JPS6229995A - 血小板機能阻止性モノクロ−ナル抗体フラグメント - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 血小板（トロンホサイｔ”　［ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ
　］としても知られる。）は、血液供給が潜在的′１．
ｒ損失にさらされる場合に、すなわら、外傷、１察過症
ａ３よびその仙の出面性瀾傷などの場合に、血液の凝集
を与えるようにヒト体内において機能する。血小板は、
損なわれた血管と亙いに迅速に相互作用して、血球の漏
出を防ぎ、そし−Ｃまた血管系における［リークＪ　　
＜ａ洩）を塞ぐように網目十にからまったものとなる血
餅の形成を促進する。しかしながら、血栓症などのよう
ないくつかの疾患状態においては、血小板機能を明止す
ることが望ましくまた必要ですらある。これは、血栓が
血管を塞き１ｑるものでありかつこの血管から血液を供
給される組織に損傷を起こす（例えば、脈管手術後の心
筋の梗塞、発作など）ため、あるいは、血小板および他
の血栓性物質が、血栓から解離してそしてからだの他の
部イウに供給される曲管にお（）る下流（Ｊとどまり得
る（たどえぽ、肺塞栓症での静脈面枠症、一時的乏面性
発作、−過性黒内陣、人工心臓からの発作など）ためで
ある。

（従来技術とその問題点） 血小板機能（Ｊ逆作用することに現在用いられている製
某剤（」１、効力（１３よび／また（１待胃″１４の欠
如を予儀イｒくされている。これゆえ、血栓症で特徴す
ｔ′Ｊられる疾患において血小板機能を明庄する新らし
いあるいト４．改良された製薬剤に対する継続した必要
円が存在している。

（発明の構成） 本発明（，１、血小板は能をＩＳｎ　＋ｌ二するモノク
ローナル抗体フラグメント関するものである。このフラ
グメンｌ−１；土、７「３モノクローナル抗体のタンパ
ク質分解的演化、好ましくはパパインまたはペプシンＣ
の消化によって得られたものである。７［３モノクロ一
ナル抗体は、Ｊス下の方法において生成された。ず１．
＞　ｔ）　’）よすヒト血小板が７１クス中に注入され
た。該マウスの稗臓が、除去され、そしてレビーら［１
，ｅｖｙ　ｅｔ−ａｔ、　　］の技法（カル、１〜ツブ
、ミクロパイオル、イムツル、　８１．　１６／Ｉ　（
１９７８年）　　［ＣｕｒｒＪｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、ｒｍｍｕｎｏｌ、　　８！、　　１６／＋（１９７
８）］）の修正によって、マウス骨猶腫と融合された。

融合細胞（ユ、インキコへ−１・されそして次（ござら
にＨＡ下培地（非融合細胞１，１増殖しない。）におい
てインキコベートされた。細胞１１次に限界希釈されそ
して抗ノイブリノーゲンレセプター活性に関するふるい
わけ法においてスクリーニングされた。正常にｌ・−血
小板とａ′″３よびイヌ血小板と反応し、血小板無力症
の血小板あるいｌ、１ＱＰＩＩｂ／Ｉ　Ｉ　Ｉａ複合体
かＥＤＴＡでｗＩ離される血小板と反応けす、そして非
活性化じｈ血小板とゆっくりと反応しまた△［）　ｌ）
活↑Ｊ１化ヒト血小板どＪ、り迅速（こ反応し、Ａ　Ｄ
　Ｐにより誘導される血小板とのフィブリノーゲンの相
互作用を完全１こ１ｊ１１トするものである、Ｉ　Ｑ　
Ｇ　１クラスの７［３と呼称される１つの特定のクロー
ンが選択された。（なお、マウスハイブリドーマ７［３
は、Ａ丁ＣＧ（こ寄託され、受託番号１−Ｉ　８　８８
３２を与えられた。）ａ）調製 ７　「３　Ｅツク［１−プール抗体は、以下に示される
手順に従い調φ１１された。

クエン酸塩加血小板濃厚面漿が」−ラーらＪＣｏｌｌｅ
ｒ　ａｔ旧、］（プロット、／１７．　８４１　（１９
７６年）　［Ｂｆｏｏｄ、４７．ε（４１（１９７６）
１　）の方法にもとすいて調製され、適当イ【緩衝液中
に懸濁されそしてフロイン１へ完全アジ１バンドと混合
されｔこ。約Ｉ　Ｘ　１０８〜５Ｘ１０Ｂの洗浄血小板
の注ｑ」物が、Ｆ３ＡＩ　Ｂ／Ｃマウス中へ腹腔内的に
１週間間隔で６回注剣され、そして７回１」のアシ１バ
ントなしの同様の注剣物が同様の時開間隔で静脈内的に
与えられた。

３日後にマウスは殺され、脾臓か除去され、細胞が分離
されそしてレヒーら（」］記）の方法にもと、　　すい
てＦ３　Ａ　Ｉ−１３／　ｃマウス青髄腫系と融合され
た。

この方法において３．９：１の比に脾細胞と骨髄種細胞
か、−緒にペレッ１〜化され、該ペレットはＲＰＭ１１
６４０培ＩｔＩｌ中のポリエヂレングリ］−ル（３５％
）に懸濁され、ここで細胞は、直ちに低速度で遠心分節
１された。溶液Ｌｌ、次ｔこＲＰＭＩを用いてそれのｊ
ス前の）開度の約２５％へ希釈され、細胞（，１再懸濁
され、再遠心分離されそして上澄液か除去された。上澄
液は次に５％Ｃ０２９！″Ｊ％Ｊ％空気気中で、胎卯ウ
シ面清をｊ０加されたＲ　ＰＭ１１６４０培地にａプい
てインキコベ−１〜され、そしてぞの後の選択は、１−
ＩＡ丁培地を添加しそして微小力価つ■ル（窪み）中へ
部分標本化（アリコツト化［ａｌｉｑｕｏｔｉｎｏｌ）
することによる通常の方法においてなされた。２週間後
に、増加を示したウェルの上澄液は、抗フィブリノーゲ
ンレセプター活性に関してスクリーニングされた。この
方法によって１ｑられたクローンは、種々の晶質に関し
て選択され、特に、７「３は成る晶質ＩＪ関して選択さ
れた。

抗体はウェルあるいはフラスコ中にてト澄）１〜から単
離された。あるいはまた、ハイブリドーマ（Ｊ３、予め
ブロスタン■［ｐｒＯ３ｔａｎｅ■１処理された［３Δ
ｌ　Ｂ／ｃラット中へ腹腔内的に性用され、そして抗体
は腹水から単Ｈされた。抗体は、５０’ん飽和硫酸アン
モニウムを用いての沈澱により１！ＩＩＩ製され、リン
酩太トリウム緩衝１］ν中に最初の容司の５〜１０％に
おいて再思ｉｉｉｊされ、そして同じ緩衝液に対（）で
透析された。リン酸緩衝液で平衡化されたタンパツノ質
Ａ−セファ［］−スＣＩ−４８［５ｅｐｌｉａｒｏｓｅ
ｃｉ／ｌ旧にお〔Ｊるり１−１７トグラフイーか行なわ
れ、溶出は、０．１Ｍクエン酸緩衝液てｐｌ−１を減少
さＩ！ながらリン酸緩衝液を用いて行なわれた。７［３
抗体１３１．１）１１か約６．０に減少した後に溶出し
た。タンパク質溶出（よ、２８０ｎｍでの紫夕（線分光
学によって観測された。

抗ＩＱＧ１、抗Ｉ　Ｑ　Ｇ　２ａ、抗ＬＯＧ２ｂ、抗Ｉ
ＱＧ３、抗１１１Ｍおよび抗■Ω△血清に対するＡ−フ
タロ−二−免疫拡散検定は、ｌ０Ｇ１の独占的イｒ存在
を示した。

精製抗体１ｊｌ、次に低減された温度、好ましくは約Ｏ
〜１ｎ’Ｃ，より好Ｊ：シクは４°ＣでＩ’）ｔ−１３
，５〜６．５の、好Ｊ！シクは約４．０のわずかに酸性
の食塩水綴栴液にス・１して一晩透析され、この後に、
新たにＩＲＪ　’に：Ｊされたペプシンか、抗体の重量
のばば２％に等しい帛で添加された。１５ノられた溶液
は次に約３７°Ｃで１２〜２／１時間イン４−１べ−１
・された。消化は該溶）１々をＰＢＳ、ｐｉ１７．４に
λ・１して透析することによって停止１−された。ポリ
アイノリルアミドゲル電気）４（動による分析（、ｊｌ
、消化が本′ｔ′１的に完全であることを示した。

幾分か胃イＴる条１′１−下において、ｌ−ａ　ｂフラ
グメントか、パパイン、その他のタンパク質分解１〕１
削、すなわら、０．１Ｍ酢ｓＪ＝、２ｍＭ　　Ｉ：ＤＴ
−Ａ、１ｍＭシスアインイスとを用いての消化によって
調製され１ｑ、そしてｐｆ−１４、５〜Ｇ、りｆよしく
は５゜５に４３いて３７℃で６〜８時間１巾ｔＡ％のパ
パインを用いることイにとがあげられる。

７「３ｔツク［］−プール抗体の得ら杓たＦ（ａｂ−）
２フラグメンｌ−１ユ次に、残存Ｊる微ｊ４の完全７［
３モノクロ一ナル抗体か除去されることを確実なものと
するために、さらにランパフ質Ａ−セファロースＯＬ−
／ｌ［３もしく　１．１．　Ｉ）　Ｆ　−５２のよう７
、ｒ　ｖＡ質におし一ノるクロマ［〜グラノィーによっ
て精製されろことができる。

」−例ユ Ｗ俸）↓に １３Ａト１３１０マウス（ジャクソンラボラ１−リーズ
、メイン州パーハーバ−［Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ　１ｌａｒｂｏｒ、ｌｉｅ、　
］　）は３Ｘ１０Ｂ洗浄血小板（０，１’ｊＭ　　Ｎ　
ａ　Ｃｌ　、１０ｍＭ　ｈリス／ＣＩ、１０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴ’Ａ、Ｄ）−１７，４［王Ｓ−［］　−（”２度洗
浄されたり１−ン酸塩加ＰＲＰ（血小板瀧厚面漿）〕が
−ｒ　５−ｔ＝中に最初の容量の１／１０〜１／２０に
再懸濁されそして１：１の割合で完全フ［１インドアジ
］ハントと混合されたものの０゜２ｍＵｔｌ−削物を、
週１１ｒｉｌの割合で６回腹腔内的に注射されＩこ。第
７週１１の注射物は尾静脈内へ静脈内的に与えられ、そ
してこの注ｑ４物は、ｒ−３（Ｆ［）−「△成分を除い
た一Ｉｓ−Ｆ）中に再懸濁された５Ｘ１０”洗浄血小板
を含む０．３ｍ（！からなるものであった。該７つの血
小板懸濁液のぞれぞれが、胃なる供曲者から得られた。

最後の注射の３日後に、マウスは頚部脱ｒ」によって殺
されそしてＩｌ！！ｌ！職が除去された。ＲＰＭＴ１６
／ＩＯ中への脾細胞の懸濁液が取り出しＩこ脾臓をかぎ
裂くことによって＝　１３− 調製された。赤血球が塩化アンモニウムで溶解された後
に、脾細胞は、定型的に用いられる培養培地（１０％胎
児１クシ面清、ペニシリン１００ＯＬＪおよび１ｄ当り
スｌヘレプトマイシン１００／、？（）をイ」加された
ＲＰＭ１１６４０）中へ入れられ鞘持された際に、融合
の１週間前まで１０％ｆ）　Ｍ　Ｓ　０１９０％胎児ウ
シ面清中で冷凍されつづ］Ｊていた非分１゛１４Ｆ３Ａ
Ｉ−Ｂ／　Ｇ　マウスｆＲ髄肝細胞系（ｘ６３−Ａ１．
６５３）と融合された。融合（，１１、レビーら（上記
）の方法の修正によって行ｔＥわれた。

筒中には２．７Ｘ１０８の肋細胞と７Ｘ１０７の骨髄腫
細ｎ；すをあわ１！てペレッ１へ化し、該ペレッ１〜は
ＲＰＭＩ培地中の３５％ポリエチレングリ］−ル２ｍ！
！に穏やかに懸濁されそして細胞は直らに２２°Ｃにて
５００ｘｃ＋で６分間遠心分自１１された。）ｄ液は次
にＲＰＭ１１６４０を用いて９％ポリＴヂレングリ］−
ルへと希釈され、細胞は再懸濁され、そして直ちに２２
°Ｃにて２３０Ｘ（］で６分間遠心分離された。上澄流
体は、次に吸い出され、そして融合細胞１，１ＲＰＭ１
１６４０培地中に懸濁され、そ（）で２０％胎卯ウシ面
清および１０％　１０９培地（ナショナル　］１ツクジ
ョン　オブ　勺イプカルヂャーズ［＋ｉａ　ｔ　ｒ　ｏ
ｎ旧Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅｓｌ　＞をイｄ’　／Ｉ１１された。細胞はフラス
コ１中に入れられ、５％ＣＯ２，９５％空気の雰囲気下
において３７°Ｃで一晩インキコベー１へされた。次の
目、培地は、ヒポキリ−ンチン（１０−４Ｍ＞、アミノ
プテリン（４Ｘ１０−７Ｍ）およびチミジン（１゜６Ｘ
１０−５）を添加り−ることによって首尾よく雑種形成
された細胞に関して選択的とされ、この後、細胞は、９
６０−１の微小力価つ■ル（］−スター、データ　パッ
ケージング、マサチコーセッツ州ケンブリッジ［Ｃａ５
ｔｅｒ、　ｎａｔａ　ＰａｃｋａＯｉｎｇ、　Ｃａｍ１
）ｒｉｄＯｅ、　Ｈａ、　１　＞中に部分標本化された
。２週間後、５７５］のつ■ルが増殖を示（）、そして
５９］のつ■ルからの上澄流体が抗フィブリノーゲンレ
セプター活・１」に関するふるいねり法（下記参照のこ
と。

）においで陽゛ＩＪ１であった。培養におけるさらに２
週間の後、陽・１ノ１のクローンは２／Ｉ−微小力両皿
（］−スター〉に移され、アミノプリテンをなくず以外
は上記したものと同じ培地で使用された。

クローンは拡張され、そして抗フィブリノーゲンレセプ
ター抗体を産生することを続（Ｊた細胞は、９０％胎児
ウシ面清−１０％Ｄ　Ｍ　Ｓ　□中に懸濁されそして液
体窒素中で冷凍された。このクローンは、限界希釈技術
およびソフ［・寒天培地での増り１＾の双方にＪ：って
、単りローン正を保証するために副次り■−ニングされ
た。

７［３抗体に冨む腹水は、予めプリスタン処理されたＲ
　Ａ　Ｒ１，、−／　ｃ　マウスの、０．１５Ｍ　　Ｎ
ａＣｆ１．１０ｍＭリン酸す１ヘリウム、ｒ）ｌ−１７
，／１（ＰＦ３Ｓ）中で２度洗浄された５Ｘ１０６ハイ
ブリツド細胞での腹腔内的性用によって調製された。

実流−１舛２ ふるい（ゼー法 ＰＰＰ（血小板淵厚面漿）（１Ω当り３　Ｘ　１０１１
０而小根に調整されている＞３５ｆｌと検定されるべき
上澄培養培地（または腹水）３５μ９が、丸底微小力価
プレート（リンプロ　ケミカル　カンパニー、］ネチカ
ット州ハムデン［ｌ　１ｎｌｌｒＯｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、、　ｌｌａｍｄｅｎ、　　Ｃｔ、　　ｌ　）のつ
■ル中にいっしょにされて２〜６０分間インキュへ−１
〜された。

次にフィブリノーゲンを被覆したビーズの懸濁液５　Ｉ
Ｉ　Ｑが添加され、そしてプレー１〜は２　Ｂ　ＯｒＩ
′１ｍで５分間回転器（テカター■、アメリカン　サイ
エンティフィック　プロダクツ、ニコージャージー州エ
ディソン［Ｔｅｋａｔｏｒ　ｖ、　Ａｍｅｌ’１Ｃａｎ
　５ｃｉｅｎｔｉｔｉｃ　Ｐｒｏ市＋ｃｌｓ、　ｒｄｉ
ｓｏｎ、　Ｎ、Ｊ、］　）におイテ）捏合された。つ■
ルは、拡大ミラー器具（コーク　マイクロティツタ−シ
ステム、ダイナチック　ラボラトリーズ　インヨーボレ
ーテッド、バージニア州アレキサンドリア［Ｃｏｏｋｅ
　ｔｌｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ。

ｎｙｎａｔ’ｅｃｂ　１．ａｌ）ＯｒｒｌｔＯ１’ｉｅ
Ｓ、　　Ｉｎｃ、、　ＡＩｅＸａｎｄｒｉａ、　Ｖａ、
］）の手助けのちとに底部より観察された。細胞を増殖
するために用いられなかった、培養培地を含有するつ■
ルは、ビーズの顕著な凝集（４十と評価される）を示し
、一方、陽性クローンからの上澄培養培地あるいはマウ
ス腹水は凝集を明止し、より低い読み（Ｏ〜３＋）とな
った。

尖鬼■ユ Ｗ本籍ｌ 培養株上澄液は、４°Ｃで５０％飽和硫酸アンモニウム
で沈澱され、０．１Ｍリン酸ノー１−リウム綴衝液、ｒ
）１１８．０中にこれらの最初の容量の１／２０〜１／
１０に再ＰＪ！濁された。同じ緩衝液に対する透析の後
、試１！）１はリン酸緩衝液で平衡化されている（リン
酸緩衝液およびクエン酸緩衝液、ｌ’）　ｌ−１３。

０で洗浄された後）タンパク質△−セファロースＣＬ−
４Ｂの０．８Ｘ１５．９Ｃｍカラムへ’＞８用された。

カラムは、リン酸緩衝液を用いて、溶離１液の光学濃度
がベースラインにもどるまで溶離され、この後、段階的
な溶離が、エイら［［ｙ　ｅｔ　ａｔ、　］（イイムノ
ミミス１〜リー、１５．　４２９（１９７Ｂ８１）　　
［Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５．　４２９　
（１９７８）　］　）によって）４（ぺられるように、
ｐｌ−１６，０，１１，５，３，５、および３．０の０
．１Ｍクエン酸緩性ｉ液を用いて行なわれた。７［３免
疫グロブリンは、Ｄ　ｔ−Ｉ　６　。

Ｏで溶離した。タンパク質溶餌１は２８０　ｎｍでの光
学濃度によって監視され、イして適当な分画がプールさ
れそして０．０５％アジ酸すトリウムを含有する王−８
に対して透析された。抗体濃度は２８０ｎｍでの吸収に
Ｊ：っで評価され、Ａ１％−１１５と１１し定された。

渡り劇 ！ラグメンーＨａ−釧習 ７　Ｅ　３−Ｅツクローナル抗体は、前記の実施例にｄ
３いて）ボべた手順に従って調製された。

精製された抗体は、次に０．２Ｍ塩化ツートリウム、０
．２Ｍ酎耐、Ｄ１１４．Ｏに対して約４℃で一晩透析さ
れ、その後、新たに調製されたペプシン（１ｍ！Ｊ／　
ｎ＋Ｑ　）か抗体の手早のほぼ２％に等しい吊で添加さ
れた。１！−？られた溶液は、次に３７°Ｃで１２〜２
／１時間インキ］−ベートされた。消化は該溶液をｒ’
１３８．ｒ）１１７．４に対して透析することによって
停止された。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
析は、消化が本質的に完全であったことを示した。

７［３モノクロ一ナル抗体のｊｑられたＦ（ａｂ′）２
フラグメントは次に、残存する微早の完全７Ｅ３モノク
ロ一ナル抗体が除去されることを確実なものとするため
にさらにタンパク質Ａ−レファロースＣ１−４Ｂもしく
はＤ　Ｅ−り　２のような物質におけるクロマト・グラ
フィーによって精製されることができる。

犬用門 ■ このＦ（ａｂ−＞２モノク１］−ナル抗体フラグメント
は、次に以下の方法によって血小板機能ＩＳ＋’１市に
関して試験された。

３匹のイヌが用いられた。第１番目（ＮＯ，１）のイヌ
は、１時間間隔で与えられた３回の性用で合計０．１７
ｍ（］／ｋｏのフラグメントを受（）た。尼後の注ｑ４
０１時間後に扱かれた血液試料け、第１ａ、ｂ図に示さ
れるように以下の点を示１ノだ。Ｊなわら、１　）４ｍ
Ａｒ）Ｐによって誘導される凝集の最大限度（１−ｍａ
ｘ）に６１％の減少を有し；２）２２０．０００／μΩ
の面小仮数（比較対照（↑−０）−２３６，０００）を
有し；そして３）血小板当り１２５１−７Ｅ３０４５．
０００分子（比較対照−５６，４，００）が結合し、こ
のことで７「３モノクロ一ナル抗体のＦ（ａｂ−）２ノ
ラグメントの１１，０００分子が血小板当り（ご結合し
ていることが示唆されている。第２番１−１（Ｎｏ。

２）のイヌは中目の０．５７ｍ０／ｋＯの投与絹を受け
た。１．５時間後、ＡＤＰに対する王…ａＸは６８％近
くまで減少し、血小板当りに結合した１２５Ｉ−７Ｆ３
の分子の数は５９％まで減少しく６２゜５００から２ｂ
、４００へ）、４時間後でＴ　ｍａｘにお【プるε３４
％低減および結合分子における６４％低減（２２，５０
０＞がみられた。２６５．０００の初期血小板数は１．
５時間で２５３，０００および４時間で２１３，０００
へ減少したが、２０時間後には２４２，０００へもどっ
た。これらの結果は第２ａ、ｂ図に示される。いずれの
イヌも自然出向はなかった。

第３番目（Ｎｏ、３＞のイヌは第３ａ、ｂ図にホすよう
に０．８ＩＯ／ｋ（ｌのフラグメントを受けた。

これらの試験結果は、７Ｅ３モノクロ一ナル抗体のＦ（
ａｂ−＞２フラグメントが、深刻な血小板減少症を起こ
すことなく生体内で顕著に血小板は能を用土することを
示すものである。

物質および方法の多くの変更が、この開示の目的および
意図より逸脱することなく行なわれ得ることは当業者に
おいて明らかなことである。

実施■ｌ 先毬杓−試、旅 周期的血流減少モデルは、ずでに詳細に述べられている
（フＡルツ、ジェイ、ディー９、イー。

ビー、クロウＴル、ジュニア、およびジー、ジー。

ラウェ、１９７６年、プレートレット　アゲレジニージ
ョン　イン　パーシャリ−オブストラクテイッド　ベッ
セル　アンド　イツツス　エリミネーション　ウィズ　
アスピリン、サーキユレーシヨン　５／ｌ：３６５〜３
７０；フ４ルツ、ジＴイ、ディー。

、１９８２年、エクスペリメンタル　アルタリカルプレ
ートレット　トロンボシス、プレートレッドインじヒタ
ーズ　アンド　ピア　ポツシブルクリニ力ル　レリーウ
■ンス、カルディΔつ７スク、レブ、レプ、、３：３７
０〜３８２；フＡルツ。

ジエイ、ディー９、ガラファー、ケイ０、およびラウ丁
、ジー、ジー、　、１９８２年、プロット　フロラ　リ
グイノションス゛　イン　ステノーズド　カニン　ニ］
−ナリー　アルブリーズ：ウアソパズムＡア　プレート
レット 十ュレーション　６５：　　２４８〜２５５　［ＦＯｌ
ｔＳ，　Ｊ．ｆ）、。

「、Ｂ．　Ｃ「ｏｖｊｅｌｌ．　、Ｉｒ．、　ａｎｄ　
Ｇ．Ｇ．　Ｒｎｖｅ，　１９７Ｂ，　ＰｌａＩｅｌｅｔ
　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐａｒｔｉａｌｌｙ
　Ｏｌｌｓｔｒｕｃｔｅｄ　Ｖｅｓｓｅｌｓ　ａｎｄ　
ｉｔｓ　Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｔ＋　Ａｓｐ
ｉｒｉｎ，　Ｃｉｒｃｌｌｌａｌｌｏｎ　５／ｌ：３６
５−３７０：　ｒＯｌｌ’ｓ，　Ｊ．Ｄ．、　１９８２
，　ＦＸｐｅｒｉｎｌｅｎｔｉａｌ　　八ｒｔｅｒｉａ
ｌ　　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　　ｌ市ｒｏｍｂｏｓｉｓ，　
　ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ａｎｄ　ｔ
ｈｅｉｒ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｒｅ
ｌｅｖａｎｃｅ，　　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．　　Ｒｅ
ｖ．　　Ｒｅｐ．、　　３：３７０−　　３８２　　；
ｒ’ｏｌｔｓ，　Ｊ．Ｄ．、　Ｇａｌｌａｇｌ＋ｅｒ，
　Ｋ．、　ａｎｄ　Ｒｏｗｅ，　Ｇ．Ｇ．。

１９８２、Ｂｌｏｏｄ　　Ｆｌｏｗ　Ｒｅｄｕｃｔｉｏ
ｎｓ　　ｉｎ　Ｓｔｅｎｏｓｅｄ　Ｃａｎｉｎｅ　Ｃｏ
ｒｎａｒｙ　Ａｒｔｅｒｉｅｓ：　Ｖａｓｏｐａｓｍ　
ｏｒ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｇｏｒｅｏａｔｉｏｎ，　
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　６５：２４８−２５５　］　
）　、これらの開示１ま、関連により本明細書中に組入
れられる。簡単に述べると、麻酔されたイヌの回旋冠状
動脈あるいｌＡ．麻酔されたザルの頚動脈のいずれかが
切開されそして、電磁消息子が血液流を測定するこめに
それのトに置かれた。動脈は、動脈の夕ｉ側を取巻いて
適当な内径の３〜４ｍｍ艮の包囲プラスチック製筒状物
を置くことによって（、：１ぼ７０％狭窄される。血小
板血栓形成による血液流にお（′Ｊる周期的減少か次に
、自発的にあるいは止血鉗子を用いての動脈の簡単な（
およそ１秒）クランピングによってもたらされるイ］加
的な動脈内膜り傷の後に開始される。数分間以内に、曲
管内の血液流は臨界レベルに減少し、その後、血液流は
、血小板血栓の自然的塞栓形成によっであるいは該筒状
物の穏やかな振鰻により誘発される塞栓形成によって、
その最初のレベルに急激に復帰する。ひとたび起ると、
周明的流損減少は、何ら干渉がなされないと持続する。

流ｍ減少の頻度の大きさは、１０分間静脈内的に０．５
７１Ω／　ｋＯ／分のＴピネフィリンを注入することに
よって一時的に高められ得る。

実験処方は、０．０１容帛の４０％クエン酸す１〜リウ
ム（血小板凝集および１２５■−７［３結合のため）で
あるいは０．３７容早の２６Ｏｎ＋Ｍ「Ｄ丁△（血小板
計数のため）で抗凝固化される血液の試オ′；１を最初
に得、そして次に外１１手術が行へねれることにより構
成された。週期的流尾減少がもたらされた後、別の１組
の白液試別が得られそして抗体（０．７〜０．８ｍ３／
Ｋｇ＞か巨丸剤として静脈内的に注入された。抗イホを
注入した３０分後に最後の１絹の試別がｊｑられた。血
小板濃厚面景にお（〕る血血小板数は、希釈および赤面
法の溶解の後に顕微鏡を用いて行なわれ（ウノペット、
ベクトンーディツキンソン［ｌｌｎｏｐｅｔ，　Ｂｅｃ
ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏ＋１ｋまた全血血小板計数は
電気抵抗微粒子カウンター（Ｓ＋ＩＶ、］−ルルウター
エレク１〜ロニツクス、フィラデ゛ルフィア州ハイアレ
イ［ＣＯＵｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，　ｔｌ
ｉａｌｅａｈ　　Ｉｌｌ）ｌこよって行なわれた。

級−里 血液流にお（）る週明的減少が、４匹のイヌおよび４匹
のリールにおいて得られた。４匹のイヌおよび４匹のザ
ルのずぺてにおいてＦ（ａｂ’）２フラグメントの注入
は、週期的流吊減少の完全な停止と、１０分ないしそれ
以下にお（）る対照流速の回復をもたらした（第１図）
。イヌにおいては、冠状流の回復は、心筋虚血の逆転を
示す心電図におｃするＳＴ部偏位の消失と相関するもの
であった。

週期的流ｍ減少は、１０分間の０．５ないし１μΩ／に
３／分のエピネフィリン注入、止血鉗子を用いての曲管
の再度の簡単なりランピングにＪ：る動脈内膜損傷の増
加、筒状物を介しての電流（１〜２ｍＡ）の通過、ある
い１．１１これらの刺激の絹合せによって復活させられ
ること１まできなかった（第４図）。曲管の組織学的検
死前８１１は、広範囲にわたる動脈内膜損傷の存在を確
認した。

ＡＩ）Ｐ　（≦２５μＭ）に対する応答にお（プる血小
板凝集は、形状変化応答は完全に残っているものの、８
匹のすべての動物において抗体注入によって事実上聞さ
れた（第５図）。　　　Ｉ−７匹３抗体結合仙究が１匹
のイヌと１匹の１Ｌルにおいてなされた。双方の動物に
おいてＧＰＴｌｂ／ＩＴＩａレセプターの８４％がＦ（
ａｂ’）２フラグメントによって阻止された（犬におい
ては、血小板当りの結合した１２５Ｉ−７「３の分子は
注入前に３４゜３００．注入後にＬ’）　５００であり
、またサルにおいては、注入前に４９，７００、注入後
に８，１００であった）。血小板数は、試験された３匹
の動物において１ｊ）％未満だけ減少した。いずれの動
物も抗体注入において心拍数および血圧に顕著な変化を
示ざなｈりだ。血液損失における客観的なデ゛−夕が得
られていないが、抗体注入後の手術部位からの過度の出
面の明らかな形跡はなかった。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図、第２ａ図および第３ａ図（ｊ、それぞれε）
、予め与えられた間隔て、本発明の１−（ａｂ’）２ノ
ラグメントで予め処理された血液へのＡＤＰ添ｈ■の１
分後の血小板濃厚面漿光学濃度にお【プる変化のプロッ
トを示し、第１ｂ図、第２ｂ図および第３ｂ図はそれぞ
れ、本発明のフラグメント投４Ｆ後の成る間隔ての血小
板当りの結合した１２５Ｉ−７Ｆ３の分子（ｘｌｏ−３
＞のプロットを示し、第４ａ〜ｄ図は本発明のＦ（ａｂ
’）２フラグメントの投与後の大動脈面圧および回旋血
液流の１匹の試験穴に関するプロットの連続的１？ツト
であり、また第５図（よ本発明のＦ（ａｂ’）２ノラグ
メント注入前および後のＡ　Ｄ　Ｐ応答の光学濃度／時
間プ［１ツ１へである。 特許出願人　番ア　リサーチ　ファウンデーションオブ
　ステー１−１ニウアシテイ オブ　ニューヨーク ７ｆｌｌ茹席 １　’１　？！ｉ　’：”Ｉ　Ｃ＋　臀’７１１　Ａｌ
’　”Ｆイス悶ｏ、２ （０，５７ｍｇ／ｋｇ） 時間（時間） イアＮｏ、３ （０，８１ｍ５／ｍ１） 一手間　（Ｅヨ′ン

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウス骨髄腫系からの細胞と、あらかじめヒト血
   小板で免疫処置されたマウスからの脾細胞との融合によ
   つて形成されたハイブリドーマによつて産生され、血小
   板機能および血栓付発作のような疾患を阻止するＩｇＧ
   ＿１クラスのモノクローナル抗体のフラグメント。
2. （２）Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄
   腫細胞と、あらかじめヒト血小板で免疫処置されたＢＡ
   ＬＢ／ｃマウスからの脾細胞との融合によつて形成され
   たハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体の
   、パパインおよびペプシンからなる群からえらばれたタ
   ンパク質分解性剤を用いての消化よりえられる特許請求
   の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体のフラグメン
   ト。
3. （３）タンパク質分解性剤が、ペプシンである特許請求
   の範囲第２項に記載のモノクローナル抗体のフラグメン
   ト。
4. （４）ｉ）マウスをヒト血小板で免疫処置し、 ｉｉ）該マウスより脾臓を除去し、そして脾細胞の懸濁
   液を調製し、 ｉｉｉ）該脾細胞を融合プロモーターの存在下でマウス
   骨髄腫細胞と融合させ、 ｉｖ）融合細胞を別々のウェルにおいて非融合細胞を支
   持しない培地中に希釈および培養し、 Ｖ）ハイブリドーマを含むそれぞれのウェルをフィブリ
   ノーゲンレセプターに対する抗体の存在に関して評価し
   、 ｖｉ）ａ）正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し
   、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰIIｂ／IIIａ
   複合体かＥＤＴＡで解離されるヒト血小板と反応せず、 ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
   性化血小板とより迅速に反応する抗体を産生するハイブ
   リドーマを選択しそしてクローニングし、 ｖｉｉ）該クローン上の上澄液から抗体を回収し、 ｖｉｉｉ）該抗体をパパインおよびペプシンからなる群
   から選ばれたタンパク質分解性剤で消化し、 ｉｘ）該フラグメントを分解混合物から回収する、 連続的ステップより得られる、血小板機能を阻止するモ
   ノクローナル抗体フラグメント。
5. （５）タンパク質分解性剤が、ペプシンである特許請求
   の範囲第４項に記載のモノクローナル抗体のフラグメン
   ト。
6. （６）ｉ）マウスをヒト血小板で免疫処置し、 ｉｉ）該マウスより脾臓を除去し、そして脾細胞の懸濁
   液を調製し、 ｉｉｉ）該脾細胞を融合プロモーターの存在下でマウス
   骨髄腫細胞と融合させ、 ｉｖ）融合細胞を別々のウェルにおいて非融合細胞を支
   持しない培地中に希釈および培養し、 ｖ）ハイブリドーマを含むそれぞれのウェルをフィブリ
   ノーゲンレセプターに対する抗体の存在に関して評価し
   、 ｖｉ）ａ）正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し
   、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰIIｂ／IIIａ
   複合体がＥＤＴＡで解離されるヒト血小板と反応せず、 ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
   性化血小板とより迅速に反応する抗体を産生するハイブ
   リドーマを選択しそしてクローニングし、 ｖｉｉ）該クローンを腹腔内的にマウス中に移し、 ｖｉｉｉ）所望の抗体を含む悪性腹水または血清を収穫
   し、 ｉｘ）該抗体をパパインおよびペプシンからなる群から
   選ばれたタンパク質分解性剤で消化し、 ｘ）該フラグメントを分解混合物から回収する、 連続的ステップより得られる、血小板機能を阻止する、
   非活性化血小板とよりもＡＤＰ活性化血小板とより迅速
   に反応するモノクローナル抗体フラグメント。
7. （７）タンパク質分解性剤が、ペプシンである特許請求
   の範囲第６項に記載のモノクローナル抗体のフラグメン
   ト。
8. （８）マウス中にハイブリドーマ７Ｅ３を注入し、そし
   て該マウスの悪性腹水または血清から回収することにお
   いて得られた物質の、パパインおよびペプシンからなる
   群より選ばれたタンパク質分解性剤での消化より構成さ
   れる、血栓性発作のような疾患における血小板機能を阻
   止するモノクローナル抗体のフラグメントの調製方法。
9. （９）タンパク質分解性剤が、ペプシンである特許請求
   の範囲第８項に記載の方法。
10. （１０）特許請求の範囲第８項に記載の方法によって調
    製されたモノクローナル抗体のフラグメント。
11. （１１）タンパク質分解性剤が、ペプシンである特許請
    求の範囲第８項に記載の方法によって調製されたモノク
    ローナル抗体のフラグメント。