JPS62288573A - 抗原の測定方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は酵素免疫分析（ｉｍｍｕｎｏ−ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｃ　　ａｎａｌｙｓｉｓ）の技術に関し、より特別
には抗原の測定のための方法に関するゆ 抗原を測定するための方法は、人間、動物及び植物の病
気の診断、植物及び動物の選択並びに環境の分析におい
て必要不可欠である。

抗原を測定するためには、免疫学的な方法が広範に使用
されている。そしてそれは抗原−抗体反応に基づくもの
である。これらの方法の感度を上げるためには、放射能
活性を持つ螢光化合物又は酵素で標Ｗ＆された抗体が用
いられる。＃素標識抗体に基づいた免疫学的な分析方法
（＃素免疫分析）はその高い感度及び人間の健康に害を
及ぼすような物質を取り扱う必要がないゆえに最近では
より広範に用いられるようになってきている。

発明の背景 多くの酵素免疫分析法が、その技術のうちで知られてい
る。不均一酵素免疫分析法（ｈｅｔｅ−ｒｏｇｅｎｅｏ
ｕｓ　　ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙ−ｍａｔｉｃ　　ａｎａ
ｌｙｓｉｓ）（ＥＬＩＳＡ）が最も広範囲に用いられて
いるが、そこでは測定すべき抗原を固相に結合させてい
る。分析される溶液からの抗原を高分子材料の表面上に
直接吸着させるか又は特異抗体で前もってその表面をお
おった後にそれに吸着させることによって、もつとも頻
繁に、その結合がなされている。次に吸着された抗原を
、酵素でＦＬｌｌｋした抗体（フンツユデー）　（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ））の溶液と反応させ、固相にそのコン
ジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）付７ｒＪさせる。そ
の後、その固相を液相から分離し、そのうちの一を分析
して酵素活性を測定し、その値を通して分析した溶液中
の抗原の量を測定する（参照、米国特許間ｍ書第３，７
２０．７６０１゜しかしながらこの方法は各測定すべき
抗原ごとに特異的なフンシュゲートを調製することが必
要である。

抗種抗体（ａｎｔ　ｆ−ｓｐｅｃ　ｉ　ｅｓａｎｔ＋）
）ｏｃｌｉｅｓ）を用いることによりコンジュゲートを
融通のきく性質のものにすることができる。この場合に
は固相に結合した抗原に特異抗体を加え、ついでその特
異抗体を調製するのに使われた動物種に対するものとし
て得られた抗種抗体（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ　　ａ
ｎｔｉ−ｂｏｃｌｉｅｓ）を含有する酵素のフンシュデ
ートを加える（英国特許明細書第１．５４９，０６９号
）。

特別な方法、そこではこれらの一般的な原理が使用され
ているが、それはフンシュデートの調製に用いられる酵
素のタイプによって区別されている。酵素の性質は、か
なりの程度、特異的なＥＬＩＳＡ法の使用見込み、感度
及び分析コストを最初に明確にしているものである。比
活性が高いこと及び貯蔵安定性のあることが酵素の望ま
れる性質である。これまでアルカリホスファターゼ、ベ
ルオキシグーゼ、β−〃ラクトシグーゼ、リゾチーム、
Δ５，３−ケトステロイドイソメラーゼ、ａ−アミラー
ゼ、グルコースオキシグーゼ及びその柿のものが、これ
らの目的のために使われでいた。アルカリホスファター
ゼ、ベルオキシグーゼ及びβ−〃ラクトシダーゼが最も
広範に使われている。

ＥＬ　ＩＳＡ法の重要な特徴は＊た酵素活性測定用の基
質のタイプのうちにもある。酵素はかなりの程度基質を
選」ζことを限定しているが、大部分の酵素はその基質
の構造におけるある程度の差異を許容している。この場
合基質加水分解生成物を高い感度で測定すること、安価
であること及びそれに貯蔵安定性があることが望まれる
。

アルカリホスファターゼを含有するフンシュデートを使
用する場合、基質としては最も頻繁にはｐ−二Ｆ口フェ
ニルホス７ヱートを使用スる（参照、米国特許明細書＄
３，８７９，２　Ｇ　２号）。酵素−アルカリホス７ア
ターゼは高い比活性を有しているが、貯蔵安定性が充分
なものではない。

ｐ−二トロフェニルホス７ヱ一トの加水分解生成物は輝
黄色（１ｉｇｈｔ　　ｙｅｌ　ｌｏｗ）のもので、その
色は実質的には人間の目による識別は不可能である。こ
の理由で測定機器が不可欠である。

ペルオキシダーゼは安価のゆえにＥＬ　Ｉ　ＳＡ法にお
けるコンジュゲートの調製のためにしばしば用いられて
いる（参照、米国特許明細書第３．７９１，９３２号）
。しかしながらそれは比活性が低く、それゆえ、それに
基づいた方法は感度が低い。そのうえ、そのうちの基質
のい（らかは発癌性を示す。

β−〃ラクトシグーゼは高い活性と貯蔵安定性を有して
いる。その基質としてはｐ−二トロ７工二ルエステルを
使用し、それは加水分解で人間の目でわずかに認識しう
るような輝黄色を示す（参照、仏国特許明細書第２，２
８８，３１２号）。

酵素免疫分析において用いられているアルカリホスファ
ターゼ、ペルオキシダーゼ及びβ−がラクトシグーゼの
基質は水溶液中で不安定であり、その製造コストが高い
が、アルカリホスファターゼ及１β−〃ラクトシグーゼ
の基質は、また乾燥状態での長期の貯蔵に不安定である
。

それゆえに、抗原を測定するための先行技術方法は同時
に高い分析感度を保証せず、高価な分析試薬と同様に複
雑な機器を必要とし、それゆえ単に特別な検査施設での
み使用が可能である。

この発明の目的は、高い感度、特に目視で抗原を測定す
る場合において高い感度を有する抗原測定法を提供する
ことにあり、この方法は安定な試薬を使用することを基
礎にＷｌき、このゆえに広範囲の使用者に受は入れるこ
とのできるものである。

発明の要約 この目的は、抗体を酵素と交差結合することによってコ
ンジュゲートを調製し、測定すべき抗原を固相に結合さ
せ、上記したコンジュゲートをその固相に結合させた測
定すべき抗原と反応させて固相及び液相を形成し、その
固相及び液相を分離し、その相のうちの一を基質と反応
させ、その酵素活性から抗原量を決定することからなる
抗原測定法によって成し逐げられる：この発明に従えば
、その方法は、コンツユデートの調製において、酵素と
して無機ピロホスファターゼ（ピロホス７エートホスホ
ヒドロラーゼ　ＥＣ３，６，１，１）を使用することに
特徴を有する。

この発明は、高い温度のもとでの抗体と酵素とのコンジ
ュゲートの安定性を高めることを可能にしているが、そ
の理由は、無機ピロホスファターゼが高い熱安定性を示
し、８０℃までの加熱に抵抗性を示すことにある。

この発明に従えば、その相の一つと基質とを反応させた
後、その反応混合物中に、次なる成分を質量％で含有す
る３〜７．５Ｎの強無機酸からなる発色試薬を加えるこ
とが推賞される；モリブデン酸の塩−０，７５〜４．５
、界面活性剤−０，０５〜０．３、マラカイトグリーン
染料−０，０２５〜０．２５．これはその光学密度を目
視測定する場合に高い分析感度を保証することとなる。

この発明に従えば、基質としてビロリン酸の塩を用いる
ことが推賞される。この塩は十分な溶解性を有し、例え
ばビロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム又はピロ
リン酸アンモニウムであってよい。このピロリン酸の塩
は少量を使用するが、その理由は無機ピロホスファター
ゼのミカエリス定数（Ｍｉｃｈａｅｌ　ｉｓ　　ｃｏｎ
ｓｔａｎｔ）は単に数マイクロモル／ＩＬに等しいのみ
だからである。そのうえ、酵素免疫分析に用いられる公
知の基質と比較してビロリン酸の塩は長い間の貯蔵でも
より安定である。この発明に従った方法におけるこの塩
の濃度は、０．２−０．５−Ｍ　に等しいものである。

この発明に従えば、無機ピロホスファターゼは、好まし
くは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）から
その細胞ホモツユネートを８３ないし９３°Ｃの温度で
熱処理し、１，６−ジアミノへキジルアブロースのクロ
マトグラフィーを行うことにより単離する。結果として
上記で特定化した酵素の単離方法は実質的に簡単なもの
となる。

（以下余白） 発明の詳細な説明 この方法の第一段階では、酵素と抗体のコンジュゲート
が取得される。この発明に従った方法における酵素とし
ては、無機ピロホス７Ｔターゼを使用する。この酵素は
良く知られており詳細に文献に記載されている（Ｊｏｓ
ｓｅ　　Ｊ、＊　ＷｏｎｇＳ、Ｃ，に、Ｔｈｅ　　Ｅｎ
ｚｙｍｅｓ、　　Ｖ、４゜ｐｐ、４９５　５２７／１９
７１／：ＢｕｔｌｅｒＬ、Ｇ、、ｐ、５２９−５４１）
。この発明において、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌ　ｉ）から単離された無機ピロホス７７ター
ゼが使用される。この酵素の回収法は文献に記載されて
いる（Ｗｏ　ｎ　ｇ　　Ｓ、Ｃ０に、？　　Ｈａ　ｌ　
ｌ　　Ｄ、Ｃ，。

Ｊｏｓｓｅ　　Ｊ、＊　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、＊Ｖ、２４５．ｐ、４３３５／１９７０／参照）、こ
の酵素の大きな利点は非常に熱に対して安定なことにあ
る。それは８０℃での１時間の加熱にも抵抗性があり、
室温で２年間貯蔵しても安定である。

酵素の分子量は　１２０，０００ダルトンに等しい。

それは６個の同じサブユニットからなり、それらの各々
は一つの活性中心を有している。その酵素の触媒活性は
２５℃の温度では約２，４００ｓ−’である。その酵素
のこれらの性質は酵素免疫分析における抗原の測定にお
いて非常に有効である。

コンジュゲートを得るため、無機ピロホスファターゼと
抗体との混合物の水溶液中に二価の交差結合剤（グルタ
ルアルデヒド）を添加し、その混合物をそれと共に特定
の時間インキエベーションする。得られるフンシュデー
トをデル−濾過法により出発化合物から分離する。

次に、測定すべき抗原に対して特異的な抗体を、固相に
結合させる：後者のものとしては、酵素免疫分析用高分
子製マイクロプレー）　（ｍｉｃｒｏ−ρｌａｔゝン）
または他の同様な器具の表面を使用する。この目的で、
その表面を抗体溶液と接触させ、それによって後者はそ
の表面に吸着される。

コンジュゲートと固相に結合した測定すべき抗原との反
応は二通りの方法で実施され、それはコンジュゲートを
調製するのに用いられた抗体の性質によって決められ５
．もし抗体が測定すべき抗原に関して特異的であるなら
、固相をコンツユデート溶液に接触させ、それによって
測定すべき抗原の量に比例した量を固相に結合させる。

もし抗体が特異抗体に対する抗種の抗体（ａｎｔｆ−ｓ
ｐｅｃｉｅｓ　　ａｎｔｉｂｏｃｌｙ）であろなら、そ
のフンツユデートを二段階で抗体と反応させる。

第一段階では、結合された抗原を有する固相を特異抗体
の溶液と接触させ、それにより抗体を抗原に結合させる
。次に、固相をコンツユデート溶液と接触させ、後者を
測定すべき抗原の１に比例した量で特異抗体と結合させ
る。

フンツユゲートを測定すべき抗原と反応させた後、液相
及び固相を分離し、そのうちの一つを基質溶液と接触さ
せる：後者としては［３２Ｐ］でラベルされたビロリン
酸の塩を用いる。一定の時間の後、無機ピロホスファタ
ーゼにより基質の加水分解で形成された［３２Ｐ］ホス
フエートを測定する。最後に［３２ｐ］ホスフエートの
放射活性を測定し、その値によって試料中の抗原の量を
決定する。

この方法を具体化した一つの方法のうちには、基質と相
の−との反応を行なったのち、呈色試薬をその反応混合
物中に添加する。その試薬としては次の成分を質量％単
位で含む３〜７．５Ｎの無機の強酸を用いる：モリブデ
ン酸の塩−０，７５〜４．５、界面活性剤−０，０５〜
０．３、マラカイトグリーン染料、−０，０２５〜０．
２５゜モリブデン酸の塩としては十分な溶解性を持つも
のならどのようなものも使用できる、例えばアンモニウ
ム塩。この発明に従った方法におけるこの塩の至適濃度
は、１．５￥を量％に等しい、０．７５質量％より低い
濃度では、光学密度、ひいてはその方法の感度を低下さ
せる。４．５質量％より高い濃度では、その光学密度が
測定すべき抗原がなくてもかなり増大し、したがって、
その感度は、特に測定すべき抗原量が少ない場合の分析
では低下する。

界面活性剤としてはトウィーン−２０、トリトン　　　
Ｘ−３０５（Ｔｒｉｔｏｎ　　　　Ｘ　　　　３０５）
　　及びステロクス（Ｓ　ｔ　ｅ　ｒ　ｏ　ｘ）を使用
できる。その最適濃度は、０．２質量％である；この場
合５単位までの光学密度の測定においてその系は透明の
＊まである。０．０５質量％より低い界面活性剤濃度と
するとその系の光学的な透明度を保持するようなその光
学密度の上限を低下せしめ、一方、０．３質量％より高
い濃度にすると、測定すべき抗原が存在してもその光学
密度が低下することとなる。

マラカイトグリーン染料の至適濃度は０．０８５質量％
である。　０．０２５質量％より低い濃度にすると測定
すべき抗原が存在してもその光学密度が低下することと
なり、一方０．２５１Ｒ量％より高い濃度にすると測定
すべき抗原が存在しなくてもその光学密度をかなり高め
とすることになる。

この発明に従った方法において、酸としては、硫酸、塩
酸及び過塩素酸を用いることができる。

５Ｎの濃度の硫酸は適している。＊濃度を３Ｎより低く
したりあるいは７．５Ｎより高くすると、測定すべき抗
原が存在してもその光学密度を減することになる。

その呈色試薬の作用は基質がら形成されたホス７二−ト
と反応することに基づいている。この発明に従った方法
において使用された酸の濃度のもとでは、マラカイトグ
リーンの高い溶解性を達成でき、どんな残渣も形成され
ない。

発色試薬を添加すると、反応混合物は？７緑色になる。

得られた着色化合物の吸光係数は少なくと６５０．００
０Ｍ−１１−１である１分析された試料に抗原が存在し
ない場合には、その色は高いコントラストのある淡黄色
である。この色の変化はその結果を視覚で評価する場合
において高い感度を保証するもである。

基質としては、０．０２〜０．５−Ｍの濃度のピロリン
酸の塩を用いる。０．０２ｍＭ　　より低いピロリン酸
の塩の濃度ではその光学密度は測定すべき抗原が存在す
る場合でもかなり低くなり、一方０．０５−Ｍをこえる
濃度では抗原が存在しない場合の光学密度を高くするこ
とになる。基質としてのピロリン酸の塩を使用すること
は、酵素免疫分析用に用いられる多（の他の基質よりも
かなり安価で゛あるという点で利、αがある。その上、
それは乾燥形態で及び１年よりも短くない量水溶液で制
限なく安定である。

上述してきたように、フンツユデートの調製のため無機
ピロホスファターゼを用いる。大ｉｗ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）から、そのホモゾネート化及び
その細胞ホモジネートの８３〜９３℃の範囲の温度のも
とでの熱処理、そしてそれに引続いての１．６−ジアミ
ノへキンルアがロース上でのクロマトグラフィーによっ
て得られたピロホスファターゼを用いることは賢明であ
る。これは＃索の単離工程を実質的に簡単なものとして
いる。上述した温度での大腸ｆｆｆ　（Ｅ。

ｃｏｌｉ）の細胞ホモジネートの熱処理は、その工程の
この段階でのピロホスファターゼからの他の蛋白質のよ
り完全な分離を保証している。これは無機ピロホス７７
ターゼが他の蛋白質よりも昇温下での熱処理に、より抵
抗するという事実によるものである。この発明に従った
方法において１、シ　Δ）ル配す先陣　消ｉね闇　！＋
　９　４ｂ　１１１１　−ｙ％　　東　１　　　　ｑ　
リ　、　９　ζ　ｐのｌ＠囲の熱処理温度が最適である
。８３℃より低い温度では、より多くの量の他の蛋白質
が残るし、一方９３℃をこえる温度では無機ピロホスフ
ァターゼが不活化する可能性がある。１，６−ツアミ／
へキシル７〃ロースでのクロマトグラフィーは、この吸
着剤に対するそれの親和性が非常に高く、また、約０．
５Ｍの濃度でそれから溶出されるという事実のゆえに、
無機ピロホスファターゼの効果的な精製を確実にするこ
とを可能にするものである。得られた酵素の純度は、ポ
リアクリル７ミドデル中での電気泳動のデータによれば
９０％をこえている。

この発明に従った方法は、抗原を光学密度によって目視
測定することを可能にする。０．１ユニツトをこえる光
学密度の値では人間の目によりその色を容易に知覚でさ
、その色は１週間は安定である。抗原が存在しない場合
にはその色は淡黄色である一方、抗原が存在する場合、
それは青緑色である。その反応生成物の分子吸光係数は
６３０　ｎｍではおおよそ５０．０００　Ｍ−’ｏｘ−
’である。この発明に従った方法は、コンツユデート及
び基質の高い安定性のゆえにどうしても低温でそのフン
シュデート及び基質を、貯蔵しなければならないという
必要性はない。酵素の高い安定性゛は５０〜６０℃の温
度で抗原測定を行なうことを可能にしている。これは分
析時間をかなり短縮する。＃素、すなわち無機ピロホス
ファターゼの単離方法は全く簡単であり、容易に利用す
ることのできる物質−大腸＠　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌ　ｉ）を利用することを基礎としている。

基質としてのピロリン酸の塩を用いることは、抗原分析
のコストを低減することを可能にする。この発明に従っ
た方法は、広範囲のユーザーにとって容易になしうる。

この発明に従った抗原測定のための方法を実施するにあ
たり最良の形態は次のとうりである。

フンシュデートを調製するための酵素としては無機ピロ
ホスファターゼを用いる。このピロホス７７ターゼは大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ　１ｃｈｉａＣｏｌｉ）細胞から得
られる。緩衝溶液中の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌ　ｉ）のバイオマス懸濁液を細胞破砕１ｉＣ
ｆ！！で処理し、ホモジネートを作る。得られた細胞の
ホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）を８５℃の温度
で２分間熱処理し、その後、上述の酵素を硫安で沈澱さ
せる。得られた沈澱を水に溶解し、その溶液を透析し、
１，６−ジアミノへキシル７〃ロースのカラムクロマト
グラフィーを行う。

このようにして調製された無機ピロホスファターゼをグ
ルタルアルデヒド存在下抗体と混合し、室温で約１時間
維持する。得られた混合物を緩衝液中でクロマトグラフ
ィーを行う。コンツユデートを含有する溶出画分を一緒
にする。

測定すべき抗原に対するＷ異抗体を含有する緩衝溶液を
酵素免疫分析用のマイクロプレートのウェル（Ｗｅｌｌ
ｓ）に入れる。次に抗体溶液を取り除き、そのマイクロ
プレートを塩化ナトリウム及びトリトン　Ｘ−３０５を
含有する緩衝溶液ですすぎ洗いし、トリトン　Ｘ−３０
５及びアルブミンを含有するトリス緩衝液中の測定すべ
き抗原の懸濁液又は溶液を、そのマイクロプレートのウ
ェルに入れ、３７℃の温度で３時間置く。３時間経過後
、その抗原溶液あるいはその懸濁液を取り除き、そのマ
イクロプレートを塩化ナトリウム及びトリトン　Ｘ−３
０５を含有する緩衝液ですすぎ洗いし、測定すべき抗原
に対する特異抗体と、無機ピロホスファターゼとのコン
ジュゲートの溶液をマイクロプレートのウェル中に入れ
、緩衝物質、トリトン　Ｘ−３０５及１アルブミンの存
在下５５℃の温度で２０分間置く。フンツユデート溶液
を取り除き、マイクロプレートを水ですすぎ洗いし、ａ
ｍ物質及び塩化マグネシウムを含有する非放射性のビロ
リン酸ナトリウム溶液０．０５　ｍＭをマイクロプレー
トのウェルに入れ、５５℃の温度で１０分間置き、その
後、５Ｎ硫酸中に１．５質量％のモリブデン酸アンモニ
ウム、０．０８５Ｙｉｆｉ％のマラカイトグリーン及び
０．２質量％のトウィーンー２０を含む溶液からなる呈
色試薬０，０５ｄを加え、その反応物質の光学密度を６
３０ｎｍで測定する。

このような具体化により次のような利点がある。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）から回
収されるピロホス７７ターゼを使用すると上記したよう
な酵素の安定性のおかげでそのコンジュゲートにより高
い安定性を与える。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌｉ）細胞のホモシュネートを熱処理すると高純
度の酵素を高収率で得ることがでさる。この発明に従っ
た方法におけるこのような具体化の中で、呈色試薬を用
いると、測定すべき抗原の含有量に応じてコントラスト
のある発色変化を確実にして、抗原を、高い感度で目視
測定することが可能となる。

（以下余白） この発明のより良い理解のため、下記にいくつかの実施
例を示す：実施例１〜５は酵素の回収を示し、実施例６
はフンツユデートの調製を示し、実施例７〜８は抗原の
測定を示す。

実施例１ 無機ピロホス７Ｔターゼの単離 １０論ＭのＭｇＣｌ２を含有するｐ　Ｈ７，２，０，０
５Ｍのトリス−ＨＣｌ　（ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　）
緩衝液の６１中に２ｈの大腸菌のバイオマス恩濁液をホ
モジナイザー中で処理して、バクテリア細胞を破壊する
。得られた細胞ホモジネートを、そ゛のホモジネートの
温度が、第一の熱交換器の出口で８５℃に、そして第二
の熱交換基の出口で１０℃になるように水が供給されて
いる二つの熱交換器に、３，６４２．／ｈの速度で連続
的に通す、第一の熱交換器をそのホモジネートが通過す
る時間は２分間である。そのホモジネートを遠心分離し
、生じた沈澱物を分離して廃棄する。上清液に硫酸アン
モニウムを加え５５％飽和にし、遠心分離し、沈澱物を
廃棄する。上清液に更に硫酸アンモニウムを加え７５％
飽和とし、遠心分離する。その沈澱物を２００ｄの水に
溶解する：その溶液を水に対して透析し、１，６−ノ７
ミ／へキジルア〃ロースのカラム（４Ｘ５０ｃｍ）に導
入する。Ｍ１ｉＣＩＬ２及びＮ　ａ　ＣＩｔを含有する
０、０５　Ｍ　）リスーＨＣｆ緩衝液でカラムを溶出す
る’、Ｍ１１Ｃ１２＠度を一定（１＋＋＋Ｍ）に保ち、
一方ＮａＣＩＬ濃度を０から０．８Ｍまで上げる：ピロ
ホス７Ｔターゼが現われるまでこの緩衝液でカラムを洗
う。

２に！！の大腸菌のバイオマスから、比活性５００Ｕ／
η、２５℃の無機ピロホスファターゼ０．３８　ｇを得
る。

ピロホスファターゼの単離において各ステップで得られ
た結果を次の表１に示す。

（以下余白） 表　１ （以下余白） 実施例２〜５ 無機ピロホスファターゼの単離 無機ピロホスファターゼの単離を前記実施例１に記載さ
れたのと同じ方法で行なったが、第一の熱交換器に供給
する水の温度を、この熱交換器の出口での細胞ホモジネ
ートの温度が８０〜９３℃の範囲内となるように変えた
。酵素の比活性及び収率の値を下の表２に示す。

（以下余白） 表　２ ホモジネートの温度１℃　酵素の比活性、Ｕ／η　収率
１％実施例６ 抗体と無機ピロホスファターゼとのコンツユデート　の
調製 ポリエチレンゲルコール沈澱及びＤＥＡＥ−セルロース
のクロマトグラフィーによってウサギ塩ｈ１から回収さ
れた抗体８ηと無機ビａホスファターゼ８ηとの混合物
を、０．１５ＭＮａＣ１を含有する８ｄの０．０１　Ｍ
リンＩＩｌ！緩衝櫃ｐ）ｆ７，４に溶解し、２５％グル
タルアルデヒド水溶１１１０，０２！を加え、２２℃の
温度で１時間インキエベートした。

次にその混合物を、０．ＩＭＮａＣｆ及び１曽ＭＭｇＣ
又２を含有する０、０５　Ｍ　）リス−ＨＣｌ緩衝液ｐ
　Ｈ＝　７．５を用い、４℃でセファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）Ｓ−３００＋７）カラム（２，５Ｘ８０Ｃ
１）のクロマトグラフィーを行う。

最初の蛋白質ピークの分画を集めて、抗原の測定に用い
る。

実施例７ カーネーションモザイク＠（ｃａｒｎａｔｉｏｎｍｏｔ
ｔｌｅ　　ｄｉｓｅａｓｅ）　　ウィルスの測定 酵素免疫分析用のポリスチレン製マイクロブレーＦのウ
ェルの中に、カーネーションモザイク病ウィルスに特異
的な抗体（１０ＰＦ！／１ｄＬ）の炭酸塩緩衝液ｐＨ９
，６溶液を、４℃の温度で２０時間の量大れる。この時
間の経過後、抗体溶液を取り除き、該マイクロプレート
を０．１５ＭＮａ（、ＩＬ及び０．１％トリトン　Ｘ−
３０５を含有する０、０１　Ｍトリス−ＨＣｌ１ｌ衝液
（ｐＨ＝７．５）ですすぎ洗いし、既知濃度のカーネー
ションモザイク病ウィルスの懸濁液を、０．１％のトリ
トンＸ−３０５及び０，１％の牛血清アルブミンを含有
する０、０１　Ｍトリス−ＨＣｌ榎衝緩衝液Ｈ＝７．４
）中で、マイクロプレートの窪みに３７℃の温度で３時
間置く。

３時間経過後そのウィルス懸濁液を取り除き、そのマイ
クロプレートを０．１５Ｍ　ＮａＣ１及びトリス−ＨＣ
！Ｌ＃ＩＬ衝液（ｐＨ＝７．５）ですすぎ洗いし、実施
例６に記載されたようにして調製されたカーネーシａン
モザイク病ウィルスに関して特異的な抗体と実施例１に
おけるようにして単離した無機ピロホスファターゼのフ
ンツユデートの溶液を、０．１％トリドアＸ−３０５及
ヒ０．１％牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ　　ｓｅｒ
ｕｍａｌｂｕｍｉｎｅ）を含有する０、０１　Ｍ　）リ
ス−ＨＣｌ１ｉｌ衝［（ＰＨ＝７．５）　中１’、０，
５Ｕ／ｌ１２ノ濃度で５５℃の温度で２０分間、マイク
ロプレートのウェルの中に置く。そのフンシュデート溶
液を取り除き、該マイクロプレートを水ですすぎ洗いし
、５曽Ｍ　　ＭｇＣＩＬ２を含有する０、１Ｍ）リス−
ＨＣｌ緩衝８Ｋ（ＰＨ＝　９．０　）に溶解させた０、
０５　ｍＭ　［３２Ｐコピロリン酸ナトリウムの溶液を
該マイクロプレートのウェルの中に入れ５５°Ｃの温度
で１０分間置く、そしてそのあと、０．２５Ｍモリブデ
ン酸アンモニウム溶ｆｉ６０４と６ＮＨＣ４１４７Ｊを
それに加える。攪拌後、得られた混合物へワーＡ　＋−
社賎轄−噌１柄　ノリゴダノーｌレーペンνン混合物（
容積比１：１）０，３ｄを加え、激しく振る。水相と有
機相とが分離した後［Ｇ２ｐ］ピロホス７エートを含有
する有機相０．２ｄの放射能活性を液体シンニル−シａ
ンヵウンターを使用して測定する。このようにして得ら
れたデータを下の表３示す。

この実施例は、慣用的に使用されていたものに比較して
コンツユデート及び基質を有するマイクロプレートのイ
ンキュベージシンの時間を短縮することを可能にせしめ
るような昇温（５５℃）下での分析を行なうことが可能
であることを示している。

表　３ ４　　　　　　　　　１．４５０ １０　　　　　　　　　２．８１０ ２０　　　　　　　　　４．５２０ 実施例８ 発色試薬を用いたカーネーションモザイク病ウィルスの
測定 次のこと以外は実質的に前記の実施例７の方法が繰り返
される：コンツユデートの溶液及びビロリン酸ナトリウ
ム溶液がマイクロプレートのウェル中で３７°Ｃの温度
で１時間保持すること、基質としては０．０２．０．０
５及び０．５−Ｍの濃度の非放射性のビロリン酸ナトリ
ウムからなるものを使用すること、基質を有する固相表
面に結合するフンツユデートの反応を実施した後、１．
５質量％のモリブデン酸アンモニウム、　０．０８５質
量％のマラカイトグリーン及び０．２質量％のトウィー
ン−２０（Ｔｗ　ｉ　ｎ−２０）の５Ｎ硫酸溶液から成
っている発色試薬０．０５ｄを添加し、その反応混合物
の光学密度を６３０ｎｍで測定すること。ウィルス濃度
を確認するためのデータを表４に示す。

（以下余白） 表４ ｎｇ／ｄ　　　ｍＭ Ｏ，０２０，０５０，５ ０（対照）　　０．０５２　０．０６９　０．２０１１
　　０．１２１０．１６００，３０８２　　０．１９３
０，２５１０，４０１４　　０．３１７０．４１６０，
５８２１０　　０．５８３０．７６１０．９８９（以下
余白） 目視分析（Ｖｉｓｕａｌ　　ａｎａｌｙｓｉｓ）で反応
媒質の色はウィルスが存在しない場合の淡黄色から高濃
度のウィルスにおける輝青色まで変化があることが判明
した。０．１６をこえる光学的濃度を持つ試料の色は対
照のそれと明確に異なっている。

実施例９〜２０ カーネーシタンモザイク病ウィルスの測定実施例８の方
法を０．０５ｍＭ　濃度のピロリン酸ナトリウム及び異
なった濃度のモリブデン酸アンモニウム、界面活性剤、
マラカイトグリーン染料及び酸を用いて繰り返した。ウ
ィルス濃度は１０ｎｇ／ｄである。このようにして得ら
れたデータを下の表５に示す。

（以下余白） 実施例２１ ソバ（ｂ　ｕ　ｃ　ｋ　ｗ　ｈ　ｅ　ａ　ｔ　）種子の
１３３−グロブリンの測定 前記実施例７の方法を繰り返したが、ウィルス懸濁液に
代えて０．１％トリトン　Ｘ−３０５及び０．１％牛血
清アルブミンを含有する０、ＯＩＭ）リス−ＨＣ１緩衝
ａ（ｐＨ＝７．５）に溶解して下記の特定濃度の１３８
−グロブリン溶液を用いる。

フンツユデート溶液の添加に先だって、ウサギの血清か
ら回収されたソバ種子１３Ｓ−グロブリンに特異的な抗
体の、０．１％トリトン　Ｘ−３０５及び０．１％牛血
清アルブミンを含有する０、１Ｍトリス−ＨＣｉ緩衝液
（ｐＨ＝７．４）の溶液を、マイクロプレートのウェル
中に入れ、３７℃の温度で２時間置き、その後、マイク
ロプレートを、０．１５ＭＮ　　とＬ　　Ｃｌ　及び　
０．１　　％　ト　リ　ト　ン　　　Ｘ−３０５を含有
する０、０１　Ｍ　）リスーＨＣｌＬｉ衝液（ｐ　Ｈ＝
　７．５　）ですすぎ洗いする。コンジュゲートはヤギ
の血清から回収されたウサギの免疫グロブリンＧに対す
る抗体を用いて実施例６に記載したようにして得られる
。基質としては、０．０５ｍＭ濃度の非放射性のビロリ
ン酸す）　＋７　’／ムが用いられので、その基質と固
相表面に結合せられたフンシュデートの反応の後に、前
記実施例８に記載された組成を持つ呈色試薬（ｃｏｌｏ
ｒ　　ｒｅａ−ｇｅｎｔ）０，０５ｄが添加される。

７ｚ？ｉ１子の１３８−グロブリンのいくつかの濃度に
ついての６３０ｎｍの光学密度の値を下記の表６に示す
。

（以下余白） 表６ ｏ　　　　　ｏ、ｏ　ａ　ｓ ６．７　　　　０，１３２ ２０　　　　０．２８１ ６０　　　　０．５８９ （以下余白） 実施例２２ マウス免疫グロブリンＧの測定 実施例８の方法を０．０５ｍＭＱ度のビロリン酸ナトリ
ウムを用いて繰り返した。コンジュゲートを調製する際
、ウサギ血清から回収されたマウス免疫グロブリンＧに
対する抗体を使用した。

マウス免疫グロブリンＧのいくつかの濃度についてのデ
ータを下記の表７に示す。

（以下余白） 表　７ ｏ　　　　　　　　　　　ｏ、ｏ　ｓ　ｓ４　　　　　
　　　　　０．１６５ １５．６　　　　　　　　０，３３９ ３１　　　　　　　　　　０．５６３ ６２　　　　　　　　　　１．３７ （以下余白） 実施例２３ カーネーションモザイク病ウィルスの測定前記実施例７
の方法を繰り返すが、コンノエデート調製の際に、パン
酵母（ｂａｃｋｅｒ’５ｙｅａｓｔ）から回収された無
機ピロホスファターゼを使用する。基質としては０．０
５　ｍ　Ｍ濃度の非放射性ピロリン酸ナトリウムを使用
し、基質と固相表面に結合したフンツユデートの反応の
後、それに実施例８の組成の呈色試薬０，０５ｄを加え
る。各ピンクモザイク病（ｐｉｎｋ　　ｍｏｔｔｌｅｃ
ｌ　ｉ　５ｅａｓｅ）ウィルスのいくつかの濃度に対す
るデータを下記の表８に示す。

（以下余白） 表８ ウィルス濃度ｔＰｇ／ａ　　　　光学密度０　　　　　
　　　０．０７５ ５　　　　　　　　０．２５６ １０　　　　　　　　０．４８５ ２０　　　　　　　　０．７５１ （以下余白）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗体を酵素と交差結合させてコンジュゲートを調
   製し、測定すべき抗原を固相と結合させ、前記コンジュ
   ゲートと固相に結合させた測定すべき抗原とを反応させ
   、固相及び液相を形成させ、得られた固相及び液相を分
   離し、その相のうちの一を基質と反応させ、その酵素活
   性の値から抗原量を測定する、 ことからなる抗原の測定方法において、そのコンジュゲ
   ートを調製する場合における酵素として無機ピロホスフ
   ァターゼを使用することを特徴とする抗原の測定方法。
2. （２）基質との反応を行なった後、質量％で次の成分：
   モリブデン酸の塩０．７５〜４．５、界面活性剤０．０
   ５〜０．３、マラカイトグリーン染料０．０２５〜０．
   ２５、 を含む３〜７．５Ｎ無機強酸からなる呈色試薬をその反
   応混合物に加えることを特徴とする特許請求の範囲第（
   １）項に記載の抗原の測定方法。
3. （３）酵素活性を測定する場合にその基質としてピロリ
   ン酸の塩を０．０２〜０．５ｍＭの濃度で用いることを
   特徴とする特許請求の範囲第（１）項及び第（２）項に
   記載の抗原の測定方法。
4. （４）無機ピロホスファターゼが大腸菌の細胞のホモジ
   ネートから、その細胞を、８３〜９３℃の温度で処理し
   、それを１，６−ジアミノヘキシルアガロースのクロマ
   トグラフィーにかけることにより単離されたものを用い
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項に記載の
   抗原の測定方法。