JP2524978B2 - 血小板機能阻止性モノクロ−ナル抗体フラグメント - Google Patents

血小板機能阻止性モノクロ−ナル抗体フラグメント

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JP2524978B2
JP2524978B2 JP61125962A JP12596286A JP2524978B2 JP 2524978 B2 JP2524978 B2 JP 2524978B2 JP 61125962 A JP61125962 A JP 61125962A JP 12596286 A JP12596286 A JP 12596286A JP 2524978 B2 JP2524978 B2 JP 2524978B2
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    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 血小板（トロンボサイト［thrombocyte］としても知
られる。）は、血液供給が潜在的な損失にさらされる場
合に、すなわち、外傷、擦過症およびその他の出血性損
傷などの場合に、血液の凝集を与えるようにヒト体内に
おいて機能する。血小板は、損なわれた血管と互いに迅
速に相互作用して、血球の漏出を防ぎ、そしてまた血管
系における「リーク」（漏洩）を塞ぐように網目上にか
らまったものとなる血餅の形成を促進する。しかしなが
ら、血栓症などのようないくつかの疾患状態において
は、血小板機能を阻止することが望ましくまた必要です
らある。これは、血栓が血管を塞ぎ得るものでありかつ
この血管から血液を供給される組織に損傷を起こす（例
えば、脈管手術後の心筋の梗塞、発作など）ため、ある
いは、血小板および他の血栓性物質が、血栓から解離し
てそしてからだの他の部位に供給される血管における下
流にとどまり得る（たとえば、肺塞栓症での静脈血栓
症、一時的乏血性発作、一過性黒内障、人工心臓からの
発作など）ためである。
（従来技術とその問題点） 血小板機能に逆作用することに現在用いられている製
薬剤は、効力および／または特異性の欠如を予儀なくさ
れている。これゆえ，血栓症で特徴ずけられる疾患にお
いて血小板機能を阻止する新らしいあるいは改良された
製薬剤に対する継続した必要性が存在している。
（発明の構成） 本発明は、血小板機能を阻止するモノクローナル抗体
フラグメント関するものである。このフラグメントは、
7E3モノクローナル抗体のタンパク質分解的消化、好ま
しくはパパインまたはペプシンでの消化によって得られ
たものである。7E3モノクローナル抗体は、以下の方法
において生成された。すなわちまずヒト血小板がマウス
中に注入された。該マウスの脾臓が、除去され、そして
レビーら［Levy et al.］の技法（カル．トップ．ミク
ロバイオル．イムノル．81,164（1978年）［Curr.Top.M
icrobiol.Immunol.81,164（1978）］）の修正によっ
て、マウス骨髄腫と融合された。融合細胞は、インキュ
ベートされそして次にさらにHAT培地（非融合細胞は増
殖しない。）においてインキュベートされた。細胞は次
に限界希釈されそして抗フィブリノーゲンレセプター活
性に関するふるいわけ法においてスクリーニングされ
た。正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し、血小
板無力症のヒト血小板あるいはGP II b/III a複合体がE
DTAで解離された後の血小板とは反応せず、そして非活
性化ヒト血小板とゆっくりと反応しまたADP活性化ヒト
血小板とより迅速に反応し、ADPにより誘導される血小
板とのフィブリノーゲンの相互作用を完全に阻止するも
のである、IgG1クラスの7E3と呼称される１つの特定の
クローンが選択された。（なお、マウスハイブリドーマ
7E3は、ATCCに寄託され、受託番号HB 8832を与えられ
た。） ａ）調製 7E3モノクローナル抗体は、以下に示される手順に従
い調製された。
クエン酸塩加血小板濃厚血漿がコーラーら［Coller e
t al.］（ブロット、47,841（1976年）［Blood,47,841
（1976）］）の方法にもとずいて調製され、適当な緩衝
液中に懸濁されそしてフロイント完全アジュバンドと混
合された。約１×108〜５×108の洗浄血小板の注射物
が、BALB/cマウス中へ腹腔内的に１週間間隔で６回注射
され、そして７回目のアジュバンドなしの同様の注射物
が同様の時間間隔で静脈内的に与えられた。３日後にマ
ウスは殺され、脾臓が除去され、細胞が分離されそして
レビーら（上記）の方法にもとずいてBALB/cマウス骨髄
腫系と融合された。この方法において3.9:1の比に脾細
胞と骨髄種細胞が、一緒にペレット化され、該ペレット
はRPMI1640培地中のポリエチレングリコール（35％）に
懸濁され、ここで細胞は、直ちに低速度で遠心分離され
た。溶液は次にRPMIを用いてそれの以前の濃度の約25％
へ希釈され、細胞は再懸濁され、再遠心分離されそして
上澄液が除去された。上澄液は次に５％CO295％空気の
雰囲気中で、胎児ウシ血清を追加されたRPMI1640培地に
おいてインキュベートされ、そしてその後の選択は、HA
T培地を添加しそして微小力価ウェル（窪み）中へ部分
標本化（アリコット化［aliquoting］）することによる
通常の方法においてなされた。２週間後に、増殖を示し
たウェルの上澄液は、抗フィブリノーゲンレセプター活
性に関してスクリーニングされた。この方法によって得
られたクローンは、種々の品質に関して選択され、特
に、7E3は或る品質に関して選択された。
抗体はウェルあるいはフラスコ中にて上澄液から単離
された。あるいはまた、ハイブリドーマは、予めプロス
タン ［prostane ］処理されたBALB/cラット中へ腹腔
内的に注射され、そして抗体は腹水から単離された。抗
体は、50％飽和硫酸アンモニウムを用いての沈澱により
精製され、リン酸ナトリウム緩衝液中に最初の容量の５
〜10％において再懸濁され、そして同じ緩衝液に対して
透析された。リン酸緩衝液で平衡化されたタンパク質Ａ
−セファロースCL−4B［Sepharose CL−4B］におけるク
ロマトグラフィーが行なわれ、溶出は、0.1Mクエン酸緩
衝液でpHを減少させながらリン酸緩衝液を用いて行なわ
れた。7E3抗体は、pHが約6.0に減少した後に溶出した。
タンパク質溶出は、280nmでの紫外線分光学によって観
測された。
抗IgG1、抗IgG2a、抗IgG2b、抗IgG3、抗IgMおよび抗I
gA血清に対するオークタローニー免疫拡散検定は、IgG1
の独占的な存在を示した。
精製抗体は、次に低減された温度、好ましくは約０〜
10℃、より好ましくは４℃でpH3.5〜6.5の、好ましくは
約4.0のわずかに酸性の食塩水緩衝液に対して一晩透析
され、この後に、新たに調製されたペプシンが、抗体の
重量のほぼ２％に等しい量で添加された。得られた溶液
は次に約37℃で12〜24時間インキュベートされた。消化
は該溶液をPBS、pH7.4に対して透析することによって停
止された。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析
は、消化が本質的に完全であることを示した。
幾分か異なる条件下において、Fabフラグメントが、
パパイン、その他のタンパク質分解性剤、すなわち、0.
1M酢酸塩、2mM EDTA、1mMシステインなどを用いての消
化によって調製され得、そしてpH4.5〜６、好ましくは
5.5において37℃で６〜８時間１重量％のパパインを用
いることなどがあげられる。
7E3モノクローナル抗体の得られたＦ（ab′）２フラ
グメントは次に、残存する微量の完全7E3モノクローナ
ル抗体が除去されることを確実なものとするために、さ
らにタンパク質Ａ−セファロースCL−4BもしくはDE−52
のような物質におけるクロマトグラフィーによって精製
されることができる。
実施例１ 抗体製造 BALB/cマウス（ジャクソンラボラトリーズ、メイン州
バーハーバー［Jackson Laboratories,Bar Harbor,M
e.］）は３×108洗浄血小板〔0.15M NaCl、10mMトリス
/Cl、10mM EDTA、pH7.4［TS−Ｅ］で２度洗浄されたク
エン酸塩加PRP（血小板濃厚血漿）〕がTS−Ｅ中に最初
の容量の1/10〜1/20に再懸濁されそして1:1の割合で完
全フロイントアジュバンドと混合されたものの0.2ml注
射物を、週１回の割合で６回腹腔内的に注射された。第
７週目の注射物は尾静脈内へ静脈内的に与えられ、そし
てこの注射物は、Ｔ−Ｓ（EDTA成分を除いたTS−Ｅ）中
に再懸濁された５×108洗浄血小板を含む0.3mlからなる
ものであった。該７つの血小板懸濁液のそれぞれが、異
なる供血者から得られた。最後の注射の３日後に、マウ
スは頚部脱臼によって殺されそして脾臓が除去された。
RPMI1640中への脾細胞の懸濁液が取り出した脾臓をかき
裂くことによって調製された。赤血球が塩化アンモニウ
ムで溶解された後に、脾細胞は、定型的に用いられる培
養培地（10％胎児ウシ血清、ペニシリン1000Uおよび1ml
当りストレプトマイシン100μｇを付加されたRPMI164
0）中へ入れられ維持された際に、融合の１週間前まで1
0％DMSO、90％胎児ウシ血清中に冷凍されつづけていた
非分泌性BALB/cマウス骨髄腫細胞系（X63−Ag8.653）と
融合された。融合は、レビーら（上記）の方法の修正に
よって行なわれた。簡単には2.7×108の脾細胞と７×10
7の骨髄腫細胞をあわせてペレット化し、該ペレットはR
PMI培地中の35％ポリエチレングリコール2mlに穏やかに
懸濁されそして細胞は直ちに22℃にて500×ｇで６分間
遠心分離された。溶液は次にRPMI1640を用いて９％ポリ
エチレングリコールへと希釈され、細胞は再懸濁され、
そして直ちに22℃にて230×ｇで６分間遠心分離され
た。上澄流体は、次に吸い出され、そして融合細胞はRP
MI1640培地中に懸濁され、そして20％胎児ウシ血清およ
び10％ 109培地（ナショナル コレクション オブ
タイプ カルチャーズ［National Collection of Type
Cultures］）を付加された。細胞はフラスコ中に入れら
れ、５％CO2、95％空気の雰囲気下において37℃で一晩
インキュベートされた。次の日、培地は、ヒポキサンチ
ン（10-4M）、アミノプテリン（４×10-7M）およびチミ
ジン（1.6×10-5）を添加することによって首尾よく雑
種形成された細胞に関して選択的とされ、この後、細胞
は960コの微小力価ウェル（コースター、データ パッ
ケージング、マサチューセッツ州ケンブリッジ［Coste
r,Data Packaging,Cambridge,Ma.］）中に部分標本化さ
れた。２週間後、575コのウェルが増殖を示し、そして5
9コのウェルからの上澄流体が抗フィブリノーゲンレセ
プター活性に関するふるいわけ法（下記参照のこと。）
において陽性であった。培養におけるさらに２週間の
後、陽性のクローンは24−微小力価皿（コースター）に
移され、アミノプリテンをなくす以外は上記したものと
同じ培地で使用された。クローンは拡張され、そして抗
フィブリノーゲンレセプター抗体を産生することを続け
た細胞は、90％胎児ウシ血清−10％DMSO中に懸濁されそ
して液体窒素中で冷凍された。このクローンは、限界希
釈技術およびソフト寒天培地での増殖の双方によって、
単クローン正を保証するために副次クローニングされ
た。
7E3抗体に富む腹水は、予めプリスタン処理されたBAB
L/cマウスの、0.15M NaCl、10mMリン酸ナトリウム、pH
7.4（PBS）中で２度洗浄された５×106ハイブリッド細
胞での腹腔内的注射によって調製された。
実施例２ ふるいわけ法 PRP（血小板濃厚血漿）（１当り３×1011の血小板
に調整されている）35μと検定されるべき上澄培養培
地（または腹水）35μが、丸底微小力価プレート（リ
ンブロ ケミカル カンパニー，コネチカット州ハムデ
ン［Linbro Chemical Co.,Hamden,Ct.］のウェル中にい
っしょにされて２〜60分間インキュベートされた。次に
フィブリノーゲンを被覆したビーズの懸濁液５μが添
加され、そしてプレートは280rpmで５分間回転器（テカ
ターV,アメリカン サイエンティフィック プロダク
ツ，ニュージャージー州エディソン［Tekator V,Americ
al Scientific Products,Edison,N.J.］）において混合
された。ウェルは、拡大ミラー器具（コーク マイクロ
ティッター システム，ダイナテック ラボラトリーズ
インコーポレーテッド，バージニア州アレキサンドリ
ア［Cooke Microtiter System,Dynatech Laboratories,
Inc.,Alexandria,Va.］）の手助けのもとに底部より観
察された。細胞を増殖するために用いられなかった、培
養培地を含有するウェルは、ビーズの顕著な凝集（４＋
と評価される）を示し、一方、陽性クローンからの上澄
培養培地あるいはマウス腹水は凝集を阻止し、より低い
読み（０〜３＋）となった。
実施例３ 抗体精製 培養株上澄液は、４℃で50％飽和硫酸アンモニウムで
沈澱され、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH8.0中にこ
れらの最初の容量の1/20〜1/10に再懸濁された。同じ緩
衝液に対する透析の後、試料はリン酸緩衝液で平衡化さ
れている（リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液、pH3.0
で洗浄された後）タンパク質Ａ−セファロースCL−4Bの
0.8×15.9cmカラムへ適用された。カラムは、リン酸緩
衝液を用いて、溶離液の光学濃度がベースラインにもど
るまで溶離され、この後、段階的な溶離が、エイら［Ey
et al.］（イムノケミストリー，15,429（1978年）［I
mmunochemistry,15,429（1978）］）によって述べられ
るように、pH6.0、4.5、3.5、および3.0の0.1Mクエン酸
緩衝液を用いて行なわれた。7E3免疫グロブリンは、pH
6.0で溶離した。タンパク質溶離は280nmでの光学濃度に
よって監視され、そして適当な分画がプールされそして
0.05％アジ酸ナトリウムを含有するＴ−Ｓに対して透析
された。抗体濃度は280nmでの吸収によって評価され、
Ａ１％＝15と推定された。
実施例４ フラグメントの調製 7E3モノクローナル抗体は、前記の実施例において述
べた手順に従って調製された。
精製された抗体は、次に0.2M塩化ナトリウム、0.2M酢
酸、pH4.0に対して約４℃で一晩透析され、その後、新
たに調製されたペプシン（1mg/ml）が抗体の重量のほぼ
２％に等しい量で添加された。得られた溶液は、次に37
℃で12〜24時間インキュベートされた。消化は該溶液を
PBS,pH7.4に対して透析することによって停止された。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、消化が
本質的に完全であったことを示した。
7E3モノクローナル抗体の得られたＦ（ab′）２フラ
グメントは次に、残存する微量の完全7E3モノクローナ
ル抗体が除去されることを確実なものとするためにさら
にタンパク質Ａ−セファロースCL−4BもしくはDE−52の
ような物質におけるクロマトグラフィーによって精製さ
れることができる。
実施例５ 試験 このＦ（ab′）２モノクローナル抗体フラグメント
は、次に以下の方法によって血小板機能阻止に関して試
験された。
３匹のイヌが用いられた。第１番目（No.1）のイヌ
は、１時間間隔で与えられた３回の注射で合計0.17mg/k
gのフラグメントを受けた。最後の注射の１時間後に抜
かれた血液試料は、第1a,b図に示されるように以下の点
を示した。すなわち、１）4m ADPによって誘導される凝
集の最大限度（Tmax）に61％の減少を有し;2）220,000/
μの血小板数（比較対照（ｔ＝０）＝236,000）を有
し；そして３）血小板当り125I−7E3の45,000分子（比
較対照＝56,400）が結合し、このことで7E3モノクロー
ナル抗体のＦ（ab′）２フラグメントの11,000分子が血
小板当りに結合していることが示唆されている。第２番
目（No.2）のイヌは単回の0.57mg/kgの投与量を受け
た。1.5時間後、ADPに対するTmaxは68％近くまで減少
し、血小板当りに結合した125I−7E3の分子の数は59％
まで減少し（62,500から25,400へ）、４時間後でTmaxに
おける84％低減および結合分子における64％低減（22,5
00）がみられた。265,000の初期血小板数は1.5時間で25
3,000および４時間で213,000へ減少したが、20時間後に
は242,000へもどた。これらの結果は第2a,b図に示され
る。いずれのイヌも自然出血はなかった。
第３番目（No.3）のイヌは第3a,b図に示すように0.8m
g/kgのフラグメントを受けた。これらの試験結果は、7E
3モノクローナル抗体のＦ（ab′）２フラグメントが、
深刻な血小板減少症を起こすことなく生体内で顕著に血
小板機能を阻止することを示すものである。
物質および方法の多くの変更が、この開示の目的およ
び意図より逸脱することなく行なわれ得ることは当業者
において明らかなことである。
実施例６ 生体内試験 周期的血流減少モデルは、すでに詳細に述べられてい
る（フォルツ，ジェイ．ディー．、イー．ビー．クロウ
エル，ジュニア、およびジー．ジー．ラウエ、1976年，
プレートレット アグレジェーション イン パーシャ
リー オブストラクティッド ベッセル アンド イッ
ツス エリミネーション ウィズ アスピリン，サーキ
ュレーション 54:365〜370;フォルツ，ジェイ．ディ
ー．、1982年，エクスペリメンタル アルタリカル プ
レートレット トロンボシス，プレートレット インヒ
ビターズ アンド ゼア ポッシブル クリニカル レ
リーヴェンス，カルディオヴァスク．レブ．レプ・,3:3
70〜382;フォルツ，ジェイ．ディー．、ガラファー，ケ
イ．、およびラウエ，ジー．ジー．、1982年、ブロッド
フロウ リダクションズ イン ステノーズド カニ
ン コーナリー アルテリーズ：ヴァソパズム オア
プレートレット アグレゲーション，サーキュレーショ
ン 65:248〜255［Folts,J.D.,E.B.Crowell.Jr.,and G.
G.Rowe,1976,Platelet Aggregation in Partially Obst
ructed Vessels and its Elimination with Aspirin,Ci
rculation54:365−370;Folts,J.D.,1982,Experimential
Arterial Platelet Thrombosis,Platelet Inhibitor a
un their possible Clinical Relevance,Cardiovasc.Re
v.Rep.,3:370−382;Folts,J.D.,Gallagher,K.,and Row
e,G.G.,1982,Blood Flow Reductions in Stenosed Cani
ne Cornary Arteries:Vasopasm or Platelet Aggregati
on,Circulation65:248−255］）、これらの開示は、関
連により本明細書中に組入れられる。簡単に述べると、
麻酔されたイヌの回旋冠状動脈あるいは麻酔されたサル
の頚動脈のいずれかが切開されそして、電磁消息子が血
液流を測定するこめにそれの上に置かれた。動脈は、動
脈の外側を取巻いて適当な内径の３〜4mm長の包囲プラ
スチック製筒状物を置くことによってほぼ70％狭窄され
る。血小板血栓形成による血液流における周期的減少が
次に、自発的にあるいは止血鉗子を用いての動脈の簡単
な（およそ１秒）クランピングによってもたらさせる付
加的な動脈内膜損傷の後に開始される。数分間以内に、
血管内の血液流は臨界レベルに減少し、その後、血液流
は、血小板血栓の自然的塞栓形成によってあるいは該筒
状物の穏やかな振盪により誘発される塞栓形成によっ
て、その最初のレベルに急激に復帰する。ひとたび起る
と、周期的流量減少は、何ら干渉がなされないと持続す
る。流量減少の頻度の大きさは、10分間静脈内的に0.5
μg/kg/分のエピネフィリンを注入することによって一
時的に高められ得る。
実験処方は、0.01容量の40％クエン酸ナトリウム（血
小板凝集および125I−7E3結合のため）であるいは0.37
容量の369mM EDTA（血小板計数のため）で抗凝固化さ
れる血液の試料を最初に得、そして次に外科手術が行な
われることにより構成された。週期的流量減少がもたら
された後、別の１組の血液試料が得られそして抗体（0.
7〜0.8mg/kg）が巨丸剤として静脈内的に注入された。
抗体を注入した30分後に最後の１組の試料が得られた。
血小板濃厚血漿における血小板計数は、希釈および赤血
球の溶解の後に顕微鏡を用いて行なわれ（ウノペット、
ベクトン−ディッキンソン［Unopet,Becton−Dickinso
n］、また全血血小板計数は電気抵抗微粒子カウンター
（Ｓ＋IV、コールター エレクトロニックス、フィラデ
ルフィア州ハイアレイ［Coulter Electronics,Hialeah
FL］）によって行なわれた。
結 果 血液流における週期的減少が、４匹のイヌおよび４匹
のサルにおいて得られた。４匹のイヌおよび４匹のサル
のすべてにおいてＦ（ab′）２フラグメントの注入は、
週期的流量減少の完全な停止と、10分ないしそれ以下に
おける対照流速の回復をもたらした（第４図）。イヌに
おいては、冠状流の回復は、心筋虚血の逆転を示す心電
図におけるST部偏位の消失と相関するものであった。週
期的流量減少は、10分間の0.5ないし１μg/kg/分のエピ
ネフィリン注入、止血鉗子を用いての血管の再度の簡単
なクランピングによる動脈内膜損傷の増加、筒状物を介
しての電流（１〜2mA）の通過、あるいはこれらの刺激
の組合せによって復活させられることはできなかった
（第４図）。血管の組織学的検死解剖は、広範囲にわた
る動脈内膜損傷の存在を確認した。
ADP（≦25μＭ）に対する応答における血小板凝集
は、形状変化応答は完全に残っているものの、８匹のす
べての動物において抗体注入によって事実上廃された
（第５図）。125I−7E3抗体結合研究が１匹のイヌと１
匹のサルにおいてなされた。双方の動物においてGP II
b/III aレセプターの84％がＦ（ab′）２フラグメント
によって阻止された（犬においては、血小板当りの結合
した125I−7E3の分子は注入前に34,300、注入後に5500
であり、またサルにおいては、注入前に49,700、注入後
に8,100であった）。血小板数は、試験された３匹の動
物において15％未満だけ減少した。いずれの動物も抗体
注入において心拍数および血圧に顕著な変化を示さなか
った。血液損失における客観的なデータが得られていな
いが、抗体注入後の手術部位からの過度の出血の明らか
な形跡はなかった。
【図面の簡単な説明】
第1a図、第2a図および第3a図はそれぞれけ、予め与えら
れた間隔で、本発明のＦ（ab′）２フラグメントで予め
処理された血液へのADP添加の１分後の血小板濃厚血漿
光学濃度における変化のプロットを示し、第1b図、第2b
図および第3b図はそれぞれ、本発明のフラグメント投与
後の或る間隔での血小板当りの結合した125I−7E3の分
子（x10-3）のプロットを示し、第4a〜ｄ図は本発明の
Ｆ（ab′）２フラグメントの投与後の大動脈血圧および
回旋血液流の１匹の試験犬に関するプロットの連続的セ
ットであり、また第５図は本発明のＦ（ab′）２フラグ
メント注入前および後のADP応答の光学濃度／時間プロ
ットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，82〔10〕（1985）Ｐ．3465 −3468 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．，34 〔１〕（1984）Ｐ．35−49 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｊｎｖｅｓｔ．，72 〔１〕（1983）Ｐ．325−338

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）血小板の機能を阻害し； （ｂ）血栓形成を阻害し； （ｃ）正常なヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し； （ｄ）血小板無力症のヒト血小板またはGP II b/III a
    複合体がEDTAによって解離された後のヒト血小板とは反
    応せず； （ｅ）不活性化血小板とはゆっくり反応し、ADP活性化
    血小板とはより迅速に反応し；さらに （ｆ）ADPによって誘導される線維素原と血小板との相
    互作用を遮断する モノクローナル抗体フラグメントである、抗原結合部位
    を有し、マウス骨髄腫系細胞及びあらかじめヒト血小板
    で免疫処置されたマウスからの脾細胞のハイブリドーマ
    より得られるIgG1クラスのモノクローナル抗体由来であ
    るモノクローナル抗体フラグメント。
  2. 【請求項２】該ハイブリドーマがX63−Ag8.653BALB/cマ
    ウスの骨髄腫細胞とBALB/cマウスの脾細胞との融合によ
    って得られる、特許請求の範囲第１項に記載のモノクロ
    ーナル抗体フラグメント。
  3. 【請求項３】（Fab′）２フラグメントまたはFabフラグ
    メントである特許請求の範囲第１項または第２項に記載
    のモノクローナル抗体フラグメント。
  4. 【請求項４】（Fab′）２フラグメントである特許請求
    の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体フラグメン
    ト。
  5. 【請求項５】該ハイブリドーマがATCCの受託番号がHB
    8832である7E3と呼称されるものである、特許請求の範
    囲第１項から第４項のいずれかに記載のモノクローナル
    抗体フラグメント。
  6. 【請求項６】（ａ）血小板の機能を阻害し； （ｂ）血栓形成を阻害し； （ｃ）正常なヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し； （ｄ）血小板無力症のヒト血小板またはGP II b/III a
    複合体がEDTAによって解離された後のヒト血小板とは反
    応せず； （ｅ）不活性化血小板とはゆっくり反応し、ADP活性化
    血小板とはより迅速に反応し；さらに （ｆ）ADPによって誘導される線維素原と血小板との相
    互作用を遮断する モノクローナル抗体フラグメントであり、抗原結合部位
    を有し、マウス骨髄腫系細胞及びあらかじめヒト血小板
    で免疫処置されたマウスからの脾細胞のハイブリドーマ
    より得られるIgG1クラスのモノクローナル抗体由来であ
    るモノクローナル抗体フラグメントを治療に有効な量含
    む血小板の凝集の処置または予防用薬剤組成物。
  7. 【請求項７】該ハイブリドーマがX63−Ag8.653BALB/cマ
    ウスの骨髄腫細胞とBALB/cマウスの脾細胞との融合によ
    って得られる、特許請求の範囲第６項に記載の薬剤組成
    物。
  8. 【請求項８】該モノクローナル抗体フラグメントが（Fa
    b′）２フラグメントまたはFabフラグメントである特許
    請求の範囲第６項または第７項に記載の薬剤組成物。
  9. 【請求項９】該モノクローナル抗体フラグメントが（Fa
    b′）２フラグメントである特許請求の範囲第８項に記
    載の薬剤組成物。
  10. 【請求項１０】該ハイブリドーマがATCCの受託番号がHB
    8832である7E3と呼称されるものである、特許請求の
    範囲第６項から第９項のいずれかに記載の薬剤組成物。
  11. 【請求項１１】（ａ）血小板の機能を阻害し； （ｂ）血栓形成を阻害し； （ｃ）正常なヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し； （ｄ）血小板無力症のヒト血小板またはGP II b/III a
    複合体がEDTAによって解離された後のヒト血小板とは反
    応せず； （ｅ）不活性化血小板とはゆっくり反応し、ADP活性化
    血小板とはより迅速に反応し；さらに （ｆ）ADPによって誘導される線維素原と血小板との相
    互作用を遮断する、 モノクローナル抗体フラグメントであり、抗原結合部位
    を有し、マウス骨髄腫系細胞及びあらかじめヒト血小板
    で免疫処置されたマウスからの脾細胞のハイブリドーマ
    より得られるIgG1クラスのモノクローナル抗体由来であ
    るモノクローナル抗体フラグメントを、血小板の凝集の
    処置または予防を目的とした薬剤を調製するために使用
    する方法。
  12. 【請求項１２】該ハイブリドーマがX63−Ag8.653BALB/c
    マウスの骨髄腫細胞とBALB/cマウスの脾細胞との融合に
    よって得られる、特許請求の範囲第11項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】該モノクローナル抗体フラグメントが
    （Fab′）２フラグメントまたはFabフラグメントである
    特許請求の範囲第11項または第12項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】該モノクローナル抗体フラグメントが
    （Fab′）２フラグメントである特許請求の範囲第13項
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】該ハイブリドーマがATCCの受託番号がHB
    8832である7E3と呼称されるものである、特許請求の
    範囲第11項から第14項のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】（ａ）血小板の機能を阻害し； （ｂ）血栓形成を阻害し； （ｃ）正常なヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し； （ｄ）血小板無力症のヒト血小板またはGP II b/III a
    複合体がEDTAによって解離された後のヒト血小板とは反
    応せず； （ｅ）不活性化血小板とはゆっくり反応し、ADP活性化
    血小板とはより迅速に反応し；さらに （ｆ）ADPによって誘導される線維素原と血小板との相
    互作用を遮断する、モノクローナル抗体フラグメントで
    あり、抗原結合部位を有し、マウス骨髄腫系細胞及びあ
    らかじめヒト血小板で免疫処置されたマウスからの脾細
    胞のハイブリドーマより得られるIgG1クラスのモノクロ
    ーナル抗体由来であるモノクローナル抗体フラグメント
    の製造方法において、以下の連続的ステップよりなるこ
    とを特徴とする製造方法： ｉ）マウスをヒト血小板で免疫処置し、 ii）該マウスより脾臓を除去し、脾細胞の懸濁液を調製
    し、 iii）該脾細胞を融合プロモーターの存在下でマウス骨
    髄腫細胞と融合させ、 iv）融合細胞を別々のウェルにおいて非融合骨髄腫細胞
    を支持しない培地中で希釈および培養し、 ｖ）フィブリノーゲンレセプターに対する抗体の存在に
    関してハイブリドーマを含む各ウェルにおける上清を評
    価し、 vi）（ａ）血小板の機能を阻害し； （ｂ）血栓形成を阻害し； （ｃ）正常なヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し； （ｄ）血小板無力症のヒト血小板またはGP II b/III a
    複合体がEDTAによって解離された後のヒト血小板とは反
    応せず； （ｅ）不活性化血小板とはゆっくり反応し、ADP活性化
    血小板とはより迅速に反応し；さらに （ｆ）ADPによって誘導される線維素原と血小板との相
    互作用を遮断する 抗体を産生するハイブリドーマを選択、クローニング
    し、 vii）該クローンの上清から抗体を回収しおよび／また
    は該クローンをマウスの腹腔内に移植し、目的とする抗
    体を含む悪性の腹水または血清を該マウスから集め、 viii）該抗体をパパインおよびペプシンからなる群から
    選ばれたタンパク質分解剤で消化し、 ix）フラグメントを分解混合物から回収する。
  17. 【請求項１７】該ハイブリドーマがX63−Ag8.653BALB/c
    マウスの骨髄腫細胞とBALB/cマウスの脾細胞との融合に
    よって得られる、特許請求の範囲第16項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】該モノクローナル抗体フラグメントが
    （Fab′）２フラグメントまたはFabフラグメントである
    特許請求の範囲第16項または第17項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】該モノクローナル抗体フラグメントが
    （Fab′）２フラグメントである特許請求の範囲第18項
    に記載の方法。
  20. 【請求項２０】該ハイブリドーマがATCCの受託番号がHB
    8832である7E3と呼称されるものである、特許請求の
    範囲第16項から第19項のいずれかに記載の方法。
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