JPS62263457A - 尿素センサ用固定化ウレア−ゼ膜の製造方法 - Google Patents
尿素センサ用固定化ウレア−ゼ膜の製造方法Info
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- JPS62263457A JPS62263457A JP61108020A JP10802086A JPS62263457A JP S62263457 A JPS62263457 A JP S62263457A JP 61108020 A JP61108020 A JP 61108020A JP 10802086 A JP10802086 A JP 10802086A JP S62263457 A JPS62263457 A JP S62263457A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は医療での臨床計測、あるいはし尿処理場のプロ
セスコントロール等に用いる尿素センサ用の固定化ウレ
アーゼ膿の製造方法に関するものである。
セスコントロール等に用いる尿素センサ用の固定化ウレ
アーゼ膿の製造方法に関するものである。
水素イオン感応性電界効果型トランジスタ（以下、ｐＨ
−ｌ５ＦＥＴという）を用いる半導体バイオセンサタイ
プの尿素センサ用の固定化ウレアーゼ膜を製膜する方法
として、従来、スチルバゾリウム基をペンダントとして
持つポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡという）およ
びウレアーゼを含む固定化材料水溶液を用いて光反応を
行う方法が提案されている（宮原、去来、５ｅｕｓｏｒ
ｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ。
−ｌ５ＦＥＴという）を用いる半導体バイオセンサタイ
プの尿素センサ用の固定化ウレアーゼ膜を製膜する方法
として、従来、スチルバゾリウム基をペンダントとして
持つポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡという）およ
びウレアーゼを含む固定化材料水溶液を用いて光反応を
行う方法が提案されている（宮原、去来、５ｅｕｓｏｒ
ｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ。
”４ｅ ＰＰＩ〜１０．１９８５） 。
この方法では固定化材料水溶液は紫外部の光によって３
次元架橋し、ρ１（−ＩＳＦＥＴ上に水に不溶な固定化
ウレアーゼ膜を形成する。この場合、ある１個のＰＶＡ
分子にあるスチルバゾリウム基が、光の照射により他の
ＰＶＡ分子にある同じ反応基と縮合するため、３次元架
橋すると考えられている。
次元架橋し、ρ１（−ＩＳＦＥＴ上に水に不溶な固定化
ウレアーゼ膜を形成する。この場合、ある１個のＰＶＡ
分子にあるスチルバゾリウム基が、光の照射により他の
ＰＶＡ分子にある同じ反応基と縮合するため、３次元架
橋すると考えられている。
しかしながら、このような従来の尿素センサ用固定化ウ
レアーゼ膜の製造方法においては、単位体積あたりのウ
レアーゼの固定化量が低く、感度の低い尿素センサしか
製造できないという問題点があった。
レアーゼ膜の製造方法においては、単位体積あたりのウ
レアーゼの固定化量が低く、感度の低い尿素センサしか
製造できないという問題点があった。
本発明は上記のような問題点を解消するためになされた
もので、固定化ウレアーゼ膜の単位体積あたりのウレア
ーゼ固定量が多く、高感度の尿素センサを得ることが可
能な尿素センサ用固定化ウレアーゼ膜の製造方法を提供
することを目的としている。
もので、固定化ウレアーゼ膜の単位体積あたりのウレア
ーゼ固定量が多く、高感度の尿素センサを得ることが可
能な尿素センサ用固定化ウレアーゼ膜の製造方法を提供
することを目的としている。
本発明の尿素センサ用固定化ウレアーゼ膜の製造方法は
、ポリビニルピロリドン（以下、ｐｖｐという） 、２
．５−ビス（４′−アジド−２′−スルホベンザル）−
シクロペンタノン２ナトリウム塩（以下、ＢＡＳＣとい
う）およびウレアーゼを含む固定化材料水溶液に光照射
して架橋反応を行う方法である。
、ポリビニルピロリドン（以下、ｐｖｐという） 、２
．５−ビス（４′−アジド−２′−スルホベンザル）−
シクロペンタノン２ナトリウム塩（以下、ＢＡＳＣとい
う）およびウレアーゼを含む固定化材料水溶液に光照射
して架橋反応を行う方法である。
ＰｖＰは固定化材料の主剤となるものであって。
分子景１０，０００〜１，０００，０００のものが好ま
しい、またＢＡＳＣは光架橋剤であり、光照射による架
橋反応によって、ＰｖＰを３次元高分子化するものであ
る。
しい、またＢＡＳＣは光架橋剤であり、光照射による架
橋反応によって、ＰｖＰを３次元高分子化するものであ
る。
本発明で用いる固定化材料水溶液は、ＰＶＰ、 ＢＡＳ
Ｃおよびウレアーゼを必須成分として含むものであるが
、このほかに架橋補助剤として牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡという）やポリリジンのようなリジンを多く含
むポリペプチドを含んでいるのが好ましい、ポリリジン
としては分子量 ５，０００〜１００．０００のものが
適している。固定化材料水溶液中の各成分の濃度は、Ｐ
ＶＰ ２〜２０重量％、［１ＡＳＣ０，１〜５重量％、
ウレアーゼ１〜１０重量％、ポリペブチ１１〜１０重量
％程度が好ましい。
Ｃおよびウレアーゼを必須成分として含むものであるが
、このほかに架橋補助剤として牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡという）やポリリジンのようなリジンを多く含
むポリペプチドを含んでいるのが好ましい、ポリリジン
としては分子量 ５，０００〜１００．０００のものが
適している。固定化材料水溶液中の各成分の濃度は、Ｐ
ＶＰ ２〜２０重量％、［１ＡＳＣ０，１〜５重量％、
ウレアーゼ１〜１０重量％、ポリペブチ１１〜１０重量
％程度が好ましい。
架橋反応に用いる照射光としては紫外光が好適である。
ＰＨ−ＩＳＦＥＴを下地電極とした尿素センサに適用
する場合は、ｐＨ−ｌ５Ｆ［！Ｔ上に上記固定化材料水
溶液を塗布して光照射を行い、微細な固定化ウレアーゼ
膜をｐ）Ｉ−ＩＳＦＥＴ上にパターニングすることがで
きる。この場合、パターニングに際して水または２５重
量％以下のグルタルアルデヒド（以下、 ＧＡという）
水溶液を現像剤として用いることができる。
する場合は、ｐＨ−ｌ５Ｆ［！Ｔ上に上記固定化材料水
溶液を塗布して光照射を行い、微細な固定化ウレアーゼ
膜をｐ）Ｉ−ＩＳＦＥＴ上にパターニングすることがで
きる。この場合、パターニングに際して水または２５重
量％以下のグルタルアルデヒド（以下、 ＧＡという）
水溶液を現像剤として用いることができる。
上記固定化材料水溶液に光照射すると、光架橋反応によ
りＰｖＰが３次元高分子化して、その中にウレアーゼが
固定され、固定化ウレアーゼ膜が形成される。この場合
ＢＡＳＣは光反応性が高く、高度に架橋した３次元高分
子が得られるため、単位体積あたりに固定化されるウレ
アーゼの量は増大する。
りＰｖＰが３次元高分子化して、その中にウレアーゼが
固定され、固定化ウレアーゼ膜が形成される。この場合
ＢＡＳＣは光反応性が高く、高度に架橋した３次元高分
子が得られるため、単位体積あたりに固定化されるウレ
アーゼの量は増大する。
以下、本発明の実施例について説明する。各例中、％は
重量％を示す。
重量％を示す。
第１図は固定化ウレアーゼ材料を評価するために用いた
ＰＨ−ＩＳＦＥＴベースの尿素センサの構造を示す斜視
図であり１図において、（１）はｐＨ−ｌ５ＦＥＴチツ
プ、（２）はｐ）Ｉ−ＩＳＦＥＴチップ（１）上に設け
たｐＨ−ｌ５ＦＥＴエレメント、（３）は固定化ウレア
ーゼ膜、（４）は金電極、（５）はエポキシ樹脂板、（
６）はカードエッヂコネクター、（７）はリード線、（
８）はｐＨ−ｌ５ＦＥＴエレメント（２）とリード線（
７）を接続するボンディングワイヤである。
ＰＨ−ＩＳＦＥＴベースの尿素センサの構造を示す斜視
図であり１図において、（１）はｐＨ−ｌ５ＦＥＴチツ
プ、（２）はｐ）Ｉ−ＩＳＦＥＴチップ（１）上に設け
たｐＨ−ｌ５ＦＥＴエレメント、（３）は固定化ウレア
ーゼ膜、（４）は金電極、（５）はエポキシ樹脂板、（
６）はカードエッヂコネクター、（７）はリード線、（
８）はｐＨ−ｌ５ＦＥＴエレメント（２）とリード線（
７）を接続するボンディングワイヤである。
実施例１
分子量３００ 、０００のＰＶＰＩＯ％を含む水溶液を
調製し、それに１％のＢＡＳＣを溶かした水溶液１００
μＱに７．５ｍｇのウレアーゼおよび２ 、５ｍｇのポ
リーＬ−リジン（分子量２５，０００）を溶解させた。
調製し、それに１％のＢＡＳＣを溶かした水溶液１００
μＱに７．５ｍｇのウレアーゼおよび２ 、５ｍｇのポ
リーＬ−リジン（分子量２５，０００）を溶解させた。
このウレアーゼを含む水溶液をスピナーを用いて２．０
０Ｏｒｐｍの速度で第１図のｐＨ４５ＦＥＴチツプ（１
）上に塗布した。その後露光機を用いて紫外部の光を第
１図の右側のｐＨ−ｌ５ＦＥＴエレメント（２）のゲー
ト表面部に照射した。
０Ｏｒｐｍの速度で第１図のｐＨ４５ＦＥＴチツプ（１
）上に塗布した。その後露光機を用いて紫外部の光を第
１図の右側のｐＨ−ｌ５ＦＥＴエレメント（２）のゲー
ト表面部に照射した。
続いてセンサのｐＨ−ｌ５ＦＥＴチツプ（１）部を３％
のＧＡ液に浸漬して現像し、右側のゲート表面部のみに
固定化ウレアーゼ膜（３）を得た。
のＧＡ液に浸漬して現像し、右側のゲート表面部のみに
固定化ウレアーゼ膜（３）を得た。
このようにして作った尿素センサを容積０．４μΩのフ
ローセルに装着した時の応答を第２図に示す。第２図に
おいて、矢印は試料を添加した時間を、曲線に付記した
数字は試料の尿素濃度（ｍｇ／ｄ）を示し、第２図では
試料の尿素濃度として５゜１０、３０．５０ｍｇ／ｄＱ
のものに対する応答が重ねて示されている。第２図か
ら明らかなように、このセンサは尿素に対して高感度の
応答を与えている。
ローセルに装着した時の応答を第２図に示す。第２図に
おいて、矢印は試料を添加した時間を、曲線に付記した
数字は試料の尿素濃度（ｍｇ／ｄ）を示し、第２図では
試料の尿素濃度として５゜１０、３０．５０ｍｇ／ｄＱ
のものに対する応答が重ねて示されている。第２図か
ら明らかなように、このセンサは尿素に対して高感度の
応答を与えている。
またこのセンサは２，０００回の使用に耐えた。第３図
はこのセンサの検量線を示す。
はこのセンサの検量線を示す。
実施例２
実施例１においてポリ−し一リジンの代りに５．０ｍｇ
の［ｌＳＡ を加え、また５％のＧＡ液を現像液として
同様に固定化ウレアーゼ膜（３）をパターニングした。
の［ｌＳＡ を加え、また５％のＧＡ液を現像液として
同様に固定化ウレアーゼ膜（３）をパターニングした。
このようにして作った尿素センサは実施例１の応答量と
ほぼ同程度の応答量を与え、１，０００回以上の使用に
耐えた。
ほぼ同程度の応答量を与え、１，０００回以上の使用に
耐えた。
実施例３
分子量ｓｏ、ｏｏｏのｐｖｐを１５％含む水溶液に、５
％のＢＡＳＣを加え、この水溶液１００μＱに１０ｍ）
Ｈのウレアーゼを加えて、実施例１と同様にスピンコー
ティング、紫外線照射を行った。現像は水に浸漬して行
った。このようにして作った尿素センサは、１００ｍｇ
／准の尿素溶液に対して、約１８ｍＶの応答を与え、繰
返しての使用には約１００回耐度耐えた。
％のＢＡＳＣを加え、この水溶液１００μＱに１０ｍ）
Ｈのウレアーゼを加えて、実施例１と同様にスピンコー
ティング、紫外線照射を行った。現像は水に浸漬して行
った。このようにして作った尿素センサは、１００ｍｇ
／准の尿素溶液に対して、約１８ｍＶの応答を与え、繰
返しての使用には約１００回耐度耐えた。
実施例４
分子１９３０，０００ （７）ＰＶＰ ２％水溶液ニ０
．３％のＲＡＳＣを加え、この水溶液１００μＱに１０
ｍｇのウレアーゼおよび３ｍｇのＢＳＡを溶解させ、実
施例１と同様にスピンコーティングおよび紫外線照射を
行い、現像は１％のＧＡ液を用いた。このようにして得
られた尿素センサの１０ｍｇ／ ｃｌＱ の尿素液に対
する応答は約１６ｍＶで、かつ約１００回の使用に耐え
た。
．３％のＲＡＳＣを加え、この水溶液１００μＱに１０
ｍｇのウレアーゼおよび３ｍｇのＢＳＡを溶解させ、実
施例１と同様にスピンコーティングおよび紫外線照射を
行い、現像は１％のＧＡ液を用いた。このようにして得
られた尿素センサの１０ｍｇ／ ｃｌＱ の尿素液に対
する応答は約１６ｍＶで、かつ約１００回の使用に耐え
た。
実施例５
分子ｆｆ１１５，０００（７）ＰＶＰ２０％水溶液に５
％（７）ＢＡＳＣを加え、この水溶液１００μＱに５ｍ
ｇのウレアーゼおよび分子−１ｉ１００，０００のポリ
ーＬ−リジン５ｍｇを加えた。
％（７）ＢＡＳＣを加え、この水溶液１００μＱに５ｍ
ｇのウレアーゼおよび分子−１ｉ１００，０００のポリ
ーＬ−リジン５ｍｇを加えた。
現像液に１５％のＧＡ液を用いて実施例１と同様に、ｐ
Ｈ−ｌ５ＦＥＴ上に固定化ウレアーゼ膜（３）をパター
ニングした。Ｌｏｎｇ／ｄＱ の尿素に対する応答は約
５ｍＶで、約７００回使用できた。
Ｈ−ｌ５ＦＥＴ上に固定化ウレアーゼ膜（３）をパター
ニングした。Ｌｏｎｇ／ｄＱ の尿素に対する応答は約
５ｍＶで、約７００回使用できた。
実施例６
分子ｆｆ１４５０，０００ （７）ＰＶＰ８％水溶液ニ
ｏ、１％ノｒｌＡｓｃを加えた水溶液１００μΩに、Ｓ
ｔａｇのウレアーゼおよび分子量１０，０００のポリー
Ｌ−リジンを加えた。現会液に２％のＧＡ液を用い、実
施例１と同様にウレアーゼを固定化した。得られた尿素
センサは１０ｍｇ／ｄｌｌの尿素溶液に対し約１１ｍＶ
の応答を与え、繰返し使用には約１００回耐えた。
ｏ、１％ノｒｌＡｓｃを加えた水溶液１００μΩに、Ｓ
ｔａｇのウレアーゼおよび分子量１０，０００のポリー
Ｌ−リジンを加えた。現会液に２％のＧＡ液を用い、実
施例１と同様にウレアーゼを固定化した。得られた尿素
センサは１０ｍｇ／ｄｌｌの尿素溶液に対し約１１ｍＶ
の応答を与え、繰返し使用には約１００回耐えた。
０なお前記実施例１〜６では、２個のｐＨ−ＩＳＦＩＥ
Ｔエレメント（２）をもつｐＨ−ｌ５ＦＥＴチツプ（１
）を用いた例について述べたが、３個以上のｐＨ−ＩＳ
ＦＥＴエレメント（２）をもつものでも同様の効果を奏
する。また１個のＰＨ−ＩＳＦＩＥＴエレメント（２）
シか持たないＰＨ−ＩＳＦＥＴチップ（１）を２個以上
用いてセンサを作ることも当然できるが、この場合には
固定化ウレアーゼ膜（３）のパターニングは不要で、片
方のｐＨ−ｌ５ＦＥＴチツプ（１）全面に固定化ウレア
ーゼ膜（３）−をつけてもよく、同様の効果を奏する。
Ｔエレメント（２）をもつｐＨ−ｌ５ＦＥＴチツプ（１
）を用いた例について述べたが、３個以上のｐＨ−ＩＳ
ＦＥＴエレメント（２）をもつものでも同様の効果を奏
する。また１個のＰＨ−ＩＳＦＩＥＴエレメント（２）
シか持たないＰＨ−ＩＳＦＥＴチップ（１）を２個以上
用いてセンサを作ることも当然できるが、この場合には
固定化ウレアーゼ膜（３）のパターニングは不要で、片
方のｐＨ−ｌ５ＦＥＴチツプ（１）全面に固定化ウレア
ーゼ膜（３）−をつけてもよく、同様の効果を奏する。
以上のように本発明によれば、ＢＡＳＣを加えたＰｖＰ
水溶液をウレアーゼ固定化材料に用いて光照射を行うよ
うにしたので、ウレアーゼの固定化量の多い固定化ウレ
アーゼ膜が得られ、高感度の尿素センサを製作できる効
果がある。
水溶液をウレアーゼ固定化材料に用いて光照射を行うよ
うにしたので、ウレアーゼの固定化量の多い固定化ウレ
アーゼ膜が得られ、高感度の尿素センサを製作できる効
果がある。
第１図は本発明の実施例における尿素センサの構造を示
す九斜視図、第２図は実施例１により製造された尿素セ
ンサの尿素水溶液に対する応答を示す入面線図、第３図
は同尿素センサの検量線図である。 図において、（１）はＰＨ−ＩＳＦＥＴチップ、（２）
はＰＨ−ＩＳＦＥＴエレメント、（３）は固定化ウレア
ーゼ膜、（４）は金電極、（５）はエポキシ樹脂板、（
６）はカードエッヂコネクター、（７）はリード線、（
８）はボンディングワイヤである。
す九斜視図、第２図は実施例１により製造された尿素セ
ンサの尿素水溶液に対する応答を示す入面線図、第３図
は同尿素センサの検量線図である。 図において、（１）はＰＨ−ＩＳＦＥＴチップ、（２）
はＰＨ−ＩＳＦＥＴエレメント、（３）は固定化ウレア
ーゼ膜、（４）は金電極、（５）はエポキシ樹脂板、（
６）はカードエッヂコネクター、（７）はリード線、（
８）はボンディングワイヤである。
Claims (7)
- （１）ポリビニルピロリドン、２，５−ビス（４′−ア
ジド−２′−スルホベンザル）−シクロペンタノン２ナ
トリウム塩およびウレアーゼを含む固定化材料水溶液に
光照射して架橋反応を行うことを特徴とする尿素センサ
用固定化ウレアーゼ膜の製造方法。 - （２）固定化材料水溶液がポリビニルピロリドン２〜２
０重量％、２，５−ビス（４′−アジド−２′−スルホ
ベンザル）−シクロペンタノン２ナトリウム塩０．１〜
５重量％、およびウレアーゼ１〜１０重量％を含むこと
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の尿素センサ用
固定化ウレアーゼ膜の製造方法。 - （３）ポリビニルピロリドンが分子量１０，０００〜１
，０００，０００のものであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項または第２項記載の尿素センサ用固定化
ウレアーゼ膜の製造方法。 - （４）固定化材料水溶液がポリペプチド１〜１０重量％
を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第
３項のいずれかに記載の尿素センサ用固定化ウレアーゼ
膜の製造方法。 - （５）ポリペプチドが牛血清アルブミンまたは分子量５
，０００〜１００，０００のポリリジンであることを特
徴とする特許請求の範囲第４項記載の尿素センサ用固定
化ウレアーゼ膜の製造方法。 - （６）架橋反応が水素イオン感応性電界効果型トランジ
スタを下地電極とし、その上に微細な固定化ウレアーゼ
膜をパターニングするものであることを特徴とする特許
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の尿素
センサ用固定化ウレアーゼ膜の製造方法。 - （７）パターニングが水または２５重量％以下のグルタ
ルアルデヒド水溶液を現像剤として行うものであること
を特徴とする特許請求の範囲第６項記載の尿素センサ用
固定化ウレアーゼ膜の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61108020A JPS62263457A (ja) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | 尿素センサ用固定化ウレア−ゼ膜の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61108020A JPS62263457A (ja) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | 尿素センサ用固定化ウレア−ゼ膜の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62263457A true JPS62263457A (ja) | 1987-11-16 |
Family
ID=14473939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61108020A Pending JPS62263457A (ja) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | 尿素センサ用固定化ウレア−ゼ膜の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62263457A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200051A (en) * | 1988-11-14 | 1993-04-06 | I-Stat Corporation | Wholly microfabricated biosensors and process for the manufacture and use thereof |
| US6306594B1 (en) | 1988-11-14 | 2001-10-23 | I-Stat Corporation | Methods for microdispensing patterened layers |
-
1986
- 1986-05-12 JP JP61108020A patent/JPS62263457A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200051A (en) * | 1988-11-14 | 1993-04-06 | I-Stat Corporation | Wholly microfabricated biosensors and process for the manufacture and use thereof |
| US5837446A (en) * | 1988-11-14 | 1998-11-17 | I-Stat Corporation | Process for the manufacture of wholly microfabricated biosensors |
| US6306594B1 (en) | 1988-11-14 | 2001-10-23 | I-Stat Corporation | Methods for microdispensing patterened layers |
| US7074610B2 (en) | 1988-11-14 | 2006-07-11 | I-Stat Corporation | System and method of microdispensing and arrays of biolayers provided by same |
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