JPS62257064A - ポリペプチドのｎ末端アミノ酸の同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は、ペプチド及びタンパク質を構成する個々のア
ミノ酸を同定し、位置を決定するためにペプチド及びタ
ンパク質のアミノ酸配列順序を化学的に決定する方法に
関する。より詳細には、本発明は古典的なエドマン（Ｅ
ｄｍａｎ）分解法を改良した方法に関する。

〔従来技術およびその問題点〕

タンパク質及びポリペプチドは天然シて存在し、最近で
は合成によってつくられる化合物であって、アミノ酸の
長い鎖から構成されている。タンパク作用をする。タン
パク質の構造と作用に関する研究にはタンパク質のアミ
ノ酸配列順序（−次構造）の決定が必要となる場合が多
い。ソマトスタチン。

インスリン、エンドルフィン等といったタンパク質又は
タンパク質の部分が化学的に又は組換えＤＮＡ法によっ
て合成されるためには、そのタンパク質を構成するアミ
ノ酸の配列順序を決定しないと、合成を行うことは通常
できない。免疫グロブリン、酵素、ウィルス被覆タンパ
ク質及び細胞表面タンパク質といったタンパク質の作用
に関する研究において、タンパク質の作用機序を解明す
るためにはタンパク質又はポリペプチドの一次構造を決
定しなければならない。組換えＤＮＡ法の場合、この−
次構造を決定しないと、これを暗号化するＤＮＡ又はＲ
ＮＡの対応構造を解明することができない。

タンパク質又はポリペプチドにおけるアミノ酸の一次配
列順序は普通、段階的な化学的分解法によって決定され
、その場合、ポリペプチドの末端からアミノ酸がひとつ
ずつ遊離され、同定される。

Ｅｄｍａｎ分解法は好適女方法であるが、その他の方法
も開発されていて、ある場合には使用することができる
。Ｅｄｍａｎ分解法によれば、タンパク質の末端からの
アミノ酸の遊離は、Ｎ末端アミノ酸残基を、この残基を
タンパク質から選択的に遊離させる試薬と反応させるこ
とによって行われる。得られたアミノ酸誘導体は、反応
混合から取り出して同定し得る安定な化合物に変換され
る。

Ｅｄｍａ　ｎが１９５０年代に提案（Ｅｄｍａｎ、Ｐ、
　、ＡｃｔａＣｈｅｍ、５ｅａｎｄ、４，２８３（１９
５０））　　した、ペプチド及びタンパク質の段階的分
解法は過去３５年間はとんど変更されなかった。第１Ａ
図〜第１Ｃ図に示した３段階法は、アルカリ性又は無水
の条件下の溶媒中で、Ｎアミノ酸を含むペプチドのＮ末
端アミノ酸をフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）
とカップリング反応させることを含む（第１Ａ図）。

余剰の試薬（モル比で５００〜１０，０００倍の余剰）
は液液抽出（′通常は多段階で）によって除去され、溶
媒は減圧下で除去される。次いで、Ｎ末端アミノ酸は無
水酸によって切断され、アミン末端アミノ酸のアニリノ
チアゾリノン（ＡＴＺ　）誘導体及び初めのペプチドか
ら末端アミノ酸のとれた、長さくＮ−１）個のアミノ酸
から成る遊離ペプチドの塩が生成される（第１Ｂ図）。

切断用の酸は減圧下で除去され、アミノ酸のＡＴＺ誘導
体は水性相中に残った残留ペプチドから抽出される。次
いで、極めて不安定なＡＴＺアミノ酸は酸水Ｍｌとの反
応によって安定なフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）
アミノ酸に変換される（第１Ｃ図）。短かくなった残留
ペプチド（Ｎ−１個のアミノ酸）はＰＩＴＣで処理され
て、分解の次のサイクルを開始する。得られたＰＴＨ−
アミノ酸はクロマトグラフィーによって同定される。以
上の段階がペプチドの各末端アミノ酸毎に繰り返される
。

液相手操作Ｅｄｍａｎ法 開発の初期段階において、Ｅｄｍａｎ分解法は手操作で
行われた。反応室は試験管又はこれに類似の容器であり
、場合により、特殊な囲いを設けて不活性雰囲気下で試
薬の添加及び除去ができる。試薬は注射器かピペットで
添加され、減圧を用いて、又は溶媒で溶解、即ち、抽出
して除去される。カップリング反応の際、タンパク質又
はペプチドはアルカリ性のカップリング反応用緩衝液に
溶解される。この方法は大きなタンパク質に対しては効
果的ではない。大きなタンパク質がこのような塩基性媒
体に比較的溶けに（いからである。

カップリング反応後にカップリング反応用緩衝液及び望
ましぐない副生物を除去する際に多ぐの問題が生じる。

この方法の１つの問題点は、残留するペプチド誘導体が
乾燥してゴム状フィルムになって、そこから反応副生物
を除去することが困難となるからである。この問題を凍
結乾燥法を用いて軽減する方法がいくつか試みられてい
る。別の大きな問題は不揮発性物質の除去である。とい
うのは、ペプチドのＰＩＴＣ誘導体が、除去されるべき
物質と同じ溶媒に溶解され易く、余剰のＰＩＴＣが残留
するか、試料の損失が生じるからである。

１つの解決法は揮発性試薬を除去し、乾燥ＰＩＴＣ誘導
体及び不揮発性物質を残すことである。次いで、この残
留物は望ましくない材料をＰＩＴＣ−ペプチドよシ容易
に溶解するように選択された１種又は２種以上の溶媒で
洗浄される。しかし、除去されるべき物質は不溶解ＰＩ
’ｌ’Ｃ−ペプチドのマトリックス中に捕獲され易い。

別の解決法は、カップリング反応用緩衝液中に溶解して
いるＰＩＴＣ−ペプチドとその他の物質を、カップリン
グ反応用緩衝液と混合し々い無極性溶媒と共に攪拌する
ことである。無極性溶媒に一層溶は易い物質はこの溶媒
に抽出され、極性の大きいＰＩＴＣ−ペプチドは極性緩
衝液中に溶解したまま残る。無極性溶媒は要素物質を溶
解して、ピペットで取り出せる分離層を形成する。しか
し、この方法はおそらく、無極性溶媒にＰＩＴＣ−ペプ
チドの一部を抽出するであろう。極性溶媒とＰＩＴＣ−
ペプチドの各一部を増り出すことなく、かつ酸素が容器
に入らないようにして抽出溶媒を除去することは実施が
極めて困難である。

前記のＰＩＴＣ−ペプチドカップリング反応法は液相で
実施されるので、最適カップリング反応特性用のカップ
リング反応用緩衝液を選択することかで′ｆ！ｌい。強
塩基はカップリング反応を最も効果的に促進する。しか
し、液相カップリング反応用媒体中に多量の水が存在す
るので、ｐＨレベルはペプチドと試薬の加水分解が起こ
る値以下に制限しなければならない。したがって、カッ
プリング反応を促進する所望の高いｐ）Ｉと、加水分解
的切断反応及び試薬の分解反応を制限する下限のｐＨと
の間の妥協点として約９のｐ）Ｔレベルの媒体が用いら
れる。

切断反応用無水酸はＰＩＴＣ−ペプチドに添加されて切
断反応段階を行い、その後、除去される。

切断反応完了後に蒸発によって除去される揮発性酸が用
いらｎる。その後、ＡＴｚ−アミノ酸誘導体が抽出溶媒
中に分離され、後に残留ペプチドが残る。

多くの場合、これらの抽出は２５ｍｔ程度の少量の物質
？用いて行わねばならない。前に論じた通り、抽出の間
に不特定前の材料が失われる。さらに、手操作による配
列屓序決定法にはかなりの器用さと熟練が必要である。

これらの問題点を克服するために、ペプチドを高分子量
ポリマー（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｓ）に固定化させるか、不
溶性マ）　ＩＪラックス共有結合させ、後述の自動化分
解反応を行うことができる。自動化によりこれまでの多
くの困難は除かれるが、自動化は高価であり、時間がか
かる（１時間当り最高１個のアミノ酸）。

固相手操作１１ｉ：ｄｍａｎ法 前記液相Ｅｄｍａｎ法の変形が５ｃｈｒｏｅｄｅｒ、Ｗ
、Ａ、の“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　１１．４４５（１９６７）”及びＪａｎｔｓｃｈ、
Ｊｒ、の“Ｐｒｏｅ、Ｆｌｒｓｔ　ＩｎｔＺＣｏｎｆ、
　ｏｎＭｅｔｈ、　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ　Ａｎａｌ、　１９３（１９７５）”に記載され
ている。そこでは、タンパク質又はペプチドは長方形紙
片に非化学的に付着され、配列順序決定操作の間、その
紙片上に置かれたままである。固相法と前記の液相法と
の間の大きな違いはカップリング反応用塩基と切断反応
用酸の供給が、密閉容器内の気相の塩基又は酸の静止雰
囲気に長方形紙片をさらすことによって行われることで
ある。

この方法は、反応のために試料を溶解する必要がないの
で、大き々タンパク質及びペプチドの分解には有用であ
る。その代わり、ペプチドは高い希釈度で長方形紙片上
に散布されて広い表面積に薄い被膜を形成する。前記の
系は１サイクルの分解を実施するのに非常に長時間を要
する。この長時間の原因となる要因は気相の試薬が効率
の悪い対流のみによってペプチドに接触することである
。

また、溶媒抽出と乾燥は攪拌、その他の強制循環手段を
用いないで行われる。

この方法の別の欠点はペプチド又はタンパク質の比較的
小さな断片の分解にのみ有効なことである。この非効率
性は機械的及び抽出上の損失並びに反応体を酸化から保
護できないことにかなりの程度起因すると思われる。

この方法の別の欠点は、使用する溶媒を変えないとヒス
チジンとアルギニンを抽出することができず、これらの
溶媒はペプチドも抽出し易いということである。これは
、ペプチドが紙の気孔（ｗｉｎｇｓ）に不完全に固定化
されるためであると考えられる。

回転カップ型配列自動分析装置 タンパク質配列自動分析装置はＥｄｍａｎ　、　Ｐ、と
Ｂｅｇｇ、Ｇ、の“Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１
　、８０　（１９６７）　”及び米国特許第３，７２５
，０１０号に記載されている。このような配列分析装置
により、ＥｄｒｒＩａｎ分解反応は基本的には前記液相
法と同じ方法で行ゎｎる。主な相違点け、反応が回転カ
ップの内面上に形成される被膜内で行われ、液体の除去
がピペットや注射器によってではなく、カップの縁から
の流出によって行われることである。試薬はポンプと弁
から成る系によってカップに添加され、要素物質は前記
の液相手操作Ｅｄｍａｎ法の場合と同様に、減圧蒸発に
よって、又は、無極性溶媒で溶解して、即ち、抽出して
除去される。

試料はカップの内壁上に被膜として維持される。

前記装置の１つの問題点はこの装置が小さなペプチドの
配列分析に無効力なことである。これは、カップ壁面上
の被膜は激しく撹拌さ１すると、余剰の試薬、副生物及
びＡＺＴ−アミノ酸銹導体の取り出しに使用される洗浄
用及び抽出用溶媒に極めて溶解され易くなるためである
。したがって、小さなペプチドはそのような溶媒に溶解
又は懸濁され、配列分析の完了前に回転カップから洗い
出される。

米国特許第３，７２５．０１０号では、蒸発によって除
去できる揮発性のカップリング反応用緩衝液が用いられ
ている。しかし、液体抽出段階がペプチドから多種類の
不揮発性物質を除去するのく用いられる。この段階で、
比較的小さなペプチドがカップから抽出される。

回転カップ法の別の欠点は、タンパク質の乾燥を慎重に
行わないと、薄い被膜を維持することができないことで
ある。したがって、溶媒の蒸発を高真空を直接適用して
行おうとすれば、カップ壁面上の溶液が沸騰し、泡立っ
て、被膜が破壊されることになる。したがって、タンパ
ク質の初期乾燥は減圧の程度をゆるく抑えて行われる。

こうして安定した乾燥被膜が形成された後に、次第に減
圧を大きくして乾燥を完了させる。充分な減圧を用いな
いと、揮発性試薬の一部がカップ上（で残り、これが工
程の別の段階で他の試薬と結合して不溶性の塩を形成し
、この塩が分解反応を妨害するようＫなる。このよう々
過度の乾燥は手間がかかり、全サイクル時間に実質的に
関係してくる。また、系が高精度の減圧装置を必要とす
る。減圧系で揮発する種々の物質がデッドスペースで結
合して固体の塩を形成するので、装置を適切に保守する
ためＫは１回の使用毎に系を浄化することが必要である
。この問題は非常に大きいので、研究者の一部は、米国
特許第３．７２５．０１０号に記載の装置の減圧系を完
全に設計し直す必要を認めている。

回転カップ型配列分析装置の別の欠点は、カップに入れ
る試薬と溶媒を正確に計量して各サイクルのくり返しの
際に同一量が供給されることを確実にする必要があるこ
とである。さもないとカップ内の未反応又は部分反応タ
ンパク質がリング状に形成され、これはそｎ以上反応に
与からないので分解工程に支障を来たす。このような計
量系は複雑であり、保守が困難である。

別の種類の自動配列分析装置がＬａｕｒｓｅｎ　、　Ｒ
。

Ａ、の’　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　２０（
１９７１）　”に記載されている。分解されるべきペプ
チドは、反応室を形成する管状ガラスカラム内に収容さ
れたゲル型固相支持体と共有結合している。試薬と溶媒
はすべて、他の溶媒又は試薬で置換されて反応カラムか
ら除去さ汎る。

この系を前記配列分析法と比較した場合の大きな相違点
は、物質の除去法として蒸発を用いないことである。そ
の代わり、全工程の間中カラムを液体で浸し、て固形支
持体を膨潤した多孔性状態に維持するっ前記Ｌａｕｒｓ
ｅｎの論文が示唆している通り、支持体である膨潤ポリ
マービーズのために、この方法は長さが３０又はそれ以
下の残基数のペプチドの配列分析に限定される。

Ｗａｓｃｈｔｅｒ　、　Ｅ、　、　Ｍａｃｈｌｅｉｄｔ
　、　Ｈ、、Ｈｏｆｎｅｒ　。

Ｈｏ、及び０ｔｔｏ　、　Ｊ、のＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、
　３５．９７（１９７３）では、マクロ細孔ガラス支持
体を用いてタンパク質及びより大きなペプチドの配列分
析を可能としている。前記系の主な欠点は、液体状、菟
のみを用いることである。したがって、ペプチドを固形
支持体へ完全に共有結合させることが不可欠である。そ
の理由は、切断反応用酸がタンパク質及びペプチドの良
溶媒であり、未結合タンパク質又はペプチドを支持体か
ら洗い落とすからである。完全な共有結合が不可欠であ
るという要件のため、ペプチド又はタンパク質のカップ
リング反応効率（約３０〜５０％）が原因でこの方法の
使用頻度は限られている。別の欠点は、ゲル型支持体が
多くの溶媒によって有害な作用を受けるので、支持体へ
のカップリング反応のためにペプチドの溶解にはごく限
られた種類の溶媒しか使用できないことである。ただし
、このゲル型支持体は小さなペプチドを保持するのには
極めて有効である。

ある種の残基は必要なカップリング反応の理由で同定す
ることができない。別の欠点はカップリング反応が長く
、時間のかかる工程であることである。

前記系の別の大きな問題点は、Ａπアミノ酸が切断反応
用酸に易溶性であるので、反応カラムからＯＴ−アミノ
酸を抽出するための溶媒として切断反応用酸を用いれば
ならないことである。切断反応用酸はカラムから望まし
くない物質も抽出し、この物質はヒスチジンとアルギニ
ンの同定を妨害することがある。ＡＴＺ−アミノ酸の溶
媒として切断反応用酸を用いスと左によＡ胃１１のか占
は−ＡＴＺ−アミノ酸を長時間接触させると化学変化を
生じ、この変化によりＡＴＺ−アミノ酸の田誘導体への
変換が妨害されることである。

この系の別の制約は、反応室内の試薬と溶媒のどれも蒸
発によって除去できないので、これらの交換には別の液
体を圧送することに二って行わねばならないことである
。圧送量はカラムの背圧によって制限されるので、この
交換は比較的時間がかかる。

ＰＴＨ−アミノ酸の同定 分解反応によって生ずるＰＴＨ−アミノ酸を検出する各
種の方法が可能となるように、これまで種々のイソチオ
シアネート試薬が調製されてきた。

ＰＴＨ−アミノ酸は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ガスクロマトグラ
フィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ
ィー（ＬＣ）並びに紫外線及びけい光検出を利用した高
速液体り「コマトゲラフイー（ＨＰＬＣ）によって同定
されていた。現在の方法はすべてＨＰＬＣを用いている
。

〔発明の概要〕

液相及び固相でペプチドの配列分析を行う際に経験する
前記の諸困難を克服するために本発明の方法が開発さ几
、この方法では、従来用いられた各液液抽出を固液抽出
によって置き換えた。使用固体は特定の反応機能を付与
して化学変性した結合シリカ吸着剤である。本発明の方
法を開発するために、変性結合シリカ吸着剤とカップリ
ングするように設計された官能基を有する新規なイソチ
オシアネート（ＩＴＣ）試薬を調製した。発明さｎたＩ
ＴＣ試薬及びその合成方法は別の係属中の出願の主題で
ある。

本発明の方法において、一般式Ａ−Ｂ−Ｃを有するイン
チオシアネー）（ＩＴＣ）試薬が使用される。ここで、
Ａは、ホウ酸部分と反応して環化構造（ホウ酸エステル
）を形成するのに使用することができるシス配置又は共
面配置の１−２或いは１−３ジオール又は１−３ヒドロ
キシ第三アミンである。Ｂは、可視光、紫外光、けい光
又は電気化学の各手法によって同定することができる発
色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、発けい先回（ｆｌｕ
ｏｒｏｐｈｏｒ、ｅ）又は起電団（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅ）　　である。Ｃは、ポリペプチドの末端アミノ
酸と反応して尿素結合又はチオ尿素結合を形成するのに
使用することができる化学官能基であって、次の第一ア
ミン反応性種であってよい（これらに限定されるもので
はない）。

Ｓ　　　　　　　　　ＯＳ 本発明の方法の第１段階では、配列分析されるべきポリ
ペプチド又はタンパク質に過剰量のＩＴＣ試薬が、ｌＴ
Ｃ試薬のＣ部分と末端アミノ酸のアミン部分との間の反
応が可能となるアルカリ性条件下で加えらｎる。

余剰のＩＴＣ試薬の抽出は、この余剰の試薬と、脂肪族
末端アミンより反応性の高い芳香族アミンを有する捕集
剤試薬との反応によって行われる。

この捕集剤試薬はまた、固定化有機水銀マ）ＩＪラック
スＰ）ＴｇＯＨ’）との反応によって捕集剤試薬を効果
的に抽出されるようにするメルカプト基を有する。余剰
のＩＴＣ−捕集剤及び捕集剤はＰＨｇＯＨカラム又はス
ラリーに固定化され、反応ＩＴＣ試薬は溶液中に残る。

この残ったＩＴＣ−アミノ酸部分は、このようなＥｄｍ
ａ　ｎ分解反応について当業者には既知の、一般にトリ
フオロ酢酸（ＴＰＡ）を使用する標準条件下で切断され
る。この切断反応に引続いて、得られたＡＴＺ−アミノ
酸と残留ペプチドはカップリング反応用緩衝液中に溶解
さｎ、　ＡＴＺ−アミノ酸は固定化フェニルホウ酸（Ｐ
ＢＡ）　との反応によって抽出される。この反応の最適
条件はカップリング反応の場合と同じである。残留ペプ
チドは固定化ＰＢＡに保持さｎないで、次の分解サイク
ルに入る。

ＡＴＺ−アミノ酸は酸性化によって吸着剤から回収され
る。この酸性化はＡＴＺ−アミノ酸のＰＴＨ−アミノ酸
への変換を容易にし、次いでこのＰＴＨ−アミノ酸がＨ
ＰＬＣといった通常の方法で同定される。

〔詳細な説明〕

本発明は、ペプチド又はタンパク質を、そのＮ末端から
出発して、配列順序を決定する一般系で＄ｌね−巧めで
ノ」ンーＩｌｉｌ＋７−１出公物脣ｆ箸１て右肺〒ム入
一本発明の方法は次の各段階を含む： 合成 ａ）　　ＩＴＣ試薬の合成（第２図）。

ｂ）固定化有機水銀化合物（ＰＨｇＯＨ）の合成。

Ｃ）固定化フェニルホウ酸の合成。

配列１１１ｉ序決定 ｄ）　　ＩＴＣ試薬をポリペプチド又はタンパク質のＮ
末端アミノ酸とカップリングさせる（第３Ａ図）。

Ｃ）第１抽出−余剰ＩＴＣ試薬の除去。

＋１）　　カップリング反応混合物に、Ｈ２Ｎ−（）−
８Ｈの形の捕集剤分子を添加して捕集剤メルカプト化合
物と余剰ＩＴＣ試薬との間に錯体を形成させる（第３Ｂ
図）。

（２）固定化有機水銀剤（ＰＨｇＯＨ）の入ったカラム
に前記段階ｅ（１）の反応混合物を通して余剰捕集剤と
ＩＴＣ−捕集剤錯体をカラムに結合させ、ポリペプチド
−ＩＴＣ錯体がカラム内を保持されないで通過するよう
にする（第３Ｃ図）。

ｆ）切断反応−無水の酸性条件下で、高められた温度で
１〜３０分間（第３Ｄ図）。この反応シでより、ＡＴｚ
−末端アミノ酸部分が残部のペプチド又はタンパク質か
ら遊離される。

ｇ）第２抽出−１，２又は１．３−ジオール或いは類似
の反応性部分をホウ酸と結合させる（第３Ｅ図）固定化
フェニルホウ酸ＣＰＢＡ）の入っだカラムに段階（ｆ）
の反応混合物を通して、ＡＴｚ−アミノ酸と残部のポリ
ペプチドとを分離する。

ｈ）カラムを通過した保持されない残部ポリペプチドを
集め、これに次回のサイクルの分解反応を行う。

ｉ）酸水浴夜中でＰＢＡからＡＴＺ−アミノ酸を遊離さ
せる。

ｊ）　　ＡＴＺ−アミノ酸を安定なＰＴＨ−アミノ酸へ
変換する。

ｋ）ＨＰＬ、Ｃ又はその他の標準法を用いてＰＴ）Ｉ　
−アミノ酸を同定する。

ＩＴＣ試薬 本発明で使用されるＩＴＣ試薬は次の一般式を有するニ −Ｂ−Ｃ （式中、Ａは、アルカリ性又は中性の条件下でホウ酸と
反応するのに使用することができるシス配置又は共面配
置ダの１．２又は１，３−ジオール（−０）ｆ）或いは
１，３ヒドロキシ第三アミン；Ｂは、既知の条件下で検
出可能な発色団、発けい光団又は起電団であり、）（Ｐ
ＬＯ，ＧＣ，ＬＣ等を用いて分離した後に、使用検出法
によってアミノ酸の位置決定及び同定を可能とするのに
使用される；Ｃは、ポリペプチドの末端アミノ酸と反応
して尿素結合又はチオ尿素結合を形成するのに使用する
ことができる化学官能基であって、次の第一アミン反応
性種であってもよいが、これらに限定されるものではな
い： Ｓ　　　　　ＯＳ −Ｎ−Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ−０．−Ｃ−８−Ｒ−及び−Ｃ
−Ｎ）（−Ｃ−８Ｒ。

これらの基は一般式 ％式％） を有する１′Ｆｂ この化合物は有機水銀部分と反応し得る捕集剤−ＩＴＣ
錯体を生じる。）。

有用なＩＴＣ試薬の例として、第２図に示した２、３−
ジヒドロキシマレイミド−４′−フェニルイソチオシア
ネー）　（ＤＨＭＰＩＴＣ）及び下記のものが挙げられ
る： ２．３−ジヒドロキシナフタレンイソチオシアネート： １．８−ジヒドロキシナフタレンインチオシアネー　ト
　； ジヒドロキシマレイミド−４′−アゾベンゼンフェニル
イソチオシアネート； 及び類似の化合物。ある条件下では、工ＴＣ試薬のヒド
ロキシルの１つの代わりに第三アミン部分を使用するこ
とができる。

ＩＴＣ試薬と固定化フェニルホウ酸との反応によって得
られるホウ酸エステルは加水分解に対してかなり不安定
に違いないので、ジオール又は類似の反応性部分とホウ
酸との間の結合は加水分解によって切断され得るため、
ＡＴｚ−アミノ酸をＰＢＡカラムから溶離させることが
できる。

捕集剤分子 本発明で使用される捕集剤分子は余剰のＩＴＣ試薬と反
応し、一般式Ｈ、Ｎ−（）　−ＳＨ（ここで、〔〕は比
較的反応性のないアルキル基、アリール基又はこれらの
誘導体である。）を有する。ＮＨ２基はＩＴＣ試薬のＮ
−Ｃ−８基又は類似の反応性基と反応するように有して
いる。ＳＨ基はＰＨｇＯＨと反応するので、従来技術の
配列分析法における主要な問題点であった余剰のＩＴＣ
試薬を除去することができる。〔〕内の成分は、アミノ
酸に典型的に存在する基と特に反応してはならない。使
用できる捕集剤の例として、Ｈ２Ｎ−フェニル−ＳＨ（
アミノチオフェノール）、Ｈ２Ｎ−フェニル−ＣＨ２Ｓ
Ｈ（メチルメルカプトアニリン）、Ｈ，ＩＮ　−Ｃ’Ｈ
２−ＣＨ，Ｓ）（（システアミン）及びこれらの過ハロ
ゲン化誘導体が挙げらｎる。荷に好適な捕集剤分子はメ
チルメルカプトアニリン及びシステアミンである。

その他の考慮点 配列分析の準備として、ペプチド又はタンパク質に、シ
スティン及び＋１シンの冬側鎖の反応を封塞するように
化学変性を行って、システィンの側鎖と固定化有機水銀
剤との間の交互作用を抑制し、また、リシンの側鎖のア
ミノ基がり注して固定化ホウ酸と交互作用を行うのを抑
制しなければなら々い。

実施例■ ２．３−ジヒドロキルマレイミ）”−４’−７エニルイ
ソチオシアネート（ＤＨＭＰＩＴＣ）の合成（第２図） ジヒドロキシフマル酸永和物３．７２を無水テトラヒド
ロフラン８０ｍｔＫ溶解させる。テトラヒドロフラン５
０ｍｔに１．３−ジシクロへキシルカルボジイミド５，
２２を溶解させた溶液を前記酸溶液に滴々加える。白色
固体の沈殿が生じ、これを溶液からろ別する。無水２，
３−ジヒドロキシマレイン酸を含有した淡黄色の溶液を
直ちに次の通り使用する： テトラヒドロフラン５０ｍｔ中にｔ−ブチルオキシカル
ボニル−１，４−フ二二レンジアミン５．０５’を含有
した溶液を無水２，３−ジヒドロキシマレイン酸の溶液
に滴々加える。濃いオレンジ色の溶液が得られ、この溶
液を約５０℃で４時間加熱する。溶液を室温着で放冷し
た後、蒸発転属させると赤褐色のろう状物質が得られる
。次いで、この粗生成物を、塩酸濃度４Ｎのジオキサン
１５０ｍｔに溶解させ、室温で１時間攪拌する。次に、
この７！８腹に精製窒素ガスを吹き込んで塩酸を追い出
す。

得られた不均一混合物を減圧下で蒸発乾個させると、暗
褐色の固形物が得らｎる。

４’−（２，３−ジヒドロキシマレイミド）アニリン粗
生成物を、濃塩酸２５ｍｔが添加された水２００ｍｔ中
に懸濁させる。得ら九た濃赤色の溶液をチオホスゲン２
．３ｍｔを添加しながら攪拌する。

次いで、反応を室温で３時間行わせる。粗生成物を溶液
からろ別し、０．ＩＮ塩酸で洗浄し、クロロホルムに溶
解し、シリカフラッシュカラムで精製し、クロロホルム
で溶離した。最初の溶離生成物を真９乾燥して２，３−
ジヒドロキシマレイミド−４′−フ二ニルイソチオシア
ネートを得た。収率は６４％であった。赤外線分析の結
果、イソチオシアネートに特徴的な２１００ｆｆｉ　　
に強い吸収があり、隣接ヒドロキシルに特徴的な３４０
０ｃｒｎ　　に吸収があった。

実施例■ Ｎ−フェニル水銀−Ｎ′−プロピルシリル尿素シリカ（
ＰＨｇＯＨ）の合成 平均細孔径６０Ａの４０ｕＭ、規格外（ｉｒｒｅｇｕｌ
ａｒ）アミノプロピルシリカゲル（１，５％Ｎ）を８０
℃で３時間乾燥した後、デシケータ内で室温迄放冷した
。

アミノプロピルシリカゲルＩｆ　当す、Ｎ　、　Ｎ’−
カルボニルジイミダゾール０．８２及びトリエチルアミ
ン０．１３ｍｔを塩化メチレン１０ｍｔに溶解させる。

この反応混合物にアミノプロピルシリカゲルｔ　加え、
室温で３時間攪拌する。この活性化されたシリカゲルを
溶液からろ別し、塩化メチレンで洗浄し、ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳ　Ｏ）で２回洗浄する。次いで、直ち
に活性シリカゲルを酢酸Ｐ−アミノフェニル水銀濃度１
０チのＤＭＳ　Ｏ溶液に加える。活性化シリカゲル１？
当り溶液７ｍｌを用いる。

反応混合物を４０℃で２４時間攪拌する。次いで、この
変性されたシリカゲルをアンモニア飽和ＤＭＳ　Ｏ溶液
にもどし、反応混合物を室温で３時間攪拌する。最後に
、生成物を溶液からろ別し、５０％ＤＭＳ　Ｏ：水、０
．０２Ｎ塩酸、ＩＮ塩化ナトナトリウム浄し、水で２回
洗浄する。次いで生成物を室温に放置して乾燥させる。

実殉例■ Ｎ−フェニルホウ酸−Ｎ′−プロピルシリル尿素シリカ
（ＰＢＡ）の合成 平均細孔径６０Ａの４０ｕＭ規格外アミノプロピルシリ
カゲル（１，５％Ｎ）を８０℃で３時間乾燥した後、デ
シケータ内で室温まで放冷した。アミノプロピルシリカ
ゲル１を当りＮ　、　Ｎ’−カルボニルジイミダゾール
０８ｙ及びトリエチルアミン０．１３ｍｔを塩化メチレ
ン１０ｍｔに溶解させる。反応混合物にアミノプロピル
シリカゲルを加え、室温で３時間攪拌する。活性化され
たシリカゲルを溶液からろ別し、塩化メチレンで洗浄し
、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で２同洗浄する。

次いで、活性シリカゲルを直ちに、９０％ＤＭＳＯ中に
Ｐ−アミノフェニルホウ酸へミサルフエート５憾を溶解
Ｌ　タｇ７夜にζ加える。活呑シリカゲル１２当り溶液
７ｍｔを用いる。反応混合物を４０℃で２４時間攪拌す
る。

この変性シリカゲルをアンモニア飽和ＤＭＳＯｇ液にも
どし、反応混合物を室温で３時間攪拌する。

最後に、生成物を溶液からろ別し、５０４ＤＭＳ０゜７
１（，０，０２Ｎ塩酸、ＩＮ塩化ナトナトリウム浄し、
水で２回洗浄する。次いで、生成物を室温で放置し、乾
燥させる。

実施例■ 配列分析における使用 ２．３−ジヒドロキシマレイミド−４′−フェニルチオ
シアネート（ＤＨＭＰＩＴＣ）（実施例■）をアセトニ
トリルに濃度５％（Ｗ／、）で溶解させた。

アンゼオテンシン１ペプチド５０Ｘ１０−９モルを固相
配列分析用緩衝液（ピリジン：Ｎ−メチルモルホリント
リフルオロ酢酸＝３：２、Ｉ）　Ｈ８，２）　２００μ
ｔに溶解させ、１ｒｒＬｔの反応容器に移した。

ＤＩ（ＭＰＴＩＣ溶液２０μＬを加えた。、容器を窒素
で掃気し、５０℃で１５分間加熱した。次いで５％（ｖ
／ｖ）メチルメルカプトアニＩＪン＠液５０μノを反応
容器に加え、さらに１５分間加熱を続けた。次に、容器
をヒーターから外し、内容物を減圧下、５０℃で１０分
間乾燥した。

内径４１で、１００ｍｒのＮ−フニニル水銀−Ｙ−プロ
ビルシリル尿素シリカ（ＰＨｇＯＨ）（実姉例■）ノカ
ラノ、を、メタノール、水及び酢酸トリメチルアンモニ
ウム緩衝ａ　（ｐＨ６Ｂ）　２００ｍ／−で洗浄して調
製した。反応容器内の乾燥内容物を酢酸トリメチルアン
モニウム（ｐＨ６，８）　ニジオキサン＝３：２の１１
９−＠ｒｅ　５００ｍｔに溶解させＰＨｇＯＨカラムに
通した。カラムをアスピレータ−によって脱Ｑ（ｅｌｕ
ｔｅ）し、さらに前記緩衝液５００μｔで洗浄し、た。

流出液を合わせ、減圧下、５０℃で３０分間乾燥した。

ＤＨＭＰＩＴＣとメチルメルカプトアニリンとを含ｉず
、２．３−ジヒドロキシ−マレイミド−４′−フェニル
チオカルバモイルペプチドを含有した反応容器内の乾燥
残留物に、無水トリフルオロ酢酸２５０ｍ／＝を加え、
容器を５０℃で１０分間加熱した。次いで、容器の内容
物を減圧下、５０℃で１０分間乾燥した。

内径４１で、１００ｍ５’のＮ−フェニルホウ酸−Ｎ′
−プロどルンリル尿素シリカ（ＰＢＡ’）　　（実施例
■）のカラムをメタノール、水及びトリエチル酢酸アン
モニウム援ｉ液（ｐＨ８，２）　５０　ｍｔで洗浄して
調製した。反応容器内の乾燥内容物を酢酸トリエチルア
ンモニウム（ｐ）Ｉ８．２）ニアセトニトリル＝１：１
の緩衝液５００ｍｔに溶解させ、ＰＢＡカラムに通した
。アスピレータ−を用いてカラムから残留ペプチドを溶
離（ｅｌｕｔｅ）させ、カラムをさらに前記緩＠液５０
０ｒｎｔで洗浄した。流出液を合わせ、減圧下で乾燥し
、次回の配列分析サイクルを行った。

２　、３−ジヒドロキシマレイミド−４′−アニリノチ
アゾリノンアミノ酸を、アセトニトリル：水：トリフル
オ【コ酢酸＝５：３：２の液５００ｍｔでＰＢＡカラム
から溶離させ、８５℃で１５時間加熱して対応するフェ
ニルチオヒダントインへの環化を行った。

得られた２、３−ジヒドロキシ−４′−フェニルチオヒ
ダントインを、４．６ｘ１５ＱＩＩｍ　のオクタデシル
カラムの逆相高速液体クロマトグラフィーＣＦＩＰＬＣ
）によって同定した。ＤＨＭＰＴＨアミノ酸に関連した
保持時間を、０．１５％（ｖ／ｖ）　）　＋）フルオロ
酢酸の水性緩衝液にアセトニトリル（４０チ（ｖ／ｖ　
）まで）を加えて傾斜溶離法によって測定した。けい光
検出法を紫外線検出法と関連させて用いた。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図〜第１Ｃ図は従来のＥｄｍａｎ分解反応を示し
、第１Ａ図はＰＩＴＣをペプチドとカップリング反応さ
せる段階を示し、第１Ｂ図はペプチドからＮ末端アミノ
酸錯体（ＡＴＺ−アミノ酸）を切断する段階を示し、＄
ＩＣ図はＡＴＺ−アミノ酸のＰＴＨアミノ酸への変換を
゛示す。 第２図はＩＴＣ試薬（ＤＨＭＰＩＴＣ）の合成の各段階
を示す。 第３Ａ図〜第３Ｆ図は本発明の方法を用いてペプチドの
配列分析を行う１サイクルを示すもので、ＷｄＡ図はＩ
ＴＣ試薬とペプチドとのカップリング反応を示し、第３
Ｂ図は余！ＰｌＩ　ＩＴＣ試薬を抽出用捕集剤分子へ結
合させる反応を示し、第３Ｃ図は固定化Ｐ）ｉｇＯ）Ｉ
を用いて余剰ＩＴＣ試薬−捕集剤錯体を抽出する反応を
示し、第３Ｄ図はＩＴＣ試薬−ペプチド錯体をＡＴＺ−
アミノ酸と短いペプチドへ切断する反応を示し、第３Ｅ
図は固定化ＰＢＡカラムでＡＴＺ−アミノ酸を抽出する
反応を示し、第３Ｆ図はＡＴＺ−アミノ酸のＰＴＨアミ
ノ酸への変換反応を示す。 特許出願人　　　アナリテイケム・インターナショナル
・インコーホレーテッド 代理人　山川政樹（ｅす１２名） ＦＩＧ、　ＩＡ ＦＩＧ、　ＩＢ ＡＴＺ−７ξノ緘 ８本

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を同定する方法で
   あつて、 ａ）一般式： Ａ−Ｂ−Ｃ （ここで、Ａ部分はシス−又は共面配置の１−２又は１
   −３ジオール或いは１−３ヒドロキシ第三アミン、Ｂ部
   分は可視光、紫外光、けい光又は電気化学の各手法によ
   つて同定することができる発色団、発けい光団又は起電
   団、Ｃ部分はポリペプチドの末端アミノ酸と反応して尿
   素結合又はチオ尿素結合を形成する官能基である。） を有するイソチオシアネート又はその誘導体を含むカッ
   プリング反応試薬を準備すること； ｂ）前記末端アミノ酸を前記反応試薬の前記Ｃ部分とカ
   ップリング反応させること； ｃ）余剰の反応試薬を除去すること； ｄ）前記反応試薬−末端アミノ酸錯体を前記ポリペプチ
   ドの残部から切断すること； ｅ）前記反応試薬−末端アミノ酸錯体と前記ポリペプチ
   ドの残部とを分離すること； ｆ）前記反応試薬−末端アミノ酸錯体を安定な化合物に
   変換させること； ｇ）前記の変換した末端アミノ酸を同定すること の各段階を含むポリペプチドのＮ末端アミノ酸の同定方
   法。
2. （２）段階ｆ）で得られる前記ポリペプチドの残部につ
   いてａ）〜ｇ）の各段階を、繰り返し、各サイクル毎に
   残部ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を同定することによ
   つてポリペプチド又はタンパク質の配列順序の決定を行
   うことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）段階ｃ）が、 （ｉ）段階ｂ）の反応混合物と式： Ｈ＿２Ｎ−〔　〕−ＳＨ （ここで、〔　〕はアルキル、アリール又は過ハロゲン
   化アルキルアリールを表わす。） を有する捕集剤分子との反応混合物を、前記Ｈ＿２Ｎ部
   分と前記余剰反応試薬の前記Ｃ部分との間の反応に好適
   な条件下で反応させること； （ｉｉ）段階（ｉ）の生成物を固定化有機水銀剤と混合
   して、余剰捕集剤分子と捕集剤分子−反応試薬錯体とを
   結合させること； （ｉｉｉ）非固定化反応試薬−ポリペプチド錯体を除去
   すること の各段階を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
4. （４）捕集剤が、Ｈ＿２Ｎ−フェニル−ＳＨ、Ｈ＿２Ｎ
   −フェニル−ＣＨ＿２ＳＨ、Ｈ＿２Ｎ−ＣＨ＿２−ＣＨ
   ＿２ＳＨ及びこれらの過ハロゲン化誘導体から成る群か
   ら選択される特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）前記捕集剤がメチルメルカプトアニリンである特
   許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）前記固定化有機水銀剤が、固定化シリカゲルに結
   合された水酸化フェニル水銀である特許請求の範囲第３
   項記載の方法。
7. （７）段階ｅ）において、段階ｄ）の反応混合物と固定
   化ホウ酸とを混合し、非固定化物質を除去することを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）前記固定化ホウ酸が、シリカゲルに結合されたフ
   ェニルホウ酸である特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）前記段階ｅ）（ｉｉｉ）が、前記固定化ホウ酸を
   酸水溶液で処理して前記反応試薬−アミノ酸錯体を固定
   化ホウ酸から除去することを含むことを特徴とする特許
   請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）前記有機水銀剤マトリックスをカラム内に配置
    されている特許請求の範囲第３項〜第６項のいずれか１
    項に記載の方法。
11. （１１）前記固定化ホウ酸がカラム内に配置されている
    特許請求の範囲第７項〜第９項のいずれか１項に記載の
    方法。
12. （１２）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を同定する方法
    であつて、 ａ）２，３−ジヒドロキシマレイミド−４′−フェニル
    イソチオシアネート（ＤＨＭＰＩＴＣ）を得ること； ｂ）前記ポリペプチドの前記末端アミノ酸を前記ＤＨＭ
    ＰＩＴＣとカップリング反応させること；ｃ）前記段階
    ｂ）の反応混合物にメチルメルカプトアニリンを加える
    こと； ｄ）Ｎ−フェニルホウ酸−Ｎ−プロピルシリル尿素（Ｐ
    ＢＡ）を収容したカラムで前記ｃ）の反応混合物の溶離
    を行うこと； ｅ）無水の酸性条件下で段階ｄ）の流出液を分解するこ
    と； ｆ）Ｎ−フェニルホウ酸−Ｎ′−プロピルシリル尿素（
    ＰＢＡ）を収容したカラムに段階ｅ）の反応混合物を加
    えること； ｇ）水性の酸性条件下で前記ＰＢＡカラムから段階ｆ）
    の固定化生成物を溶離させること； ｈ）段階ｇ）で得られた流出液を安定なフェニルヒダン
    トインアミノ酸誘導体に変換すること；ｉ）段階ｈ）の
    生成物を同定すること、 の各段階を含むポリペプチドのＮ末端アミノ酸の同定方
    法。
13. （１３）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を同定する方法
    であつて、 ａ）一般式： Ａ−Ｂ−Ｃ （ここで、Ａ部分はシス−又は共面配置の１−２又は１
    −３ジオール或いは１−３ヒドロキシ第三アミン、Ｂ部
    分は可視光、紫外光、けい光又は電気化学の各手法によ
    つて同定することができる発色団、発けい光団又は起電
    団、Ｃ部分はポリペプチドの末端アミノ酸と反応して尿
    素結合又はチオ尿素結合を形成する官能基である。） を有するイソチオシアネート又はその誘導体を含むカッ
    プリング反応試薬を準備すること； ｂ）カップリング反応試薬のＣ部分がポリペプチドのＮ
    末端アミノ酸と反応してカップリング反応試薬−ポリペ
    プチド錯体を形成するようにポリペプチド試料をカップ
    リング反応試薬と接触させることによつて反応混合物を
    形成すること；ｃ）余剰のカップリング反応試薬を捕集
    剤分子と反応させて捕集剤分子錯体を形成することによ
    つて反応混合物から余剰のカップリング試薬を除去する
    こと； ｄ）反応混合物を第１固定化試薬と接触させて、この試
    薬に余剰の捕集剤分子及び捕集剤分子錯体を結合させか
    つカップリング反応試薬−ポリペプチド錯体を第１固定
    化試薬との接触からはずすこと； ｅ）カップリング反応試薬−ポリペプチド錯体を切断し
    て、カップリング反応試薬及びポリペプチドのＮ末端ア
    ミノ酸を含む錯体と、切断ポリペプチドとの混合物を形
    成すること； ｆ）この混合を、カップリング反応試薬のＡ部分と反応
    する第２固定化試薬と接触させて、これにカップリング
    反応試薬−Ｎ末端アミノ酸錯体を結合させ、切断ポリペ
    プチドを第２固定化試薬との接触からはずすことによつ
    て、切断ポリペプチドと反応試薬−Ｎ末端アミノ酸錯体
    とを分離すること； ｇ）反応試薬−Ｎ末端アミノ酸を安定な化合物に変換す
    ること； ｈ）段階ｆ）で生成した安定な化合物を同定すること の各段階を含むポリペプチドのＮ末端アミノ酸の同定方
    法。
14. （１４）段階ｅ）で得られた切断ポリペプチドについて
    ａ）〜ｈ）の各段階を繰り返してポリペプチドの配列順
    序の決定を行うことを特徴とする特許請求の範囲第１３
    項記載の方法。
15. （１５）捕集剤分子が式Ｈ＿２Ｎ−〔　〕−ＳＨ（ここ
    で、〔　〕はアルキル基、アリール基又はこれらの過ハ
    ロゲン化誘導体である。）を有し、第１固定化試薬が固
    定化有機水銀剤であり、捕集剤分子錯体が、捕集剤分子
    のＮＨ＿２部分と余剰の反応試薬のＣ部分との間の反応
    によつて形成される特許請求の範囲第１３項記載の方法
    。
16. （１６）捕集剤分子が、Ｈ＿２Ｎ−フェニル−ＳＨ、Ｈ
    ＿２Ｎ−フェニル−ＣＨ＿２ＳＨ、Ｈ＿２Ｎ−ＣＨ＿２
    −ＣＨ＿２ＳＨ及びこれらの過ハロゲン化誘導体から成
    る群から選択される特許請求の範囲第１５項記載の方法
    。
17. （１７）捕集剤分子がメチルメルカプトアニリンである
    特許請求の範囲第１６項記載の方法。
18. （１８）固定化有機水銀剤が、シリカゲルに結合された
    水酸化フェニル水銀である特許請求の範囲第１５項記載
    の方法。
19. （１９）第２固定化試薬が固定化ホウ酸である特許請求
    の範囲第１３項記載の方法。
20. （２０）固定化ホウ酸が、シリカゲルに結合されたフェ
    ニルホウ酸である特許請求の範囲第１９項記載の方法。
21. （２１）段階ｅ）が、固定化ホウ酸を酸水溶液で処理し
    て、固定化ホウ酸から固定カップリング反応試薬−Ｎ末
    端アミノ酸錯体を遊離させることをさらに含む特許請求
    の範囲第２０項記載の方法。
22. （２２）固定化有機水銀剤がカラム内に配置されている
    特許請求の範囲第１５項〜第１８項のいずれか１項に記
    載の方法。
23. （２３）固定化ホウ酸がカラム内に配置されている特許
    請求の範囲第１９項〜第２１項のいずれか１項に記載の
    方法。
24. （２４）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を同定する方法
    であつて、 ａ）２，３−ジヒドロキシマレイミド−４′−フェニル
    イソチオシアネート（ＤＨＭＰＩＴＣ）を含むカップリ
    ング反応試薬を準備すること； ｂ）カップリング反応試薬のイソチオシアネート部分が
    ポリペプチドのＮ末端アミノ酸と反応してカップリング
    反応試薬−ポリペプチド錯体を形成するようにポリペプ
    チド試料とカップリング反応試薬とを接触させることに
    よつて反応混合物を形成すること； ｃ）余剰のカップリング反応試薬がメチルメルカプトア
    ニリンと反応して捕集剤錯体を形成するようにメチルメ
    ルカプトアニリンを反応混合物に加えること； ｄ）段階ｃ）の反応混合物をＮ−フェニル水銀−Ｎ−プ
    ロピルシリル尿素シリカの入つたカラムで溶離を行つて
    、これに余剰のメチルメルカプトアニリン及び捕集剤分
    子錯体を結合させ、カップリング反応試薬−ポリペプチ
    ド錯体を含有した流出液を得ること； ｅ）段階ｄの流出液中のカップリング反応試薬−ポリペ
    プチド錯体を無水の酸性条件下で切断して、切断ポリペ
    プチドと、カップリング反応試薬及びポリペプチドのＮ
    末端アミノ酸を含む錯体との混合物を形成すること； ｆ）段階ｅの混合物をＮ−フェニルホウ酸−Ｎ′−プロ
    ピルシリル尿素シリカ（ＰＢＡ）で溶離を行つて、これ
    にカップリング反応試薬−Ｎ末端アミノ酸錯体を結合さ
    せ、切断ポリペプチドを含有した流出液を得ること； ｇ）結合したカップリング反応試薬−Ｎ末端アミノ酸錯
    体をＰＢＡの入つたカラムから水性の酸性条件下で溶離
    してカップリング反応試薬−Ｎ末端アミノ酸錯体を含有
    した流出液を得ること；ｈ）段階ｇの流出液中のカップ
    リング反応試薬−Ｎ末端アミノ酸錯体を安定なフェニル
    ヒダントインアミノ酸誘導体に変換すること； 及び ｉ）段階ｈで生成した安定なフェニルヒダントインアミ
    ノ酸誘導体を同定すること の各段階を含むポリペプチドのＮ末端アミノ酸の同定方
    法。