JPS62221697A

JPS62221697A - タン白の凍結保護方法

Info

Publication number: JPS62221697A
Application number: JP61260519A
Authority: JP
Inventors: ジヨン　エフ．カーペンター; スチーブン　シー．ハンド; ジヨン　エツチ．クローウエ; ロイス　エム．クローウエ
Original assignee: SAUSUUESUTAN RUIJIANA THE, University of
Current assignee: SAUSUUESUTAN RUIJIANA THE, University of
Priority date: 1986-03-13
Filing date: 1986-10-31
Publication date: 1987-09-29
Also published as: US4806343A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景（１）発明の分野本発明はこれらの生物学的活性が凍結仮保存すれるよう
なタン白の保護方法に関する。この保鏝セ凍結又は凍結
乾燥にも拘らずタン白の生物学的活性を保存する凍結保
護剤を添加することにより達成される。さらに詳細には
、本発明は有利には非液体形で貯蔵でき、一方実質的に
丁べての生物学的活性を保Ｍできるように治療的にＭ効
なタン目上保存する方法に関する〇（２）背景の一般的論議タン白に生物のほとんど普遍的成分の１つである。生物
の脆さおよび環境条件のきわめて狭い範囲内でのみ生き
残るこれらの通例的能力は比較的狭い温度範囲外で生物
学的活性ＴＩ−Ｗするタン白の損失により説明できる。

例えば、凍ｉｈしはしはタン白の三次元構造を永久に変
更し、通例は生物学的活性ｔそう失する０特に過敏性のタン白の種類は酵素である。酵素は生活細
胞により生産され、体温で特異的生化学反応を接触する
ポリペプチド分子である。このよう女酵素の例はホスフ
ォフラクトキナーゼ（ＰＦＫ）で、これは解糖系の律速
触媒である。ＰＦＫは７ラクトース６−ホスフエートに
リン酸基の付加を接触するが、酵素か一度凍結されると
不可逆的に丁べての接触活性を失なう。

クン白は生体の機能および調節に重要な役割を演するの
で、タン白に又有用な薬剤になった。例えば、膵臓タン
白インシュリンは動物の血糖レベルの調節に役に立つ。

動物のインシュリン生産か損なわれる場合、赳こる生理
学的状態は糖尿病として知られる。この病気は通例イン
シュリンの特定投与量ケ動物に注射することによシ治療
される。

しかし、費用およびこのような治療の不都合さは患者に
投与するまでその生物学的活性上保存する九めに液体形
でインシュリン會冷蔵する必要性により増大する。しか
し冷蔵濁度でさえ、タン白は不安定で、七の活性のいく
らかｔ失なう。従ってこのようなタン白を凍結し、これ
らに長期貯蔵寿命を与えることが望ましい。

埃在インシュリンのようなタン白を簡単に凍結又は凍結
乾燥することはできない。その理由は凍結および七の後
解凍、又は凍結乾燥およびその後の再水利に通例タン白
の生物学的活性を減少するからである。この問題は凍結
又は凍結乾燥後タン白の生物学的活性を保存する方法を
見出丁ために努力する結果になった。

例えば、米国特許第４．１８０．９１７号明細書は酵素
ｋｙＬ結乾燥する複数工程方法を開示する。この方法で
は酵素は凍結乾燥後代表的には約７５〜８５％の生物学
的活性老回復する。方法は逆浸透又は限外赫過を使用し
、水不俗性塩で添加して酵素浴液を濃縮する必要により
複雑化している。この方法により処理されるプロテアー
ゼおよびα−アミラーゼｍ成物は全く安定で、不俗性塩
の添加および逆浸透全使用しなくても凍結後これらの実
装的活性ｆｔｔ−保Ｍする。

米国特許第３．６０７．８５８号明細書は少量の非イオ
ン界面活性剤の存在で小容器内で急速凍結することによ
りヒトの血液タン白を凍結乾燥する方法を記載する。こ
の方法により処理されるグロブリンは凍結に対し既に全
く安定で、界面活性剤の添加ｔしなくても凍結乾燥後ま
で残存する。非イオン界面活性剤の添加は単にグロブリ
ンのＰ＋ｍ解方法會加速するために役立つだけである。

タン白の保存を扱かうものではないが、米国特ｆｔ第４
，１３４．２１４号明細書にポリサッカライド抗原が−
２０〜−４０℃の温度で凍結乾燥することにより保存で
きることｒ開示する〇同様にタン白の保存には関しないがカリホルニアーデー
ビス大学の（Ｈｒｏｗｅらのりボゾームに関する研究が
ある。リボゾームに１つ又はそれ以上の同中心ホスフオ
リピド重層から成る人工小胞である。Ｃｒ０Ｗｅは例え
ば５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２３巻、７０１〜７０３頁（
１９８４年２月１７日）にリボゾームにトレハロースを
単に添加するとこれらのホスフオリビド膜で破壊せずに
凍結乾燥および再水利できることを示した。（’ｒｏｗ
ｅにより示唆される保護の機檎はホスフオリｔド極性上
部基と凍結中上部基間の付着を阻止するトレハロースと
の間の直接的相互作用である。ｃｒｏｗｅ　ｒｘ又トレ
ハロースはりボゾームの転移ＷＪｉｆ低下し、水和ホス
フオリぎド小胞内容物の漏出を生ずることか既知である
液体結晶相へ熱互変性ゲルの転移を阻止すると信じてい
る。

先行技術にジメチルスルホキシド（ＤＭＳ０　）および
グリセロールのような低娼保護剤に熱力学効果により水
溶媒の栴造を変更することによりタン白に保護作用ｒ発
揮することを水膜した。Ｇｅｋｋ。

ら、Ｂｌｏ　Ｃｂｅｍｉ８ｔｒ７　２０　：　　４６６
７〜４６７６（１９８１）。従ってトレハロースの作用
ｍ　’ｆｐ＞　Ｂ保護されるｌ＠質との直接相互作用の
１つであることｆ　（：ｒＯＷ８が教示して以来、トレ
ハロースがタン白に保護することは予報されていない。

ＤＭＳＯのような従来の凍結保護剤ｔタン白に使用する
ことは、ＤＭＳ０および他の凍結保護剤が生物学的に相
容性のない物質であるので重大問題を提示する。このよ
うな相容性のない物質がタン白に添加される場合、生物
学的システムでタン白の使用前に毒性反応を抑止するた
め凍結保護剤は除去されねばならなかつ友。相容性のな
い＠負が変質性を百する場合、タン白の活性を減少又は
破壊し、褐変させる「タン白褐変」を起こ丁ことができ
る。

ごのタン白褐変現象はＬｅａ　、　　Ｃ−Ｈ，およびＲ
，３゜Ｈａｎｎａｎ　、　Ｂｉｏ　ｃｈｉｎ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　、　　３　：　３１３（１９
４９）　；Ｌｅａ　　Ｃ，Ｈ−および’Ｒ，Ｓ−Ｈａｎ
ｎａｎ　。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ａｃｔａ、　、
　　４　：　５１８（１９５０）；ｌｅａ　、　Ｃ，Ｈ
，およびＲ，８，）（ａｎｎａｎ　、　Ｂｉｏ　ｃｈｉ
ｎ。

Ｌｅａ　　Ｃ，Ｈ，およびＲ，８，１（ａｎｎａｎ　、
　Ｎａｔｕｒｅ　、　１６５：４３８（１９５０ン　；
　　Ｆｅｅｎｅｙ　　、　　　’ＲＪｊ　、　、　　　
Ｇ−ＢｌａｎｋｅｎｈｏｒｎおよびＨ，ＤｉＸＯｎ　Ｘ
７１．ｄｖ、　Ｆｒｅｔ。

Ｃｈｅｍ、、２９：１３５（１９７５）？論議サレル。

ＤＭＳ　Ｏおよびグリセロールのような先行棧術の凍結
保護剤に関する別の間＠はごれらが凍結保護作用を発揮
する前に数モル量で溶液に含まれねばならないことであ
る。ごのような過剰量の添加剤は生物学的機能を破壊し
、除去することは困難である。

従って生物学的活性が凍結仮保存されるようにタン白の
保護方法を供することが本発明の目的である。

本発明の別の目的は凍結および解凍中又は凍結乾燥およ
び七の後の再水和中タン白を保護するような保存方法を
供することである。

本発明の面別の目的は無毒性の、生物学的相容性添加剤
のみｔ使用するような保存方法を供することである。

本発明のさらに別の目的な治療的に有用な物質および酵
素のようなタン白ｔこれらの生物学的活性の大部分全保
有させながら凍結および解凍又は凍結乾燥および再水利
できるような方法を供することである。

面別の目的は非変質性でタン白の褐変を起こさないタン
白に対する凍結保ｍ除加剤を供することである。

最後に、無毒性で治療用タン白と共に動物に投与できる
凍結保護添加剤を非常に低濃度で使用できるような方法
を供することである。

発明の要約上記目的はタン白を炭水化物および遷移金属イオンに暴
露し、次にタン白を凍結することにより凍結後これらの
生物学的活性が保存されるようなタン白保護方法を供す
ることにより達成される。

好ましい態様では、タン白ａ２ｍＭＺｎ＋″およびトレ
ハロースのようなポリヒドロキシル炭水化物の５０〜１
００　ｍＭ水性浴液に暴露される。溶液に２５　ｍＭ濃
度のポリヒドロキシル炭水化物會２ｍＭＺｎ＋にと共に
添加することにより、タン白は七の生物学的活性の多く
ｔ保留する。通例約２５〜１００　ｍＭ　　より多いポ
リヒドロキシル炭水化物濃度にタン白で暴露することは
必要ではない。平均すると９０％より多い活性の保留が
これ、らの非常に低譲度でさえ認められるからである。

ある好ましい態様では、予備処理した、凍結保護凍結タ
ン白は低温で真空に暴露され、凍結乾燥として既知の方
法で脱水される。インシュリンのような治療的に有効量
の凍結保護した医薬的有用タン白は凍結乾燥され、糖尿
病患者のようなタン白の使用者に分配するため包装され
る。凍結乾燥タン白は単にこれらｔ再水和し、無毒性炭
水化物および遷移金属イオンｔタン白から除去せずにこ
れらｔ使用者に投与することにより投与できる。

他の態様では、タン白は所望の場合凍結保護添加剤を透
析して除去することができる。

他の態様でに、タン白および凍結保護剤は凍結され、タ
ン白の生物学的活性を失なわずに貯蔵される。タン白の
凍結は単に冷蔵するタン白の貯蔵性に比し非常に七の貯
蔵性を延長する。

ｚＨ＋Ｗ　、Ｃｕ”、Ｃｄ”’　、Ｎｉ．＋２およびＣ
ｏ÷２のような２価の適格金属イオンにポリヒドロキシ
ル炭水化物と共同して十分に作用して凍結による生物学
的活性の損失からタン白を保護する。この凍結保護性は
Ｚｎ”！の痕跡量、例えば０−２５　］ｎＭより少ない
Ｚｎ５Ｏ，浴故においてさえ認められる。遷移金属イオ
ンの好ましい濃度は［］、５５ｍより多く、一層好まし
くは１　ｍＭより多く、もつとも好ましくは遷移金属イ
オンの約１〜２　ｍＭである。

’ｌ　ｍＭの遷移金属イオンの存在で凍結保護性はトレ
ハロース、マルトース、ラクトース、シュークロース、
セロビオース、グルコース、ガラクトース、７ラクトー
ス、イノシトール、ンルビ）　−ルおよびグリセロール
のような炭水化物について認められる。

図面は１００　ｍＭ　）レバロース水浴液中の各種濃度
のＺｎ８０．の存在で凍結および解凍後ホスフォフラク
トキナーゼにより回復された生物学的活性の％グラフで
ある。

詳細な記載「可治性タン白」とは細胞膜のような膜構造に結合しな
いタン白を意味する。次のデータは膜結合タン白の生物
学的活性の保有を評価することが困難であるため可溶性
タン白の研究に限定される。

細胞膜に他の生物学的構造の存在は保有される生勧学的
活性の発見に影ｖｔ及ぼすかもしれない。

従って次のデータは単に可溶性タン白に関するに過ぎな
い。しかし本発明は可溶性タン白の凍結保護にのみ限定
されない。

酵素ホスフォフラクトキナーゼ（ＰＦＫ　）は次の凍結
保護研究に対するモデルタン白の１つとして使用される
。通例凍結又は凍結乾燥後すべての生物学的活性ｔそう
失する、寒冷および凍結に超過散性であることが既知で
あるので研究に選択された。大部分の他の酵素も凍結後
および解凍により実質的生物学的活性のそう失に対し全
く敏感である。

「遷移金属」とは元素週期体表のＶＩ　Ｂ族からＩＢ族
に糾する元素を含υものと規定される。

例　　ｌ凍結用のＰＦＫ酵素を調製するために、ＰＦＫは５ｍＭ
ジチオトレイトール（ｐ）１８．０）ｋ含有する１００
ｍＭ！ｊン酸ソーダバッファに対し一夜透析した。次に
２０μｌの貯蔵酵素ｔポリプロピレンエツペンドルフ遠
心分離管中の２６０μＡ！　（７）　２　ｍＭＺｎＳＯ
４および水性溶液（上記バッファ中に調製）のトレハロ
ースに添加し、約０．０２５　ｍ９／ＩＩＬ６の最終Ｐ
ＦＫ　９度およびＩ　Ｑ　Ｑ　ｍＭの所望炭水化物濃度
を得た。この酵素−炭水化物俗液の二重複製分析ｔ−Ｂ
ＯＣｋおよびＦ’ｒｉｅｄｅｎ、　％Ｔ、　Ｂ１１１．
　ｃｈｅｍ、　、　２５１：５６３０〜５６３（５（１
９７１１５）の７ラクトース１．６−ジホスフニートー
カツプル手順に従ってＰＩＦＫ接触活性に対し行なった
。この手順で、日立二重ビーム分元元度計モデル１００
−６０ｔ−。

３４０　ｎｍで吸収するＮＡＤｆ（の消失を測定するた
めに便用した。別法では、３４０ｎｍの吸収の増加′１
ｔＮＡＤＰカップル分析に対し測定した。次に１５０μ
ｊの酵素−炭水化物溶液を別のエッペンドルフ遠心管に
移し、液体窒素に６０秒浸漬して凍結した。次に酵素ｖ
Ｉ４製物は室温で解凍し、２５°Ｃで接触活性を分元元
度計で直ちに分析した。回復し九係活性値は凍結前に測
定した活性の係として表わし九〇残留対照試料（未凍結
ンに試験期間中安定であること七保証するため再び接触
活性ｔチェックし友。

この手順全便用して、ＰＦＫは凍結前に２　ｍＭＺｎｓ
ｏ　４および１００　ｍＭ　）レバロース水浴液で処理
する場合、１００％のその接触性を保留することがわか
った。

例　　１例Ｉの手順’に１００ｍＭのトレハロースノ存在でＺｎ
８０．の次の１ｌｆｆｉ’に使用して反復し九：ｏ・１
ｍＭ　ｓ　Ｏ−２５ｍＭ　ｓ　Ｏ−５ｍＭ　ｓ　１−Ｏ
ｍＭオヨヒ１−５ｍＭ、こｔらの各濃度で保留された酵
素活性の係扛図示する。

例　　ｍ例Ｉの手順’ｔ　１００　ｍＭのトレハロースおよびＺ
ｎ８０４の代りに２　ｍｕ濃度の次の塩：　Ｎａ２ｓＱ
４、Ｍｇ８０４、Ｍｎ８ＱイＣｕＥｉＱ、、　Ｎｉｃｉ
４、Ｃ０Ｃ１ｇ　オよびＣｄＣ１２ｙ＜使用して反復し
た。これらの各処理により保留された酵素活性の％は表
■に示す。

表　　１凍結解凍中の損傷からＰＦＫの保護：１００ｍＭ１７）
　）　Ｖ　ハＣ１−スの存在で添加したカチオンの影響
添加塩（２ｍＭ）　　　　　　回復活性係Ｈｏｎｅ　　
　　　　　　　　　　１７．６ＺｎＥ１０４　　　　　
　　　　１００−９Ｍｇ５ｏ、　　　　　　　　　　　
１８．７Ｍｎ８０．　　　　　　　　　　２２．７ｃｕ
ｓｏ、　　　　　　　　　　　６６．９ＣａＣ１２２０
，７Ｃ（ＬＣ１２！１３．４ＮｉＣ１２７６，８ＣｄＣ１２ｙ　９．ＯＮａ、８０４　　　　　　　　　　１７．７凍結保護性
は遷移金属カチオンの存在で向上することがわかる。非
遷移金属カチオン、Ｍｇ、　Ｃａ。

ｌＪａはほとんど又は全く効果’ｋＷＬ、ない。

例　　■ カチオンを添加しないことｔ除いて、酵素ＰＦ’に上側
１記載のように調製し、トレハロースと共に凍結しｔ。

ｆＬ粘結後ＰＦ’には最少の酵素活性を示すのみであっ
た。このデータは表１に包含される。

例■ 酵素は非還元性トレハロースの代りに１００ｍＭ＃に度
の還元性ジサッカライドマルトースで処理したことを除
いて、例Ｉ記載のように酵素を調製し、炭水化物および
２　ｍＭＺｎ８０４の存在で凍結し比。

手順は数回反復し、各回毎に次のジサッカライド炭水化
物：シュークロース、ラクトースおよび上田ビオースの
異る１つの１００　ｍＭ水溶液にトレハロースを置き換
えた。

最後に、イノシトール、グリセロール、ソルビトール、
グルコース、ガラクトースおよび７ラクトースのような
モノサッカライドの１００ｍＭ溶液に例Ｉのトレハロー
ス溶液と置き換え次ことを除いて同じ一＋順を行なつ九
。

それぞれの場合に回復された生物学的活性の％は表２に
示す。比較のために１　［１０ｍＭ炭水化物の存在で亜
鉛を存在させずに凍結および解凍後ＰＦＫにより保留さ
れた酵素活性係も表２に示す。

ｈ　　ＯＣｏ　　Ｎ　？−（ト）　哨　ヘ　り　哨　（
口　（ｈｃ鵠　り　ぐ鵠　唖　（（寸　−℃　−凍結保
護性は２　ｍＭＺｎ８０４の添加により丁べての濃度で
非常に向上し几。

例■ 例■の手順を次の各＃Ｊｆ：２５ｍｍおよび５０ｍＭ　
’ｋ　使用しテＰＦ’Ｋ　をトレハロース、シュークロ
ース、ラクトース、マルトース、セロビオース、イノシ
トール、グリセロース、グルコース、ガラクトース、フ
ラクトースおよびソルビトールのそれぞれにより処理し
次。比較として、””ｋ２５ｍＭおよび５０　ｍＭの同
じ各炭水化物により処理したが、遷移金属イオンは添加
しなかった。これらの各種濃度の凍結保護剤に暴露中凍
結および解凍後ＰＦＫにより保留され友酵素活性ｑｂは
表２に示す。

例■ ＰＰＫ　％再び調製Ｌ／、０．３２　ｍｕ　　Ｚｎ”Ｘ
　ｚ含ｇ６０ｍＭ）レバロース水浴液に暴露し九０中１
＠は５　ｍＭのジテオトレイトールを含７４０−ＩＭリ
ン酸ンーダバツファを使用し几ことｔ除いて、酵素−炭
水化物浴液が凍結する点まで例１の記載に従った。この
例では、溶液を液体窒素中で凍結後、液体窒素下にＬａ
ｂｃｏｎｃｏ　１４ｏａｅｌ　８凍結、乾燥機に移し、
１２時間凍結乾燥し７ＩＣ（−５０〜−７０℃、５〜１
０ミクロンＨｇＸ王で〕。凍結乾燥装置から取り出して
、乾燥粉末は３．０ｍＭジチオトレイトールを含■する
１５０μｌの蒸溜水に再溶解し、溶液の最終容量を測定
し友。この溶液は直ちにＰＦＫ接触活性を分析し、対照
値と比較した。回復されたＰＦＫ活性は７５．４係であ
り友。

例■ 各ａ！＄ｆＨのマルトースおよびグリセロール溶液に例
■で使用したトレハロース溶液’ｋｍき換え金属イオン
を添加しないことｔ除いて、例■の凍結保護性および凍
結−乾燥手順上反復した。対照として、ＰＰＫは炭水化
物又は遷移金属添加剤全使用せずに単に凍結乾燥し、生
物学的活性はほとんど回復されなかつ几。

溶質の＃度およびこれらの手順の結果は表６に要約する
：表　　　６金属カチオンを添加しない凍結乾燥中の可溶性タン白（
ホスフォフラクトキナーゼ］の保護溶質濃度　　　　ＰＰＫ活性炭水化物無添加　　　　　Ｏ。

マルトース　　　　　　２０　　　　　３０．６６０　
　　　８６．７グリセロール　　　　　２０　　　　　　〇　　−グリ
セロール単独（遷移金属カチオン未添加）は低温保護性
を示さない。一方表２のデー°夕はグリセロールｔ！　
２　ｍＭのＺｎ＋　２と併用して対比濃度で実質的にす
べてのＰＩＦＫ活性を保存する。亜鉛イオン未添加でマ
ルトースは対比できる凍結保護性を得る九めに非常に高
い濃度の炭水化物を必要とする。

例　　■ ０．３２　ｍＭ　　Ｚｎ＋２１　′に含ｆｊ　６０　ｍ
Ｍ　）　１１　ハｏ　−ス、０．５４　ｍＭ　　Ｚｎ＋
ｌ　ｉｅ含ｔｒ１００ｍＭ）レバＣＩ−スおよび１．６
２ｍＭ　　Ｚｎ”　１ｃ含む３００　ｍＭ　）　Ｌ／／
％０−ス濃＆１−ウサヤ筋肉からのＰＩＦＫおよびウサ
ヤ筋肉からの２クテートデヒドロデナーゼ（Ｉ、ＤＨ）
と共に使用したこと食除いて、例電の凍結−乾燥手順を
反復した。各種バッファ中のトレハロースにより供され
る凍結保護性を例示する几めに、ＰＦＫ’１ｔａ＋　５
　ｍＭジチオトレイトールを含ｔｒＱ、ＩＭリン酸ンー
ダバツファ、ｐＨ８，０，２５℃、（ｂｌ　５　ｍｕジ
チオトレイトールを含ｔｆｏ、０２Ｍ）リシン−ＮａＯ
Ｅ（バッファ、−７，９，２５℃、および（０）　５　
ｍＭジチオトレイトールを含Ｕ　Ｏ，０１Ｍリン酸ンー
ダバツファ、ＰＨ８，０，２５℃で凍結乾燥した。結果
は表４に示す：各種バッファ溶液濃度の効果はＰＦＫ　’ｉ凍結乾燥す
る場合最少であるが、Ｔ、、ＤＨｉ凍結乾燥する場合一
層有意であることがわかる。

例　　Ｘ凍結−解凍中ＰＦＫ以外のタン白に対し凍結保護剤とし
てＺｎ＋２−　ｇ　ＩＪヒドロキシル炭水化物のＭ用性
七例示するために、例Ｉの凍結−解凍法會それぞれ０．
３２　ｍＭ、　（１，５４ｍＭおよび１．６２ｍＭ０Ｚ
ｎ＋２濃度を含ｕ　６０　ｍＭｓ　　１００　ｍＭおよ
び６００ｍＭｄ＆の一トレハロースでいくつかの他のタ
ン白を使用して反復した。これらのタン白はウサギ筋肉
からのラクテートデヒドロデナーゼ（ＩＪＤＨ）、ウサ
ギ筋肉からのぎルベートキナーゼ（ＰＫ）、酵母からの
へキソキナーゼ（ＨＫ）、豚の心臓からのグルタメート
ピルベートトランスアミナーゼ（ＧＰＴ　）およびウサ
ギ筋肉からのアルドラーゼ（Ａｌｔｔｏ　）　ｋ含んだ
。ラクテートデヒドロゲナーゼＵ　２　ｍＭピルビン酸
ソーダ、０．１５　ｍＭＮＡＤＦＬ、　１００ｍＭ　　
ＫＣＩおよび８３ｍＭ）リス−ＨＣｌ　、ｄ（７，５ｋ
含む反応混合物中で２５℃で接触活性を分析した。

ぎルベートキナーゼは１ｍＭホスフォエノールｔルペー
ト、５　ｍＭ　ＡＤＰ　、　　１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，
０，１５ｍＭＮＡＤＨ，１５ユニツト／　’　　ＬＤＨ
％　　１０　ｏ　ｍｕ　　ｘｃ１オヨび３ＱｍＭ）リス
−ＨＣＩ、ｐＨ７，５’に含む反応混合物中で分析した
。ヘキンキナーゼ活性ＩｒＬ５　ｍＭグルコース、３　
ｍＭ　ＡＴＰ　％　　６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、Ｑ、５ｍ
ＭＮＡＤＰ、　０．５ユニット／ｄグルコース−６−ホ
スフニートデヒドロデナーゼ、３ｍＭジチオトレイトー
ル、５０　ｍＭイミダゾール、５３　ｍＭ　）リス−ａ
ｃ１、ｐＨ８，０から成る反応混合物中で測定し几。

アルドラーゼは１．１ｍＭフラクトース−１，６−ピス
ホ；ｘ、７ｘ−ト、０−１５　ｍＭ　ＮＡＤＨ，２０μ
ｇトリオースホスフェートイソメラーゼ、５０μｇグリ
セロール−６−ホスフニートデヒドロデナーゼ、３ｍＭ
ジチオトレイトール、５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ
　）リス−ＨＣ’ｌ、ｐＨ８，０ｋ含む反応混合物中で
分析した。グルタメート−ピルベートトランスアミナー
ゼ活性は１．０Ｍアラニン、９．６ｍＭアルファーケト
クルタレート、０．１５　ｍＭ　　ＮＡＤＨ，９ユニツ
ト／　”　　ＬＤＨ％　　５０　ｍＭリン酸ソーダバッ
ファ、ｐＨ７，５’に含む反応混合物を使用して分析し
た。

ＮＡＤＨｔ−消費するＮＡＤＨ−カップル分析の場合、
吸収の減少は３４０　ｎｍで起こった。ＮＡＤＰ　’ｉ
生成するＮＡＤＰ−カップル分析に対しては吸収の増加
。

は３４０　ｎｍで起こつ友。

タン白により回収され比活性ｑｂは表５に示す：例　　
匁例Ｘの凍結−解凍手順を反復し九が、トレハロースに次
の炭水化＠：マルトース、グリセロールおよびンルビト
ールで置き換え次。７．ｎ＋　２又は他の遷移金属イオ
ンは全く添加しなかった。

タン白により回収された活性部は表６に示す：比較とし
て遷移金属イオン又は炭水化＠を添加しないで凍結−解
凍手順を反復し次。この手順の結果は表７に示す：表　７炭水化物又は２価の金属カチオンを添加せずに回復した活性部ＩＪＤＨＱｐｘ　　　　　　　　　　　　３８−４ＨＫ　　　　　
　　　　　　４０．６ＧＰＴ　　　　　　　　　　　１８．６Ａｉｏ、　　　
　　　　　　　５１．４例■ ウサギ筋肉からのアルドラーゼ４１　［１［１ｍＭ　ト
レハロースおよび０．５４　ｍＭＺｎ”２に暴露し、１
００　ｍＭ　）リシンおよびＩ　Ｃｌ　ＯｍＭクエン酸
塩、ｐ）１８−Ｏｋ含む反応混合物中で分析した。凍結
−解凍は例■におけるように行ない、９３．Ｌ％の生物
学的活性を回収し友。

例　　ｘｉｕ糖尿病治療用のヒトのインシュリンはインシュリン１■
につき約４０ユニツトの用量単位で通例包装される。Ｋ
ｌｉ　Ｔ、＋ｉｎ７会社により商標名ＨＵＭＩ７Ｌ工Ｎ
として販売されるようなヒトインシュリンの１００ユニ
ツトガラスびんを調製し、例１記載のように１００　ｍ
Ｍ　）レバロースおよび２ｍＭＺｎ　＋　２に暴露し穴
。次にインシュリンは凍結し、使用するまで冷凍庫に貯
蔵し、薬剤の寿命を延長し友。使用者はインシュリンを
冷凍庫から取り出し、使用前に解凍する。解凍したイン
シュリンおよびトレハロース／Ｚｎ＋２は浴液かラドレ
バロース金除去しないで使用者に注射する。

例　　ＸＩＶ１００ユニツトびんのヒトインシュリンを既知の組み換
えＤＮＡ技術技術用使用得る。次にインシュリンを調製
し、Ｉ　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　）レバロースおよび２ｍＭＺｎ
＋２に暴露し、例■の手順を使用して凍結乾燥した。次
に凍結乾燥インシュリンは使用時まで粉末形で貯蔵する
。使用者は凍結乾燥調製物に無菌水を添加し、特別の糖
尿病患者の状態に所望の十分な濃度を得る〇例　　ｘｖトレハロースおよびＺｎ”は解凍又は再水利後および注
射前にインシュリンから透析により除去することを除い
て、例Ｘ■およびＸＩＶの手順を反復した。

例　　Ｘ■ 例ｉｔおよび例ＸＩＶの手順ｔインシュリンｌｊ外の治
療的に有用なタン白およびペプチド七使用して反復する
。このような医薬的タン白の例はインターフェロン、ベ
ーター−エンドルフィン、リムホキナーゼ、インターフ
ェロンズ、ペプチド成長因子および多数のペプチドホル
モンｈ含ａｏ　Ｃの方法により保存できるペプチドホル
モンの例にヴアソプレシン、トランスフェリン、リラキ
シン、プロラクチンおよび生長ホルモンを含む。

例　　Ｘ■ 輸注用人工赤血球（ＲＢＣ）’ｔ−ヒトのヘモグロビン
上リポゾーム中にカプセル化することによりｆｆ造でき
る。リボゾームおよびカプセル化へモグロ♂ンは例Ｉ記
載のように１００　ｍＭ　）レバロースおよび２ｍＭ　
　Ｚｎ８０４に暴露し友。次にリボゾームおよびヘモグ
ロビンは凍結（例１におけるように）又は凍結乾燥（例
■におけるように〕して人工ＲＢＣ’ｉ保存し、貯蔵で
きる。次に人工ＲＢＣ［ヘモグロビンの生物学的活性を
そう失させずに輸注に必要な場合解凍又は再水利できる
。トレハロースは背景で論議したＣｒｏｗｅの研究で例
示されるようにリボゾームを極低ｍ＠理学的に保護する
。タン白ヘモグロビンは本研究により例示されるように
トレハロースおよび亜鉛により極低温物理学的に保護さ
れる。リボゾームに対し人工ＲＢＣの製造を例示する雑
誌の論文はＹｕａａａら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＰｈａ
ｒｍａｃｏｂｉｏ　−Ｄｙｎａｍｉｃｓ　、８巻、１号
、１７頁（１９８５）　；　Ｄｉｍｉｔｒｏｖ　、工ｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａＩＪｒｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｍｌ
ｏｒＯＯｌｒＯｕ：Ｌａｔｉ、Ｏｎ　−Ｃ１１ｎｉｃａ
ｌ　ａｎｃＬＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　、３巻、３〜
４号、３８７頁（１９８４）：Ｈｕｎｔら、５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　２３３号、１１６５〜１１６８頁（１９８５
）を含む。

上記例ｔ−ｘｖｕに各種タン白に対する凍結保護の特異
的方法を例示する。一般に、トレハロースのような非還
元性炭水化物で便用し、マルトースのような還元性炭水
化物のタン白褐変効果を回避することか一層望ましい。

タン白褐変は暴露が永ひいた後貯蔵タン白を褐変させ、
生物学的活性ｔそう失させることができる。

非還元性炭水化物は遊離カルボニル基を含まなイモノで
、トレハロース、シュークロース、イノシトール、ンル
ビトールおよびグリセロールを含む。還元性炭水化物は
遊離カルボニル基を含み、マルトース、ラクトース、セ
ロビオース、グルコース、ガラクトースおよびフラクト
ースを含む。

好ましい態様で本発明の原理を例示し、記載したが、当
業者には本発明はこれらの原理から逸脱することなく修
正できることは明らかであ、る。本発明の特許話求の精
神および範囲内に入る丁べての修正を出願人は特許狛求
する。

【図面の簡単な説明】

図は各種濃度のＺｎ８０．　Ｔ！−含’０１００１ｎＭ
）レバロース水溶液により処理し几ホスフォラクトキナ
ーゼの凍結および解凍後に回復された生物学的活性係を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）凍結に基づく生物学的活性の損失を抑止するタン
白の保護方法において、凍結前に有効量の炭水化物およ
び遷移金属イオンにタン白を暴露することを特徴とする
、上記方法。
（２）遷移金属イオンはＺｎ＾＋＾２、Ｃｕ＾＋＾２、
Ｃｄ＾＋＾２、Ｎｉ＾＋＾２およびＣｏ＾＋＾２から成
る群から選択する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）炭水化物はトレハロース、マルトース、ラクトー
ス、シュークロース、セロビオース、グルコース、ガラ
クトース、フラクトース、イノシトール、ソルビトール
およびグリセロールから成る群から選択する、特許請求
の範囲第１項記載の方法。
（４）タン白は酵素である、特許請求の範囲第３項記載
の方法。
（５）タン白を炭水化物に暴露する工程は約２５〜１０
０ｍＭ濃度の炭水化物を含む溶液にタン白を加えること
を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（６）遷移金属イオンの濃度は少なくとも約２ｍＭであ
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（７）タン白を凍結する工程はさらにこのタン白の凍結
乾燥を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（８）特許請求の範囲第７項の方法の生成物を含む組成
物。
（９）このタン白は医薬的に有用なタン白であり、凍結
乾燥タン白はこのタン白の使用者に投与するため治療的
に有効量の用量ユニットで包装される、特許請求の範囲
第７項記載の方法。
（１０）特許請求の範囲第９項の方法の生成物を含む組
成物。
（１１）タン白は再水和し、炭水化物および遷移金属イ
オンをこのタン白から除去せずに使用者に投与する、特
許請求の範囲第７項記載の方法。
（１２）特許請求の範囲第１項の方法の生成物を含む組
成物。
（１３）タン白はインシュリンである、特許請求の範囲
第１項記載の方法。
（１４）タン白は可溶性タン白である、特許請求の範囲
第１項記載の方法。
（１５）タン白は医薬的に有用なタン白であり、この凍
結乾燥タン白はタン白の使用量に対し治療的に有効量の
用量ユニットで包装される、特許請求の範囲第１項記載
の方法。
（１６）凍結に基づく生物学的活性の損失を抑止するタ
ン白の保護方法において、炭水化物および遷移金属イオ
ンを含む浴液に可溶性タン白を加え、この可溶性タン白
を凍結乾燥する工程を含む、上記方法。
（１７）可溶性タン白は酵素である、特許請求の範囲第
１６項記載の方法。
（１８）このタン白は治療的に有効量の治療的に有用な
タン白を含む、特許請求の範囲第１６項記載の方法。
（１９）生物学的活性を失なうことのない凍結に適する
タン白組成物であつて、タン白および凍結に基づくこの
タン白の生物学的活性の損失を抑止する十分量の炭水化
物および遷移金属イオンを含む、上記タン白組成物。
（２０）凍結組成物であつて、凍結タン白および凍結に
基づくこのタン白の生物学的活性の損失を抑止する十分
量の炭水化物および遷移金属イオンを含む上記凍結組成
物。
（２１）タン白、炭水化物および遷移金属イオンを含む
組成物。
（２２）遷移金属はＺｎ＾＋＾２、Ｃｕ＾＋＾２、Ｃｄ
＾＋＾２、Ｎｉ＾＋＾２およびＣｏ＾＋＾２から成る群
から選択する、特許請求の範囲第２１項記載の組成物。
（２３）リポゾームカプセル化ヘモグロビンを含む人工
赤血球の凍結に基づく生物学的活性の損失を抑止する方
法において、人工赤血球をトレハロースおよび遷移金属
イオンを含む有効量の凍結保護剤に暴露し、人工赤血球
を凍結する工程を含む、上記方法。
（２４）さらに人工赤血球を凍結乾燥する工程を含む、
特許請求の範囲第２３項記載の方法。
（２５）特許請求の範囲第２３項の生成物を含む組成物
。
（２６）特許請求の範囲第２４項の生成物を含む組成物
。