JPS62501446A - コレステロ−ルエポキシド類の免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

コレステロールエポキシド類の免疫分析法本発明は酵素的または化学的および免 疫学的操作の糺合せの使用による生物産生物、分泌物、体液および組織中のコレ ステロールエポキシド類を特異的かつ正確に定性および定量分析する方法を指向 する。 発明の背景 本発明は、一部はコレステロールエポキシド類が動物産生物中に代謝的にまたは 自動酸化により生ずることが認められる観察に関する。分子酸素および光の存在 下にコレステロールは容易に自動酸化して主にコレステロール５β、６β−エポ キシドおよび少割合の異性体、コレステロール５α、６α−エポキシドを形成す る。自動酸化の程度は時間および温度とともに増大する。従って、コレステロー ルエポキシド類は老化コレステロール冨製品、例えば乾燥卵製品中に見出される 。 しかし、種々の器官および＆ＪＨｔｔ１例えば肝臓、男性前立ｌ！？および女性 乳房中に代謝的に形成されるコレステロールエポキシド類が主に重要である。コ レステロールからコレスタン３β、５α、６β−トリオール、内生コレステロー ル合成の擬調製物、への経路中の非常に過渡的な代謝中間体とＬ７てコレステロ ールエポキシド類は通常法して蓄積しないし、またそれらは一般に臨床科学者に 現在利用できる分析操作で検出できないやしかし、種々の前発育（ｐｒｅＪｅｖ ｅｌｏｐｍｅｎｔ　）または存在する病理状態に関連し、コレステロールエポキ シド類は関連ｗｉ織および分泌物中に蓄積する。最初に投薬依存反応としてコレ ステロール５α、６α−エポキシドが紫外線照射に暴露後のヒトおよび動物の皮 唐巾に検出された。同様に、コレステロールエポキシド類は家族性コレステロー ル過剰血症を、セい店＊　の１１１ｉ　？Ｖ”　１身ソｆ在し、それはまた血： ・ｎコ［・ステしレール名文もまた」、ν１さ一已る。且１躇のニア　Ｌ−ステ ｔ−１−ル箔積；４、ませ、：希少だがＬ７がし致１１？ｉ的なウー（〜ルマン 病１、こおいて認められた。 コし・ステ！」−ルエボキら・）頚が集配人ｉ；ｊ立腺の組織および分ン必物中 に見出されることの最近の観察は非常に重要であるにの観察は殊に良性および悪 性の疾患の発達に一致する。エボ１−シこルステロー・ル憩１、ままた女性乳７ ．げく）泌り°フ中ｊ、こ老化とともに閥察さヲ１．、乳癌の発達り、二対する 非常に危険な範［５乙こ関連イる１、女１′Ｉ−乳房および男性前立腺にともに がなりの量のコレステｌコールを産生ずるホルモン制御腺性分泌器官である。血 清、＋ｉｉＪ立腺組’４Ｊ）　Ｊ、び乳房吸引液のコレステロール含量の有意な 増加はそのときエボキシコし・ステロール類の出現に関連し、コレステロールの 合成および代ハ（の制御の若干の喪失を示唆する。 突然異生成および発癌にお＋３る：ｌ　Ｌ−ステロール類りよびその代謝産１チ クの”］　ｒｉｆｌな没書は水子論争の主題であ−２た。最初の観察は一目５・ ステロールエポキシド類を実験動物に皮下投与したときに肉腫および他の腫瘍の 生成を示Ｌ２だ。皮Ｊｉの紫外線照射径：の腫瘍の形成はコレステ１ｆｆ−ル５ ｔｋ、６α−エポキシドの初期形成に相関された。同様に、ニアＬ／ステロール エボ′４うド類は酸素化ステロ−ル類の、コレステＬ’ｌｌ−ル自体でない血管 毒性のために、ついには了テ１コーム性硬化障害および心血管遮断１刊害を出現 さセる動豚壁Ｔｉ傷を発達させると１１＃測される。 コレステロールエポキシド 染色体損傷およびＩ）　Ｎ　Ａ修複合成４生ずる）分な証拠がある。コレステ＋ １−ルＪα、６α−エポキシドはｉ）　Ｎ　Ａ　ａ強い物理的結合を形成し、こ の巨大分子に対するステｒｒ　４ドのがなりの共有型結合を生ずる。同様に、コ レステロール５α、６α−エポキシドがよく知られた３−メチルコラントレンと 同程度の発癌物質であることがハムスター胚細胞で示された。このステロール代 謝産物はまたヒト結腸癌における病因物質として関連づけられた。 多くの周知外因性発癌物質が、内因代謝エポキシド化反応による親電子性「最終 発癌物質」に代謝活性化されることを考膚、すると、親電子性コレステロールエ ポキシド類もまた多様の細胞毒性、変異原性および発癌〕１生理反応に重要な役 割を果たすことができることが予想される。生物体液および組織中のそれらの検 出および定量は臨床医学においてますます重要になった。 前立腺分泌物中のエポキシコレステロール類の絶えざる存在はヒトおよびイヌ前 立腺の良性および悪性疾患のいずれもの発達に対する診断薬であることができる 。同様に女性乳房吸引液中のコレステロールエポキシド類の検出は良性乳房疾患 および乳癌の発達に対する危険因子として関連させることができる。コレステロ ールエポキシド類が通常、進行アテローム性動脈硬化に凸く早期の死を生ずる家 族性コレステロール過剰血症を患５う患者の血清中に検出されるので、血清中の これらコレステロール代！ｌ産物の出現は冠血管疾患の発達に対する重要な危険 因子として役立つことができる。 生物体液およびＭｉ繊織中コレステロールエポキシド類の定性および定量測定は 、それらの比較的低濃度のために困難で、高費用および時間のか＼る仕事であっ た。薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスー液体クロマ トグラフィー、核磁気共鳴スペクトロメリーおよびマススペクトロメトリーノ操 作はすべて単独または組合せて種々の生物体液および組織中のコレステロールエ ポキシド類の検出、ｄＬ’ｌおよび定量測定に用いられた。研究プロジェクトに おいて実験操作とし、て重要であるりれども、これらは医学的実施における日常 的、迅速、正確かつ経済的な臨床分析に容易に通しない。 コレステロールエポキシド類に対する免疫検定の開発に対する通常の操作は一連 のよく確立された方法に従うことができる。通常、コレステロールエポキシドは それ自体「ハプテン」のような抗原ではなく、通常抗原分子例えばタンパク質に 対する安定な共有結合により複合体化されよう。タンパク質「担体」例えばウシ 血清アルブミン、オボアルブミンおよびウシガンマグロブリンはしばしばこの目 的に向けられる。コレステロールエポキシド−タンパク質複合体すなわち「免疫 原」は次いで若干の生実験動物例えばマウス、ラットまたはウサギの血液に導入 される。外来抗原物質を認識すると動物は次にその結果、外来コレステロールエ ポキシド含有タンパク質またはコレステロールエポキシド自体と複合体化する特 異的能力を有する「抗体ｊはいわれる特定クンバク質を生ずる。動物によるこの 特異抗体の産生はコレステロールエポキシドに対する免疫検定試験操作の開発に おける木質的段階である。動物の血液からのこの特異抗体の分離が免疫検定試験 操作の１つの木質的成分または試薬の製造を可能にしよう。 コレステロールエポキシド特異性抗体タンパク質と血清あるいは乳房または前立 腺分泌物中の試験生成物との反応は分離可能な複合体の形成を生ずる。試験生成 物、コレステロールエポキシド、を若干の酵素または放射性元素で標識すれば、 生ずる複合体中の標識の量は従って一定量の標準化試薬抗体に加えた産生物の量 に依存する・標識化試験生成物を既知参照として試験患者からの未知試料と混合 すれば、試験試料中の生成物は抗体との反応において標識参照生成物と競争しよ う、これは抗体と結合した！！！識の景の低下に生ずる。この低下はｊ勇常屯考 の試験試料中の住成物、コレステ「】−ルエボキ；リド、の鋭敏かつ正確な測定 を与える。従って、コレステ１１．］−］ルエ、Ｊミキシド特異性抗体タンパク および酵素または放射性標識コｌ／スチロールエポキシド試験生成物がそれぞれ 酵素−免疫または放射免疫検定試験操作の本質的成分である。 酵素または放射性元素連結抗体検定のいずれを基に１７でも、免疫検定試験操作 は通常非常ｔ７鋭敏、高特異性かつ木来速やかである。上記操作は通常コレステ ロール自体の定量に用いられないけれども、それらは、コレステロールエポキシ ドと同様に通常生家り体液および組織中に単に小量で存在する他のコレステロー ル誘導分子例えばステロイドホルモン類、テストステロン、５α−デヒドロテス トステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール−１７β、フルチ ゾルおよびコルチゾンのしｎ床試験に現在広く使用される。 しかし２、通常、関連または類憤分子構造を有する他のステロイドの交差反応性 が存在するので特定のステロイドホルモンの免疫検定において遭遇する複雑さが ある。１例として、エストラジオール−１７βに対する抗血清はエストロン、エ ストラジオール・＝１７αおよびエストリオール１７βに対しそれぞれ９４．６ １および１９の交差反応率を示すことができる。酸物体液例えば血清および乳房 または前立腺分泌物中のコレステロールエポキシド類の濃度を考慮すると、さら に常に最も有意過剰のコレステロールが認められる。４０〜１００倍程度大き程 度レステロールの濃度が通常コレステロールエポキシド類の濃度に比較して認め られる。 従って、完全なコレステロールエポキシド−タンパク質免疫原を指向する抗体の 製造で、コレステロール自体がこの抗体と若干の交差反応性を示すことが予想さ れる。これはコレステロールエポキシドに対する免疫検定操作の有用性を、コ！ ノステシ」−ル自体が反応し擬陽性結果を生ずる６■能性！ｍ　、Ｊ、り低下す るであろう。 従って、本発明の［］的は、免疫学的または免疫検定操作を訳にしてＪ目２・ス テロールエポキシ１を定量１および定量的ムこ測定する臨床診断法を捉供するこ とである７ 発明の概要 本発明はコレステし１−ルエボキミ／ドの存在を定性、および定量的に測定する ｌ）？Ｘ庫診断法を掃供する。診１ｔ、’ｉ法に用いる物質の装造方法は構造的 にコレステ１」−ル、コレステロールエポキシド生！ｌ！ｙｒ体液およびＭｉ繊 織中通常存在する他の関連ステロイド分子とノ「常に異なる新規なコレスｊ〜ロ ールエポキシドアダクト分子の製造に特定の：ＪＩ、＝ステロールエポキシ１反 応を用いる。好まし５い態様において、［’ｉ！ｉ乳動物肝臓可溶性上澄み部分 の酵７：、Ｓ−グルタチオントランスフェラーゼを用いてコレステロール５α、 にα−エポキシドをＳ−グルタチオン接合体、３β、５α−ジヒド１１キシコ！ ／スタン−６β−イル−８−グルタチオンに転化する。この接合体はハブテンと してクンバク質担体、タンパク質ウシ血清アルブミンに安定な共有結合により連 結して免疫反応の開始に適する免疫原を生ずる６生じた抗体はコレステロールエ ポキシド自体よりはむしろコ！ノステロール１ボキシＩ’ーグルタチオンアダク ト生成物に感受性かつ特異的である。これらの抗体の１種またはより以上をアダ クトに対する免疫検定に使用するために選ぶことができる。 従って、多クローンまたは単クローン性のいずれかの生じた抗体を用いて体液の 試料中のコレステロールエポキシドの存在または濃度を測定する方法を与える。 試料は初めにハブテン連結物質（好ましくはＳ−グルタチオントランスフェラー ゼ）の存在下にハブテン（好ましくはグルタチオン）に接触させて開環した３。 ５　（６１−トランスージアキシアルージヒドロキシコレスクン−６（５）−イ ル−ハブテンアダクトを形成させる。このアダクトを、調製抗体を用いて免疫検 定操作により検出または検定することができる。 発明の説明 グルタチオン（γーグルタミルーシステイニルーグリシン）は請求核試薬として Ｓ−グルタチオントランスフェラーゼ活性の一次基質である。このトリへブチド 代謝産物は通常、事実上すべての細胞中に見出される。Ｎ−末端グルタチオンは 非α−ペプチジル結合を通してシスティンに結合するので異常なトリペプチドで ある。１ｆｆｉ常グルクチオンは広範な代謝機能、一般に本来「保護性」、を果 たす。解毒反応に含まれ、それは生細胞を酸化および遊離基相互作用から保護す る。解毒経路中の初期段階には外来有毒化合物とグルタチオンのＳＨ基とのＳ− 置換グルタチオン誘導体を生ずる反応が含まれる。これらの反応はＳ・−グルタ チオントランスフェラーゼ類により酵素的に進行するけれども、若干はまた酵素 なしに化学的に進行することができる。 肝臓の正常解毒反応として、コレステロール５α、６α−エポキシドとグルタチ オンとの反応はラット肝臓中に２形態のＳ−グルタチオントランスフェラーゼＢ として確認されるむしろ特異的な可溶性Ｓ−グルタチオントランスフェラーゼ類 により媒介される。−Ｉ’Ｇに、Ｓ−グルタチオントランスフェラーゼ類は全く 非特異性群の可溶性酵素である。しかしこの関連において、それらはむしろ広く かつ重なる基質特異性苓有すると思ゎゎる。コレステロール５α、６α−エポキ シドを親電子性基質として、土にＳ−グルタチオントランスフェラーゼ３部分の みが酵素活性を示す。 これらのむしろ特異的な酵素は、ザイトソル可溶性塩基性肝臓タンパク質酵素と して肝臓の可溶性タンパク質部分の相当部分を構成する。約４５，０００の分子 量を有するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＢははｙ“等しい分子量の２つ のタンパク質サブユニットからなる。 グルタチオンおよび基質としてのコレステロールエポキシドのほかに、Ｓ−グル タチオントランスフェラーゼ類との酵素反応は、反応におけるＡＴＰの関与が必 要である高エネルギー中間体の初期形成を必要としない、コレステロール５α、 ６α−エポキシドに対するＳ−グルタチオントランスフェラーゼＢの特異性はむ しろ特有である。 純コレステロールエポキシド類は一般に市販源から入手できず、従ってそれらは コレステロールから合成した。ジブロミドを経て精製した分析用コレステロール をこの合成に用いた。コレステロール５α、６α−エポキシドはフィーグーはか （Ｆｉｅｓｅｒ、　Ｌ、　Ｆ。 ａｎｄ　Ｆｉｅｓｅｒ＋　Ｍ、）、「有機合成用試薬（Ｒｅａ５ｅｎｔｓ　ｆｏ ｒ　ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　）　Ｊ　ｖｏｌ、　１．１９６７、ジ ョン・ワイリー（Ｊｏｈｎ。 Ｗｉｌｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　、ｐ、　１３６の操作により合成した。 ：２１／、２．チロール（５０ｍｍ＋ｏｌ）の塩化メチレン（７５ｍｆｆ）中の 溶液庖ｍークロロ過安息香酸（５４ｍ　ｍｏ＋　）の塩化メチ１．−７（１２０ ｍ／）中の溶液で２５℃で３０分間にわたり処理した１、過剰の過酸は１０％亜 硫酸ナトリウムの添加により破壊した。有機層を５％木木炭炭酸水素ナトトリム 水、最後に飽和水性塩化ナトリウムで抽出し１、次に乾燥し、蒸発させると粗住 成物が得られ、８８％水性アセトンからの再結晶またはシリカゲルクロマトグラ フィーによす容易に精製された。コレステロール５α、６α−エポキシド（純度 〉９５％、融点１４２〜１４３℃）が収率＞９０％でｆＵられた。 コレステロール５α、６α−エポキシドはトーマほか（ＴｏｈｌＩｌａ　。 Ｍ、、　Ｔｏｍｉｔａ、　？、、　ａｎｄ　Ｋｉｍｕｒａ、　Ｍ、）　、テトラ ヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　、４４． ４３５９〜４３６２　（１９７３）の手順によりコレステロールから合成した。 前記のように、３０％過酸化水素（５，５ｍｉすをコレステロール（１００■） および第２鉄アセチルアセトナート（９３０■）のアセトニトリル（１００ｍＡ ）中の溶液に４０℃でかくはんしながら清純した。 過剰の過酸化水素は飽和水性亜硫酸ナトリウムで破壊し、有機相をエチルエーテ ル（５０ｍＡ！ｘ３）で抽出した。 有４！！層を合せて飽和水性塩化すトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾 燥した。減圧蒸発後に得られた残留物をベンゼンアセトンで勾配溶離を用いるシ リカゲル」二の液体クロマトグラフィーにより精製した。コレステロール５α、 ６α−エポキシドを含む選んだ両分をプールし、蒸発させた。水性アセトンから 再結晶するとコレステロール５α、６α−エポキシド（融点１３１〜１３４℃） が収率６０％で得られた。 放射性免疫検定操作の成分として放射性標識コレステロール５α、６α−エポキ シドおよびコレステロール５β、６β−エポキシドもまた前記操作を用い、容易 に入手できる放射性標識コレステロール出発物質から製造した。高特異的活性の トリチウムおよび炭素−１４標識コレステロールエポキシドはともにこの方法で 製造した。 動物の免疫系のり）来抗原に応答する能力は抗原分子の大きさに非常に依存する 。ステロイド例えば低分子量を有するコレステロールエポキシドはそれ自体抗体 産生を誘出することができない。 しかし、ハブテンとしておよびタンパク質担体単位を含む巨大分子構造（免疫原 ）の一部として、コレステ［１−ルエボキシド類およびその誘導体はイれ自体免 疫系を誘発しハブラーン自体と試験管内で反応する抗体を生ずることができる。 ：７レステ［フール５α。 ６α〜エポキシドまたはコレステロール５β、６β−エポキシドをハブテンとし て含有する免疫原はさらｔこ、し２かし、より低度にコレステロールおよび他の 密接に関連する分子例えばコレスタン３β、５α−ジオール、コレスタン３β、 ６β−ジオールまたはコレスタン３β、５α、６β−トリオール可能にする６： ルステロールエボキシド類の特イｊのｆＪｌ電了的反応性は華に反応性コレステ ロールエポキシド類から直接誘導したハブテン化合物としての使用を可能にする 。これらのＸＡ　導体はコし・ステロールエポキシドおよびコし・ステロールの 構造とは一４分に貰なる分子−構造を有し、免疫後生ずる抗体に特異性を−５え る。二目ノステＬＪールエボキシド類とグルタチオンとの！ｌ￥右の相互作用は 、化学または酵素反応のいずれによってもそのような選択性ハブテンとして作用 するＳ−グルタチオン接合体を生ずる。 コレステロールエポキシド類と他の接合体を形成することができ、それは本発明 の範囲内にある。！３１電子的性質によっ”ごコレステロールエポキシド類はＳ −グルタチオン以外の多様の核試薬と反応し５．多くの場合に親化合物とは非常 に異なる誘導体を生ずることができる。しかし、水および簡単な低分子量アルコ ールとの反応はなおコレステロールエポキシドに若干構造的に関連する生成物を り１する。コレステロール５α、６α−エポキシドおよびコレステロール５β、 ６β−エボ４゛シトと水との相互作用（加水分解）は−敗する生成物、コレステ ロール３β、５α、６β−トリオールの形成を生ずる。コレステロールエポキシ ド類のより複雑な構造および高分子鼠の他の核試薬による類似のトランスジアキ シアル開裂はコレステロールおよびその反応性エポキシド類と一層広範に菫なる 構造を有する誘導体を生ずる。コレステロール５β、６β−エポキシドは触媒量 のリン酸の存在下にベンゼンアセトン（チオフェノール）と反応してトランスア キシアル間環ヲ経て３β、５α−ジヒドロキシコレスタン６β−８−イル−チオ フェノールを生ずる。コレステロール５β、６β−エポキシドはこの反応におい て３β、６β−ジヒドロキシコレスタン５α−８−イルチオフェノールを生スる 。コレステロール５α、６α−エポキシドはまたイミダゾールと反応して３β、 ５α−ジヒドロキシコレスタン６β−イミダゾールアダクトを生じよう。コレス テロールエポキシド類は従って、多様の他の核試薬と反応してハランスジアキシ アルエボキシド間環により相当する共役アダクトを生ずることができる。従って これらの反応の多くはこれらの誘導体に特有の特異性を有する抗体の構造に有用 な免疫原の構成にハブタンとして役立つコレステロールエポキシド類の特定の誘 導体の製造に用いることができる。 本発明において、請求 成物または接合体はハブタンとして役立つ。好ましいハブテンはコレステロール ５α、６α−エポキシドとのグルタチオン反応生成物、すなわちハブテンとして 役立つ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン６β−８−イルグルタチオンである 。 本発明によれば、ハブテンはさらに共有型結合橋分子例えばＡ−ステロイド環の ３β−ヒドロキシ基を含むヘミスクシナート、０−カルボキシメチルエーテルま たは類似構造によりタンパク質担体に結合させ、不変化Ｂ環に結合した完全な決 定因子（例えばグルタチオン）を残す。免疫後生ずる抗体中のＡステロイド環構 造に対する免疫特異性の喪失は、多くのステロイドがコレステ。 −ルのよ−）にステロイド分子のこの部分中にコレステ１７・−ルエボキシド類 に類似する構造決定因子を有するので、重要なことでないと思われろ。コレステ ロール５α、６α−エポキシドの反応生成物に対する本発明に関連する免疫決定 因子は主に１３環の６β位置にあり、コレステロール５α、６α−エポキシドか ら誘導される生成物のそれはＡおよび８反問の５α位置中にある。 免疫原タンパク質担体の選定は一般に臨界的ではない。本発明による免疫検定操 作の調製物は以下に担体タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いて例示され る。仮定分子￥約７０．０００を有するウシ血清アルブミンは約６１個の末端ア ミノ基を含み、タンパク質折りた＼みのためにそのすべてが直接接近できるわけ ではない。このむしろよく規定されたタンパク質のほかに、他のタンパク質担体 分子、例えばウサギ血清アルブミン、ミオグロビン、リソチームヘモグロビンな どもまた利用できる。 免疫原タンパク質担体に対するハブテン、コレステロール５α。 ６α−エポキシドおよびコレステロール５β、６β−エポキシドまたはそれらの 核試薬との反応生成物の結合は炭化水素橋例えばスクシニル橋により達成するこ とができる。初めに、コレステロール５α、６α−エボキシドヘミスクシナート およびコレステロール５β、６β−エボキシドヘミスクシナートはともに両エポ キシコレステロールと無水コハク酸とのピリジン溶液中の相互作用により得た。 ステロイド誘導体分子をタンパク４１４体に連結する他の方法は０−カルボキシ メチルエーテル橋の使用である。コレステロールエポキシド類の３βヒドロキシ ル基は一定条件下にジアゾ酢酸エチルまたはブモロ酢酸エチルと反応させると。 −カルボキシメチルエーテル誘導体がエステルとして生ずる。次いでアルカリけ ん化するとコレステロールエポキシド類の３β−０−カルボキシメチルエーテル 誘導体が！Ｕｌ−３’る。このコＬ・ステロールエポキシド橋化合物はヘミスク シナートニ７レステロールエボキシド誘導体よりも一層アルカリ加水分解に対し 安定である。ステロイドハブテン分子とタンパク質担体との間の他の共有型結合 橋はまたジスルフィド、ジオール、ジＪステル、ジシニド橋（ｄｉｃｉｎｉｄｅ ）などを用いることができる。 免疫原分子の好ましい製造ニｊ６いて、コレステロールエポキシド−・ミスクシ ナート類または相当する３β−０−カルボキシメチルエーテル誘導体およびそれ らの核試薬誘糞体はタンパク質担体、例えばウシ血清アルブミンの末端アミノ残 基に化学的にカップリングさせることができる。多くの種々のカンプリング反応 を用いることができる。好ましくは、カルボジイミド反応を用いてカルボキシル 基をクンバク質分子の末端アミノ基に結合させると安定なペプチド結合が形成さ れる。また他の反応、例えば混成無水物を用いてカルボキシル基を末端アミノ基 に結合させることができる。エポキシド構造は酸性条件に対し鋭敏であるので、 完全なコレステロールエポキシＦ類を含む化学反応中、ｐＨを慎重に制御するこ とが望ましい。 ステロイド−タンパク質接合体に対する全免疫応答は免疫原中のステロイドとタ ンパク質との分子比に依存する。若干が分子の折りた−みにより遮蔽されるので 、ウシ血清アルブミン分子上のすべてのアミノ基が化学置換に利用されるわけで はなく、従って、ステロイドとタンパク質とのモル比はしばしば１５：１〜３０ ：１の範囲にある。従って、ステロイド−タンパク質比とステロイドハブテンを 指向した抗血清の力価、特異性および親和性との間の直接相関の明らかな証拠は 必らずしも存在しないかもしれない。 本発明の範囲内の特異性抗体を製造する最終免疫原には、ステロイド分子の３β ヒＩ゛ロキンル、５％　ｇよびタンパク質の末端ア′ミノ法を含む橋に。−リク ンバク質担体に共イ１型結合した二２レスう請求核試薬反応生成物（ハブ巧ン） が含まれる。ハブテン、３β、５α−ジヒドロキシ：】

【／スタンー６β−８− イルーグルタチメンを含む好ましい免疫原のｒｆａにおいて、コレステロール５ α、６α−エポキシド−３β−〇−ヘミス々シナー１またはコト・ステロール５ α、６α−エポキシド−３β−０−カルボキシメチルエーテル誘導体をカルボジ イミド反応によりタンパク質担体、ウシ血清アルブミン縮合させる。最後に、タ ンパク質結合物質のエポキシド官能基をグルタチオンと反応させると最終免疫原 が生成する、ハブテン自体、３β、５α−ジヒドロキシコレスクン−６β−８− イル−ゲルタデオン、のタンパク質担体に対する直接カルボジイミド縮合もまた 可能であるが、しかしグルタチオン部分のカルボキシル基の潜在的反応性のため にあまり好まＬ２くない。しかし、カルボジイミド縮合プロセスにおいて、３１ 反応性の核試薬誘導構造決定因子との他の請求 せて最終免疫原を生成させることができる。 有用なハブテンおよびハブテンとして請求 疫原分子の構成の概要は次のとおり総括することができる。 求核試薬はコレステロールエポキシド部分のエポキシド環と、求核試薬の性質に より遊離コレステロールエポキシド、その橋誘導体またはコレステロールエポキ シド含有免疫原で反応させることができる。 コレステロールエポキシド＋求核試薬−アダクトＩコレステロールエポキシド− 橋＋求核試薬−アダクト■コレステロールエポキシド−橋−タンパク質＋求核試 薬−免疫原 アダクトＩは次に橋を結合し、最後にタンパク質にカンプリングさせて免疫原を 形成させる。 アダクト■は直接タンパク質にカップリングさせて免疫原を形多様の核性物質を コレステロールの親電子性エポキシド類と反応させることができる。酸性条件は 一般にエポキシドの親電子特性を増加する。硫黄、窒素および酸素含有求核試薬 の種々の群を挙げることができる。 Ｈ２ Ｘ　＝−３−Ｃ１１，−ＣＯＯ１１（１４グリコール酸）Ｘ　＝−３−ＣＩｌ− ＣＯＤｌｌ　（ナオーＪＬ４ｉＶｌｌｌｉｆｆｉ）Ｘ　＝−Ｓ−Ｃ１１−ＣＩｌ 、−Ｃ１］０１１　（チオリンゴ酸）Ｘ＝−５Ｒ（アルキルチオール類） 窒素含有求核試薬 直上１１顔 Ｘ＝　ＣＯ２ＣＦ３　（）リフルオロ酢酸）Ｘ　＝−ＯＲ（アルキルアルコール 類）（２−了ミノー６−オキシプリン）　＜２．４−ジＡ゛キシビ１ノミジン） ２−メチルアデニン　５−メチルアデニン２′−デオキシアデノシン （９−β−２′−デオキシ−Ｄ−リボフラノシルアデニン）アデノシン５′−リ ン酸　アデノシン３′−リン酸（アデニル酸；５′−アデニル酸）　（３′−ア デニル酸）アデノシン２′−リン酸　アデノシン３’、５’−リン酸（２′−ア デニル酸）（環状アデニルＭ）リボヌクレオシド　２′−デオキシリボヌクレオ シドアデノシ７５′−リン酸　デオキシアデノシン５′−リン酸（アデニル酸； 　Ａ　Ｍ　Ｐ　）　（デオキシチミジン；　ｄ　Ａ　Ｍ　Ｉ）　）グアノシト５ ′−リン酸　デオキシグアノシン５′−リン酸（グアニル酸；ＧＭＰ）　（デオ キシグアニル酸、ｄＧＭＰ）シチジン５′−リン酸　テ゛オキシシチジ７５′− リン酸７（シチジン酸；ＣＭＰ）　（デスキシシチジン酸；　ｄ　ＣＭ　Ｉ）　 ）ウリジン５′−リン酸　デオキシチミジン５′−リン酸（ウリジル酸；ＵＭＰ ）　（デオキシチミジル酸；ｄＴＭＰ）リボヌクレオシド ５′−一、二、および三リン酸 塩基　略号 アデニン　ＡＭＰ　ＡＤＰ　ＡＴＰ グアニン　ＧＭＰ　ＧＤＰ　ＧＴＰ シトシン　ＣＭＰ　ＣＤＰ　ＣＴＰ ウラシル　ＵＭＰ　ＵＤＰ　ＵＴＰ デオキシリポヌクレオシド ５′−一、二、および三リン酸 アデニン　ｄＡＭＰ　ｄＡＤＰ　ｄＡＴＰグアニン　ｄＧＭＰ　ｄＧＤＰ　ｄＧ ＴＰシトシン　ｄＣＭＰ　ｄＣＤＰ　ｄＣＴＰチミン　ｄＴＭＰ　ｄＴＤＰ　ｄ ＴＴＰより複雑なヌクレオチド誘導体 補酵素Ａ　ジヌク１／オチド補酵素 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）Ｏリン酸でエステル化される コレステロールエポキシドとＤＮＡとの相互作用が明らかに示された。 ＤＮＡ　ＲＮΔ コレステロールエポキシドとの相互作用るこ適する核試薬のｊハ定は核試薬の反 応性および反応の特異性による。多くの核試薬例えば核酸ＤＮＡよ７よびＲＮ　 Ａは多くの相互作用部位を有する。 コレステロールエポキシドとの相互作用の単一の主部位を有するより簡単な核試 薬が好ましい。コレステロールエポキシド含量に対する生物学的試料の分析にお いて、ｌ）Ｒ床研究室条件下に核試薬との相互作用によるエポキシドの転化が完 了し、容易かつ便宜に行なわれることが重要である。この関連において、コレス テロールエポキシドのグルタチオンとの相互作用は酵素または化学的手段により 簡単な条件下に行なうことができる。生ずる生成物は公知であり、ハブチントし てその存在下に生ずる抗体により特異的に認識さ、、！する。コレステロールエ ポキシドとチオフェノールおよびイミダゾールとの相互作用もまた単一特定部位 を含む。Ｃ＝床試料でこれらの反応はまた存在するコレステロールエポキシドの それぞれの核試薬生成物への転化に用いることができる。従って、純ハブテンと して請求 応生成物の製造および最終免疫原として抗原タンパク質担体への最終カンプリン グはずべて特異性および求核試薬＝−コレステロールエポキシド反応の程度によ る。不完全な反応で所望の免疫原を精製後に得ることができる。 免疫原の最終合成後、それを精製し、確認する。上記方法のいずれかにより得ら れた請求核試薬タンパク質複合体は常法により共有型結合でない請求核試薬生成 物を含まないように精製することができる。好ましくは、これは恒流の蒸留水に 対する透析またはＧ−２５セフアデツクス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル濾過により 達成することができる。精製後、免疫原接合体はノ１ブテン対担体モル比の達成 について確認される。コレステロールエポキシドと相互作用し、た核試薬の措ｉ 貴狛ｆユ友に、１．り免疫原の直接紫外−可視分光測光、放射性同位体併用：！ 、：たば加水分片開？を含む種々の方法は１べてハゲテン対タンパクｎ比の測定 に適用できる。 適当な免疫原の利用性で、多様のよく確立された免疫操作をハブテン、殊に請求 に対して特異性の抗体の製造に用いることができる。適当なビヒクル、例えば塩 類または油性アジュバント乳濁液中の調製免疫原を多皮内、皮下または筋向投与 により投与することができる。抗体応答は通常比較的早い。はとんどすべての投 与経路例えば皮下、筋向、静脈内およびリンパ節または足肉跡内、が後のブース ター注入に関連して利用されるけれども、多部位皮内免疫が免疫原のブースター 注入なく満足な結果を生ずることが認められる。マウス、ラット、モルモソ［・ 、ウザギ、ヒツジ、ヤギおよびウマを含め非富に種々の動物種が免疫ブｌ］セス に用いられた。 ハブテン−タンパク質免疫原による動物の免疫感作により生した多りＤ−ン性抗 体は次いで公知技術により血’Ｉｎから回収することができる。免疫プロセス中 、ハブテン特異性抗血清の濃度を一定間隔で動物の採血によりモニター・する、 緩衝液で孔釈した抗血ＹＲをハブテンと反応させ、培養すると反応が抗体−ハブ テン複合体を形成し、それを公知技術により測定および分離することができる。 特定の請求 に指向する単クローン性抗体もまた製造することができる。８９７３球は動物の 免疫におりる特異性抗体産生に含まれる。単クローン性方法においては、２つの 体細胞、１つは新生骨髄細胞に属し、他は免疫感作動物から得たｔＪの抗体産生 Ｂリン８球、を融合またはバイブリフト形成させる。生じた融合細胞またはハイ ブリドーマは新生物税からの連続増殖に対する能力および８９７３球からの免疫 感作ハブテン含有免疫原に対する抗体を分泌する能力を保持する。単一リンパ球 から誘導されたハイブリドーマ細胞系は唯一種の抗体を生ずる。コレステロール エポキシド−求核試薬ハブテンのみを指向する抗体を生ずる特異性ハイブリドー マ細胞系の選定は公知技術により行なうことができ、それにより免疫検定試験キ ットの木質成分の連続的利用性が与えられる。 定試験手順は抗体−ハブテン反応、殊にコレステロールエポキシド自体に対する よりもむしろ反応として請求 生物試料中に存在するコレステロールエポキシドを酵素または化学的方法により 、抗体によって認識できる核試薬反応生成物に転化させることが免疫検定に必要 である。抗体の発生に用いた原ハプテンの製造に用いたと同様の試薬をこの目的 に用いることができる。 抗原（ハブテン）−抗体反応を測定可能または可視可能にするために、抗原また は抗体を若干の特定の固有特性、例えば光放出（けい光性抗体技術）、酵素活性 （酵素免疫検定）、高電子走査能力（免疫フェリチン法）または放射能（放射免 疫検定）により示すことができる分子で標識することが必要である。 酵素免疫検定操作には、ハブテン特異性抗体を酵素例えばホースラデイシュ（ｈ ｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　）ペルオキシダーゼを結合させることにより標識するこ とができる。この酵素は、二官能性反応物例えば４．４’−ジフルオロ−３，３ ′−ジニトロフェニルスルホンまたはグルタルアルデヒドにより抗体タンパク質 に結合させることができる。酵素接合抗体は次いでハブテンと反応することがで き、非結合抗体は洗浄により除去される。ハブテン−抗体複合体は電子供与体例 えばジアミノベンジジンの存在下に過酸化水素と反応させると測定可能な呈色反 応を生ずる。 同様に、ハブテン（抗原）はまた酵素で標識することができる。 グリコース６−リン酸デヒドロゲナーゼはしばし７ば使用される標識化酵素であ る。酵素標識ハブテンがハブテン特異性抗体に結合すると酵素活性は低下する。 典型的な競争免疫検定において、生物試料中のハブテンは抗体に対して酵素標識 ハブテンと競争し、それにより抗体によって誘発される酵素の不活性化を減少さ せる。 グリコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性はハブテンの濃度に相関し、基質 ＮＡＤのＮＡＤ、Ｈへの酵素触媒１１用に暴き分光測光的に測定される。 放射免疫検定操作を用いるとき、請求 求核試薬接合ハブテンは放射性元素例えばトリチウムまたは炭素−１４で標識す ることができる。コレステロールエポキシドまたは求核試薬成分をそのように標 識することができる。例としてトリチウム標識コレステロールをコレステロール エポキシド類に転化することができる。これらの求核試薬例えばグルタチオンと の相互作用によりトリチウム標識ハブテンが生ずる。また、放射性標識ゲルタデ オンとコレステロールエポキシドとの反応によるステロイド核上の標識グルタチ オン求核試薬の存在もまたエポキシドの検出に対する基準として用いることがで きる。添加した放射性標識ハブテンと試験試料中に存在するものとのハブテ〉特 異性抗体に対する競争が検出および定量の基準とし７て役立つ。 以下の実施例は本発明の好ましい態様を示す。 実施例１ 炭慮二り尤（双ユ上久チー監二）に−包息ユ、−（−色二工ｇ−キ４ｙコンデン サーを備えた２５ｍ／ミクコミクコミクロフラスコ中−コレステロール（５０ｍ ｃｔ／　ｍｍｏｆｆ）　８ｍ　（１ｍｃｉ、　２０　μＩｌ＋ｏｌ）を塩化メチ レン（５ｍ＃）中に溶解する。２５℃で３０分間、ｍ−クロロ過安息香酸（２５ μｍｏｌ）の塩化メチレン（１０＋ｍＩす中の溶液で処理し、次に１０％水性亜 硫酸ナトリウムを、ヨウ素デンプン紙が残留過酸に対して陰性になるまで清純す る。反応混合物をミクロ分液漏斗に移し、次いで５％炭酸水素ナトリウム水溶液 で洗浄してｍ−クロロ安息香酸を洗浄し、次に塩水で洗浄する。溶媒を蒸発させ た後残留物を８８％水性アセトンから結晶化すると所望のｔ　１ａＣ−コレステ ロール５α、６α−エポキシド（７■、５０　ｍＣｉ／　ｍｍｏｌ＞が得られる 。放射性標識生成物を非標識コレステロール５α、６α−エポキシドで所望の特 定放射能に希釈する。 実施例２ 上ユ±立人旧Ａ二上ステユニ酉５Ｑ＝、６α二舌叫土乞工実施例１の手順に従い 、１°２，６．’ｌ−’Ｈ−コレステロール（７５Ｃｉ／　ｍｍｏ６　）　５　 Ｋ　（Ｉ　Ｃｉ、１３μｍｏｉｌすを塩化メチレン中のｍ−クロロ過安息香酸（ １５μｍｏｂ）で処理する０次いで生成物を回収すると１．２．６．７−　”Ｈ −コレステロール５α。 ６α−エポキシド（４，５ｗ、７５　Ｃ４／　ｍｍｏ　１　）が得られる。 実施例３ ・　、−１４゛　コレ２ラドｏ−ｉヒ５／？、６β−工畦快ゴタしコンデンサー を備えた２５１１１７！ミクロフラスコ中でアセトニトリル（１０１１ｆ）中の ４　＋４ｅ−コレステロール（５０＋ｅＣｉ／ｍｍｏｆｆｉ　）　８　［（１、 ｍＣｉ、２（ｌＩＪｍｏＩすおよび第二鉄アセチルアセトナート７５■にかくは んしながら４０℃で３０％過酸化水素（０，５ｍｆ）を摘加する。過剰の酸化剤 を飽和水性亜硫酸ナトリウＪ・で破壊し、次に丁チルエーテル（５ｉρ×３）で 抽出する。 有機相を飽和塩水で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧仄 発さ→Ｊ゛る。！無定形残留物が生ずる。ベンゼン−アセトンでシリカゲル勾配 りＩＺＩ７トグラフイーを行ない、次に水性°？セトンから再結晶すると４、、 −１　ａ　Ｃ、−−７レステロール５β、６βエポキシド（４■、５０　ｍＣｉ ／　ｍｍｏ６）が得られる。 実施例４ −１−１シ±久み（２Ｎ：す・・忍−テ−リ−一二イＬ＝５−β−１−−６−β −ニエー不１−ンツー一実施例３の手順に従い、アセトニトリル（１０ｍ／Ｉ） 中の１゜２．６．Ｌ＝″１１−＝コレステロール（７５Ｃｉ／　ｍｍｏ７す５＃ 　（ＩＣ４，１３μｍｏｅ）才９よび第二」失アセチルアセトす一１５０■にか かくはんしｊ【がら４０℃で３０％過酸化水素（０，３ｍｌ’す苓清純する。ク ロマＩ・グラフィーによる精製および再結晶１１．２．、６゜７−”Ｈ−コレス テロール５β、６β−エポキシド（３■、７５Ｃｉ／Ｉ１１ｍｏｌ）が得られる 。放射性１コレステロールエポキシド非標識物質で所望の特定活性に孔釈する。 影−−−晃 ３β、５α−ジ）−ドロキシ１！・スタン−６β−３−イル−グルタチオ：、ノ （ハブテン） エタノール（１０１１Ｉ！す中のコレステロール５α、６α−エポキシド（１０ ０■、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に水（５ｍｌ）中のグルタチオン（１５０ｍｌ 、　０．５１１Ｎｍｏ／すを加える。５Ｎ水酸化ナトリウム（０，５ｓ＋ｊすを 加えた後、混合物を３時間還流する。冷却後、氷酢酸で酸性になし、減圧蒸発後 残留物を１％水性酢酸（５ｍ＃）に溶解し、水飽和１−ブタノール（１０ｍｊ！ ｘ３）で抽出する。溶媒を蒸発させると残留物が生じ、それを水（５ＬＩｌｌす に熔解し、初めに順次エタノール、メタノール、水およびメタノール−水（１： 　１、ｖ　／　ｖ　）洗浄で処理したアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　） 　Ｘ　Ａ　Ｄ　−２カラム（４０Ｘ２ｃｍ＞上で精製する。 反応生成物の添加後カラムを水、メタノール−水（１：１、Ｖ／Ｖ）で洗浄し、 メタノールで？ｇ　Ｋｌする（それぞれ５８２：５のベッド体積）、ニンヒドリ ン反応およびシリカゲル０６０プレート上で１−ブタノール−氷酢酸−水（４： 　ｉ　：　５、ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）を溶媒系とした薄層クロマトグラフィー によりモニターした百分から溶媒を蒸発させると単一ニンヒドリン陽性成分を示 す無定形残留物（１４５■）が得られるや 実施例５Ａ コレステロール５α、６α−エポキシドの３β−５α−ジヒドロ４、＞、ｒｔｚ ：ｚノー’、／　＝−−β−に一−−＄１４７Ｌ／　ニゲ−）Ｌｔタノトｔ　７ 　Ｃヅ７）ｆｆｌ−１ヒト前立腺液（１ａｌｌ）中のコレステロール５α、６α −エポキシド（２０μｇ、０．０５μｍｏｌ）を可溶性ラット肝臓Ｓ−グルタチ オントランスフェラーゼβ（１０■）とともに０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、 ｐＨ７、０，１０ｍｊ！の最終容積まで、中のグルタチオン（６■、２０μｌイ ）の存在下に３７℃で３０分間培養する。反応生成物、３β、５α−ジヒドロキ シコレスタン−６β−３−イル−グルタチオン、はハブテンとして特異性抗体反 応によりまたは直接抽出および精製により測定できる。 実施例６ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル−グルタチオン（ハて元 ））〜−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一部−−−実施例 ５の手順に従い、水（５ｍｌ）中のコレステロール５β。 ６β−エポキシド（１００■、０．２５ｍｍｏ１）を５Ｎ水酸化ナトリウム（０ ，５ｍ１）の添加後３時間還流する。実施例５！こ示したように反応混合物を抽 出し次ムこアンバーライ）ＸＡＤ−２上で精製した後、シリカゲルＧ−６０１層 クロマトグラフィーで、溶媒系１−ブタノール−氷酢酸−水（４８１：　５、ｖ 　／　ｖ　／　ｖ　）で単一ニンヒドリン陽性成分を示す無定形生成物（１３０ ■）が得られる。 実施例７ ３β、５α−ジヒドロキシ：コレスタン−５β−８＝イルーシステイニＹ二（さ ズラーン＞−−−−８−一−１−−一−−−−−−１−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−−−−−２一実施例５０手順に従い、エタノー ル（１０ｍ＝す中のコレステロール５α、６α−エポキシド（１００塚、０．２ ５ｍａ＋ｏｆｆ）を水（５ａ＋６）中の１２−システィン（６０■、０．５０ｍ ｍａｉｌすに加え、５Ｎ水酸化ナトリウム（０，５＋ｎｌ：すを力１１えた後３ 時間還・疏する。 反応混合物を抽出し１、次にアンバ〜ライトＸＡＤ〜２上のクロマトグラフィー で精製するとシリカゲルＧ−６０薄層クロマトグラフィーで溶媒系、ｌ−ブタノ ール−ギ酸−水（４二１：２、Ｖ／ｖ　／　ｖ　）中−−−二゛／ヒトＩＪン陽 性成分を示４無定形成分く１０５■）が得られる。 実施例８ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５（λ−８−イルーシステ±、、７　（ ／〉−ブーブー；・′）−一−−−−−−−−−−５−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−８−−−−−−−−−−−|−−−−−−一 実施例５０手順に従い、エラ２ノール（１０ｍｎ）中のコレステロール５β、６ β−エポキシド（１００■、０．２５ｍｍｏρ）を水（５ｍＡ’）中のＬ−シス テ・イン（６０■、０．５０ｍｍｏｆｆ）に加え、５Ｎ水酸化ナトリウム（０， ５＋＋＋＆）の添加後３時間遠？Ｌする０反応混合物を抽出し７、次にアンバー ライトＸ　Ａ　Ｄ−２上のり１コマトゲラフイーにより精製するとシリカゲルＧ 〜６０薄層クロマトグラフイーで、溶媒系１−ブタノール−ギ酸−水（４：　１ 　：　２、ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）で単一ニンヒドリン陽性成分を示す無定形生 成物（９８■）が得られる。 実施例９ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−８−イル−チオフェノール（ハプ テン） コンデンｆ−ヲｈａエタ５０　ｍｌフラスコ中、コレステロール５α、６α−エ ポキシド（１００曙、０．２５ｍｍｏｉすのベンゼン（１０ｍＡ’）中の溶液に チオフェノール（５５＋ｎｇ、　０．５　ｍｍｏ７すの淵リン酸数滴を含むベン ゼン（１０ｍｊす溶液を清純する。混合物を］時間還流する。冷却後、反応混合 物を減圧下に蒸発させると油状残留物が得られ、それをエチルエーテル（２５ｍ ｊすに再び溶解する。生じた溶液を５％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍｌ×２） で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に蒸発させる。生じた残留物を クロロホルム−メタノール勾配溶離を用いるシリカゲルＧ−６０上の液体クロマ トグラフィーにより精製する。所望生成物を含む両分を合せ、次に減圧蒸発させ ると、シリカゲルＧ−６０ｍＦクロマトグラフプレート上で溶媒系１−ブタノー ル−氷酢酸−水（３：　１　：　５、ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）で展開後紫外吸収 により単一成分を示す無定形物質（８５■）が得られる。 実施例１０ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル−チオフェノール（ハプ テン） 実施例９の手順に従い、コレステロール５β、６β−エポキシド（１００ｗ、Ｏ −２’　５　ｍ＋ｉｏ６　）のベンゼン（Ｌｏａｎ）中の溶液をチオフェノール （５５■、０°５ａ＋ｍｏＪ）の、鴻リン酸数滴を含むべ一′・ン（１０１す） 溶液で処理する０反応混合物は３β、６β−ジヒドロキクコ１／スタン−５α− Ｓ−イル−チオフェノールを含有゛４ると認められ、それを実施例９に示した手 順により回収する。無定形生成物（３５ｍｇ）はシリカゲルｙＪ層クロマドグう フィーで溶媒系１−ブタノール−氷酢酸−水（３：　１　：　５、ｖ　／　ｖ／ Ｖ）で単一紫外吸収成分を示す。 実施例１１ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−３−イル−０−ｌチオクレズ二ノ 煕、Ｑ）１逢！よ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一部一−−−−− 実施例９の手順に従い、コレステロール５α、６α−エポキシド（１００１■ｇ −０，２５ｍｍｏｊすをｏ−チオクレゾール（６０ｗ、０、５０　＋＋＋ｍｏ１ ）で処理すると所望生成物、３β、５α−ジヒドロキシコレスタン６β−８−イ ル−０〜チオクレゾールが無定形固体（７５■）として回収される。 実施例１２ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イルーＯ−チ」：す」乙ｙ゛ −ル　（ヱＸプｉ−４し−〜−−−−−６−−−−−−−−−−−−−一、−− −一実施例９の手順に従いコレステロール５β、６β−エポキシド（１００ａｖ 、０．２５　ｍ＋１ｏ１）を０−チオクレゾール（６０■、０．５０ａ＋ｍｏｊ すで処理すると所望生成物、３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８− イル−０−チオクレゾールが無定形固体（４０■）として回収される。 実施例１３ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−８−イル−ｍ−チオクレゾール（ ハブーン）□−□−−−−−□、一実施例９の手順に従い、コレステロール５α 、６α−エポキシド（１００ｗ、０．２５ｍｍｏｎ）をｍ−チオクし・プール（ ６０■、０．５０ｍｍｏｊすで処理すると所望の生成物、３β、５α−ジヒドロ キシコレスタン−６β−５−イル−ｍ−チオクレゾールが無定形固体（７２■） として回収される。 実施例１４ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−３−イル−ｍ−チオり士ヅヨＪ二 （／％７−’ｌ０−−−実施例９の手順に従い、コレステロール５β、６β−エ ポキシド（１００ｓ、　０．２５　ｍ１１１ｏｊすをｍ−チオクレゾール（６０ ａ＋ｒ。 ０．５０ｍｍｏＪ）で処理すると所望生成物、３β、６β−ジヒドロキシコレス タン５α−８−イル−ｍ−チオクレゾールが無定形固体（３０■）として回収さ れる。 実施例１５ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−８−イル−ｐ−チオクレゾール（ ハプテン） 実施例９の手順に従い、コレステロール５α、６α−エポキシド（１００ｕ、０ ．２５　＋ｌＩｍｏｊ！　）をｐ−チオクレゾール（６０ｕ、０．５０ｍ５ｏｊ ）で処理すると、所望生成物、３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−８ −イル−ｐ−チオクレゾールが無定形固体（８０■）として回収される。 実施例１６ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル−ｐ−チオクレゾール（ ハプテン） 実施例９の手順に従い、コレステロール５β、６β−エポキシド（１００ｍｇ、 ０．２５ｍｍｏｎ）をｐ−チオクレゾール（６０■、０．５０ｍｍｏｊすで処理 すると、所望生成物、３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル− ｐ−チオクレゾール、が無定形固体（３８■）として回収される。 実施例１７ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−３−イル−チオグリコ−火葭〕の １′テン＞　、−− コンデンサーを備えた５０１１７！フラスコ中でコレステロール５α、６α−エ ポキシド（１００ｍｇ、０．２５＋＋＋ｍｏｆｆ）のエタノール（１０ｍｎｏ７ す中の溶液を０．５Ｎ水性水酸化ナトリウム（５７すに熔解したチオグリコール 酸（４６■、０．５０ｍ＋ｍｏｉすとともに２時間還流する。冷却後、反応混合 物を氷酢酸で酸性にし、減圧下に蒸発させる。油状残留物をベンゼン（５ｍｅ　 Ｘ　３）で抽出し、抽出物を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥する。減圧蒸発後 、残留物をシリカゲルＧ−６０液体クロマトグラフィーによりクロロホルム−メ タノール勾配溶離を用いて精製する。生成物、３β。 ５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−８−イル−チオグリコール酸、が選択ク ロマトグラフィー画分の蒸発から無定形固体（８０■）として得られる。 実施例１８ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル−チオグリコニ」すＬ美 ユプク詠＝＞−−一部一一□一実施例１７の手順に従い、コレステロール５β、 ６β−エポキシＦＣ１００ｇ、０．２５ｍｍｏｆｆ）を０．５Ｎ水酸化ナトリウ ム溶液（５ｍｊす中のチオグリコール酸（４６■、０．５０　ｍｍｏｊ！　）で 処理する。抽出し、クロロホルム−メタノール勾配溶離でシリカゲル液体クロマ トグラフィーを行なった後、生成物、３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５ α−８−イル−チオグリコール酸が選んだ百分から蒸発した後無定形固体（３３ ■）として得られる。 実施例１９ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−３−イル−チオール″（ハプテン ）　− 実施例１７の手順に従い、コレステロール５α、６α−エポキシド（１００βｗ 、０．２５　ｍｍｏｎ　）を０．５　Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５ｍ１１）中の チオール酢酸（５３■、０．５０ｍ＋ｎｏ／）で処理する。抽出し、液体クロマ トグラフィーにより精製すると生成物、３β、５α−ジヒドロキシコレスタン− ６β−８−イル−チオール酢酸が選んだ百分から蒸発させた後無定形固体（７５ ■）として得られる。 実施例２０ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−３−イル−チオール　（ハプテン ＞−、、−−−９−一−−実施例１７の手順に従い、コレステロール５β、６β −エポキシド（１００＋ｗ、０．２５ａ＋ｍｏ／）を０．５Ｎ水酸化ナトリウム 溶液（５ｍＡ’）中のチオール酢酸（５３■、０．５０ｍｍｏｊ））で処理する 。抽出し、クロマトグラフィーにより精製後、生成物、３β。 ６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル−チオール酢酸が選んだ両分か ら無定形固体（３０■）として得られる。 実施例２１ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−８−イル−チオサリチル　（ハブ テン）　一 実施例１７の手順に従い、５α、６α−エポキシドｃｉｏｏ■、０．２５ｍｍｏ ６）を０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５＋１１１）中のチオサリチル酸（７７ ■、０．５０　ｍｍｏｊすで処理する。抽出し、クロマトグラフィーにより精製 し、選んだ両分を蒸発させた後、生成物、３β２５α−ジヒドロキシコレスタン −６β−３−イル−チオサリチル酸が微結晶固体（１１０ｍｇ）として得られる 。 実施例２２ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル−チオサリチル１：（リ ブｊ！→−２〜−−一一−−−−−−一−−−−−−−−−−−＝−〜−−−− −−−−一部一一−−〜一実施例１７の手順に従い、コレステロール５β、６β −エポキシド（１００ｒｒｗｚ、０．２５ｍｍｏＡ）を０．５　Ｎ水酸化ナトリ ウム溶液（５１１１１）中ノ（−オＪＪ−リチ）Ｌ４ｔ　（７７ｖｔ：、０．５ 　Ｏｎ＋ｍｏｉす　Ｔ：処理する。抽出し、クロマトグラフィーにより精製し、 選んだ両分を蒸発させた後、生成物、３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５ α−８−イル−チオサリチル酸が半結晶固体く４３■）として得られる。 実施例２３ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−３−イル−２−チオウラシルくハ ブテン） 実施例１７０手順に従い、コレステロール５α、６α−エポキシド（１００＊、 ０．２５ｍｍｏＪ）を０．５　Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５１）中の２−チオウ ラシル（６４Ｉ１ｇ、　０．５０　ｍ＋ｎｏｆｆ　）　テ処理する。抽出し、ク ロマトグラフィーにより精製し、選んだ百分を蒸発させた後、生成物、３β、５ α−ジヒドロキシフレスタン−６β−８−イル−２−チオウラシルが半結晶固体 （１０１■）として得られる。 実施例２４ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−８−イル−２−チＬ！Ｌ九乙乞エ ヘＬ九Ｚ１−．□−−−−−−一、−一部−−−−−−−−−−、−９−一部− −−実施例ｘ７の手順に従い、コレステロール５β、６β−エポキシド（１００ ＋ｗ、０．２５　ｍｍｏｊ！　）を０．５　Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５１）中 の２−チオウラシル＜６４ｍｇ、０．５０　ｍ＋５ｏＪ）　テ処理する。抽出し 、クロマトグラフィーにより精製し、選んだ百分を蒸発させた後、生成物、３β 、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−５−イル−２−チオウラシルが半結晶 固体（３８■）として得られる。 実施例２５ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−ｏ−ｐ−トルエンスルホナート（ ハプテン） かくはん機を備えた５０ｍｎフラスコ中にコレステロール５α。 ６α−エポキシド（１００ｓ、０．２５　ｍｍｏｆ　）のベンゼン（１０ＩＩＩ ！す中の溶液をベンゼン（１０ｍ！す中のｐ−トルエンスルホン酸（８６■、０ ．５０ｍｍｏ／）と混合し室温で４時間がくはんする０反応混合物を５％炭酸水 素ナトリウム水溶液（５ｍＪＸ３）で抽出し、次に水で洗浄し、無水硫酸ナトリ ウムで乾燥する。溶媒を減圧で蒸発させると油状残留物が生ずる。シリカゲルＧ −６０液体クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール勾配溶離を用いて精 製すると生成物、３β、５α−ジヒドロキシコレスタン・−６β−０−ｐ−トル エンスルホナートを含む選んだ両分が得られる。減圧蒸発さ−ｄ＋と主＄、物が 半結晶固体（７０■）として得られる。 実施例２６ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−０−ｐ−トルエンスルホナート（ ハブテン） 実施例２５の手順に従い、コレステロール５β、６β−エポキシドとｐ−）ルエ ンスルホン酸とをｌ：２のモル比で混合する。 反応後、生成物、３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−０−ｐ−）ルエ ンスルホナート、をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製すると半結晶固体 として回収される。 実施例２７ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−０−）リフルオロアセ　−ト（ハ プテン） 実施例２５の手順に従い、コレステロール５α、６α−エポキシドとトリフルオ ロ酢酸とを１＝２のモル比で混合する０反応後、生成物、３β、５α−ジヒドロ キシコレスタン−６β−０−トリフルオロアセタート、をシリカゲルクロマトグ ラフィーにより精製すると無定形固体として回収される。 実施例２８ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−〇−トリフルオロアセタート（ハ フニｊと二匙と）　、、−、−−一部−−〜−−−８−−−３−ｍ−実施例２５ の手順に従い、コレステロール５β、６β−エポキシドとトリフルオロ酢酸とを １：２のモル比で混合する０反応後、生成物、３β、６β−ジヒドロキシコレス タン−５α−〇・−トリフルオロアセタート、をシリカゲルクロマトグラフィー により精製すると無定形固体として回収される。 実施例２９ ３β、５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−Ｎ−イルーイミダブニ丑」図りゴ づ勺、−一部一一一一、−一部一一一一、−−−一−−−−−−かくはん機を備 えた５０ｍ／フラスコ中で、コレステロール５α、６α−エポキシド（１００ｍ 、０．２５　ｍｍｏｆ　）のエタノール（１０ｍ７す中の溶液をエタノール（１ ０＋＊Ｎ）中のイミダゾール（３５■、Ｑ、５ｍ＋ｘｏｉ’）と混合する。反応 混合物を８０℃で４時間かくはんする。溶媒を減圧で蒸発させると油状残留物が 残る。 クロロホルム−メタノール勾配溶離でシリカゲルＧ−６０液体カラムクロマトグ ラフィーによりコレステロール５α、６α−エポキシドのイミダゾールアダクト 生成物を含む両分が得られる。減圧下に溶媒を蒸発させると無定形生成物〈４１ ■）が得られる。 実施例３０ ３β、６β−ジヒドロキシコレスタン−５α−Ｎ−イルーイミダｙ−二ソに〜（ ’−’フリえ一ツーΣ−−−−−＝−−−−−−−−一部一一−−−１−−−− −１−−−−−−一−−−−−−−−−−実施例２９の手順に従い、コレステロ ール５β、６β−エポキシドとイミダゾールとを１：２のモル比で相互作用させ ると所望生成物が生じそれを回収する。 実施例３１ コレステロール５α、６α−エポキシド−α−メチルイミダゾールアダ名」（ハ ブテ乙＞−ｍ＝□−〜−−１−−−□、−ｍ−実施例２９の手順に従い、コレス テロール５α、６α−エポキシドおよびα−メチルイミダゾールが１＝２のモル 比で所望の生成物、 実施例３２ コレステロール５β、６β−エポキシド−α−メチルイミダゾールアダクト　（ ］＼Ａ元ン）　、−１−一部一一実施例２９の手順に従い、コレステロール５β 、６β−エポキシドおよびα−メチルイミダゾールが１：２のモル比で所望の生 成物、 実施例３３ コレステロール５α、６α−エポキシド〜α、β−・イミダゾールーンＬカッｂ ４−イー酸−アー１ｙｈｖｚブーテーンｌ）、、　、、、、、、、、−−、、、 −、、、、、−、、−、、、、、、、、、−一実施例２９の手順に従い、二］レ スデｌコール５α１６α〜エポキシドおよびα、β−イミダゾールジカルボン酸 が１：２０モル比でアルカリ性条件下に所望の生成物、 実施例３４ コレステロール５β、６β−エポキシド−α、β−イミダゾールジカルボン酸ア ダクト（ハプテン） 実施例３３の手順に従い、コレステロール５β、６β−エボキで所望の生成物、 実施例３５ コレステロール５α、６α−エポキシド−ヒスタミンアダクト（ハプテン） 実施例２９の手順に従い、所望の生成物、がコレステロール５α、６α−エポキ シドおよびヒスタミンから得られる。 実施例３６ コレステロール５β、６β−エポキシド−ヒスタミンアダクト（ハプテン） 実施例２９の手順に従い、所望の生成物、がコレステロール５Ｂ、ｂβ−エポキ シドおよびヒスタミンから得られる。 実施例３７ コレステロール５α、６α−エボキシドーヒスタジンアダクト（ハプテン） 実施例２９０手順に従い、所望の生成物、がコレステロール５α、６α−エポキ シドおよびし一ヒスタジンから得られる。 実施例３８ コレステロール５β、６β−エボキシドーヒスタジンアダクト（ハプテン） 実施例２９０手順に従い、所望の生成物、がコレステロール５β、６β−エポキ シドおよびＬ−ヒスタミンから得られる。 実施例３９ コレステロール５α、６α−エポキシド−ピペリジンアダクト（ハプテン） 実施例２９の手順に従い、水性または水性アルコール溶液中でコレステロール５ α、６α−エポキシドおよびピペリジンの相互作用で所望の生成物、 実施例４０ コレステロール５β、６β−エポキシド−ピペリジンアダクト（ハプテン） 実施例２９の手順により水性または水性アルコール溶液中でが得られる６ 実施例４１ コレステロール５α、６α−エボキシドーアルキルビベリジンアー≦７’７〜− 」辷−一部−クーご−〉！二＝？ニー≦ンｉ＼−；七で一ン二一部一一一一一− −−一−−一一一一一−−一部−−−−−−|−− 実施例２９の手提により水性または水性アルコール溶液中でか得られる。 実施例４２ コレステロール５β、６β−エボキシドーアルキルピペリジンアグクトいブテン ＞　、、、−ｍ＝ 実施例２９の手順により水性または水性アルコーノ【ノ溶液中でか得られる。 実施例４３ コレステロール５α、６α−エポキシド−ピペコリン酸アダクト」ムプ孟７）　 、、、、、　□− アルカリ水溶液または水性アルコール溶液におし）て実施例２９の手順に従う。 実施例４４ ｊｌ／ステロール５β、６β〜工１罰シド−ビへ：コリンＬ夏アダクトー（）＼ ア一〉］］゛−二−二ノ、、、、、、、、、、−、、、、、、、、、、、、、− 、、−−−、、、、−、−、、−、、、、、、、、A、、−、−−−−−”、、 、−−−−−、、、、、、、−、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、 −、、、、、、−、、、、、−■−、、、、、、、、、、−、、、、、−−−− −、、、−アルカリ水溶液または水性アル−ト−ル渚液ｔコおいて実施例２９の 手順に従う。 実施例４５ コレステｌ】−ル５α、６α−エポキシド−ピロリジンアダクト−山、＞−て主 ｙ工８−１．〜〜−−−−−−−〜．−−−−−−−−−−−−−−−−−−一 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−|−−８−一−９−−−−−− 水性または水性アルコール漆液において実施例２９０手順に従実施例４６ コレステロール５β、６β−エポキシド−ピロリジン７ダクトユム７’−Ｔｈ７ ）　、−、−−−−、−−、、、−、−、、、、−、、、、−、、、−−−、、 −一、−−−−水性または水性アルコール溶液において実施例２９の手順に従う 。 実施例４７ コレステロール５α、６α−エポキシド−３−ビロリンアダクト（ハプテン） 水性または水性アルコール溶液において実施例２９０手順に従実施例４８ コレステロール５β、６β−エポキシド−３−ビロリンアダクト（ハブテン） 水性または水性アルコール溶液において実施例２９の手順に従実施例４９ コレステロール５ａ、６α−エポキシド−アミノ酸アダクト（ハプテン＞　、□ −１−２−□ 実施例２９の手順に従って、水性または水性アルコールおいて中性−アルカリ性 条件で種々のアミノ酸が核試薬として作用することができる。 ３β，５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−Ｎ）ｌ−　Ｃ　Ｈ　−ＣＯＯＨ実 施例５０ 実施例５１ ６β−ｎ−プロポキシ−３β，５α−ヒドロキシコレスクン（ハブテン）−一ー ーーーーーーーーーー〜ーーーー−〜ーーーーーーーーーーーーーーコンデンサ ーを備えたフラスコ　（５０ｎ＋ｎ＞中のコレステロール５α，６α−エポキシ ド（１００■、０．２５＋＋＋ｗ＋ｏｆｆ）の１−プロパツール（２０ｍ！リ中 のトリフルオロ酢酸（１．０＋ｎｆｆ）を含む溶液を１時間還流する。減圧蒸発 で溶媒を除去する。油状残留物をベンゼン（１０ｍｆ）に溶解し、５％水性炭酸 水素ナトリウム（２ｍｌｘ２）および水で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥す る。減圧蒸発後熱定形固体残留物をシリカゲルＧー６０カラム液体クロマトグラ フィーによりクロロホルム−メタノール勾配溶菌を用いて精製する．選んだ画分 から生成物、６β−ｎ−プロポキシ−３β，５α−ジヒドロキシコレスタン（４ ５■）が得られる。 実施例５２ ５α−ｍ−ブトキシ−３β，６β−＝ジヒドロキシコレスタン（ハ２若云７）　 −一〜ーーーーーーーーーーーーーーーー−−一−−一−−，−−一部−−一一 一−一実施例５１に示した手順に従い、コレステロール５β．６β−エポキシｔ ′および１−ブタノールからトリフルオロ酢酸触媒で生酸物、５α−Ｄ−ブトキ ン−３β、６β−ジヒドロキクコレスクンが得られる。 他の大きいアルキルアルコールもまたコＩ／ステロ・−ルエボキシド類との相互 作用に用いてアルコキシハプテンを得ることができる。−ＯＣＲ，より大きいア ルコキシ基は交差反応性がないかまたは最小の大きい特異性を与える。 実施例５３ ３β、５α−ジヒドロキクコレスクン−６β−Ｎ６−アデニン」／と４云ｚ）− −−−一−−−−−−−−５−２−−−−−−−−一−−−−−−−−−〜−− −−−−−−−一部一一−−−−−−−−| かくはん機を備えたフラスコ（５０ｍｆ）中で、コレステロール５α、６α−エ ポキシドく１００■、０．２５　ｍｍｏｆ　）および５０％水性エタノール（２ ５ｍｊすに溶解したアデニン（１３５■、１．０ｍｍｏｐ）を３７℃で２４時間 混合する。減圧下に蒸発させ、生じた反応残留物をベンゼン（１０ｉｆｆＸ３） で抽出する。 ベンゼン抽出物を合せて１％アンモニア水および水で洗浄し、無水硫酸ナトリウ ノ、で乾燥する。減圧茎発後残留物をシリカゲルＧ−６０液体クロマトグラフィ ーによりクロロホルＪ、−メタノール勾配溶離で精製する６Ｎ″−アデニンアダ クトを含む選んだ画分を合せて減圧下に蒸発させると無定形固体（１１■）が生 成物として得られる。 実施例５４ ３β、６β−ジヒドロキクコ１／スタン−・５α−Ｎ＆−アデニン−←へ１−デ フ）　−ｍ＝−−−−−−−−−−−−−”　、、、、、　、−一実施例５３の 手順に従ってコレステロール５β、６β−エポキシドとアデニンとを反応させる と所望アダクト生成物が生ずる。 実施例５５ ３β、５α−ジヒドロキクコレスクン−６β−ＮＭ　−グアニン（ハブテン） 実施例５．３の手順に従い、コレステロール５α、６α−エポキシドとグアニン とを反応させるとグアニンのＮ２位置を含む所望アダクト生成物が生ずる。 実施例５６ ３β、６β・−ジヒドロキクコレスクン−５α−Ｎ”−１’アニン−ｑソ１ゾー ン−＞　−、−、、、、−一〜−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ｍ＝− −−−−−１−−−−−−−−＝−−−−−−|一−−−−−−−− 実施例５３の手順に従い、コ

【／ステｒ】−ル５β、６β−エポキシドとグアニ ンとを反応させるとグアニンのＮ２位置を含む所望アダクト生成物が生ずるゆ 種々のプリン類およびピリジン類並びにそれらそれぞれのヌクレオシドおよびヌ クレオチド誘導体とコレステロール５α、６α−エポキシＩ′およびコし・ステ １〕−ル５β９６β−エポキシドとの相互作用が水性または水性アルコール溶液 において中性で生し、それぞれ３β１５α−ジヒド０＄シコレスクン−６β−お よび３β、６β−ジヒドロキクコ１／スタン−５−アダク１！４１成物を生ずる 。プリンおよびピリミジン分子上の相互作用の位置はすべて、６β合物が最もし ばしば生ずるのご完全には知られていない。 種々のプリン類および相互作用の位置：Ｎ６−アデニン（若干Ｎ９置換） Ｎ６−アデノシン Ｎｈ３′−アデニル酸 Ｎ”−５’−−アデニル酸 Ｎ６−−アデノシンニリン酸 Ｎ６−アデノシン三リン酸 Ｎ”−２−メチルアデニン（若干Ｎ９置換）Ｎ２−“グアニン（若干Ｎ９置換） Ｎ′−グアノシン（若干Ｎ７置換） Ｎ”−３’−グアニル酸（若干Ｎ７置換）Ｎ”−５’−グアニル酸（若干Ｎ７置 換）Ｎ２−１−メチルグアニン（若干Ｎ９置換）ユ北ノテロールエ畦斗−λＦ＆ ｊ（Ｉｓ伍宵工実施例５７ 一５α、ｆ）ａ−エポキシコレスタン　３＃　Ｏ−へＢ入９ｆ＜、、ｊ　ｈコン デンサーを備えた５００ｍ１’フラスコ中でコレステロール５α、６α−エポキ シド（１０ｇ、２５ｍｍｏＩすを無水コハク酸（５ｇ、５０ｍｍｏｎ）のピリジ ン（１００ｍｆｆｉ）中の溶液とともに窒素下に１２時間還流する。冷却後ベン ゼン（３００ｍ７すおよび砕氷を反応混合物に加える。冷却溶液を冷水性塩酸で 激しくかくはんしながら多少酸性にする。その後冷却混合物をクロロホルム（１ ００ｍ＃Ｘ３）で抽出する。クロロホルム抽出物を合せて水で洗浄し、無水硫酸 ナトリウムで乾燥し、クロロホルムを減圧下に蒸発さゼると無定形残留物が生し 、それをエチルエーテルで摩砕した。ヘミスクシナート生成物（６，２ｇ）が水 冷エーテルで洗浄した後乾燥した。 実施例５８ ５β、６β−エポキシコレスタン−３β−０−ヘミスクシナート実施例５７の手 順に従い、コレステロール５β、６β−エポキシド（１０ｇ、　２５　ｍｍｏｆ ’）と無水コハク酸（５ｇ、　５０　ｎ＋ｍｏｆ）とを相互反応させると所望の 生成物（５，５ｇ）が生成される。 実施例５９ ５α、６α−エポキシコレスタン−３β−〇−カルボキシメチル王：ｊソ艶−− −−−−−−−−−−−−−−−。 コンデンサーを備えた５００ｍ＃フラスコ中でコレステロール５α、６α−エポ キシド（１０ｇ、２５　ｍｍｏｆす　；Ｇ：ブロモ酢酸メチル（７ｇ−５０ｍｍ ｏＡ）のピリジン（１００ｍｌ）中の溶液とともに窒素下に８時間還流する。冷 却後反応混合物に砕氷を加え、次いでクロロホルム（３００ｍｌすを加える。ク ロロホルム層を水洗浄で抽出し、次いで減圧下に蒸発させると油状残留物が生ず る。アルコール性水酸化カリウム（１％、１００ｍｊすを反応残留物に加え、水 浴中６０℃で１時開けん化する。クロロホルム（１００ｅ＋ｆ）を加え次に水で 洗浄し、無水硫酸すトリウムで乾燥し、減圧蒸発させると無定形生成物（４，０ ｇ）が生ずる。 実施例６０ ５β、６β−エポキシコレスタン−３β・−〇−カルボキシメチルエーテノｌｚ −一部一一一−−−−−〜−−−−−８−一−−−〜−−−−−−−−−−−１ −−一−−−−−−実施例５９の手順に従い、コレステロール５β、６β−エポ キシド（１０ｇ、　２５　ｍｍｏ７すとブロモ酢酸メチル（７ｇ、５０ｍｍｏ　 ７！　）を相互反応させると、けん化後所望の生成物（４，８ｇ）が生ずる。 実施例６１ ５α−ヒドロキシコレスタン−６β−８−イル−チオフェノール−３β−〇−ヘ ミスクシナート 実施例９０手順に従い、５α、６α−エポキシコレスタン−３β−０−ヘミスク シナートをチオフェノールで、痕跡量の淵リン酸を触媒として含むベンゼン溶液 中１：２のモル比で処理すると所望生成物が得られる。 実施例６２ ６β−ヒドロキシコレスタン−５α−３−イル−チオフェノール−３β−０−カ ルボキシメチルエーテル実施例９の手順に従い、５β、６β−エポキシコレスク ンー３β−〇〜カルボキシメチルエーテルをチオフェノールで、痕跡量のン；リ ン酸を触媒とし°ζ含む−く／ゼン溶液中で１：２のモル比で処理すると所望の 生成物が得られる。 実施例６３ ５α−ヒドロキシコレスタン−６β−０−ｐ−トルエンスルホナート−３β−〇 −カルボキシメチルエーテル実施例２５の手順に従い、５α、６α−エポキシコ レスタン−３β−０−カルボキシメチルエーテルをｐ−トルエンスルボン酸で、 ベンゼン溶液中で１：２のモル比で処理すると所望の生成物が得られる。 実施例６４ ６β−ヒドロキシコレスタン−５α−０−ｐ−１−ルエンスルボナートー３β− ０−ヘミスクシナート 実施例２５の手順に従い、５β、６β−エポキシブレスクン−３β−Ｏ−ヘミス クシナートをｐ−）ルエンスルホン酸で、ヘンゼン溶液中、１：２のモル比で処 理すると所望の生成物が得られる。 実施例６５ ５α−ヒドロキシコレスタン−６β−Ｎ−イル−イミダゾール−３β−〇−カル ポキシメヂルエーテル 実施例２９の手順に従い、５α、６α−エボキシコレスクンー３β−〇−カルボ キシメチルエーテルをイミダゾールで、エタノール中１：２のモル比でアルカリ 性反応で処理すると所望の生成物が得られる。 実施例６６ ６β−ヒドロキシコレスタン−５α−０−エトキシ−３β−〇一実施例５１の一 ト順に従い、５β、（３β　工Ｊミーヤン：Ｊレス々゛／３β−〇−へＳズク・ −リ′−１の１−タノール弓１ｊの７．し夜をトリノル・工寸ロＩ′ｌＩ酸で処 理する。と所望の生成物がｉ；しｌ　、ｌ’ｌイ）６実施例５７ ラン血；青アルフ゛ミツー５Ｌ人・、５ｔｘ−エボ４シニ目１、・スジソー３β −ｐニー９で＼逮−不り一ジイ二む一＝ニー、、、、、−１−−力−くブ１ノ　 ン　”’　（−色ぢ？［幻−−−−−−−−−−−−−−ジ」キ刊ン（１０１１ １（：）中の５α、距；α　丁５Ｊ：キ・ン：】レスタン−３β何）−＝・ミス ニー゛７・ノー　１−　（１０Ｌｒ＜）　、水＜５　ｍｉ’ｌ）中の１　丁チル −３−（３−ジメチルアミノフ゛日ビル）カル、に・ン・イミド塩酸塩（１００ １１１ｆｆ）　ト３よび０．０５　Ｎリン酸塩緩衝液ｐＨ７，８（１０ｍＡ）中 の結晶・ｊｙ　ｙ＞血清１ルグミ７（ＢＳＡ、２００ｗ）を室、・品で２４時間 かくはんイる。反＋４ｉＳ混音物は次いで冷蔵器中、５℃で４時間水に対し、て ｊ３折ず４）。透析後保持さノ１だ不；♂過１”で質を次いで’２，００ｆ）ｘ ｇで遠心分離しく２０分）、」二澄みを凍結乾燥すると軽い生成残留物（１ｆｉ Ｑ■）が得られる。生成物は重油ハシテンを含ま４′、者ＢＳＡ分子に対し平均 ９個のハブテン残基を塊む。必要なときにはステロイドータ′、／バク質複合体 はまたＧ　−−２５＋フエアデ・・ノクスゲル濾過により精製し２て透通ハプテ ンを除去づる。 実施例６８ ウシ血清アルブミン　５β、１５β−エポキシ」レスクン−３β−０−へ翅冬− 久−・）・−丈−二り竺−！−ゾーワーングー〈免−疫−原−＞　、−、、、、 −、−、−、、、、、−−−一実施例６“７の手順に従い、５β、６β−工Ｊ　 ４−シコレスクン−３β−０−へミスクシナ−１・をウシ血清アル７゛ミンに結 合させ、生じたステロ・イド−タンパイＪ質複合体を分離し２、精製する。 実施例６９ ウシ血清アルブミン・−５α７６α・−エボキシコレスクンー３β−０−カル弘 え之／−％／Ｌ４−−ｉ−ノリ１グユｙり菖逸月−−−−〜実施例６７の手順に 従い、５α１６α−エポキシコレスタン−３β−０−カルボキシメチルエーテル をウシ血ｆｆｌアルブミンに結合させ、生じたステロイド−タンパク質複合体を 分離し、精製する。 実施例７０ ウシ血清アルブミン−５β、６β−エポキシコレスタン−３β−０−カルボキシ メチルエーテルヵノブリング（免疫原）実施例６７の手順に従い、５β、６β− エポキシコレスタン−３β−０−カルボキシメチルエーテルをウシ血清アルブミ ンに結合させ、生じたステロイド−タンパク質複合体を分離し、精製する。 実施例７１ つλ血清アルブミンー６β−ヒドロキシコレスクン−５α−０−ｌヨＪ二〇−ヘ ミλ−り乞±二上ｐｌす１象ノ〕兼艶実ＨＭ６７の手順に従い、６β−・ヒドロ キシコレスタン−５α−〇−エトキシー３β−ｏ　−／％、ミスクシナートをウ シ血清アルブミンに結合させ、生じたステロイド−タンパク質複合体を分離し： 精製する。 実施例７２ ウシ血清アルブミン−５α−ヒドロキシコレスタン−６β−Ｓ−イル−チオフェ ノール−３β−０〜ヘミスクシナートカツプリングバ免炎凰＞、−一部一−−− −、−７□２一実施例６７の手順に従い、５α−ヒドロキシコレスタン−６β− ８−イル−チオフェノール−３β−０−ヘミスクシナートをウシ血清アルブミン に結合させ、生じたステロイド−タンパク質複合体を分離し、精製する。 実施例７３ ウシ血清アルブミン−５α−ＬニドＬ］キシコレスタン−６β−Ｎ　−イル−イ ミダソ゛−Ｊレー３β−０−カルボキシ、メチルエーテルヵツエＷ、−イクニ、 羨免咬源＞、　−１−、、、−、、、−、、、−−−−−、、、、、、、、、、 、−、−、−−−−−−一−−−−〜、−|−−−−−− 実に例６１の手順に従い、５α−ヒドロキシコレスタン−６β−Ｎ−イル−イミ ダゾール−３β−０−カルボキシメチルエーテルをウシ血清アルブミンに結合さ く、ｑ−ｅだステロイド−タンパク質複合体を分翻し、精製する。 実施例７４ ウシ血清アルブミン〜５α−し１勺−λキー：、ｓ：ｌレスタン−６β−５−１ ゛ルー＝グルタチオン・−３β−・０−カルボキシメチルエーテルカソ７”ｌに す゛）−Ｑ」−（免長原＞　−、、−、、、−−、−、−、、、”−、、−−０ −一部一−−−−−ジオキサン（１０ｍｊす中の精製５α、６α〜エポキシコレ スタン〜３β−〇−カルボキシメチルエ・−チル（１００ｓ）、水（５ｍ／す中 のｌ−７丁デル−３−（３−ジメ・ｆルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ １００ｍＲ）および０．　０　５　Ｎリン酸塩緩衝液ｐＨ７．８　（１　０　ｍ ｎ）中の結晶ウシ血清７　ＪＬ／ブミ７（２００＋ｗ）を室温で２４時間かくは んする。反応混合物４次いで冷蔵器中、５℃で４８時間水に対して透析する．不 透過部分を次に１２０００　Ｘ゛ｇで２０分間遠心分渭する。次いでＪ二澄みを グルタチオン（３００■）で冷蔵器中５℃で゛１２時間硬理重心。別の１−ｌｌ ａにおいて、上澄Ｉノ．＋ｆ−ラットの貯蔵Ｓーグツｌ弓すＪ゛，／１ランスブ ｆラーゼＩ３の存在下にグルタ（オンで処理する。実施例５へのＥｌ’順に従い 、反応後生酸物を透析ｊ−，、ｃ　−　２　５セフアオー仁ノクスゲル濾過し： より精製する。 実施例７５ ウシ血清アルブミン−　６β−ヒト［′Ｊキジコレスタン−５α−ｓ−イル−グ ルタチオン−３β−〇−ヘミスクシナー１カンブリングヱダ−？）（免兼−原’ ）−−一−−−−〜−〜〜−一−＝−−−−２−−−−−−一−−−−−−１− １−−−一−−一−−−一実施例７４の手１（頃に従い、カシ血清アルブミンを ５β、６β〜エボキシコレスクン−３β−０−ヘミスクシナートに結合させ、次 いでグルタチオンと化学的またはＭｆｆｉ的に相互作用させると生成物のアダク ト免疫原が生ずる。 免創則′Ｌ上 免疫感作 抗原（ステロイド−ＢＳＡ接合体、５〜１５■毎動物）を２ｍｌ塩水に溶解し、 等容積の完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント＜ＣＦ八）で乳化する。 この乳濁液を４月令おすウサギの背の両側に沿って１回、外皮内および皮下位置 に注射する。ウサギを辺縁耳静脈から、注入２週間後に始めて週１回採血する。 ヤギ（成熟めず、完全または卵巣摘出）に、ＣＦＡ中に乳化した抗原３ｍｇの４ 皮下注射を週間隔で、次にブースター注射を６〜７週間陪で与えた。血液試料を 頚静脈から、最初の注射の５週後および各ブースター注射の２週後に採取する。 非希釈血清は４℃で９ケ月まで貯蔵される。 放射性免疫検定 血清Ｇ　Ｏ，Ｉ　Ｍ−Ｎａ（Ｊおよび０１１％ＮａＮ３を含む０．０５ＭＬリス （Ｔｒｉｓ）−１１Ｃ（［３１衝液（ｐｌ＋８．０）で、予備滴定により示され るように、同種のトリチウム化したステロイド（１２〜１８ｐｇ＞の一定量の４ ０〜４５％が抗体に結合するように所要程度に希釈する。 １０Ｘ７５ｎの使い捨て試験管に入れた赤血清０．４ｍ！！ロフトに種々の量（ ０，５Ｘ　１０−”　〜・１０−’ｇ）の非標識ハブテンまたは異種ステロイド を同一緩衝液０．１ｍｊ！に加える（冷ステロイドの１０μｇ／ｍｆｆエタノー ル溶液を緩衝液で所要濃度に希釈する）。 、−の混合物を０．１＋ｎ７！トリス緩衝液中の同種トす３−ラム化ステｔｉＪ イドの１定￥（１２〜１８ｐｇ）を加える前にＱ′ｒで３０分間培養し５、次い でさらに３時間０℃で保持する（手持標識ステロイド前に冷ステロイドまたは未 知試料・を抗血清心こ加えるこの［先制（ｐｒｅ−ｃｍｐｔｉｖｅ）　ｊ法は２ ステ１−】イド種を同時乙こ加える「平衡」法に比べて検定の感度を多少増進す る）。次いで残留’６１ｍ、ステロイドを、トリス緩衝液中のデキストラン被覆 木炭の懸濁液〔０，５％ｗ　／　ｖフリット（Ｎｏｒｉｔ　）　Ａ活性炭および ０．０５％ｗ　／　ｖデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ　）　Ｔ　２０　）　０． １　ａ１１７！を加え、０℃で１０分間かくはんし、２２００×ｇで２０分間４ ℃で遠心分離することにより除去する。液体シンチレーション計数により結合し た放１・１性ステロイドを測定するため（ご上澄み部分（０，５ｍｐ）をインス ターゲル（Ｘｎｓｔａ−Ｇｅ　１　）　（バソカード・インス１ルメント社（Ｐ ａｃｋａｒｄｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、）　）を入れた計数バイアル中へ回 収する。 免−交説」１ 多様の免疫操作をステロ・イドに対する抗血清の生成に用いることができる６　 ９通の実施はア・ンユバント乳濁液のみを皮下または筋肉、足肉踊注入（皮下ま たは皮肉）および結節内経路で注射することであるｔ３れども、後者の方法は多 くの別個のリンパ節の開放手術における位置選定および注射の技術的困銘性によ り複雑である。 好ましい方法は体表面の相当部分１°−広がる４０またはより以上の部位に免疫 原乳濁液を注射する多皮肉注射操作である。抗体応答は比較的速く、ブースター 注射はさらに多少の効果を有する。 はとんどすべての投与経路、例えば皮下、筋肉、静豚内、リンパ節または足肉鉦 内、が後のブースタ・−注射と関連して適用されるけれども、多部位皮肉免疫の みがブースター注射なしで満足な結果を生ずると思われる。 多様の動物種がウサギ、ヒツジ、ヤギおよびモルモ・ノドを含めて免疫に用いる ことができる。 上記好ましい態様は限定することを意図するものではな（１°前記の物質および 方法における変更は当業者に明らかであろう。従って、本発明は請求の範囲によ ってのみ限定されるべきである。 国際調査報告 １１１１１ＡＩｌｌｅＡ参１＾ｅｐＨ！ａｌｉｅｎＮ６．Ｆ＝Ｔ、ｌ化（＋５． ｌ、二りり一とＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ 工ＮＴ　ＣＬ４：　Ｃｌ２Ｑ　：ｌ／６０．　ｉ／４８ＵＳ　ＣＬ　：　４３６ ／８０ＬＪ、８０４，８１７，８２２，８２３

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．流体試料中のコレステロールエポキシドの存在または濃度を測定する方法で あって、 前記試料をハプテン連結物質の存在下にハプテンと接触させて開環した３，５（ ６）−トランス−ジアキシアル−ジヒドロキシコレスタン−６（５）−イル−ハ プテンアダクトを形成させ、前記アダクト含有試料を、測定量の標識アダクトの 存在下に前記アダクトに対する抗体と接触させて、前記抗体に結合した標識アダ クトの量を測定する、 ことを含む方法。
2. ２．流体試料中のコレステロールエポキシドの存在または濃度を測定する方法で あって、 前記試料をハプテン連結物質の存在下にハプテンに接触させて開環したトランス −３，５（６）−トランス−ジアキシアル−ジヒドロキシコレスタン−６（５） −イル−ハプテンアダクトを形成させ、 前記アダクト含有試料を前記アダクトに対する標識抗体の測定量と接触させ、 非結合標識抗体を結合した標識抗体から分離し、前記アダクトに結合した標識抗 体の量を測定する、ことを含む方法。
3. ３．抗体が比色測定可能である物質により標識される、請求の範囲第２項記載の 方法。
4. ４．標識アダクトが分光測光可能である物質により標識される、請求の範囲第１ 項記載の方法。
5. ５．標識抗体または標識アダクトか放射性同位体より標識される、請求の範囲第 １項または第２項記載の方法。
6. ６．ハプテンが実質的にグルタチオンを含み、前記ハプテン連結物質がＳ−グル タチオントランスフェラーゼを含む、請求の範囲第１項または第２項記載の方法 。
7. ７．３，５（６）−トランス−ジアキシアル−ジヒドロキシコレスタン−６（５ ）−イル−ハプテンアダクトを含む免疫原。
8. ８．アダクト共有型結合橋によりタンパク質に連結される、請求の範囲第７項記 載の免疫原。
9. ９．ハプテンがグルタチオンを含む、請求の範囲第７項または第８項記載の免疫 原。