシ酪酸の菌体内蓄積能力とを有するプロトモナス属に
属する菌を、菌体濃度が３０乃至２００　ｔ／ｌとなる
迄、メタノールを炭素源及びアンモニアを窒素源として
流加培養する工程と、この培養液に引続きメタノール及
びアンモニアを、炭素／窒素の供給比が第一工程におけ
るよりも大きな比率となり且つポリ−β−ヒドロキシ酪
酸合成経路の酵素活性が実質上高く維持されるように供
給して、流加培養を行う工程とから成ムことを特徴とす
る微生物によるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法が
提供される。

本発明を以下に詳細に説明する０ 発明の好適実施態様の説明 使用菌株 現在のところ、メタノール資化性菌の分類は流動的であ
り、種々の種名に属する特定の直株についてポリ−β−
ヒドロキシ酪酸（７’ＨＢ）の菌体内生産に関する報告
があることは既に詳述したところであるが、本発明にお
いては、メタノール資化性とポリ−β−ヒドロキシ酪酸
の菌体内蓄積能力とを有するプロトモナス（ｐｒｏｔσ
ｍ０ルαｌ）属の細菌を使用する。

インターナシコナル・ジャーナル・オブ・システマテイ
ツク・バクテリオロジー第６４巻第２号第１８８〜２０
１頁（１９８４年４月）、著者浦上及び駒形両氏によれ
ば、上記プロトモナス属とは、極鞭毛を有し、ダラム陰
性、非胞子形成性、桿菌であり単独又は対で存在する。

細胞中にカロチノイド色素及びバクテリオクロロフィル
が形成される。デオキシリボ核酸の塩基組成は、グアニ
ン及びシトシンの両含有率が６５乃至６７モルチである
。菌体内脂肪酸は大量のＣ１□、（炭素数１８個および
二重結合１個を有していることを示す。以下同様）直鎖
不飽和脂肪酸及び少量のＣ，、、。

直鎖不飽和脂肪酸、ｃｎ：ａシクロプロパン酸並びに３
−０Ｈ−Ｃ，、、ｏ　ヒドロキシ酸から成る。主なユビ
キノンはＱ−１０であり、ユビキノンＱ−８、Ｑ−９及
びＱ−１１が少量成分として存在する。

プロトモナス属とメチロバクテリウム属とけ、メタノー
ル資化性とＰＨ８蓄積能力とを有する点では共通してい
るが、メチロバクテリニウム属はメタン資化性を有する
（特開昭５６−１１７７９３号公報参照）のに対して、
プロトモナス属はメタン資化性を有しない点で両者は全
く相違する。

本発明の目的に好適に使用されるグロトモナス・エクス
トルフェンスＫ　（ｐｒｏｔｏｍｏｎａｚ　ｅｘｔｒｕ
ｑｕｔｎｚＫ、微工研菌寄第８３９５号）１１−ｔ、詳
細には下記の菌学的特性を有する。

１、顕微鏡的形態 メタノール含有液体培地およびメタノール含有寒天培地
にて３００で２日間培養した。

■　細胞の形および大きさ 直桿状　０．９〜１．２μ×１．５〜４．０μ■　集団
、単細胞あるいけ双細胞になる。

■　運動性・・・あり。極鞭毛を有する。

■　胞子の有無・・・生産上れない。

■　ダラム染色・・・陰性 ■　抗酸性・・・陰性 ■　ｐＨＢ（ポリ−β−ヒドロキシ酪酸）の生成・・・
隣性 ２、各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養 ３０Ｃで５日間培養 コロニーの形態および性状 外形・・・円形、大きさ・・・２〜３順、隆起・・・半
球形、構造・・・均質、表面・・・平滑、辺縁・・・平
滑で金縁、色・・・赤色乃至ピンク色、透明度・・・不
透明、硬度・・・パター質■　メタノール寒禾平板培養 ３０Ｃ’で３日間培養 肉汁寒天平板培養と同じ ■　肉汁寒天斜面培養 ３０Ｃで３日間培養 接種線に一様に旺盛に生前中る。

隆起・・・中程度、表面・・・平滑、辺縁・・・平滑、
色・・・赤色あるいはピンク色、透明度・・・不・透明
、硬度・・・パター質 ■　メタノール寒天斜面培養 ３０１Ｔで３日間培養 肉汁寒天斜面培養と同じ ■　肉汁液体培養 ３０Ｃで３日間培養 全体に生育する。沈澱あり。凹環を形成しない。

■　ペプトン水液体培養 ５０Ｃで３日間培養 全体に生育する。沈澱あり。凹環を形成しない。

■　メタノール含有液体培養 ３０ｒで３日間培養 全体に生育する。沈澱あり。凹環を形成しない。

■　肉汁寒天穿刺培養 ３０Ｃで６日間培養 小乳頭状に一様に生育する。培地表面では直径２〜４ｒ
ｍぐらいの円状に生育する。

■　メタノール含有穿刺培養 ３０Ｃで３日間培養 小乳頭状に一様に生育する。培地表面では直径２〜４Ｉ
ｅ１１ぐらいの円状に生育する。

０　肉汁ゼラチン高層培養 ２０Ｃで１０日間培養 菌の生育はみられるが、ゼラチンは液化されない。

■　リドマスミルク ３０ｒで４週間培養 生育ばみられるが、アルカリは生産されない。

３、生理学的性質 ■　硝酸塩の還元 硝酸塩を亜硝酸に還元する○ ■　脱窒反応・・・陰性 ■　、４ｆ　Ｒテスト・・・陰性 ■　〆Ｐテスト・・陰性 ■　インドールの生成・・・陰性 ■　硫化水素の生成・・・陰性 ■　デンプンの加水分解・・・陰性 ■　クエン酸の利用（コーザーＫｏｚｔｒ培地とクリス
テンセンＣｈｒｉｚｔｅｎｚｔｎ培地を併用）弱く利用
する。

■　窒素源の利用 アンモニウム塩、硝酸塩、尿素およびペプトンを窒素源
としてそれぞれ利用する００　色素の生成 赤色の非水溶性色素を菌体中に生成する。

■　ウレアーゼ・・・陽性 ０　オキシダーゼ・・・陽性 ◎　カタラーゼ・・・陽性 ■　アンモニアの生成・・・陰性 ■　生育の範囲 、ｐＨ５〜９の範囲で生育する。ｐＨ６〜８が好ましい
。

０温度１５〜４０Ｃで生育する。２５〜３５ｔｒが好ま
しい。

［相］　酸素に対する態度・・・好気性■　Ｏ−Ｆテス
ト（ヒューライフソンＪｌｕｑｈ１、ｅｉｆｒｏｎ　　
法による） 糖を酸化的に分解するが、醗酵的に分解しない。

■　糖類の資化性ならびに酸の生成 糖　　類　　　　資化性　　酸の生成 Ｌ−アラビノース　　　　　　十（ｌｖ）　　　　　　
　十り−キシロース　　　　　　　士（Ｗ）十〇−グル
コース　　　　　　　士　　　　　　　士り−マンノー
ス　　　　　　　士（ＬＤ）　　　　　　　十り−クラ
クトース　　　　　　士士　　　　　　十〇−ガラクト
ース　　　　　　士（Ｗ）　　　　　　士麦芽糖　　−
− シ　　ョ　　糖　　　　　　　　十　　　　　　　　　
−乳　　　　糖　　　　　　−− トレハロース　　　　　　　　　十（ｕＪ）−Ｄ−ゾル
ピット　　　　　　　　−− Ｄ−マンニット　　　　　　　−− イノジット　　　　　　　　　−　　　　　　　−グリ
セリン　　　　　　　　士　　　　　　十デン粉　　　
　−− 資化性　　　　　　　　酸の生成 十十旺盛に資化する　　十　生成する 十　資化する　　　　　　−生成しない刊Ｗ）弱く資化
する −　資化しない ■　メタノールの資化性 旺盛に資化する ｅ　メタンの資化性 資化しない ＠　バクチリオフ００フイルの生成 生成する Ｏ　分離源 土壌 本発明者は、上記プロトモナス・エクストルクエンスＫ
に対してさきの講演要旨率にシュードモナスＫ　ｆｌｌ
　（ｐｙｅｕｄｏｍｏｎａｒ　ＪＦＰ、　Ｋ　）の名称
を用いてい友。しかしながら、パージイノ・マニュアル
・オプ・デターミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅ
ｒｑｅｙ’ｚ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｏｔｔｅｒｍｔ
ｎａｔｉｗｇＢａｃｔｇｒｒｏｌｏｑｙ）第８版〔編集
者ブツキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ　）、ギボンス（Ｇ
ｉｈｂｏｑｒ　）、コワン（Ｃｔｙｗａｎ）、ホルト（
ＩＩｏＬｔ）、リストン（ＬｉｚｔｏｒＬ）、ムレ−（
Ｈｕｒｒｙ）、ニイヴン（）ＶｉｕｔｒＬ）、ラピン（
Ｒαν１ｒＬ）及びスタニイア（Ｓｔａｉｎｉｇｒ　）
、ウィリアムズアンドゥイルキンス社（Ｗｉ　ｌ　Ｚ　
ｉ　（Ｚ７７１ＪＦαｎｄ１７ｉ１ｋｉｎｚ）　］およ
びパージイズ・マニュアル・オプ・システマテイツク・
バクテリオロジー（Ｂｅｒ−ｑｅｙ’ｚ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　１ｌａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｑｙ）第１版〔編集者クリグ（Ｋｒｉｅｑ）ｂよびホ
ルト（Ｈｏｌす：ウイリアムズアンドゥイルキンス社（
ｒＶｉ　ｌハａｍｊａｎｄ　Ｗｉ　１ｋｉｒＬ、）　）
には、これらの菌株に相当する菌種はみあたらない。

むしろ、前述Ｉ−た浦上及び駒形両氏の文献により提案
されているプロトモナス・エクストルクエンスと菌学的
性質が一致することから、この菌株は前記菌種に属する
ものと同定された。

勿論、本発明は上記した特定の菌株に限定されることな
く、同属或いは単に同種の菌であれば何れをも使用する
ことができる。

高菌体濃度培養 本発明によれば先ず、上記菌を、菌体濃度が３０乃至２
００　ｆ／ｌとなる迄、メタノールを炭素源及びアンモ
ニアを窒素源として流加培養する。

微生物の培養法は、回分式培養法、流加培養法、連続培
養法の６種に大別される。回分方式では、培養槽中に培
地を仕込み、種菌を接種した後は適当な通気攪拌を行う
ほかには培養終了時まで栄養源の補給や、培養液のｐＨ
や培養温度などの因子以外の環境因子の制御等をほとん
ど行わないため操作及び装置等が簡単であるが、培養経
過に伴う環境因子の変動には著しいものがあると共に、
最終主意物濃度は反量の仕込量により決定され、あまり
高濃度に主意することは期待できない。何故なら、原料
濃度を高くした場合には、メタノール資化性菌などにお
ける基質阻害を起すなど、炭素源の仕込量には限界があ
り、また窒素源として使用されるアンモニウムイオンも
高濃度においては毒性を示すからである。

一方、連続培養法は、連続的に゛栄養源を補給すると同
時に、連続的に培養液を抜き出す方法であり、培養の終
了ごとに菌体の回収や装置の洗浄などを行う必要はなく
、生学性も高いという利点があるが、培養の長期化に伴
い雑菌汚染や菌株の変異が起り易いために、必らずしも
工業的に有利な方法とけ言いがたい。

これに対し、流加培養法とけ、培養開始時の各栄養源１
度を低ぐしておき、微生物による消費量に応じて必要量
を補給し、培養終了により培養液を抜き取る方法であり
、この方法によれば、通常培養液のｐＨはたとえばアン
モニア水腫たけ硫酸などの添加により一定に維持され、
他の栄養源は不足を生じないように少量ずつ添加され、
培養全期間を通して栄養源の濃度を低（維持することが
できるため、回分方式に比して生産性が著１．〈向上し
、また連続培養法よりも培養を安定に行なうことができ
るという利点がある。本発明方法では、かかる見地から
流加培養法を採用するものである。

培地栄ｉ源としては、ＮＨ４＋、ＰＯ＋”−５Ｋ＋、Ｎ
ａ”、ＳＯ４２−等の他に、マグネシウム、鉄、カルシ
ウム、亜鉛、マンガン、コバルト、銅、モリブデン等の
金属塩が挙げられる。また、必要に応じ有機栄養源、例
工ばチアミン、リボフラビン、パントテン酸塩、ビオ千
ン、ニコチン酸等のビタミン類や、大豆蛋白加水分解液
、廃糖蜜、酵母エキス等を添加することができる。

上記成分の内でも、ＮＦＩ４＋は菌体の増殖に多量に必
要であり、菌体による消費速度が最も速い成分である。

ただＮＨ４＋濃度が１２／を以上になると阻害効果が認
められ、約０．２グ／ｌにおいて最も増殖が良好であっ
た。培養液におけるＮＨ４＋濃度を０，０５乃至０．５
ｆ／ｌの範囲とすることが望ましい。アンモニウム塩と
してはｌ’ｉＨ，Ｃ４または（ＮＨ，ｈ　Ｓ　Ｏ＜が優
れている。ｐｏ、”−及びに＋も菌体増殖に不可欠の成
分であり、Ｃα＋　Ｚ　ｎ及びＮａが欠乏すると増殖が
鈍る現象が認められる。

炭素源と（−でのメタノール濃度は、培養液中で比増殖
速度からみて、０．０５乃至５９／ｌ、特に０．３乃至
０．７ｆ／ｌの範囲内にあることが望ましく、０．５？
／ｌの濃度が至適である。培地ｐＨは、５乃至９、特に
６．５乃至Ｚ５の範囲が比増殖速度からみて好ましく、
７が至適である。また、培養温度は２５乃至３７Ｃ１特
に２９乃至３１Ｃが比増殖速度からみて好ましく、３０
ｔｌ’が至適であるｄメタ／−ル濃度の制御は、培地中
のメタノール濃度をセンサー等で検出し、メタノールの
流加流量を制御することにより行われる。メタノール濃
度の制御は、これに限定される本のではないが、微孔性
テフロンチュービングセンサーとガスクロマトクラフと
を使用し、マイクロコンピュータ−を装備したプロセス
コントローラー（三幸電子、プロセスコントローラ５ｒ
−３００１）による定値制御で行い得る。制御のプログ
ラムにはＰＤ方式（比例要素と微分要素とからなる自動
フィードバック制御方式）とステップワイズ方式を用い
ることができ、排気中のＣＯ，濃度を赤外線ガス分析計
を用いて測定し、景論的に計算することにより自動変換
する。計算されたメタノール供給量に基づき、メタノー
ル供給用のステッピングモーターの回転数をプロセスコ
ントローラの出力に応じて自動調節し、定値制御を良好
に行うことができる。

アンモニアの供給は、培養液のＰＨ調節を兼ねてアンモ
ニア水を供給することにより行われる。

アンモニア水と１．では例えば濃度が２５乃至′５５ｗ
ｔ％のアンモニア水を用いることができ、一般にはメタ
ノールと同時に供給することが望ましい。

アンモニア水の供給を同時に行う場合には、両者の供給
割合いは、量論的に計算される値に基づいて行うのがよ
く、一般に炭素／窒素の供給比は５乃至１５、特に７乃
至１０の範囲とするのが望ましｂ０培地又は培地のｐＨ
調節の目的の友めに、アンモニア水とは別個にアルカリ
性溶液（例えば５、２　ＮＫＯＩＩと０．２　ＮＮαＯ
Ｈの混液）を用意し、必要に応じアンモニア水以外にア
ルカリ性液をｐＨ調節の目的で滴下し得る。このｐＨＩ
Ａ節ｔｄｐＨ計からの検出信号によりアルカリ液の流量
を制御することにより容易に行われる。

培養液の溶存酸素濃度を１乃至７　ＰＰＭに維持するこ
とが好ツしく、この九めに空気、酸素或いはこれらの混
合ガスを培養液中または培養＠空隙に供給する。また、
培養液を攪拌羽根等で攪拌して酸素が培養液中に溶解す
るようにする。培養液中の溶存酸素濃度を、それ自体公
知の酸素検出機構、例えばポーラログラフ式酸素センサ
とフィールドラブ溶存酸素分析計を用いて測定１−２測
定値をプロセスコントローラに入力し、メタノール濃度
の制御と同様に、供給ガスの酸素分圧や攪拌羽根の回転
速度を自動調節することができる。

菌体増殖に必要な無機成分は、メタノール供給と同時に
補給できる。プロトモナス・エクストルクエンス・Ｋの
乾燥菌体の化学組成の一例を第１表に、初発培地及び無
機物供給液の組成の代表例を第２表に示す。

第　　　１　　　表 ｉ’ｉ　　　１０８ Ｈ７０ に５．２ ５２．１ Ｍ？　　　１，５ Ｍα　　０．１ Ｃ゛α　　０，０５ Ｆｔ　　　０８１２ Ｚｎ　　　Ｏ，０３ ｕｎ　　　Ｏ，０２ ＣＯＯ，０２ Ｃｕ　　　Ｏ，０３ 、Ｖｏ　　　Ｏ，００５ 第２表 成　　分　　　　　初発培地　　　　無機物供給溶液、
＾＝ノ’ｔ　ＰＩ３　　　　　　　　　　　　　　　　
０．８　　（９／ｌン　　　　　　　−−＜９／ｌ）〃
α、ＨｐＯ，・１２Ｈ，０３− ＜ＮＨ，）、５０４０．８　　　　　　　−〃ｌ／’０
４　　　　　　　　　　　　　　　　２７０Ｉｆ、５０
．　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｕｑｓＯ４
・７／’１．０　　　１００　　ＣＷｔ）　　　８０Ｆ
　ｇ　Ｓ　Ｏ，・７〃ρ　　　　１０　　　　　　　　
２．３ＣａＣ１，−２ｇ、０　　　　　５　　　　　　
　　１１．７Ｍｎ５０４・ｎＨ，０２０，５ （’　ｏｃ　ｌ＊・６Ｈｖ０　　　　　５　　　　　　
　　　ｏ、　５ＺｎＳ（Ｊ４４１１ρ　　　　　５０．
６ＣｕＣＬ、−２１１，０１０，４ Ｎａ、ＭｏＯ，−２１１，００，２− Ａ（ｅｔｈａｎｏｌ　　　　　　　Ｏ，５（ｒ／ｌ）　
　　−ｐＨ７，０ アルカリ溶液（５，２ＷＫＯＨ及び０，２ＮＮａＯＨの
混合液）添付図面第１図は、本発明方法の実施に好適に
使用される流加培養の制御系統を示すブロックダイヤグ
ラムであり、１は培養槽、２は培養液、３は攪拌羽根、
４Ｆｉモーターを示し、−型枠の部材は対応する内容物
の貯槽を示１−１二重枠の部材は分析機器及び／又は制
御機構を示す。図中ＤＯとあるけ溶存酸素の検出機構を
示す。

本発明によれば、このようにして培地中の菌体濃度が３
０乃至２００９／ｌ、特に３０乃至１２０ｆ／ｌとなる
迄菌体増殖を行わせる。即ち、菌体濃度が上記範囲より
も低い場合には、ＰＨ８の生産性の点で不利であり、一
方、菌体濃度が上記範囲よりも高くすることは、溶存酸
素不足等による菌体増殖の阻害因子が表われるので、本
発明の目的に不利である。本発明は、何等かの環境因子
により菌体の増殖が律速されたり、或いは阻害されたり
する直前迄菌体濃度を高めておき、次いで第一段階より
は少ないが、ＰＨ８合成経路の酵素活性が高いレベルに
維持されるように流加培養を続行することにより、ＰＨ
Ｂを高生産速度で効率良く製造し得る本のである。

１）　ＨＢ化量培養 本発明方法の第二段階では、菌体を高濃度で含む培養液
に、メタノール及びアンモニアを、炭素／窒素の供給比
が第一工程におけるよりも大きな比率となり且つＰＨ８
合成経路の酵素活性が実質上高いレベルに維持されるよ
うに供給して流加培養を続行する。

細胞内に蓄積物質がある場合には、菌体は主意物とそれ
以外の菌体成分とから成り立っており、培養開始後を時
間における夫々の濃度をｘｔ、ｘｐ。

）（ｒとすると、式 ％式％ で表わされる。また培養液量をｌ／ｌ　　とすると、流
加培養法ではＶｔ　４．経時的に変化するため、培養槽
全体では式　　。

ＶｔＸｔ＝〆、ｘｐ十〆ｔ　Ｘｒ　　　−・−・・−（
２１となる。ところで、ＰＨＢの生合成経路は全て）（
ｒに含まれており、実際にＸｒは３０〜７０％がタンパ
ク質で占められている。今、ＰＨ８合成系の酵素活性を
求める場合には、Ｘｒ当りのＸＰ毎成速度を考える必要
があり、そこで培養槽全体における単位Ｘｒ当りのＰＨ
ＢＣＸｐ）の生産速度をνｐとすると、式 となり、νρは菌体の本つｐＨ８合成能を示すものであ
る。

ところで、既に指摘した通り、流加培養により菌体濃度
を十分に高めた後、窒素源の供給を停止して、窒素飢餓
に干ることによりＰＨ８を生産する方法では、培地中の
ＷＳ２“が消費されてしまい、窒素欠乏状態になるとｐ
ＨＢ生童能が次第に減少する。第２図は、ｐＨ８生産期
において窒素源の供給を停止した場合について、窒素源
を供給した時点からの時間を横軸、ＰＨ８の生産速度ν
Ｐを縦軸としてプロットした結果を示し、第２図中のＮ
ｏは窒素欠乏になった時点を示す。第２図の結果から、
培養液中の＃７７、　９度が減少している間け、ＰＵＢ
生竜主意高く、またやや上昇しているが、培地中の〃〃
Ｊが消費されてしまい、窒素欠乏状態になると、ＰＨ８
生産能が次第に減少し、その経時的変化は一次活性低下
曲線に従うことがわかる。即ち、ＰＩＩＢ合成系酵素は
窒素欠乏により徐々に活性低下していくことがわかる。

これに対して、本発明によれば、ＰＨ８合成期において
も完全に窒素飢餓にするのではなく、酵素活性を維持で
きる程度の少量の窒素源を連続的に供給することにより
、速やかにしかも高濃度でＰＨ８を蓄積させることに成
功したものである。

本発明において、メタノール及びアンモニアの供給比率
は、上述した条件が満足されるものであればよいが、一
般には炭素／窒素の供給モル比（Ｃ７Ｎ比）が８乃至４
０、特に２０乃至３０の範囲内となるようにするのがよ
い。Ｃ７Ｎ比が上記範囲よりも小さい場合、即ちアンモ
ニアの供給比が上記範囲よりも大きくなると、菌体の生
理活性が減少し、アンモニアの消費速度も低下するため
に、培地中にＮＨ４が蓄積し始め、ｐｆｌＢ濃度も比較
的低い濃度で飽和するようになる。一方、Ｃ７Ｎ比が上
記範囲よりも大きい場合、即ちアンモニアの供給比が上
記範囲よりも低い場合には、ＰＨ８合成経路での酵素失
活により、Ｐ　Ｉｆ　Ｂの生産速度が低下する傾向があ
る。事実、本発明によれば、ｐＨＢ生童期に窒素源の供
給を停止する場合に比して、約半分の時間でＰＨ８含有
率が５０乃至７０％の高濃度となるような生産を行うこ
とができる。

本発明のｐＨＢ生童段階において、低いＣ７Ｎ比はｐＨ
８含有率が低い時点での活性を維持する効果があり、一
方高いＣ７Ｎ比はｐＨ８含有率が増大してからのｐ　Ｉ
Ｉ　Ｂ主意能の活性低下防止に有効であることがわかっ
た。以上の結果から、Ｐ〃Ｂ合成期においても、アンモ
ニアを少量ずつ供給し、その流量は、ＰＨ８の細胞内含
有率の増加に従って徐々に減少させることが望ましい。

、第３図は、各Ｃ７ＩＶ比について培養開始時からＣ７
Ｎ比を一定に保ったまま、メタノール／アンモニアを供
給【７た場合のＣ／　Ｉ’Ｖ比とＰＨＢ含有率（Ｘρ／
Ｘｔバーセント）との関係を示す。第３図の結果から、
ＰＨ８の含有率はＣ／Ｎの供給モル比が大きい程大きく
なり、ＰＨ８含有率はＣ７Ｎ供給モル比によりコントロ
ールされることがわかる０ ＰＨＢ合成期におけるＣ／Ｎモル比は、ｐＨ８含有率に
影響をもたらすが、それと同時にｐＨ８合成能の活性低
下速度をも支配する。今、培養時間ｔ、　ｌ　ｔ、にお
けるｐＨＢ合成能をシρ０．シρ、と表わすと、比活性
低下速度−ｋｄ′！ｉ−次式のように定義することがで
きる。

ＰＨ８合成期におけるＣＺＮ比を変化させ、上記式（４
）の定義に基づいてｋｄを算出した結果を第４図の線Ａ
に示す。この結果から、ｐＨ８合成能の活性低下速度は
Ｃ／Ｎの供給モル比に従うことが明らかである。窒素源
の供給を完全に停止した場合には、第２図からｋｄ＝０
．０３２Ａｒ　’と計算されるので、第４図からＣ７Ｎ
比が最終段階で２９〜ろ０である場合に、ＰＨ８含有量
が最大値に近い状態で定常状態に達するものと思われる
。

また、第６図に示す結果をＣ／Ｉ’ｉ比の対数に対ｌ−
て表わすと、第４図の線Ｂに示す通り、ｐＨ８゜含有率
（Ｘρ７ｘｔ、％）とＣ７Ｎ比との関係が明瞭となり、
下記式 ％式％（５） が成り立つ。かくして、ｐＨＢ合成合成式（７）に従っ
て、Ｘｐ／Ｘｔの増加に伴い、Ｃ７Ｎ比を決定し、これ
に基づいてメタノールの供給速度に対し、窒素源の供給
速度を調節することにより、ｐＨＢ合成能の活性低下速
度を最小限に抑制しながら、短時間の内にｐＨ８生産を
行い得ることが明らかとなろう。

後処理及び生成ｐＨＢの特性 本発明によれば、一般にｐＨＢ含有量が５５乃至７０重
量係の範囲内にある菌体を、１５０乃至２５０　？／ｌ
という高濃度で生産することができる。しかも、高菌体
濃度増殖に要する時間は、濃度によっても相違するが一
般に３０乃至７０時間であり、ＰＨ８生産培養に要する
時間は、ＰＨＢ含有量によっても相違するが、５０乃至
１２０時間の範囲内である。

ＰＨ８は菌体内に顆粒として生成するので、培養液から
先ず菌体を分離し、次いでそれ自体公知の菌体破壊処理
に賦し、次いでＰＨＢを公知の手段で分離する。菌体の
分離は、ｒ過、遠心分離等の固−液分離操作で行うこと
ができ、菌体の破壊は、ホモジナイザー、ミリング等の
剪断処理や超音波照射、凍結乾燥等により行うことがで
きる。

ｐＨ８の分離は、破壊された菌体を、クロロホルム、１
＋２−ジクロルエタン等のハロゲン化炭化水素で抽出し
、この抽出液を蒸発乾固　非溶媒との混合による凝固沈
澱等に賦し７、必要により精製処理に付することにより
、単離することができる○得られるＰＨ８の融点は１０
００以上であり、高度に純粋なものであり、その分子量
は１０Ｓ　　乃至１０７の範囲にわたることが認められ
た。

発明の作用効果 本発明によれば、以上詳述した通り、メタノール資化性
とポリ−β−ヒドロキシ酪酸の菌体内蓄・積能力とを有
するプロトモナス属菌を、メタノールを炭素源、アンモ
ニアを窒素源として高菌体濃度となる迄流加培養により
増殖させ念後、ＰＨ８生産期においてもアンモニアの供
給を停止することなく、炭素／窒素の供給モル比が第一
段のそれよりも大となるように供給し７て流加培養を続
行することにより、ＰＨ８合成経路の酵素活性を高く維
持でき、ｐＨ８が高濃度で蓄積された菌体を高笛体濃度
でしかも高主意速度で製造することが可能となる。特に
ＰＨ８生産期において、ｐＨ８菌体含有量の増加に伴な
ってＣ７Ｎ供給モル比を減少させることにより、最も有
効にＰＨ８含有量を高めながら、しかも半量速度を高め
得るこ、とができる。

実施例 本発明を次の実施例で説明する。

以下の実施例において、各種の測定及び分析は次の方法
によった。

（１）菌体濃度の測定方法 菌体濃度の測定には培養液を０．９ｒｂｔチ水溶液で適
度に希釈［また後５７０　ｎｍにて濁度を測定［７た。

（高滓スペクトロニック２０）グロトモナスｅエクスト
ルクエンスＫに対する濁度＜０Ｄｓｔ。）と菌体濃度（
Ｘ）との関係けＸ＝ＯＤ、ｌ、。Ｘｏ、４９であった。

各菌株に対する濁度と菌体濃度の関係は、培養終了後、
各菌体を遠心分離して集め、再蒸溜水で２回洗浄した後
に乾燥し重量を求めた。

（２）ＰＨ８の定量方法 細胞内のＰＨ８の定量方法は、Ｇ、Ｂｒａｕｎｔｑｑら
の方法に従って、ガスクロマトグラフにて分析を行なっ
た。操作方法は凍結乾燥菌体約５０■を秤量後、スクリ
ューキャップ付１０ｍＺ試験管に入れ、クロロホルム２
−と、硫酸を３％含むメタノール２−を加え、栓をして
１１０Ｃにて６．５時間反応させた。反応終了後、水１
−を加え激しく１０分分間上うした後に下層のクロロホ
ルム層を抜き取り、生成したヒドロキシ酪酸メチルを定
量した。内部標準試薬として安息香ｆｆｉ？１（■／−
メタノール〕の濃度で硫酸メ・タノールに溶解しておき
、同様に反応後、生成した安息香酸メチルのピークとヒ
ドロキシ酪酸メチルのピーク面積比からＰＨ８量を計算
した。

カラムは２ｍステンレスカラム（内径３　ｍｓ　）　ｆ
用いて、充填剤としてＲｅｂｐｌｅｘ　４１］Ｑ　−Ｃ
ｈｒｏｍ−ｏｚｏｒｈ　ＧＡＦ−０ＭＣ５３０／　８０
メツシユを使用１〜た。分析に先立ち検量線を求めるた
めに、菌体を含まない安息香酸のみ反応させたクロロホ
ルム−メタノール混液にヒドロキシ酪酸メチルの特級試
薬を秤８１−た後溶解させ、水１−を加え抽出し、下層
のクロロホルム層を分析に用いた。その結果、ピークの
面積比と濃度の関係は次のように表わされることがわか
った。

Ｓα Ｃα＝　５．６　ｘ　−ｘ　ｃ　ｂ ｂ Ｃｂ：　安息香酸メチルの濃度ＣＴｎＩｌ／ｍｅ）Ｓｈ
：　安息香酸メチルのピークの面積検量線として、ＰＨ
８の標品を用意して同様の宝前操作を行った場合にも、
上記式に合うことが判明した。なお、ｐＨＢの標品はＧ
、　Ｂｒａｕｎｅｑｙらの方法に従って、プロトモナス
・エクストルクエンスにのアセトン乾燥菌体からクロロ
ホルムで抽出した後、残渣をろ過して除き、ろ液をアセ
トン中に滴下しｐＨ８を沈澱させ、得られたＰｒｆＢを
アセトンとジエチルエーテルでそれぞれ２回ずつ洗浄（
、ｐＨＢ標品と［７た。

（３）Ｎｌｌ、＋の分析方法 培養液を経時、的に約１０耐抜き取り、遠心分離（１１
００００Ｇｘ１５，４ｔＺ’）Ｌ、た後、上澄液中のＩ
ＶＨ，＋濃度をベルセロット反応で測定した。この反応
操作は次の通りである。

÷ 試料　　　　　０゜１− ４．１− すなわち、Ａ液、Ｂ液を各２−と試料０．１−を混合し
、３７Ｃ’で３０分反応後６３０　ＦＬＦ７！の吸光度
を測定した。

（４）培養液量の測定方法 培養中一時的に通気と攪拌を止め静置してジャーファー
メンタ−壁面の目盛で測定し、さらに培養終了後、全量
をメスシリンダーで測定した。

（５）ＰＨ８の抽出方法 プロトモナス畳エクストルクエンスにの菌体内の全ＰＨ
８を抽出するには前節で述べた方法では不完全なため、
さらに抽出条件を厳しくし超音波処理を行うことにより
抽出する方法をとった。すなわち５２のアセトン乾燥菌
体に対しクロロホルム１００−で１２時間３０ｔｌ’で
抽出した後、ろ過して残渣を集め、残渣に再び１０〇−
のクロロホルムを加え４０Ｃにて最大条件で超音波処理
′ｆ３０Ｍ行ないろ液を合わせ、３倍容のへキサン中に
混入しｐＨ８を沈澱させた。

このｐＨ８をアセトン及びジエチルエーテル各５０−で
２回ずつ洗浄し念。

（６）ＰＨ８の特性試験方法 抽出したＰＨ８は、ＩＲ分析、Ｃ１Ｃ１３−Ｎ及び１１
’ＮＭＲ分析により構造を標品と比較し、また、融点及
び分子量分布を調べ次。

（７）電子顕微鏡サンプル調製方法 培養前期、中期、後期の菌体を遠心分離して集めた後、
グルタルアルデヒドと四酸化オスミウムの二重固定をし
、アルコールで脱水した後樹脂へ包埋した。そして超薄
切片に切断したサンプルを酢酸ウランとクエン酸鉛で二
重染色し検鏡した。

実施例１゜ （１）使用菌株 プロトモナス・エクストルクエンスＫ（微工研菌寄第８
３９５号）を用すた。

（１１）使用培地及び培養方法 第２表に示す初発培地を使用し、前培養液は５０〇−容
坂ロフラスコ１０本に、各１００−のこの培地を用意し
、メタノール１％を炭素源とし、−白金耳を保存用スラ
ントから植菌した後、３０Ｃにて６日間振とり培養した
。菌体が増殖後、滅菌済みの橙付遠沈管を用いて雑菌汚
染しないように遠心分離した。この菌体を新鮮なＩＥ２
表の培地１００−に再懸濁し、ジャーファーメンタ−Ｃ
２を容　１ｕｅｉｚｈｉｙａ　Ｃｏ、　ｔｙｐｅＭＢ　
）に用意した６５０−のＣ培地と合わせ、７５０−にて
培養を開始した。

Ｏｕ）培養条件の制御 培養条件の制御は、第１図に示す制御系統を使用し、且
つ明細書本文に説明した方式により行った。即ち、予備
試験の結果から、温度、ｐＨ及びメタノール濃度を夫々
３０ｔ”、ＰＨ＝７０及び０．５１−ｆｌに定値制御し
た場合に比増殖速度の最大値が得られることがわかった
ので、温度〜３０士〇、５Ｃ，ｐＨ＝７．０±０．１、
メタノール濃度０．５±０．２ｔ／ｌに制御して培養を
行った〇 アンモニア水（濃度３３０４％　）及び第２表に示す無
機物供給液はメタノールに対して一定の割合いで供給す
る方法を採用した。アンモニア水の供給割合いは、物質
収支を考慮［２て高菌体濃度増殖期にはＭ　ｔ　ＯＨ：
　ＮＨ１＋の供給モル比を１：８とした。

培地内の溶存酸素濃度は、空気と純酸素を混合して供給
し、攪拌羽根の回転数を５００乃至１４００　ｒｐｍと
することにより、菌体増殖期だけでなく、ｐ　ｆｌ　Ｂ
生産期にも、２〜３　ｐｐｍに維持した。

ＧＶ）　　菌体増殖 上記条件下で菌体増殖を行ったところ、Ｎｆｌ、”濃度
は菌体増殖期においても０．２？／を以下に抑制されて
おり、高ＮＨ４＋濃度（例えばＮＨ４”１．４ｆ／ｌ）
の場合に入られる増殖の停滞期は認められず、７５時間
後には菌体濃度＜Ｘｔ　＞け約１５０９／ｌに達した。

この時点で、通気ガスの酸素分圧は１００チ、及び攪拌
羽根の回転数は１４００　ｒｐｍに達しており、これ以
上溶存酸素濃度レベルの維持が困難であることから、Ｐ
Ｈ８生童生産の切換えを行った。

（）ｐＨＢ生童 ｐ　Ｉｆ　Ｂ　生産期においては、メタノールとアンモ
ニアとの供給モル比を２５：１に維持して、メタノール
とアンモニア水とを同時に供給した。

増殖期終段において、ｐＨＢが菌体内に約１８チ蓄積さ
れていたが、Ｃ／Ｎ供給モル比の切替によりｐＨ８含有
量が急激に増加した。

最終的に１３０時間の培養でｐ　１１　Ｂ濃度１３７ｇ
／ｌと非常に高濃度迄生音することができた。

この時全菌体量は２１７　ｔ／ｌに達しており、ＰＨ８
含有率は６５チであった。また、全消費メタノールに対
するＰＨ８の総生産量の収率ば。

０．１９ｆ／ｌであった。

（ｖ′ＯｐＨＢの特性 凍結乾燥菌体から抽出したｐＨ８の赤外吸収スペクトル
（ＩＲ）を第５図に示す。ＩＲ分析、ｃＩｓ−ＮＭＲ及
ＵＨ’−ＮＭＲｔｙ＞各スペクトルはいずれもｐＨＢの
構造の特徴を示すものであった０また、融点は１７６Ｃ
であった。得られたｐＨ８の分子量分布を第６図に示す
０分子量分布の測定結果では、１０万程度の本のが最も
多く存在しているが、１００万以上に及ぶものもあり広
範な分布を示した。なお、平均分子責は６．Ｏｘ　１．
０５であった。

ｐＨＢの電子顕微鏡写真によると、培養前期の菌体増殖
期にはＰＨ８がほとんどできていない細胞や１個または
２〜３個の小さな顆粒が存在しているものが認められる
。

ｐＨ８生産期において、ｐＨ８の顆粒は巨大化しており
、最終的には細胞内のかなりの部分をＰＨＢが占めてい
ることがわかった。

実施例２゜ 使用菌株、培地及び培養方法は何れも実施例１と同様に
行った。

ただし培地中の菌体濃度が３０９／ｌに達した時点で、
アンモニア水＜３３ｗｔ％）の流量を、Ｏ（ゼロ）、０
．０６．０．２６．０．７８及び１．６−７時の各条件
に設定し、アンモニア水の定流量流加培養を行った。尚
、菌体の増殖期におけるアンモニアの供給速度は約３−
７時であった。上記アンモニア水の供給量は、Ｃ／Ｎモ
ル比で夫々、無限大、３５０．８０．２７及び１６に相
当する。

各アンモニア供給速度での菌体濃度（Ｘｔ）、ＰＨＢ濃
度Ｃ９／ｌ）及び菌体内ｐＨ８濃度（Ｘｐ／Ｘｉ。

チ）を、第７図、第８図及び第９図に示す。

第９図の結果から、ＰＦＩＢ生童期におけるアンモニア
の供給量をゼロではなく、適量供給することにより、菌
体内ＰＨ８濃度が３０％の場合、生産速度を約半分に節
約し得ることがわかる。

実施例６゜ 使用菌株、培地及び培養方法は何れも実施例１と同様で
あるが、培地菌体濃度が８０９／ｌになる迄増殖を行っ
た後、前記式（６）に従い、初期のＣＺＮ比を９とし、
終期のＣ７Ｎ比を３５として、ＰＨＢ生竜主意った。

最終的に、１３５時間の培養でＰＦＩＢ濃度１４４ｙ７
ｔで、全菌体濃度２２５　？／ｌで、ｐＨ８含有８６４
％の結果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の実施に好適に使用される流加培養
の制御系統を示すブロックダイヤグラムであり、 第２図はｐＨ８生産期において窒素源の供給した時点か
らの時点を横軸、ＰＨ８の生産速度を縦軸としてプロッ
トした結果を示す線図であり、第６図は、メタノール−
アンモニアを供給した場合のＣ７Ｎ比とＰＨ８含有率と
の関係を示す線図であり１ 、＠４図は、Ｃ７ＩＶ比と失活速度及びｐＨＢ含有率と
の関係を示す線図であり、 第５図は実施例ｊで生産されるＰＨ８の赤外吸収スペク
トルを示す線図であり、 第６図は実施例１で生産されるＰＨ８の分子量分布を示
す線図であり、 第７図、第８図及び第９図は、実施例においてＰＨＢ生
幸期のアンモニア供給速麿を変化させた場合における夫
々菌体濃度、ＰＨＢ濃度及び菌体内ｐ　ＩＩ　Ｂ濃度を
示す線図である。 第１図において、１は培養槽、２Ｖｉ培養液、３は攪拌
羽根、４はモーターを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）メタノール資化性とポリ−β−ヒドロキシ酪酸の
   菌体内蓄積能力とを有するプロトモナス属に属する菌を
   、菌体濃度が３０乃至２００ｇ／ｌとなる迄、メタノー
   ルを炭素源及びアンモニアを窒素源として流加培養する
   工程と、この培養液に引続きメタノール及びアンモニア
   を、炭素／窒素の供給比が第一工程におけるよりも大き
   な比率となり且つポリ−β−ヒドロキシ酪酸合成経路の
   酵素活性が実質上高く維持されるように供給して、流加
   培養を行う工程とから成ることを特徴とする微生物によ
   るポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法。
2. （２）第二工程における炭素／窒素の供給比が８乃至４
   ０の範囲内にある特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）前記菌がプロトモナス・エクストルクエンスであ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）培養液中のメタノール濃度を０．０５乃至５ｇ／
   ｌに維持する特許請求の範囲第１項記載の方法。