JPS625131B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、免疫抑制としての抗ヒト・リンパ球
グロブリン（以下、AHLGと略称）の製造方法に
関するもので、殊に、免疫原として人間の末梢血
リンパ球より精選されたＴリンパ球を使用して馬
を免疫し、生成される抗リンパ球抗体を馬の血清
から分離精製して回収することを特徴とする動物
由来の免疫抑制抗ヒト・リンパ球グロブリンの製
法に関するものである。 AHLGの従来からの製造方法としては、人間の
リンパ球を免疫原として動物に投与して、動物の
血液を抽出して、製られていたが、この方法で
は、免疫原として用いられ末梢血、脾臓、胸腺等
から分離されたリンパ球には、赤血球、血小板、
血清蛋白、糸球体基底膜等と共通の抗原が混在し
ているので、これらから製られるAHLGには、上
記の赤血球、血清蛋白等の抗原に対する抗体が含
有されており、副作用を生じさせる原因となつて
いた。 このような副作用の欠点を解決する為に、本発
明のように、免疫原の選択や開発が進められてお
り、例えば、サル由来のリンパ球を、人リンパ球
の代替として用いる方法（英国特許第1303750
号）、人リンパ細胞の可溶性抽出物を用いる方法
（特開昭46−2047号）、人胸腺細胞を用いる方法
（特開昭47−19021号）、５種以上の人の培養リン
パ細胞からの選択（フランス特許第2153193号）
する方法および培養リンパ細胞の培養液の非細胞
性上澄液を用いる方法（特開昭49−116222号）等
が開示されている。しかしながら、これらによつ
てかなりの混在抗体の低減は、促進されたものの
人リンパ球に対する抗体価が十分でなかつたり、
あるいは副作用を完全に解消することができず、
これらのAHLGを臨床に応用するには、相当に制
約を受けた。また、免疫原の追求とは別に、分画
精製法によつてAHLGから混在抗体を除去する方
法も開示されている。しかしながら、これらの方
法においては、リンパ球グロプリンを治療的用途
に使用し得る程度の収量で得ることは困難で、し
かもコスト的にも高価でかつ煩雑な操作となる短
所があつた。 以下、実施例に従い詳細に説明する。 本発明で使用された人末梢血より得られるＴリ
ンパ球は人の末梢血管より血液を採取して、まず
白血球を分離しこれよりFicoll−Conray比重遠心
法によりリンパ球を分離する。リンパ球には胸腺
由来リンパ球（Ｔリンパ球）と骨髄由来リンパ球
（Ｂリンパ球）とがあり、移植免疫において主役
を演ずるのはＴリンパ球である。そこで分離され
たリンパ球よりロゼツト形成遠心法および
Fluorescence activated cell sorter（FACS）を
用いてＢリンパ球を除去して、Ｔリンパ球だけを
分沸離し、このＴリンパ球を免疫原とする。この
ように調製された免疫原は、そのまゝ若しくは−
80℃に冷凍保存し、必要に応じて解凍して使用す
る。 動物（好ましくは馬）への免疫化は、１回の免
疫原量を１〜50×10⁹細胞／20mlとして等量のフ
ロインドの完全助剤（Freunds complete
adjuvant）と混合しエマルジヨン化して２週間隔
で０週、２週と皮下投与する。４週において１〜
50×10⁹個の細胞だけを静脈内投与する。以後
は、動物から採取した血漿の力価を測定し、必要
ならば追加免疫する。採血は、４週以後１回約15
あて１週間隔で２回血球返還採血法によつて行
う。血漿からのAHLGの回収は、次のようにして
行う。 得られた血漿を、抗凝固剤（ヘパリン等）で処
理し、遠心分離をおこなつた上清から公知の方法
によりｒ−グロブリンを回収する。もし上清が多
くの赤血球凝集素（ヘモアグルチニン）又は、抗
人血清蛋白抗体を含むならば、必要に応じて人赤
血球及び人血漿によつて各々の抗体を除去する処
理にかける。処理は最も簡単には、抗原抗体反応
によつて生じた沈殿物を遠心分離によつて除去す
れば足りるが、効率的には、各々の抗原を担体に
吸着させたアフイニテイークロマトグラフイーの
原理を利用することが好ましい。このように必要
により不要抗体を吸収除去した動物血清（以上
AHLSと略す）から公知の方法によりｒ−グロブ
リンを回収する。 すなわち、不要抗体不含の血清に硫安を25〜50
％の飽和に添加し、グロブリン分画を回収する。
さらに好ましい方法としては、25〜30％飽和で沈
殿する画分を除去した後、さらに40〜50％飽和で
沈殿する画分を回収する。別の方法としては
AHLSを弱塩基性陰イオン交換体（例えばDEAE
−Cellulose、DEAE−交サ結合祈デキストラ
ン、ここにDEAEはジエチルアミノエチル基を示
す、）と接触させ、グロブリン以外の成分を吸
着・分離する方法である。イオン交換体は、特に
限定されることはないが、PH６〜８の平衡化条件
が好ましい。簡便には、蒸溜水でよい。吸着され
ずに残つたグロブリンは、ろ過の後さらに42％飽
和に硫安を添加して沈澱としてAHLGが得られ
る。その他の好ましい方法としては、ポリグリコ
ール共重合体による静注可能なｒ−グロブリンの
製法（英国特許第1435816号）、ポリエチレングリ
コールによる静注可能なｒ−グロブリンの製法
（英国特許第1372953号）、アクリノールによるｒ
−グロブリンの精製（USPNo.3607857号）、エタノ
ールによるｒ−グロブリンの製法（USPNo.
2543215号、No.2520076号、No.2437060号）等が利
用可能である。なお追加処理として、抗補体活性
不活化のためのトリプシン、プラスミン等による
公知の処理及び、肝炎ウイルス等の病原ウイルス
の不活化のための60℃、10時間の公知加熱処理を
行なうことは、自由である。 AHLGは、遠心分離後再溶解して過の後蒸溜
水又は生理食塩水に対して透析を約24時間行う。
透析が終つた水溶液は除菌過を行つた後、分注
される。分注は、１アンプル４〜15mlあるいは凍
結乾燥された場合はAHLG蛋白量として50mg〜
1000mgに分包する。 得られたAHLG製剤の特徴は、次に述べる活性
テストにより吟味することができる。 (1) 細胞障害試験 AHLGの力価試験としてリンパ球細胞障害験
を行う。リンパ球は、０型血液の正常人よりヘ
パリン採血した血液からフイコル（Ficoll）法
（臨床検査、18、７、1974）により調整する。
得られたリンパ球は、バルビタール緩衝液によ
つてリンパ球約1.5×10⁴個／mlの浮遊液を調整
し、補体を含むウサギ血清で５倍希釈する。検
体は生理食塩水による２倍希釈系列をつくる。
検体の各段階希釈液およびリンパ球浮遊液の
各々0.1mlずつを内径５〜６mm長さ70〜80mmの
小試験管にとり、37℃90分保つたのち約1550r.
p.mで６分間遠沈し、沈査に２％トリパンブル
ー（TryPan blue）を３滴加えて５分間放置す
る。染色後直ちに判定する。判定は、顕微鏡下
に染色された白血球数をかぞえて20％以上のと
きを陽性とし、×80希釈以上での陽性の場合が
AHLGの力価として規格に適合するとした。 第１表に示す比較実験は、免疫原としてヒト
リンパ球膜成分およびヒト、末梢血リンパ球及
び本発明によつて提供されるAHLGを用い各々
の場合に得られた検体の力価を陽性と判断され
る最大希釈倍数としてその免疫後の推移を表わ
した。この結果、本願の方法によつて得られる
AHLGは十分の力価を有するものである。

【表】 (2) ロゼツト形成阻止力価 Ｔリンパ球に特異的な羊赤血球と結合する機
能をAHLGが抑制する能力を測定するために、
ロゼツト試験（The Joural of immunology
113 266（1974））が行なわれる。フイコル
（Ficoll）法により調整したリンパ球を約1.5×
10⁷個／mlにバルビタール緩衝液に浮游する。
ヒツジ赤血球（SRBC）は約1.0×10⁸個／mlに
生理食塩水に浮游する。ガラス小試験管にリン
パ球浮游液0.2mlとSRBC0.25mlとを混ぜ、（リ
ンパ球とSRBCの混合比率は１：８〜10）ハン
クス液0.55mlを添加して37℃に15分間インキユ
ベートした後、1500r.p.m×5min.遠心分離す
る。その沈査を４℃において１〜２時間静置し
た後、ハンクス液を0.2ml加えて試験管を上下
に振り、または円形回転してリンパ球を静かに
再浮游させる。 リンパ球の周囲に３ケ以上のSRBCが凝集し
ているものをロゼツト形成リンパ球とみなし、
ロゼツト形成率を求める。 ロゼツト形成阻止はSRBCを加える前に検体
AHLGと共にリンパ球を37℃においてインキユ
ベートすることによつておこる。すなわち、リ
ンパ球浮游液0.2ml、希釈検体0.5mlおよびヒト
赤血球、羊赤血球で吸収した５倍希釈モルモツ
ト補体0.05mlを混合し、37℃、90分間インキユ
ベートした後SRBC浮游液0.25mlを添加した
後、前述と同様の方法でロゼツト形成率を測定
する。 25％以上のロゼツト抑制率の場合を陽性とす
る。 以下の第２表に示す比較実験の結果は、免疫
原としてヒト末梢血リンパ球を用いた場合及び
本願方法で得られたAHLGの力価を陽性と判断
される最大希釈倍数としてその免疫後の推移を
表わした。その結果は、第２表に示した。この
結果、本願AHLGの力価は十分の力価を有する
ものである。

【表】 (3) 赤血球凝集素価の測定 AHLGの抗赤血球抗体活性は赤血球凝集素価
をもつて測定される。赤血球浮游液はＯ、Ａ、
Ｂ、AB、各型赤血球を0.9％食塩液で２回洗浄
し、赤血球沈層を２％の割合に0.9％食塩水に
浮游させて調製した。 試験管（内径７mm長さ80mm）にこの赤血球浮
游液0.1mlおよび検体の0.9食塩水希釈液0.1mlを
加えて振り、よく混和した後1000r.p.m.で１分
間遠心分離する。測定は試験管底の血球塊がち
ようどはなれる程度に振とうして、赤血球の凝
塊ができるか否かを読む。凝塊ができる最高の
希釈度を検体の赤血球凝集素価とする。 比較実験は、免疫原としてヒトリンパ球膜成
分およびヒト末梢血リンパ球を用いた場合及び
本願の方法で得られたAHLGの力価の推移を表
わした。その結果は、第３表に示した。この結
果、本願AHLGは実質上無視し得る程度の抗赤
血球抗体活性を有するに過ぎない。

【表】 (4) 血小板凝集素価 AHLGの抗血小板抗体活性は、凝集法によつ
て検定することができる。Ｏ型ヒト血液（ヘパ
リン血）を10min×1000r.p.m.の遠心分離を行
うことにより多血小板血漿（PRP）を得る。こ
のPRPは血小板を約30万個／mm^３含有する。こ
のPRP0.05mlと等量の各希釈倍数のAHLGとを
室温でホール付きスライドグラス上で混合し、
カバーグラスで覆い、30分後に顕微鏡下に血小
板の凝集の有無を観察する。血小板３個以上の
集りを凝集とみなし、この凝集の認められる検
体希釈倍数を血小板凝集素価とした。 比較実験は、免疫原としてヒトリンパ球膜成
分およびヒト末梢血リンパ球を用いた場合及び
本願発明の方法によつて得られたAHLGの力価
の推移を表わした。その結果は、第４表に示さ
れる。この結果、本願方法によつて得られる
AHLGは、ほとんど完全に抗血小板抗体活性を
有していない。

【表】 (5) 局所刺激試験 AHLGの局所に対する刺激性を肉眼的、組織
学的検査により検定する。試験は体重2.5〜3.0
Kg雄の家兎を１群３匹用い免疫後４週目に採血
した血液から調製したAHLG凍結乾燥標品10ｇ
を２mlの生理食塩水に溶解し、その１mlを投与
する。投与は家兎背部の毛を刈り、左右の背部
仙棘筋の中央にそれぞれ被検試料を注射する。
投与２日目および７日目に家兎を潟血致死させ
た後、注射部位の中心にメスを入れ筋肉の変化
を(1)に示す判定基準に従つて肉眼的検査を行
う。さらに該部の筋組織を摘出し、ブアン氏液
で固定し、HE染色を行つた組識学的検査を(2)
の判定基準に従つて行う。 (1) 肉眼的検査判定基準 スコアー 障害の程度 ０：局所作用が全く認められない。 １：軽度の充血及び投与部位に判別困難なほ
どの出血斑、わずかな腫張が認められる。 ２：中程度の充血及び小出血斑、わずかに白
い変性、軽度の腫張が認められる。 ３：強度の充血及び出血斑、著明な白変性、
腫張が認められる。 ４：壊死を伴う褐色変性が認められる。 (2) 組織学的検査判定基準 筋組織の出血、細胞浸潤、浮腫、変性、壊
死、線維化等の変化の性質と強度を勘案し
て、その障害を次のように分類した。 スコアー 障害の程度 ０：障害が認められない １：障害がわずかに認められる。 ２：軽度の障害が認められる。 ３：中等度の障害が認められる。 ４：強度の障害が認められる。 比較実験としてヒトリンパ球膜成分およびヒ
ト末梢血リンパ球を各々免疫原として用いた場
合及び本願方法によつて得たAHLGにつき、２
日目、７日目の所見を平均スコアーとして第５
表に示した。その結果、本願AHLGは何らの刺
激性を示さなかつた。

【表】 (6) 急性毒性試験 本願AHLGの急性毒性試験を体重約200ｇの
ラツト１群５匹を用いて行つた。各AHLGは生
理食塩水に溶解した後、500mg／Kg、1000mg／
Kg、1500mg／Kg、2000mg／Kgを腹腔内投与し、
５日間観察を行つたが、死亡例は認められなか
つた。 かくして本願発明の製造方法によつて提供さ
れるAHLGは、リンパ球に対する特異的抗体活
性及び免疫抑制能力を有し、かつこれまで人体
の抗リンパ球グロブリンの使用を制限していた
抗赤血球及び抗血小板活性という夾雑抗体活性
が実質上存在せず、本願はきわめて安全な医薬
の製造方法を提供するものである。 実施例 (1) 白血球の採取 ヒト末梢血より採取したACD（Acid citr
ate dextrose）血液を低温高速遠沈し、上清の
血小板を含む血漿を取り出した後、沈澱した赤
血球層との境界にあるBuffy Coat clot（豚皮
脂凝血）を抽出する。この中にはリンパ球、顆
粒球および単球が含まれているが、その外に小
数の赤血球および血小板が混在している。 (2) リンパ球の分離 前記のBuffy Coat clotに同量のPhosphate
buffeved saline（PBS）を加えて白血球浮游
液を作り、これによりFicoll−Conray比重遠心
法によりリンパ球を分離する。Ficoll−Conray
液はFicoll蒸留水溶液24容に33.4％Conray400
10溶を混和する。白血球浮游液の上にFicoll−
Conray液を静かに重層し、1500r.p.m.30分間
遠心し、Ficoll−Conray液層の上にある白い帯
状のリンパ球層を採取する。これを同量のPBS
に浮遊して10分間遠心し、沈澱に0.8％NH₄Cl
（Tris bufferでPH7.4に調整）を加えて、混在
する赤血球を溶解する。その後さらにHanK′s
Balanced Salt So lution（HBSS）で３回洗滌
遠心してリンパ球を分離する。以上により純度
90％以上のリンパ球が得られる。 (3) Ｔリンパ球の分離 (a) ロゼツト形成遠心法によるＴリンパ球の分
離前記の分離されたリンパ抗を５×100⁶／ml
の濃度に牛胎児血清（FCS）に浮游させ
る。羊赤血球（SRBC）を（HBSS）で３回
洗滌遠沈した後羊赤血球（SRBC）１×
10⁸／mlの濃度にFCSに浮游させる。両浮游
液を等量に混和して、37℃15分間incubateし
た後、４℃で２時間静置する。ついでその浮
游液にFicoll−Conray液を重層し、遠心して
管底からロゼツト形成細胞を採取する。これ
をPBSで洗滌後0.8％NH₄Cl（Tris bufferで
PH7.4に調整）を加えて、羊赤血球
（SRBC）を溶解させた後充分に洗滌してＴ
リンパ球浮游液を得る。以上により純度約90
％のＴリンパ球が得られ、Ｂリンパ球は１％
以下となる。 (b) Fluovescence activated cell sorter
（FACS）によるＴリンパ球の分離。 前記のＴリンパ球浮游液（１×10⁶／ml）
をFITC標識抗ヒトIgG家兎血清（50×10⁶／
mg／ml）と共に４℃15分間incubateしてＢリ
ンパ球に螢光抗体を結合させた後FACSにか
ける。この際細胞当り10⁵以上の免疫グロブ
リンが結合したものをＢリンパ球とし、５×
10³以下のものをＴリンパ球として螢光閾値
を調整する。以上の操作によつて分離された
Ｔリンパ球は純度99.9％となる。このＴリン
パ球を抗原としてウマの免疫に使用する。 (4) 免疫化と特異抗体（AHLG）の回収 馬に対して、人のＴリンパ球を20×10⁹細胞
量を等量のFreunds complete adjuvantと混じ
て０週、２週と皮下投与し、４週において20×
10⁹細胞量だけを静脈内投与する。５週目にお
いて15の血漿を血球返還採血した。得られた
血漿５にヘパリンナトリウム注（株式会社ミ
ドリ十字製）を50000単位（５ml）添加し、
1000r.p.m.×10分間遠心分離し、上清
（AHLS）を回収した。このAHLSの人リンパ
球に対する細胞障害試験の抗体価は×16（抗体
希釈法）である。このAHLSに塩化カルシウム
0.4％になるように加え、加温してフイブリン
を析出させ、遠沈して脱フイブリンした後、56
℃で30分間加温して、補体成分を非働化した。 次に自然分布率に従つて混合したヒトＡ型、
およびＢ型赤血球を血清量の25％に加えて赤血
球凝集素の吸収を行なつた。ついでAHLSに硫
安20％飽和による沈殿を除いた後さらに33％飽
和を行ない、得られた沈澱を透析した。次に
DEAE−セルローズ処理を行なつた後、その
液にさらに硫安32％飽和を行い、その沈澱を透
析してAHLGを回収した。この透析液を0.22μ
の口径を有するフイルターによつて除菌過を
行つた。この液を凍結乾燥して、約20ｇの
AHLGを回収した。このAHLGについて、細胞
障害試験、ロゼツト試験を行つた結果充分な力
価を認めた。また赤血球凝集試験、血小板凝集
試験によりこれらの抗体は極めて少なく、さら
にオクタロニー法および重層沈降法で抗ヒト血
清抗体を、また螢光抗体法により抗ヒト糸球体
基底膜抗体を調べたが、これらの抗体の存在は
認められなかつた。 このAHLGを用いて局所刺激試験、急性毒性
試験をおこなつたが、いずれも良好な結果を得
た。 上記したようにAHLGは、それを投与された患
者において生体内における免疫特に細胞性免疫反
応を抑制する作用を有している。このグロブリン
は、生体内で主として細胞性免疫反応を担当する
Ｔリンパ球の機能を失わせしめることにより、こ
れを投与された患者において、皮膚及び臓器等の
移植に際して拒絶反応を抑制して、移植片の生着
を高める効果がある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 人の末梢血リンパ球より精選された胸線由来
   リンパ球（Ｔリンパ球）を免疫原として人を除く
   動物を免疫し、その動物に産出された抗リンパ球
   抗体を動物の血清から回収することを特徴とする
   抗ヒト・リンパ球グロブリンの製造方法。