JPS62240643A

JPS62240643A - 補酵素ｑの精製方法

Info

Publication number: JPS62240643A
Application number: JP8227686A
Authority: JP
Inventors: Shiro Kajiyama; 梶山　士郎; Tadashi Iino; 正飯野; Tokuo Matsuda; 松田　徳夫; Iwao Terao; 巖寺尾
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1986-04-11
Publication date: 1987-10-21
Also published as: JPH0578538B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は補酵素Ｑの精製方法に関するものであり、さら
に詳しくは、互いに直列に接続された複数の吸着カラム
クロマトを使用することにより大量の粗製補酵素Ｑを精
−裏する新規な方法を提供するものである。

補酵素Ｑは生体内では末端呼吸系の電子伝達系に関与し
、重症筋無力症および肺気腫などの各種の疾病に対して
優れた薬理効果を示す有用な物質である。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点］補酵素Ｑは合成または微生物菌体もしくは天然物からの
抽出などの方法により得られるが、これらの方法により
得られた粗製補酵素Ｑは補酵素Ｑとともに多くの不純物
を含み純度がきわめて低いものである。補酵素Ｑを医薬
などとして使用するときには、この補酵素Ｑは極めて高
い純度であることが必要とされているが、そのため工業
的に優れた精製方法が要求される。

ここで工業的に優れた精製方法とは精製された補酵素Ｑ
（以下精製補酵素Ｑと記す）の純度が高く、かつ、単位
精製補酵素Ｑ当りの吸着カラムクロマトに使用する充填
剤使用ｔ（９−充填剤／ｇ−精製補酵素Ｑ）及び溶媒使
用量（ｌ−溶媒／ｇ−精製補酵素Ｑ）が少ない精製方法
である。

粗製補酵素Ｑから吸着カラムクロマトグラフィにより精
製補酵素Ｑを得るには、以下に示す様な多くの方法が知
られている。すなわち、充填剤として無機吸着担体を用
いる方法があり、担体としてシリカゲルを使用する方法
には、たとえば特開昭５４−５２７９０号、特開昭５７
−１８９８８号、特開昭５９−３３３５４号、特公昭５
Ｂ−５３９１７号、特公昭５９−２６２７３号、特公昭
５７−２１３０９号および特開昭５６−１０９４１号な
どに記載されている方法が知られている。一方、担体と
してフロリジルを使用する方法には、たとえば、特開昭
５４−１１０３８９号、特公昭５８−１２２６６号およ
び特開昭５４−１２２７９５号に記載されている方法が
あり、また、担体としてアルミナを使用する方法として
は、たとえば、特開昭５９−４５８９４号に記載されて
いる方法など極めて多数の方法がある。

これらの無機吸着担体を用いた精製方法はすべて一本の
カラムを用いたクロマトグラフィーである。

また無機吸着担体を用いた方法で純度の高い精製補酵素
Ｑを収得しようとする場合には、回収率（精製補酵素Ｑ
／粗製補酵素Ｑ）が極端に低く、単位精製補酵素Ｑ当り
の充填剤使用量及び溶媒使用量を多量にしなければなら
ないのが一般である。従って、工業規模での精製のため
には精製装置を大規模とする必要があるが、大規模化す
る場合にはカラム内での溶媒の局部的な偏流、混合、粗
製補酵素Ｑの拡散問題等があり、吸着カラムクロマトグ
ラフィの性質上、大規模化が非常に困難である。

また、充填剤として多孔性合成樹脂を用いる方法がある
。すなわち非極性の多孔性合成樹脂を使い、使用溶媒と
して極性溶媒を用いる吸着カラムクロマトとしては、た
とえば、特開昭５５−３９７０１号、特開昭５６−１２
ｊ４９０号、ｆ？開昭５７−２６８６号、特公昭５７−
６９１０号、特公昭５９−５０６４８号などがあり、ま
た、極性の多孔性合成樹脂および非極性溶媒を用いる吸
着カラムクロマトとしては、たとえば特公昭５７−１１
３０２号などが知られているが、前記の無機吸着単体を
使用したときと同様の理由−こより工業規模での純度の
高い精製補酵素Ｑを収得することが困難であり、そのう
え多孔性合成樹脂を用いた吸着カラムクロマトグラフィ
の性質上、純度の高い精製補酵素Ｑを高回収率で収得す
るためには、吸着カラムクロマトグラフィに引続いてさ
らに無機吸着担体を用いた吸着カラムクロマトおよび再
結晶化などの精製が必要である。

本発明の目的は、従来の吸着カラムクロマトグラフィに
よる粗製補酵素Ｑの精製は大規模化に不適であることお
よびこの精製だけでは通常は満足すべき程十分番こ高い
純度の補酵素Ｑが得られないとの問題点を解決しうる補
酵素Ｑの精製方法を提供するにある。

〔問題を解決するための手段、作用〕

本発明者らは、吸着カラムクロマトグラフィによる方法
であり゛ながら、工業規模での精製が可能であり、さら
に後処理をしなくても十分に純度の高い補酵素Ｑを得る
ために鋭意研究を重ねた結果１本発明に到達した。

すなわち、本発明は、粗製補酵素Ｑを吸着カラムクロマ
トグラフィで精製するに際し、互いに直列に接続された
複数のカラムを使用し、粗製補酵素Ｑ溶液を該カラムへ
順次通過させて粗製補酵素Ｑ溶液中の不純物含有量を順
次低下させ、最終カラムから主成分が補酵素Ｑである区
分を回収することを特徴とする補酵素Ｑの精製法である
。

本発明の粗製補酵素Ｑとは、補酵素Ｑ　−Ｑの少なくと
も１種とともに、１種あるいは多種類の不純物を多量に
含有する補酵素Ｑ含有物そのもの、または予め抽出、濃
縮およびまたは結晶化などのそれ自体公知の精製を経た
ものである。補酵素Ｑ含有物は、その製法および由来に
は特に制限はなく、具体的には、たとえば、微生物菌体
、動物臓器および血合肉などの生物体からの抽出物なら
びに合成により得られた反応生成物またはその濃縮物な
どが挙げられる。

本発明において粗製補酵素Ｑは溶液となして互いに直列
に接続された複数のカラムを順次通過させることにより
、その中の不純物の含有量は順次低下させられるが、そ
のための手段として、（イ）各カラムの塔底から不純物
を順次排出するとともに他の不純物をそれぞれのカラム
に順次滞留させる手段、１０）各カラムξこ不純物をカ
ラムに順次滞留させる手段、などがある。前者（イ）が
好ましい。

本発明を図面によって具体的に説明する。この説明に使
用される粗製補酵素Ｑは第１図に示したような溶出パタ
ーンを有するものとする。

すなわち、この粗製補酵素Ｑの主成分は補酵素Ｑであり
、補酵素Ｑよりも早く時間の経過に伴って順次溶出され
る不純物Ｘ　　、Ｘ　　およびｘ３と、補酵素Ｑよりも
遅く時間の経過に伴って順次溶出される不純物Ｘ４　ｓ
　１Ｂおよびｘ６を含有している。しかして補酵素Ｑと
各不純物とは、いずれもその曲線は長く裾をひき、各成
分は載然と区分されることはなく常に少量乃至微量の他
の成分を互いに含有する。

本発明のために使用される精製装置のフローシートの例
を第２図に示す。すなわち、この装置は第１カラム　１
、第２カラム　２および第３カラム　３の５本のカラム
を有している。各カラムの塔頂にはそれぞれ第１塔頂管
４、＠２塔頂管５および第３塔頂管６がある。これらの
塔頂管は第１塔頂管４から分岐した塔頂連絡管７ｊＣよ
って互いに接続されている。また、これらの塔頂管には
それぞれ第１塔頂弁８、第２塔頂弁９および第３塔頂弁
１０が設けられている。

また、各カラムの塔底にはそれぞれ第１塔底管１１、第
２塔底管１２および第３塔底管１′５がある。各塔底管
にはそれぞれ第１塔底弁１４、第２塔底弁１５および第
３塔底弁１６が設けられている。また、各塔底管には各
カラムの塔底と各塔底弁との間にそれぞれ第１検出器１
７、第２検出器１８および第３検出器１９が設けられて
いる。第１塔底管１１の＠１塔底弁１４と第１検出器１
７との間の２部分と、第２塔頂管５の第２カラム２の塔
頂と第２塔頂弁９きの間の部分とは第１連絡管２０で連
絡され、以って第１カラム１と第２カラム２とは互いに
直列に接ている。各連絡管にはそれぞれ第１連絡弁２２
および第２連絡弁２３が設けられている。第１カラム１
の塔頂には供給管２４が設けられている。なお各カラム
の塔底の検出器としては、たとえば紫外線吸収測定器（
■ＩＶモニター）および赤外線吸収測定器などをそれぞ
れ使用することができる。またこれらの測定器にかえて
、予め実験的に求められたタイムスケジュールによって
弁を開閉させることもできる。

この装置を使用して、粗製補酵素Ｑ中の不純物を各カラ
ムの塔底から順次排出させる七ともに他の不純物をそれ
ぞれのカラムに残留させて除去するための操作（イ）に
ついてまず説明する。

すなわち、溶媒に粗製補酵素Ｑを溶解させた溶液を供給
管２４から第１カラム１に供給し、各成分を展開させ第
１カラム１内の充填剤に吸着させる。次いで、第１塔底
弁１４から液を系外へ排出させながら第１塔頂管４から
溶媒を注下して、主成分が不純物Ｘ　である区分を第１
カラム１から第１塔底弁１４を経て系外に排出させる。

第１カラム１からのこの排出液の補酵素Ｑが＊１検出器
１７で検出された時点でたゾちに第１塔底弁１４を閉め
第１連絡弁２２を開は第１カラム１からの排出液を第１
連絡管２ｏを経由して第２カラム２へ移行させる。この
際、第１検出器１７で不純物ｘ６　が検出されはじめた
時に速やかに第１連絡弁２２を閉めて第２カラム２に移
行しないうちに主成分が不純物ｘ６　である区分を第１
カラム１に残留させる。第２カラム２では、前記第１カ
ラム１におけると同様に各成分は展開せしめられ吸着さ
れ、ついで、第２塔頂弁９を開は第２塔頂管５から溶媒
を注下して主成分が不純物ｘ２　である区分を第２塔底
弁１５から系外に排出させる。

第２検出器１８で第２カラム２からの排出液中の補酵素
Ｑが検出された時点で前記のようにこの排出液を第３カ
ラム３に移行させ、一方、主成分が不純物Ｘ５　である
区分は第２カラム２に残留せしめられる。第３カラム３
でも第１カラム１および第２カラム２におけると同様Ｉ
こ、各成分の展開、分離および溶出が行われ、第３カラ
ム３の第３塔底弁１６から不純物Ｘ３．補酵素Ｑおよび
不純物ｘ４　　のそれぞれを主成分とする各区分が順次
排出される。この排出液中の補酵素Ｑを第３検出器１９
によって検出し、主・成分が補酵ｆｉＱである区分を回
収する。各カラムに残留せしめられた主成分が不純物で
ある区分を溶媒で洗い出し各カラムの充填剤は再生され
、各カラムは再度、吸着カラムクロマトグラフィに供さ
れる。各カラムでの各成分の展開吸着、溶出および不純
物の洗い出しの時間を適宜組合わせるーたとえば第１カ
ラム１での不純物の洗い出しと併行して、第２カラム２
では各成分の展開、吸着、第３カラム３では少量の残存
不純物の洗い出しを行なう−ことにより各カラムの遊び
時間を削減し各カラムを有効に利用することができる。

次に、この装置を使用して粗製補酵素Ｑ中の不純物を各
カラムに残留させて除去するための操作１口）について
説明する。すなわち、溶媒に粗製補酵素Ｑを溶解させた
溶液を供給管２４から第１カラム１に供給する。ついで
第１塔頂管４から溶媒を供給し、第１塔頂弁８、第１連
絡弁２２、ｔａ２連ＪＩＰ２３＃よび第１Ｆ底弁１　ｇ
をそれぞれ開は他の弁を閉め、前記の溶媒を第１カラム
１、第１連絡管２０、第２カラム２、第各成分は各カラ
ム内に展開せしめられ吸着される。第１カラム１からの
排出液中の補酵素Ｑの殆ど全量が第１カラム１から排出
され、第１検出器１７で第１カラム１からの排出液中の
補酵素Ｑがほとんど検出されなくなり、かつ、不純物ｘ
６　が検出されはじめた時に第１連絡弁２２を閉めて、
第１カラム１内に主成分が不純物ｘ６である区分を残留
させ、一方、第２塔頂弁９をに移行せしめられる。第２
検出器１８で第２カラム２からの排出液中の補酵素Ｑが
ほとんど検出されなくなり、かつ、不純物Ｘ、が検出さ
れはじめた時に第２連絡弁２３を閉めて、第２カラム２
内に主成分が不純物５である区分を残留させ、一方、第
３塔頂弁１０を開は第３塔頂管６から溶媒を注下し、第
３塔底弁１６を開けて第３カラム３から排出液を系外に
流出させる。

この排出液には不純物Ｘ４、Ｘ２　ｓ　Ｗ３　、補酵素
Ｑおよび不純物ｘ４　　をそれぞれ主成分とする区分が
、この頴序で逐次排出され、第３検出器１′９で主成分
が補酵素Ｑである区分を検出し７、回収する。第１カラ
ム１および第２カラム２のそれぞれに残留せ【７められ
た不純物ｘ６　および不純物Ｘ５　　のそれぞれを主成
分とする区分および第３カラム３に残留した少量の不純
物ｘ４　を主成分とする区分は、各カラムに溶媒を流下
させて充填剤を洗浄すること−こより除去され、各カラ
ム内の充填剤は再生され、各カラムは再度、吸着カラム
クロマトグラフィに供され、また、各カラムの操作を適
宜組合わせることにより各カラムを遊ばせることなく有
効に利用することができるのは前記の操作ｆイ）におけ
ると同様である。

本発明で使用される充填剤には特に制限はなく、従来、
一般に使用されている充填剤が使用可能であるが、代表
例を挙げれば次の如くである。

すなわち、無機充填剤としてはシリカゲル、アルミナ、
フロリジル、活性炭、ヒドロキシアパタイトなどがあげ
られる。また、シリカゲルの市販品の例を挙げると、ワ
コーゲルＣ−２００およびワコーゲルＣ−３００（いず
れも和光紬薬製）、シリカゲルアート（Ａｒｔ　）　９
３８５およびシリカゲルアート７７３４（いずれもメル
ク社製）、ならびにシリカゲルＫＴ−３０６３およびシ
リカゲル４Ｂ（いずれもフジゲル社１１）などがある。

また、有機充填剤としては一般に多孔性合成樹脂が使用
されるが、この代表例として非極性合成樹脂としてたと
えばアンバーライトＸＡＤ−２（ローム書アンド・ハー
ス社ＳＳ　＞　、アンバーライトＸＡＤ−４（ローム−
アンド・ハース社製）およびハイポーラスポリマーＨＰ
（三菱化成工業株式会社製）のようなスチレン−ジビニ
ル共重合体などがあり、極性合成樹脂として、たとえば
アンバーライトＸＡＤ−７（ローム・アンド・ハース社
製）およびアンバーライトｎト８（ローム・アンド・ハ
ース社製）などのポリアクリルエステル、アンバーライ
トＸＡＤ−９（ローム・アンド−ハース社製）のような
スルホキシド、およびアンバーライトＸＡＤ−１１（ロ
ーム・アンド・ハース社製）のような極性合成樹脂があ
げられる。

各カラムに充填される充填剤は互いに同じであってもよ
く、また異なってもよい。同じであることが好ましい。

同じ種類の無機充填剤であることが特に好ましい。

本発明において粗製補酵素Ｑを溶解するための溶媒およ
び各カラムに注加される溶媒は粗製補酵素を溶解しうる
溶媒であればよく、単一溶媒および混合溶媒のいずれを
も使用しうるう通常は、無機充填剤を用いる場合におい
て、単一溶媒としては非極性溶媒が好ましく、たと工ｌ
ｆ、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−へブタン、イソ
オクタン、シクロヘキサンおよびこれらの混合物、石油
エーテルなどの炭化水素が実用上特に好ましい。混合溶
媒としては、前記の非極性溶媒にエチルエーテルなどの
エーテル系、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系
、あるいはアセトン、メチルエチルケトンなどケトン系
の有機溶媒を加えた混合溶媒が特に好ましい。また充填
剤として多孔性合成樹脂を用いる場合において、非極性
多孔性合成樹脂を使用する場合にはメタノール、工”タ
ノール、イソプロｔ４）−ル、　ｎ−フロパノール、ア
セトン、メチルエチルケトン、イソプロピルエーテル、
テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルセロソルブ、
ジメチルホルムアミド、アセトニトリルおよび水などの
極性溶媒を単独または相互の混合物として使用すること
ができ、混合溶媒が好ましい。メタノールと水、メタノ
ールとアセトン、メタノールとｎ−ヘキサン、アセトン
乏水などの混合溶媒が特に好適に使用される。一方、極
性多孔性樹脂を使用する場合には、ベンゼン、トルエン
、ｎ−ヘキサン、石油エーテル、石油ベンゼン、インペ
ンクン、四塩化炭素およびクロロホルムなどの非極性の
溶媒を単独または相互の混合物として使用することがで
きる。また、これらの溶媒にアセトン、エーテルおよび
酢酸エチルのそれぞれを混合した混合溶媒も使用しの混
合溶媒が特に好ましい。

各カラムの塔頂から注入される溶媒は、各カラムに充填
されている充填剤の種類、粗製補酵素Ｑに含有されてい
る不純物の種類、数および量ならびに処理温度などに応
じてそれぞれのカラムの条件に適した溶媒を使用するこ
とが一般であるが、各カラムで共通な溶媒を使用するこ
ともできる。また、各カラムの塔頂から供給される溶媒
は供給の途中で別の溶媒に変更１７てもよい。

なお、各カラムとも無機充填剤が充填されている場合お
よび極性多孔性樹脂が充填されている場合には後のカラ
ムはど溶媒の極性を大きくすることが好ましい。反面、
各カラム七も非極性多孔性樹脂が充填されている場合に
は後のカラムはど溶媒の極性を小さくするこ七が好まし
い。なお、溶媒の極性を調節するためには、常法の如く
極性の異る複数の溶媒を混合すればよい。

たとえば、ヘキサン／アセトン（容量比）を１００１０
．９８／２．９５１５、の比率で混合すればその極性は
この順で大きくなる。また、メタノール／アセトン（容
量比）を７／３．５１５．３／７で混合すればその極性
はこの頴で小さくなる。

カラムの温度、カラムに供給される粗製補酵素Ｑ溶液の
温度、供給速度、各カラムに注下される溶媒量および供
給速度などは、使用される充填剤の種類、粗製補酵素Ｑ
中の不純物の数、種類および量ならびに溶媒の種類など
によって異なり一概に特定しえない。これらの条件は、
各カラムで、各カラムに適した条件を選択すればよいが
、各カラムの条件を同じくすることもできる。しかして
実用上、通常はつぎのような条件が採用される。すなわ
ち、たとえば、カラムに供給される粗製補酵素Ｑ溶液の
温度およびカラムの温度はそれぞれ充填剤が吸着能を失
なわず、粗製補酵素Ｑ中の補酵素Ｑ、が溶剤に溶解し、
溶媒の沸点より低い温匠であればよく、通常は１５〜５
０℃、好ましくは室温乃至常温であり、特に加熱、冷却
の必要はないが、加熱、冷却することを妨げない。なお
りラムの温度は後のカラムはど高くすることが好ま；−
い。

粗製補酵素Ｑ溶液の供給量は、無機充填剤を用いた場合
には、通常は各カラムで使用した充填剤合計重量（ｇ）
の５０重量パーセント以下七され、実用上３０重量パー
セント以下七するこ七が好ましい。

また、充填剤として多孔性合成樹脂を用いた場合には、
通常は各カラムで使用した充填剤合計容積（−／）の５
０重看パーセント（ｇ−粗製補酵素Ｑ／ｒｑｅ−充填剤
合計容ｆｊｆ）以下とされ、実用上、３５重量パーセン
ト以下七するこきが好ましい。なお、ここで充填剤合計
容積（−／）とは見掛の容積ではなく実容積である。

粗製補酵素Ｑを溶解する溶媒の量は、特に制限はないが
、通常は粗製補酵素Ｑ１．９に対１．て０．５〜５ｒｒ
ｔｌの割合きされ、１．３〜２．５・ｎ／！の割合が好
ましい。

本発明で使用する各カラム間の充填剤重量１＆１の割合
には、特に制限はないが、最大充填！（重量）と最小充
填量（重量）との比は実用上、通常は０．１〜１とされ
る。

本発明で各カラムに注下される溶媒の見掛けのカラム空
筒速度〔単位時間当りの溶媒供給量ｍ／（□）／カラム断面積（ｃｍ　２　）　＝ａｎ　／　ｓ
ｅｃ　１ｅｃには、特に制限はないが、実用上、通常ｏ、００１〜０
．５１／ｓｅｃ、好ましくは０．０１〜ｏ　、　１ｃｍ
／　ｓｅｃである。さらにカラム内上部圧力は分離上好
ましい供給溶媒の見掛けの空筒速度が維持されれば常圧
でも加圧下または減圧下でもよい。

〔実施例〕

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。し
かしながら本発明はこれらの実施例によって限定される
ものではない。

実施例　１２本のカラム（ｔａ２図における、互いに直列に接続さ
れた第１カラム１および第２カラム２に相当−従って第
３カラム３および第２連絡管２１は使用しないχ直径２
２ｔｓ＋、長さ４５１１ｍの円筒）に、ｎ−ヘキサンに
懸濁させた充填剤ワコーゲルＣ−！ｔｏｏ　　１４０９
を二等分シ、７０ｇずつ２本のカラムに充填した。

２５℃のｎ−へキサン　５４ｍ／に、微生物菌体から得
られた粗製補酵素Ｑ、。２７ｇ（補酵素Ｑ、。含量　１
８．９ｇ）を溶解した溶液を第１カラム１上部に供給し
た。

ついで、第１カラム１の塔底から液を抜出しつ＼塔頂か
ら溶媒■（アセトン含有率　０．５容量係のアセトンと
ヘキサンとの混合溶媒　以下同様）を注下した。この時
の溶媒■の供給速度を６８４ｍ１／ｈｒ、見掛けのカラ
ム空筒速度を０．０５ｃＩｎ／３ｅｃとし、第１カラム
１の温度を２５℃に保った。

この操作により第１カラム１の第１塔底弁１４から不純
物の溶液２６０ｔｑｔを系外に取り出したときに、第１
検出器１７（ＵＶモニター　波長　２５４ｍ　　以下同
様）で補酵素Ｑ、ｏが検出された。この時に第１塔底弁
１４を閉め、第１連絡弁２２および第２塔底弁１５を開
け、補酵素Ｑ１Ｇを含有する区分を第２カラム２へ移行
させた。これと同時に第２塔頂弁９を開け、溶媒■（ア
セトン含有率８容量チのアセトンとｎ−ヘキサンとの混
合溶媒　以下同様）を注下した。

このときの溶媒■の供給速度を８０ｍ１／ｈｒ　　とし
た。

この時、第１カラム１に供給される溶媒■の供給量を６
８４　ｍｌ／　ｈｒ　から６０４ｍ１／ｈｒ　に変更し
た。第２カラム２０カラム温度を３５°Ｃとした。また
ｔａ１カラム１および第２カラム２のそれぞれの塔頂圧
力はそれぞれ０．３４／ｃｆｎ２Ｇおよび０　、　Ｉ　
Ｋｆ／ｆｆ１２−　Ｇでアッタ。

ここで第１カラム１および第２カラム２での溶媒の見掛
けの空筒速度はそれぞれ０．０４４ａｎ／ｓｅｃおよび
ｏ　、ｏ　５ｃｍ／　ｓｅｅであった。

吸着カラムクロマトグラフィ開始から溶出液合計量２０
００ｖ＋７？（第１カラム１塔底から２６０ｒｎ／、第
２カラム２塔底から１７４０ｍｅ）となった時に、第１
検出器１７で補酵素Ｑ、ｏが検出終了され、第１塔頂弁
８、第１塔底弁１４およセトンとｎ−ヘキサンとの混合
溶媒　以下同様）に変更しその供給速度を６８４ｗ６／
ｈ、　　、ｓ−（、た。

ここで第２カラム２での溶媒■の見掛けの空筒速度は０
　、０５Ｃ：ｎ１／　ｓｅｅである。第２カラム２での
温度は３５℃のままとした。第２カラム２の第２塔底弁
１５より溶出液を不純物だけを含む溶出区分、不純物→
補酵素Ｑ、ｏとを含む区分、おもに補酵素Ｑ、。だけを
含む区分、および不純物と補酵素Ｑ、。とを含む区分の
４つの区分として溶出層に分取した。それぞれの溶出液
量は、１５２０−１３６５イ、１３３５ｍ／および１２
５ｍ１であった。

各カラム塔頂から注下された溶媒使用合計量は３６０５
ｍ／であった。おもに補酵素Ｑ、。だけを含む区分１３
３５ｒｑ／から溶媒を除去して１５゜１２９の補酵素Ｑ
、。を得た。この補酵素Ｑ、ｏの融点は４８℃で、逆相
および順相高速液体クロマトグラフィー、マススペクト
ルならびに赤外線吸収スペクトルより純度１００チの補
酵素Ｑ、。

であることが確認された。

収得した精製補酵素Ｑ、０回収率は８０優に相当する。

収得精製補酵素Ｑ、ｏｌｇ当りの溶媒使用合計量および
充填剤使用合計量はそれぞれ２３９＋＋Ｉｔおよび９．
３ｇであった。

なお第１カラム１には多量の不純物が残留していた。

比較例　１第２カラム２の塔頂から溶媒を注下することなく、第１
カラム１の塔頂からのみ溶媒を注下し、かつ、第１カラ
ム１の塔底から排出液を系外へ抜き出さなかったほかは
実施例１に準じて行なった。

すなわち、第１カラム１に注加される溶媒は、アセトン
含有率０．５容８４のアセトンとｎ−ヘキサンとの混合
溶媒であり、供給速度６８４ｍｅ　／　ｈ　ｒ　、見掛
けの空筒速度Ｑ　、Ｑ　５　ＣｒｒＬ　／　ｓｅｅ七し
、その供給全景を２０００ｍ／とした。また、各カラム
の温度を２５℃に保った。

次にこの溶媒をアセトン含有率１容量チのアセトンとｎ
−ヘキサンとの混合溶媒に変更し、供給速度、見掛けの
空筒速度は変更しなかった。

なおこの溶媒の供給全量を１６７０ｍ／とじた。

また、各カラムの温度を３５℃に変更した。

各カラムの塔頂圧力はそれぞれ０．３に１Ｆ／α２−Ｇ
および０　、１　Ｋ４／Ｃ’ｍ２−　Ｑであった。

第２塔底弁１５からの溶出液を、不純物だけを含む溶出
区分、不純物と補酵素Ｑ、ｏとを含む区分、おもに補酵
素Ｑ１Ｇだけを含む区分および、不純物と補酵素Ｑ、ｏ
とを含む区分の４区分として溶出層に分取した。溶出液
量はそれぞれ１５８０ｒｄ、　　７７５ｐｒｅ、　　９
２０冑／オヨＩＪ　３９５ｖ／テ合計量は５６７０ｍ１
！であった。

おもに補酵素Ｑ、ｏだけを含む区分９２０−／から溶媒
を除去して、純度９９４の補酵素ＱＩＧ１０．５ｇを得
た。収得した精製補酵素Ｑ、。の回収率は５５％に相当
し、収得精製補酵素Ｑ、。

（純度９９チ）１ｇ当りの溶媒使用合計量および充填剤
使用合計量はそれぞれ５５３罰および１３゜３ｇであっ
た。

ここで得られた回収率は実施例１に比して著しく劣り、
精製補酵素Ｑ、。純度も実施例１に比して劣っていた。

また、精製補酵素Ｑ、。１ｇ当りの溶媒使用合計量およ
び充填剤使用合計量は実施例１に比して極めて多かった
。

実施例　２微生物菌体から得られた粗製補酵素　５４９（補酵素Ｑ
、。含量　３７．８９）を、第２図に示した装置を用い
て精製した。カラム６本（すべて径２２關、長さ４５０
ｓｓｍ）の円筒のそれぞれに％　ｎ−ヘキサンに懸濁さ
せたワコーゲルＣ−５００２１０，！ｉ＋を７０ｇずつ
各カラムに充填した。

２５℃のｎ−ヘキサン　１０８ｍ１に、前記の粗製補酵
素　５４ｇを溶解した溶液を第１カラム１上部に供給し
た。

ついで第１カラム１の塔底から液を系外へ抜き出しつ＼
、塔頂から溶媒■を注下した。溶媒■の供給速度を６８
４Ｍｌ／　ｈ「、見掛けのカラム空筒速度を１．０５／
ｍ／　Ｓｅｃとしてカラム温度を２５℃番こ保った。

この操作により第１カラム１の第１塔底弁１４から不純
物の溶液１７０−を系外に取り出１゜たときに第１検出
器１７（ＵＶモニター）で補酵素Ｑが検出された。この
時に第１塔底弁１４を閉め、第１連絡弁２２および第２
塔底弁１５を開け、補酵素Ｑ、。を含有する区分を第２
カラム２へ移行させた。これと同時に第２塔頂弁９を開
は溶媒■を注下した。このときの溶媒■の供給速度を８
Ｑｍ／／ｈｒ　　とした。

この時、第１カラム１に供給される溶媒■の供給速度を
６８４　ｍｌ／　ｈｒ　から６ＯＡ−ｎ／！／ｈ「に変
更した。

第２カラム２の温度も２５℃と１．た。また、第１カラ
ム１および第２カラム２のそれぞれの塔頂圧力はそれぞ
れ（）　、　３　Ｋｆ／Ｃｍ２−　Ｇおよび０　、　Ｉ
　Ｋｇ／ｃｒｎ２−Ｑであった。

ここで第１カラム１および第２カラム２での溶媒の見掛
けの空筒速度はそれぞれ０．０，１４ｃｒＩｔ／ｓｅｃ
および０　、０５（ｍ／　Ｓｅｅであった。

第２カラム２の第２塔底弁１５からの溶出液を第２検出
器１８で検出して不純物だけを含む分取し系外に取り出
した。

次に第２塔底弁１５を閉め、第２連絡弁２３および第３
塔底弁１６を開け、多量の補酵素Ｑ、。

を含有する区分を第３カラムＳｌこ移行させた。

これと同時に第３塔頂弁１０を開は溶媒■を８０・〃ｌ
／ｈｒ　の供給速度で注下した。

第３カラム３での溶媒の見掛けの空筒速度は０　、０５
６ｃｍ／　ｓｅｃとなった。

第１カラム１および第２カラム２の温度はそれぞれ変更
せず、第３カラ、ム３の温度を３５６Ｃとした。

各カラムの塔頂圧力はそれぞれ０．４麺／α２−Ｑ、　
０　、２）１４／Ｃ！ｎｚ、−Ｇおよび０　、１Ｋｇ／
ｒｍ２−Ｇであった。

吸着カラムクロマトグラフィ開始から溶出液合計量が２
０５０ｍｇ（第１カラム１塔底から１７０−１第２カラ
ム２塔底から７７０脣〆、第３カラム３塔底から１１１
０＋１）ＪＣ達［７た時に、＠１検出器１７では補酵素
Ｑ、ｏがほとんど検出されなくなり、第１塔頂弁８およ
び第１連絡弁２２を閉じ、補酵素Ｑ、ｏを含有する区分
の第１カラム１から第２カラム２への移行と第１カラム
１下への溶媒の注奈を終了した。

なお、第３カラム３では、補酵素Ｑを含有する区分の第
２カラム２から第３カラム３への移下行および溶媒■の注与は継続中である。

この時に、第２カラム２に注下された溶媒＠を溶媒■に
、また、供給速度を８０ｍ／／ｈｒ　から６０　Ａ’ｎ
ｌ／　ｈｒ　（Ｃ変更シタ。

ここで第２カラム２での溶媒■の見掛けの空筒速度は０
　、０４４ｍｌ／　ｈｒ　　となった。

また、第２カラム２および第３カラム３の塔頂圧力はそ
れぞれ０．３Ｋｆ／ｍｚ−Ｑおよび０゜１に９／Ｃｍ２
Ｇであった。

吸着カラムクロマトグラフィ開始から溶出液合計量が４
０１（Ｌｄ（第１カラム１塔底から。

１７０、−Ｊ、第２カラム２塔底から７７０ｍ１１第３
カラム３塔底から３０７０ｍ（）となった時に、第２検
出器１８で補酵素Ｑ、。がほとんど検出されなくなり、
第２連絡弁２３および第２塔頂弁カラム３への移行を終
了した。なお、第３カラム３における不純物溶出は継続
中である。

また、この時、第５カラム６へ注下されていた溶媒■を
溶媒■（アセトン含有率１，５容量蛎のアセトンとｎ−
ヘキサンとの混合溶媒　以下同様）に、供給速度を８０
＋ｍ／／Ｊ１．から６８４−／ｈｒに変更した。

ここで第３カラム３での見掛け、の空筒速度はｏ　、　
ｏ　５Ｃｒｎ／　ｓｅｅとなる。

次いで第３カラム３の第３塔底弁１６からの溶出液を不
純物だけを含む溶出区分、不純物と補酵素ｑ＋ｏとを含
む区分、おもに補酵素Ｑ、。だけを含む区分および不純
物と補酵素Ｑ、ｏとを含む区分の４つの区分として溶出
層に゛分取した。

これらの溶出液量はそれぞれ２４００ｍ７．６００ｍ１
．　１８００ｒｉ’！およびＡＯＯｍｌでアッタ。また
、吸着カラムクロマトグラフィ開始からの溶媒使用合計
量は６１４０ｄ（第１カラム１塔底から１７０ｍ／、第
２カラム２塔底から７７０ｒ−／。

第３カラム３の塔底から５２００ｍ／）であった。

おもに補酵素Ｑ、ｏだけを含む区分１８００−から溶媒
を除去して２８．３５９の補酵素Ｑ、。

を得た。この補酵素Ｑ１Ｇの融点は／１８”ｃで、逆相
および順相高速液体クロマトグラフィーならびにマスス
ペクトル、赤外線吸収スペクトルにより純度１００％の
補酵素Ｑ、ｏであることが確認された。

収得した精製補酵素Ｑ、。の回収率は７５チ、であり、
収得精製補酵素Ｑ、ｏｌｇ当りの溶媒使用合計量および
充填剤使用合計量はそれぞれ２１７、呵ｌおよび７．４
Ｊであった。

なお、第１カラム１および第２カラム２には多量の不純
物が残留していた。

比較例　２第２カラム２および第３カラム３へは溶媒を注下せずに
第１カラム１のみに溶媒を注下し、第１カラム１および
第２カラム２のそれぞれの塔底から系外へ液を排出しな
かったほかは実施例２に準じて行なった。すなわち、２
５℃のｎ−ヘキサン　１０８Ｍに実施例２と同様の粗製
補酵素Ｑ、ｏ５４９を溶解した溶媒を第１カラム１に供
給した。第３塔底弁１３を開け、前記の粗製補酵素Ｑ　
を各カラムを順次通過させて各成分を展開、吸着させた
。

第１カラム１の塔頂から溶媒■を、供給速度を６８４ｍ
ｅ／ｈｒ、見掛けの空筒速度をｏ、。

５備／ｓｅｅとし、３０００ｗ／！注下した。

各カラムの温度をそれぞれ２５℃に保った。

ついで溶媒■から溶媒■に変更１７、供給速度を変更し
ないで、溶媒■　３１７０ｍ／を注下した。

また、各カラムの温度をそれぞれ３５℃に変更した。第
１カラム１、第２カラム２および第３カラム３の塔頂圧
力はそれぞれ０．４に４／ｃｍｚ−Ｇ、０　、２に４／
ｃｒｎｔ−Ｇおよび０　、１　Ｋ１７ｃｍ２含む溶出４
分、不純物と補酵素Ｑ、ｏとを含む区分、おもに補酵素
ＱＩＯだけを含む区分および不純物と補酵素Ｑ、。とを
含む区分の４つの区分ととして、溶出層に分取した。そ
れぞれの溶出液量は５１４０ｍ１．１２００Ｔｎ／、　
　１０８０ｍ／および７５０＊／であった。おもに補酵
素Ｑ、。だけを含む区分１０８０づから溶媒を除去して
、純度９９４の補酵素Ｑ、。１７　、０１９を得た。

収得した精製補酵素Ｑ、ｏの回収率は４５４゜５６３　
ｒｎ７！および１２．５．９であった。この比較例２で
得られた回収率は実施例２に比して著し７く劣り、また
精製補酵素Ｑ、。純度は実施例２に比して劣っていた。

また、精製補酵素１ｇ当りの溶媒使用合計景および充填
剤使用合計量はいずれも実施例２に移して極めて多かっ
た。

寝施例　３実施例１と同様にして得られた粗製補酵素Ｑ、。

１０ｇ（補酵素Ｑ１０含量　７．［１９）を、充填剤さ
してハイポーラスポリマーＨＰ−２０（三菱化成工業株
式会社製）１２０ｍ／を６ａｍｔずつ２等分し、カラム
に充填しアセトン・メタノール（容積比４：６　以下同
様）で溝たしたほかは実施例１に準じて精製した。

すなわち、２５℃のアセトン・メタノール（４：６）の
混合溶媒に前記の粗製補酵素Ｑ、。１０ｇを溶解した溶
液を第１カラム上部に供給した。

次いで第１カラム１の塔底から液を抜出しつ＼、塔頂か
ら溶媒■（アセトン：メタノール＝４：６の混合溶媒　
以下同様）を注下した。

この時の溶媒■の供給速度を６８４’Ｑｌ／ｈｒ、見掛
けの空筒速度をＱ　、　０５　Ｃｒｒｌ　／　ｓｅｅと
し、第１カラム１の温度を２５℃に保った。第１カラム
１の塔頂圧力は常圧であった。

次に第１カラム１へ注下されていた溶剤■の供給量が６
００４になった時に溶媒■を溶媒■（アセトン：メタノ
ール＝５：５　以下同様）ｆこ変更した。

この操作により第１カラム１の第１塔底弁１４から不純
物を含む溶液７２０ｍ１を系外に取り出したときに第１
検出器１７で補酵素Ｑ、。が検出された。この時に第１
塔底弁１４を閉め、第１連絡弁２２および第２塔底弁１
５を開け、補酵素Ｑ、Ｏを含有する区分を第２カラム２
へ移行させた。これと同時に第２塔頂弁９を開け、溶媒
■（アセトン：メタノール＝９：１の混合溶媒　以下同
様）を注下した。

この時の溶媒■の供給速度を８０　ｍｅ／　ｈｒ　　と
した。

第１カラム１および第２カラム２においてカラム温度を
それぞれ２５℃お°よび３５℃七１２、また塔頂圧力は
共に常圧であった。ここで第２カラム２で″の溶媒■の
見掛けの空筒速度は０゜０５６ｃｒｒＬ／　ｓｅｅであ
る。

吸着カラムクロマトグラフィ開始から溶出液合計量１０
２０ｒｎｌ（第１カラム１塔底から７２ｏ１ｊ１１．第
２カラム２塔底カラ５０　（１＋＋ｊ）　トｔｚツた時
に第１検出器１７で補酵素Ｑ、ｏが検出されなくなり、
第１塔頂弁８、第１塔底弁１４および第１連絡弁２２を
閉じた。

この時、第２カラム２では、溶媒■から溶媒■（アセト
ン：メタノール−６：４　以下同様）に変更し、その供
給速度も６８４ｙｄ／ｈｒ　に変更した。ここで第２カ
ラム２での溶媒♀の見掛けの空筒速度は０．０５ｃＩｒ
Ｌ／ｓｅｃである。

第２カラム２での温度は３５℃のま＼とした。

Ｑ、ｏとを含む区分、おもに補酵素Ｑ、ｏだけを含む区
分および不純物と補酵素Ｑ、。とを含む区分の４つの区
分として溶出層に分取した。それぞれの溶出液量は１２
０１Ｒ１１５０ｍ７．５４５−および５０−であった。

各カラム塔頂から注擁された溶媒使用合計量は１４８５
−であった。おもに、補酵素Ｑ、ｏだけを含む区分５４
５ｄから溶媒を除去して５゜９ｇの補酵素Ｑ、ｏを得た
。この補酵素Ｑ、ｏは逆相詔よび層相高速液体クロマト
グラフィ、マススペクトルならびに赤外線吸収スペクト
ルにより純度９９．１４の補酵素Ｑ、。であることが確
認された。

収得した精製補酵素Ｑ、。回収率は８５ｅ４に相当する
。

収得精製補酵素Ｑ、８１９４４当りの溶媒使用合計量お
よび充填剤使用合計量はそれぞれ２５２ｄおよび２０．
５ｉ１であった。

なお、第１カラム１には多量の不純物が残留していた。

比較例　３第２カラムの塔頂からは溶媒を注下することなく、第１
カラム１の塔頂からのみ溶媒を注下し、かつ、第１カラ
ム１の塔底から排出液を抜き出さなかったほかは実施例
３に準じて行なった。

下すなわち、第１カラム１に注加する溶媒として順次溶媒
■　６５０１１Ｌｌ、溶媒■　３００ゴおよび溶媒■　
４２０属を使用した。どの溶媒も、供給速度を６８４ａ
ｌ？／ｈｒ　、見掛けの空筒速度を０　、０５Ｃｒｎ／
　Ｓｅｃとした。また、各カラムの温度を２５℃に保っ
た。各カラムの塔頂圧力はいずれも常圧であった。

第２塔底弁１５からの溶出液を不純物だけを含む溶出区
分、不純物と補酵素Ｑ、ｏとを含む区分、おもに補酵素
Ｑ、ｏだけを含む区分および不純物と補酵素Ｑ、ｏとを
含む区分の４つの区分として溶出類に分取した。それぞ
れの溶出液量はそれぞれ７２　ａｒＩｔｌ、　　２　ａ
　０Ｐｎｌ、　　４ｏ　ｏｒｄおよび５０ｍ／であった
。

おもに補酵素Ｑ、。だけを含む区分ａｏｏｙｎｔから溶
媒を除去して、純度９９チの補酵素Ｑ、。

４．３ｇを得た。収得した精製補酵素Ｑ、ｏの回収率は
５５％、収得精製補酵素Ｑ、。（純度９９チ）ＩＬｔｆ
ｌ当りの溶媒使用合計量および充填剤使用合計量はそれ
ぞれ３１９ｍＡ’および２２゜６ｄであった。

ここで得られた回収率は実施例乙に比して著しく劣り、
精製補酵素Ｑ、。純度も実施例６に比して劣った。また
、ｔａ製補酵素Ｑ、。１ｇ当りの溶媒使用合計量および
充填剤使用合計量は実施例３に比して極めて多かった。

実施例　４微生物菌体から得られた粗製補酵素　５４ｇ（補酵素Ｑ
、。含量　５７．８ｇ）を、第２図に示した装置を用い
て精製した。カラム３本（すべて径２２ｍ、長さ４５０
１１１の円筒）のそれぞれにｎ−へキサンに懸濁させた
ワコーゲルＣ−３００２１０ｇを７０９ずつ各カラムに
充填した。２５℃のｎ−ヘキサン　１０８−に前記の粗
製補酵素　５４９を溶解した溶液を第１カラム１上部に
供給した。ついで第１連絡弁２２、第２連絡弁２３を開
は第３カラム６の塔底から液を抜き出しつつ第１カラム
１の塔頂から溶媒■を注下した。溶媒■の供給速度を６
８４１ｄ／ｈｒｓ見掛けの各カラム空筒速度を０．０５
ｃＩｒＬ／ｓｅｅ　　として各カラム温度を２５℃に保
った。

各カラムの塔頂圧力はそれぞれ０　、９　ｂ／ｃＩ１１
２Ｑ、０．４Ｋｇ／σ２Ｇおよび０　、１　Ｋｌ／工２
Ｇであった。

吸着クロマトグラフィー開始から溶出液合計量が２２ｒ
ｌＯｍｌｌ？に達した時に、第１検出器１７では補酵素
Ｑ、。がほとんど検出されなくなり、第１塔頂弁８およ
び第１連絡弁２２を閉じ、第１カラム１への溶媒の注下
を終了した。これと同時に第２塔頂弁９を開は第２塔頂
管５から溶媒■を注下した。溶媒■の供給速度を６８４
−／ｈ「、見掛は空筒速度をＯ、Ｏ５ｃ１ｎ／　ｓｅｅ
として第２カラム２および第５カラム３の温度をそれぞ
れ５５°Ｃに保った。第２カラム２および第３カラム乙
の塔頂圧力はそれぞれ０．４麺／ｃ１ｒＬ２ＧおよびＯ
−ｉ　Ｋｐ／ｃｍｚ□　であった。

吸着カラムクロマトグラフィ開始から溶出液合計量が４
５００−となった時に第２検出器１８で補酵素Ｑ、ｏが
ほとんど検出されなくなり、第２連絡弁２３および第２
塔頂弁９を閉め、第２カラム２への溶媒の注下を終了し
た。これと同時に第３塔頂弁１０を開は溶媒■を注下し
た。

溶媒■の第３カラム３への供給速度を６８４ｄ／ｈｒ　
、見掛けの空筒速度をｏ　、　ｏ　５ｃｍ／ｓｅｃとし
て、各カラムの温度を３５℃に保った。第３カラム３の
塔頂圧力は０　、１１４／ｃＩｎｚ　Ｇであった。

次いで第３カラム乙の第３塔底弁１６からの溶出液を、
不純物だけを含む溶出区分、不純物と補酵素Ｑ　とを含
む区分、おもに補酵素Ｑ、。だけを食む区分および不純
物と補酵素Ｑ１０とを含む区分の４つの区分として溶出
順に分取した。

これらの溶出液量はそれぞれ３５２０ｄ、６５Ｑｄ、１
８００ｍおよび８６０ｄであった。また、吸着カラムク
ロマトグラフィ開始からの溶媒使用合計量はｔｓａｏｏ
ｍｚであった。おもに補酵素Ｑ、ｏだけを含む区分１８
００−から溶媒を除去して、純度９９．５％の補酵素Ｑ
、。２２゜４５９を得た。

収得した精製補酵素Ｑ１０の回収率は５９．４チであり
収得精製補酵素Ｑ、ｏｌｇ当りの溶媒使用合計量および
充填剤使用合計量はそれぞれ３０５ｍ１および９．４９
であった。

〔発明の効果〕

本発明において補酵素Ｑの回収率は著しく向上し、また
精製補酵素単位重量当りの充填剤使用量および溶剤使用
量が大きく節減される。従って、本発明は吸着カラムク
ロマトグラフィによる方法でありながら、補酵素Ｑの工
業規模での精製が可能となる。しかも本発明によって得
られた補酵素Ｑの純度は高いつ

【図面の簡単な説明】

第１図は粗製補酵素Ｑの溶出パターンの一例を示し、第
２図は本発明のために使用される精製装置のフローシー
トの一例を示す。なお、図面に右いて１・・・第１カラム　２・・第２カラム　３・・・第３
カラム　４・・・第１塔頂管　　５・・第２塔頂管６・
・・第３塔頂管　　７・・・塔頂連絡管　　８・・・第
１塔頂弁　　９・・・第２塔頂弁　　１ｏ・・・第３塔
頂弁　　１１・・・ｍＩ塔底管　　１２・・・第２塔底
管　　１３・・・第３塔底管　　１４・・・第１塔底弁
１５・・・第２塔底弁　　１６・・・第３＠底弁１７・
・・第１検出５　１８・・・第２検出器１９・・・第３
検出器　　２ｏ・・・第１連絡管２１・・・第２連絡管
　　２２・・・第１連絡弁２ト・・第２連絡弁　　およ
び　２４・・・供給管特許出願人　　三菱瓦斯化学株式
会社代表者長野和吉

Claims

【特許請求の範囲】

粗製補酵素Ｑを吸着カラムクロマトグラフィで精製する
に際し、互いに直列に接続された複数のカラムを使用し
、粗製補酵素Ｑ溶液を該カラムへ順次通過させて粗製補
酵素Ｑ溶液中の不純物含有量を順次低下させ、最終カラ
ムから主成分が補酵素Ｑである区分を回収することを特
徴とする補酵素Ｑの精製法