JPS62190081A - 酵素又は微生物菌体の粒状固定化成形物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素又は微生物菌体の固定化法に関しさらに詳
しくは酵素又は微生物菌体を粒状成形物として固定化す
る方法に関する。

酵素又は微生物の固定化法としては、従来から包括法、
物理的吸着法、共有結合法等多くの方法が知られている
。これらの方法によって得られる塊状あるいはシート状
の固定化物は、微生物反応や酵素反応に使用する場合に
は、細かく切断したり磨砕したりした後カラムに充填す
るのが普通である。しかしその場合固定化物は面同志で
密着することが多く、微生物反応や、酵素反応の効率が
悪くなり、また、しばしばチャネリング現象を起こして
カラムを閉塞する等の欠点もある。

これらの欠点は酵素又は微生物菌体を粒状成形物として
固定化することができれば、流動しゃす〈カラムへの充
填作業が容易になり、粒子同志の接触面積も少なく微生
物反応や酵素反応の効率をアップすることができる。酵
素又は微生物菌体を粒状成形物として固定化する方法に
ついては、固定化担体としである種の親水性光硬化性樹
脂と多価金＆ｓイオンとの接触によりゲル化する能力の
ある水溶性高分子多糖類との組合せにより、水性媒体か
ら粒状固定化物を製造する方法が公知である。（公開特
許公報　昭５９−１１１８２）この方法は酵素又は微生
物菌体の活性をそこなうことなく水性媒体から極めて簡
単に粒状固定化物を製造することができるが、固定化担
体としである種の親水性光硬化性樹脂と多価金属イオン
との接触によりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖
類を用い、これに光重合開始剤、酵素又は微生物菌体を
加えた液状組成物を、多価金属イオンを含有する水性媒
体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させ、次いで得
られる粒状ゲルに水性媒体中で活性光線を照射して該粒
状ゲル中の光硬化性樹脂を硬化させる方法であるため、
水性媒体中の溶存酸素濃度が高いと光硬化性樹脂の光硬
化性が低下するという欠点がある。特に光硬化性樹脂の
重合禁止剤として、酸素と結合して重合禁止作用を示す
ハイドロキノン等が用いられているとこの傾向は著しい
、光硬化性樹脂の硬化が不十分であると包括固定化する
酵素又は菌体の粒子からのもれや水性媒体のにごすなと
好ましくない結果を生じる。溶存酸素の影響を除くには
水性媒体中への粒状滴下と活性光線照射を不活性ガス中
で行うというめんどうな操作を必要とする。

本発明者らはこれらの欠点を克服し、水性媒体中の粒状
固定化に際し、水性媒体中の溶存酸素や光硬化性樹脂中
の重合禁止剤の影響を除去する方法を鋭意研究した結果
本発明にいたった。

本発明の特徴は酵素又は微生物菌体の粒状固定化成形物
の製造に際して （ａ）　　　１分子中に少なくとも２個のエチレン性不
飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂（ｂ）　　光重合
開始剤 ＣＣ）　　　多価金属イオンとの接触によりゲル化する
能力のある水溶性高分子多糖類 （ｄ）　　酵素又は微生物菌体 を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンとアスコル
ビン酸又はアスコルビン酸ナトリウムを含有する水性媒
体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させ、次いで得
られる粒状ゲルに活性光線を照射して該粒状ゲル中の光
硬化性樹脂を硬化させることにある。この水性媒体中に
含有されるアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリウ
ムが、その還元作用により光硬化性樹脂中に含まれるノ
＼イドロキノンなどの水性媒体中の溶存酸素の酸化によ
るベンゾキノンの生成を防いで、光硬化性樹脂の硬化性
の向上に著しい効果がある。その結果包括固定化した酵
素又は菌体の粒子からのもれや水性媒体のにごりを著し
く少なくすることができる。また、ベンゾキノンなどの
様な溶存酸素の存在にかかわりなく重合禁止作用を示す
重合禁止剤を光硬化性樹脂の重合防止に使用した場合で
も、水性媒体中のアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナ
トリウムによりベンゾキノンを重合禁止作用の小さいハ
イドロキノンに還元して光硬化性を向上させることがで
きる。

以下本発明の方法についてさらに詳しく説明する。

／　ａ　”Ｉ　　ＭＪ　＋　硅”ＩＩ　Ｊａ　ＩＰ　ｈ
ｋ　ｋｍ　Ｗｋ本発明の方法においては、固定化担体の
１つとして、１分子中に少なくとも２個のエチレン性不
飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂を使用する。該光
硬化性樹脂としては、一般に３００〜３０．０００、好
ましくは５００〜２０，０００の範囲内の数平均分子量
を有することができ、また、酵素又は微生物菌体を懸濁
させた水性媒体中に均一に分散するに充分なイオン性又
は非イオン性の親水性基、例えば水酸基、カルボキシル
基。

リン酸基、スルホン酸基、アミン基、エーテル結合など
を含み、且つ波長が約２５０〜約６００ｎｍの範囲内の
活性光線を照射したとき、硬化して水に実質的に不溶性
の樹脂に変わるものが好適に使用される。そのような光
硬化性樹脂は酵素又は微生物菌体の固定化担体として既
に知られており（例えば、特公昭５５−４０号公報、特
公昭５５−２０６７６号公報等参照）、代表的なものと
して以下ｉこ記載するものを挙げることができる＝（１
）　　高酸化不飽和ポリエステル類：例えば、無水マレ
イン酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、無水イタ
コン酸などの不飽和多価カルボン酸の少なくとも１種と
、トリメリット酸、無水トリメリット酸、ピロメリット
酸、無水ピロメリットａなどの飽和多価カルボン酸の少
なくとも１種とからなる多価カルボン酸成分と、多価ア
ルコールとのエステル化により得られる酸価が４０〜２
００の範囲内の不飽和ポリエステルの塩類；無水マレイ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、無水イタコ
ン酸などの不飽和多価カルボン酸の少なくとも１種と、
１分子中に３個より多いヒドロキシル基を有する多価ア
ルコールを少なくとも５車間％含む多価アルコール成分
とのエステル化物中の残存ヒドロキシル基に酸無水物を
反応させて得られる酸価が４０〜２００の範囲内の不飽
和ポリエステル類など。

（１１１高酸化不飽和エポキシド類：ボリグリシジル化
合物例えばシェルケミカル社製のエピコート８２８、エ
ピコート１００１．　エピコート１００’４などのｎ当
量と多価カルボン酸、例えばマレイン酸、アジピン酸、
トリメリット酸などの（ｎ−１）当量と（メタ）アクリ
ル酸などの不飽和カルボキシル化合物２当量との付加反
応物に残存するヒドロキシル基にｍｆ＃水物を付加して
得られる酸価が４０〜２００の範囲内の不飽和エポキシ
ド類；上記の如きポリグリシジル化合物ｎ当量と上記の
如き多価カルボン酸（ｎ＋２）当量との付加反応物に残
存するヒドロキシル基に酸無水物を付加させて得られる
化合物に（メタ）アクリル酸グリシジルなどの不飽和グ
リシジル化合物を反応させて得られる酸価が４０〜２０
０の不飽和エポキシド類など。

Ｇ１１ｌ　　アニオン性不飽和アクリル樹脂類：ここで
アニオン性不飽和アクリル樹脂とは、（メタ）アクリル
酸及び（メタ）アクリル酸エステルから選ばれる少なく
とも２種の（メタ）アクリル糸上ツマ−を共重合させて
得られるカルボキシル基、リン酸基及び／又はスルホン
酸基を含有する共重合体に光重合可能なエチレン性不飽
和基を導入した樹脂であり且つ下記式 ％式％（１） ［式中、Ｃは樹脂中のカルボキシル基の濃度（鵬０文／
　ｋｇ）であり、Ｐは樹脂中のリン酸基濃度（ｇｏ文／
　ｋｇ）であり、Ｓは樹脂中のスルホン酸基濃度（霧ｏ
Ｊｌ／ｋｇ）である］によって算出されるＡの値が０．
８〜５（■ｏｆ／ｋｇ）の範囲内にあり、そして該樹脂
中の光重合可能なエチレン性不飽和基の濃度が０．１〜
５（腸０交／に８）の範囲内にある樹脂をいう、かかる
共重合体は公知の方法で合成することができ、その際、
コモノマーとしてアクリル酸、メタクリル酸などの不飽
和カルボン酸を使用すればカルボキシル基を含有する共
重合体が得られ、コモノマーとしてホスマーＭ、ホスマ
ーＣＩ［両者とも油脂製品■製コなどの不飽和リン酸エ
ステルを用いればリン酸基を含有する共重合体が得られ
、また、コモノマーとして（メタ）アクリル酸−２−ス
ルホエチル、　（メ々）７〃リル酩−３−スルホプロピ
ルなどの不飽和スルホン酎エステルを使用すればスルホ
ン酸基を含有する共重合体が得られる。かくして得られ
る共重合体に光重合可能なエチレン性不飽和基を導入す
るためには、該共重合体中に存在するカルボキシル基、
リン酸基又はスルホン酸基に（メタ）アクリル酸グリシ
ジルなどの不飽和グリシジル化合物を反応させることに
よって可能となる。

（財）　カチオン性不飽和アクリル樹脂：例えば、（メ
タ）アクリル酸−２−ジエチルアミンエチル、（メタ）
アクリル酸−ｔｅｒｔ−ブチルアミノエチル、ビニルピ
リジンなどの不飽和アミノ化合物を５重量％より多い敬
を含む（メタ）アクリル酸エステルの共重合体に、（メ
タ）アクリル酸グリシジルなどの不飽和グリシジル化合
物を反応させて得られる不飽和アクリル樹脂；ポリスチ
レンをクロロメチル化後、不飽和アミノ化合物で第４級
化して得られる不飽和アクリル樹脂；ポリエチレンイミ
ンと不飽和グリシジル化合物との付加物など。

（ｖ）　　ポリエチレングリコールと（メタ）アクリル
酸とのポリエステル類：例えば、分子量４００〜１００
００で３０重沿％未満のプロピレンオキシド基を含むポ
リエチレングリコールの（メタ）アクリル酸などの不飽
和モノカルボン酸のジエステル；ｎモルの無水マレイン
酸などの２塩基酸と（ｎ＋１）モルの分子量６００〜１
００００のポリエチレングリコールおよび２モルの（メ
タ）アクリル酸などの不飽和モノカルボン酸のエステル
化物；ｎモルのトリメリット酸などの３塩基酸とｎ＋２
モルの分子量６００−１００００のポリエチレングリコ
ールおよび３モルの（メタ）アクリル酸などの不飽和カ
ルボン酸のエステル化物など。

（虜）　　ポリエチレングリコールと（メタ）アクリル
酸２−ヒドロキシエチルとのウレタン化付加物類：例え
ば、ｎモルのトリレンジイソシアネート、キシリレンジ
イソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなど
のジイソシアネートと（ｎ−１）モルの分子量８００〜
１００００のポリエチレングリコールおよび２モルの（
メタ）アクリル酎２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モ
ノヒドロキシ化合物とのウレタン化物；ｎモルのデスモ
ジュールＬ（バイエル社製）などのトリイソシアネート
と（ｎ−１）モルの分子量８００〜１００００のポリエ
チレングリコ−Ｊしおよび（ｎ＋２）モルの（メタ）ア
クリル酸２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒドロ
キシ化合物とのウレタン化物；１モルのトリメチロール
プロパンなどの３官能性ヒドロキシ化合物と４モルのジ
イソシアネートと２モルの分子量４００〜１００００の
ポリエチレングリコールおよび２モルの（メタ）アクリ
ル酸２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒドロキシ
化合物とのウレタン化物など。

一不飽和セルロース類：例えば、セルロースアセテート
フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタ
レート、ヒドロキシエチルセルロースなどの水溶性のセ
ルロースと（メタ）アクリル酸グリシジルなどの不飽和
グリシジル化合物又は無水イタコン酸、無水マレイン酸
などの不飽和酸無水物との付加反応物。

−不飽和ポリアミド：例えば、１モルのトリレンジイン
シアネート、キシリレンジイソシアネートなどのジイソ
シアネートと１モルのアクリル酸２−ヒドロキシエチル
などの不飽和ヒドロキシ化合物との付加物をゼラチンな
どの水溶性ポリアミドに付加反応させた不飽和ポリアミ
ド。

以上に例示した如き光硬化性樹脂はそれぞれ単独で使用
することができ、或い、は２種もしくはそれ以上組合わ
せて使用してもよい、これら光硬化性樹脂のうち、本発
明において特に有利に使用しうるちのとしては、前記（
ｖ）のポリエチレングリコールと（メタ）アクリル酸と
のポリエステル類及び（ロ）のポリエチレングリコール
と（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルとのウレタ
ン化付加物を挙げることができる。

（ｂ）　　光重合開始剤 １−　　ｔ、ｌ　　　（ｏ　　’＋　　　ｔｆ　Ａｘ’
？−を１ａｌ’ｒｋｋｍｍｋｒｒ＋　半１７４５　ｈテ
　［ｉを促進する目的で、本発明に従う液状組成物には
光重合開始剤（光増感剤）を含ませる。使用しうる光重
合開始剤は光照射により分解してラジカルを生成し、こ
のものが重合開始種となって重合性不飽和基を有する樹
脂間に橘かけ反応を起こさせるもので、例えばベンゾイ
ン、アセトインなとのα−カルボニルアルコール類；ベ
ンゾインメチルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、
ベンゾインプロピルエーテル、アニソインエチルエーテ
ル、ピバロインエチルエーテル等のアシロインエーテル
類；ナフトール、ヒドロキシアントラセンなどの多環芳
香族化合物類ツメチルベンゾイン、α−メトキシベンゾ
インなどのα−と換アシロイン類；２−シアノー２−ブ
チルアゾホルムアミドなどの７ゾアミド化合物類；硝酸
ウラニル、塩化第２鉄などの金属塩類；メルカプタン類
；ジスルフィド類；ハロゲン化合物類；染料類等をあげ
ることができる。

これらの光重合開始剤は単独又は２種以上組合せて通常
０　、　Ｏｌ　＝　ｌ　ＯｐＨＲ（ｐｅｒ　ｈａｎｄｒ
ｅｄ　Ｒｅｓｉｎ）の割合で使用できる。

（ｃ）　　水溶性高分子多糖類 本発明の方法は、酵素又は微生物菌体の固定化担体の水
性媒体中でのゲル化を達成するために、固定化担体とし
て、前（ａ）項に述べた光硬化性樹脂と組合わせて水溶
性高分子多糖類を使用することに１つの大きな特徴があ
る。

本発明において使用する水溶性高分子多糖類は、水溶性
であり、水性媒体中で多価金属イオンと接触したときに
水に不溶性又は難溶性のゲルに変化する能力のある高分
子多糖類で、一般に約３．０００〜約２，０００，００
０の分子量を有し、また、多価金属イオンと接触させる
前の水溶性の状態で通常少なくとも約１０ｇ／１（２５
℃）の溶解度を示すものが好適に使用される。

かかる特性をもつ水溶性高分子多糖類の具体例としては
、アルギン酸のアルカリ金属塩、カラギーナン、マンナ
ン、キトサン等が包含される。

これら水溶性高分子多糖類は水性媒体中に溶解した状Ｅ
；で、多価金属イオン、例えばマグネシウムイオン、カ
ルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオ
ン等のアルカリ土類金属イオン或いはアルミニウムイオ
ン、セリウムイオン、ニッケルイオン等の他の多価金属
イオンのうちの少なくとも１種の多価金属イオンと接触
するとゲル化しうる。なお、本発明において使用しうる
水溶性高分子多糖類は、すべての多価金属イオンの接触
に対してゲル化能を有している必要はなく、少なくとも
１種の多価金属イオン、好ましくはアルカリ土類金属イ
オンと接触した時にゲル化する能力を有していれば充分
である。ゲル化が起る多価金属イオンの濃度は水溶性高
分子多糖類の種類等により異なるが、一般には少なくと
も０．１簡０文／文である。

Ｃｄ）　　酵素又は微生物菌体 本発明の方法により固定化しうる酵素又は微生物菌体の
種類には特に制約はなく、本発明の方法によれば、どの
ような種類の酵素又は微生物菌体でも、その酵素活性を
実質的に失活させることなく固定化することができる。

しかして、本発明の方法によって固定化しうる酵素及び
微生物菌体の代表例を示せば次のとおりである。

（イ）酵素の例 ラクテートオキシダーゼ（１，１，３，２）、グルコー
スオキシダーゼ（１，１，３，４）、アルデヒドオキシ
ダーゼ（１，２，３，１）、キサンチンオキシダーゼ（
１，２，３，２）、ピルビン酸オキシダーゼ（１，２，
３，３）。

ピルビン酸リダクターゼ（１，２，４，１）、３−ケト
ステロイドΔ４−デヒドロゲナーゼ（１，３，９９，５
）、 Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ （１，４，１，１）、 Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （１，４，１，３）、 Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ （１，４，３，２）、 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ （１，４，３，３）、 ピリドキサールリン酸オキシダーゼ （１，４，３，５）、 カタラーゼ（１，１１，１，６）、 カテコールメチルトランスフェラーゼ （２、１、１、６）、 （２、３、１、９）、 アスペルテートアミノトランスフェラーゼ（２，６，１
，１）、 アラニンアミノトランスフェラーゼ （２、６、１、２）、 ピリドキサミンピルベートトランスフェラーゼ（２，６
，１）、 ヘキソキナーゼ（２，７，１１）、 グルコキナーゼ（２，７，１，２）、 フルコトキナーゼ（２，７，１，４）。

ホスホグルコキナーゼ（２，７，１，１０）、ホスホフ
ルクトキナーゼ （２，７，１，１１）、 ピルベートキナーゼ（２，７，１，４０）、カルボキシ
エステラーゼ（３，１，１，１）、アリールエステラー
ゼ（３、１、１、２）、リパーゼ（３，１，１，３）、 ホスホリパーゼＡ（３，１，１，４）、アセチルエステ
ラーゼ（３、ｌ　、　１　、６）、コレステロールエス
テラーゼ （３、１、１、１３）　　、 グルコアミラーゼ（３，２，１，３）、セルラーゼ（３
，２，１，４）、 イヌラーゼ（３、２、１、７）、 α−グルコシダーゼ（３，２，１，２０）、β−グルコ
シダーゼ（３，２，１，２１）、α−ガラクトシダーゼ
（３，２，１，２２）、β−ガラクトシダーゼ（３，２
，１，２３）、インベルターゼ（３，２，１，２６）、
ペプシン（３，４，４，１）、 トリプシン（３、４、４、４）、 キモトリプシンＡ（３，４，４，５）、カテブシンＡ（
３，４）、 パパイン（３，４，４，１０）、 トロンビン（３，４，４，１３）、 アミダーゼ（３，５，１，４）。

ウレアーゼ（３，５，１，５）、 ペニシリンアシダーゼ（３，５，１ｌｌ）、アミノアシ
ラーゼ（３，５，１，１４）、アデニンデアミナーゼ（
３、５、４、２）、Ａ、Ｔ、Ｐ、アーゼ（３、６、１、
３）、ピルベートデカルボキシラーゼ （４，１，１，ｌ）、 オキザレートデカルボキシラーゼ （４，１，１，２）、 トリプトファンデカルボキシラーゼ （４，１，１，２７）、 アルドラーゼ（４，１，２，１３）、 マレートシュダーゼ（４，１，３，２）、トリプトファ
ンシンターゼ （４，２，１，２０）、 アルドラ−ゼ（４，３，１，１）、 リジンラセマーゼ（５，１，１，５）、グルコース−６
−リン酸インメラーゼ （５、３、１、９）、 ステロイドΔ−インメラーゼ （５，３，３，１）、 マクシニルＣｏＡシンセターゼ （６、２、１、５）、 など。

（註）カッコ内の数字は酵素番号を表わす。

（ロ）　微生物菌体の例： ラクトバチルス・ブルガリクス （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
）。

アエロバクタ−・アエロバクタ （Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、バチ
ルス−ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、プロテウス−ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ）、ｘ−、シェリシア・コリー（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、シュードモナス番プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）。

アクロモバクタ−ｅリクイダム （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｌｉｑｕｉｄｕｍ）、
クルブラリア会ルナータ （ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　１ｕｎａｔａ）、コリネバク
テリウム・グルタミカム （ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｌ）。

ノカルディア・ロドクラス （Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｒｈｏｄｃｒｏｕｓ）、サー２カ
ロミセスφフォルモセンシス （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｆｏｒｍｏｓｅｎｓ
ｉｓ）　　、サツカロミセスΦセルビシア （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）、サツカロミセスφカルスベルゲンシス （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅ
ｎｓｉｓ）、サツカロミセス・ロブスタス （Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　　ｒｏｂｕｓｔｕｓ
）、サツカロミセス・ロキシイ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｒｏｕｘｉｉ）、（
Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｊａｒ）、
ジゴサッ力ロミセス・ツヤ （Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍ７ｃｅｓ　５ｏｙａ）。

チゾサッ力ロミセス・ボンポ （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｐｏｍ
ｂｏ）　　、など。

液ＩＪＷ戚１びｂ礼公： 以上に述べた（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各成
分は、水性媒体中で相互に充分に混合することにより液
状組成物にすることができる。使用しうる水性媒体とし
ては、水又は緩衝水溶液が好適であるが、場合によって
は水溶性アルコール類と水又は緩衝水溶液との混合液、
水溶性ケトン類と水又は緩衝水溶液との混合液、水や緩
衝水溶液と均一に混合しうるエステル系溶剤溶液などを
使用することもできる。

上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各成分の相互
の使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の
種類等に応じて広範にわたって変えることができるが、
一般には、（ａ）成分の親水性光硬化性樹脂１００重量
部に対し、下記の割合で使用するのが適当でる（カッコ
内は好適範囲である）。

（ｂ）光重合開始剤・０．５〜５重量部（１〜３屯：、
一部） （ｃ）　　水溶性高分子多糖類　：　０．５〜１５重融
部（１〜８重に部） （ｄ）　　酵素又は微生物菌体　：０．００１〜５０重
量部（０，０１〜２０重量部） また、水性媒体は上記（ａ）〜（ｄ）の合計に対して１
０〜１５００重量部（５０〜９ｏｏ重闇部）の範囲で使
用することができる。

Ｌ土部： 上記の如くして調製された液状組成物は次いで多価金属
イオンとアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリウム
を含有する水性媒体中に滴下することにより粒状にゲル
化される。

上記水性媒体中に含ませうる多価金属イオンとしては、
該液状組成物中の水溶性高分子多糖類をゲル化させる能
力のあるものが選ばれる。その際該多価金属イオンが該
水溶性高分子多糖類をゲル化させる能力を有しているか
否かは、例えば、親水性光硬化性樹脂と水溶性高分子多
糖類を均一に含む混合水溶液を該多価金属イオン液に滴
下して粒状にゲル化するかどうか観察することにより容
易に決定することができる。

また、上記水性媒体中に含ませるアスコルビン酸、また
はアスコルビン酸ナトリウムは、滴下する液状組成物中
の光硬化性樹脂に含まれるハイドロキノンなどが、水性
媒体中の溶存酸素による酸化で重合禁止性の強いベンゾ
キノンなどに変化して光硬化性を低下させるのを防ぐ働
きをする。

選ばれた多価金属イオノンとアスコルビン酸又はアスコ
ルビン酸ナトリウムを含有する水性媒体の調製は、水性
媒体中に、該多価金属の水溶性化合物、例えば該多価金
属のハロゲン化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、硝酸
塩等を溶解した後、アスコルビン酸又はアスコルビン酸
ナトリウムを溶解することにより行なうことができる。

その際の水性媒体中の多価金属イオンの濃度は、一般に
０．０１〜Ｓｍｏ文／ｆＬ、好ましくは０．１〜２ｍｏ
！Ｌ／４の範囲内とすることができる。一方。

アスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリウムの濃度は
、一般に０．００１−１腸０交／文、好ましくはｏ　、
ｏｏｓ〜０　、１　ｍｏｆ　／ｌの範囲内とすることが
できる。

かかる多価金属イオンとアスコルビン酸又はアスコルビ
ン酸ナトリウムを含有する水性媒体中への前記液状組成
物の滴下は、例えば注射針のような先の細い管の先端か
ら該液状組成物を滴下する方法、遠心力を利用して該液
状組成物を粒状に飛散させる方法、スプレーノズル先端
から該液状組成物を霧化して粒状として滴下する方法な
どの方法により行なうことができる０滴下する液滴の大
きさは最終の粒状固定化物に望まれる粒径に応じて自由
に変えることができるが１通常は直径が約０．１〜５■
組好ましくは約０．５〜３層層の液滴として滴下させる
のが好都合である。

滴下した液状組成物は水性媒体中で多価金属イオンと接
触し、直ちにゲル化して、粒状のゲルとなる。その際の
ゲル化の機構は正確にはわからないが、水溶性高分子多
糖類がハロゲン化物又は塩溶液により凝東し、ついで水
溶性高分子多糖類に含まれるアニオン基が多価全屈イオ
ンを介して、イオン結合することにより三次元的に架橋
してゲル化するものと推定される。

上記ゲル化の温度は通常室温で充分であるが、必要によ
り酵素又は微生物菌体が失活しない程度の加温下にゲル
化を行なってもよく、あるいは冷却下に行なってもよい
。

笈硬進： 上記の如くして生成せしめた粒状ゲルは、そのまま水性
媒体中に分散させた状態で、活性光線を照射することに
より、該粒状ゲル中の親水性光硬化性樹脂を硬化せしめ
る。この際、水性媒体中に含まれるアスコルビン酸又は
アスコルビン酸ナトリウムは、光硬化性樹脂中に含まれ
るハイドロキノンなどが、水性媒体中の溶存酸素による
酸化で、重合禁止性の強いベンゾキノンなどに変化して
光硬化性を低下させるのを防ぐ、これは、アスコルビン
酸又はアスコルビン酸ナトリウムがその還元性によりベ
ンゾキノンなどを重合禁止性の弱いハイドロキノンなど
に還元するためと思われる。光硬化性樹脂に含まれるハ
イドロキノンなどが、樹脂保存中あるいは液状組成物配
合時にベンゾキノンなどに酸化されて粒状ゲル中に含ま
れる場合、光硬化性樹脂の重合禁止剤としてベンゾキノ
ンなどが使用されて粒状ゲル中に含まれる場合も同様に
水性媒体中でアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリ
ウムにより、重合禁止作用の弱いハイドロキノンなどに
還元されて光硬化性が向上する。光硬化性樹脂の硬化に
より粒状ゲルは木に実質的に不溶性で機械的強度の大き
い酵素又は微生物菌体の粒状固定化物が得られる。

上記光硬化に使用しうる活性光線の波長は該粒状ゲル中
に含まれる光硬化性樹脂の種類等に応じて異なるが、一
般に約２５０〜約６００ｎｍの範囲内の波長の光を発す
る光源を照射に使用するのが有利である。そのような光
源の例としては、低圧水銀灯、°高圧水銀灯、蛍光灯、
キセノンランプ、カーボンアーク灯、太陽光等があげら
れる。照射時間は光源の光の強さ、光源からの距離等に
応じて変える必要があるが、一般には約０．５〜約１０
分間の範囲内とすることができる。照射は生成せしめた
全粒子ゲルに活性光線が出来るだけ゛まんべんなく行き
わたるようにすべきである。

このように照射処理が終った粒状ゲルは氷島、るいは、
緩衝水溶液で洗浄し、そのまま保存に供したりあるいは
粒状ゲルを凍結乾燥して保存することができる。

かくして本発明により粒径が約０．５〜約５腸■の酵素
又は微生物菌体の粒状固定化物が、極めて簡単な操作で
製造することができ、連続的生産も可能である。

本発明の利点は、光硬化性樹脂を固定化担体として水性
媒体中へ滴下した粒状ゲルに光照射して酵素又は微生物
菌体を粒状固定化するに際して、光硬化性樹脂の重合禁
止剤や水性媒体中の溶存酸素による硬化不良を防止する
ことにある。これにより包括固定化した酵素又は菌体の
粒子からのもれや水性媒体のにごりを著しく少なくする
ことができ、粒状固定化酵素又は菌体の活性を向上させ
る効果がある。

次に実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ ハイドロキノン２ｇを含み、数平均分子量４０００のポ
リエチレングリコール２０００ｇとインホロンジイソシ
アネート１モル（２２２ｇ）およびメタクリル酸２−ヒ
ドロキシエチル１モル（１３０ｇ）からなる光硬化性樹
脂１００重量部と、ベンゾインイソブチルエーテル２重
量部および蒸留水１００重量部をよく混合する。これに
２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００重量部および０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）にとかした酵素インベル
ターゼ（０，１％濃度）１００重敬部を加えると共によ
く混合し、得られる光硬化性樹脂−酵素混合液を０．５
Ｍ塩化カルシウム溶液と０．０５Ｍアスコルビン酸溶液
のｌ：ｌ混合液中に注射器先端の注射針から液面高さ１
０ｃｍより滴下したところ粒径約２腸層の粒状物が得ら
れた。

この粒状物を平らな底面を有するペトリ更に単層となる
ようにアスコルビン酸を含む塩化カルシウム液と共に移
し深さ１ｃｍの水溶液中に粒状物が存在するようにして
ベトリ皿の上面及び下面から波長３００〜４００ｎｍの
活性光線を３分照射したところ圧縮強度３０　ｋｇ／　
ｃ＋ｗ２の粒状固定化酵素が得られた０滴下した塩化カ
ルシウム−アスコルビン酸液のにごりを３７５ｎ■の吸
光度で測定したところ０．０１であった。

この粒子のインベルターゼ活性をショ糖を基質として測
定したところ、固定化しないインベルターゼに対する比
活性が８５％であった。

比較のため上記光硬化性樹脂−酵素混合液をアスコルビ
ン酸を含まない０．５Ｍ塩化カルシウム溶液に滴下し光
照射して得られた粒状固定化酵素の圧縮強度は２０ｋｇ
／ｃ腸２、インベルターゼ比活性は６５％であった。ま
た、滴下した塩化カルシウム溶液のにごりは３７５ｎ層
吸光度として０．１を示した。

実施例２ ベンゾキノン０．１ｇを含み、数平均分子量１０００の
ポリエチレングリコール１０００ｇとメタクリル酸２モ
ルとからなる光硬化性樹脂１００重是部に草留水１００
重量部を加えてから約５０℃に加温してよく混合して均
一な樹脂水溶液トシ、これにベンゾインエチルエーテル
２重量部を加えて混合溶解した。

この樹脂混合液に３％アルギン酸ナトリウム水溶液７５
重量部、２％グルコースイソメラーゼ菌体酵素液（重炭
酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８）２５重量部を加えて均一な
混合液を作成した。この均一な混合液を注射針先端から
５％の塩化カルシウムと２％のアスコルビン酸ナトリウ
ムを含む水溶液中に液面より２０ｃ■の位置から滴下し
たところ粒径１．５１の粒状物が得られた。

この粒状物を平らな底面を有するペトリ皿に単層となる
様にアスコルビン酸ナトリウムを含む塩化カルシウム液
と共に移し、深さｌｃ謬の水溶液中に粒状物°が存在す
るようにして上面より３分及び下面より３分間波長３０
０〜４００ｎｍの活性光線を照射したところ圧縮強度４
０　ｋｇ／　ａｍ２の粒状固定化菌体酵素が得られた０
滴下した塩化カルシウム−アスコルビン酸液のにごりを
３７５ｎｍの吸光度で測定したところ０．０５であった
。

この粒状グルコースイソメラーゼの活性をブドウ糖を基
質としてｐＨ８の重炭酸ナトリウム緩衝液中で６０℃に
て測定したところ固定化しないグルコースイソメラーゼ
に対する比活性が９０％であった。

比較のため上記光硬化性樹脂−菌体酵素混合液をアスコ
ルビン酸ナトリウムを含まない５％塩化カルシウム溶液
に滴下し光照射して得られた粒状固定化菌体酵素の圧縮
強度２５　ｋｇ／　ｃｍ２、グルコースイソメラーゼ比
活性は８０％であった。また滴下した塩化カルシウム溶
液のにごりは３７５ｎ■吸光度として０．５を示した。

実施例３ ハイドロキノン０．２ｇを含み、重合度が５００のポリ
ビニルアルコール５００ｇに。

１．０モルのＮ−メチロールアクリルアミドを付１＋ｎ
　ｌ　−ｒ　ｆＭ　＋誉ｍ１ｋｋ、ｋｋＪ　Ｂｌｔｙｆ
ｆｉ　９　ＦＩ　Ｑｌｓ索泣６１００重量部にベンゾイ
ンイソブチルエーテル０．５重量部を均一に混合し、３
％に一力うギーナン水溶液１００重量部及び酵母サツカ
ロミセス・セルビシア（ＡＴＣＣ１０２７５）の菌体ペ
ーストｉ。

重量部（１０％濃度）を均一に混合分散した。しかる後
その分散液を注射器先端から５％の塩化カリウムと２％
のアスコルビン酸ナトリウムを含む水溶液へ滴下したと
ころ球状にゲル化した。その球状ゲルをアスコルビン酸
ナトリウムを含む塩化カリウム液と共にペトリ皿に移し
、上面及び下面から波長３００〜４００ｎ■の活性光線
をそれぞれ３分づつ照射したところ直径３層層の球状固
定化酵母が得られた。この球状ゲル内の酵母総画数を測
定したところｌＸｌ０’個／−であった。

この粒状固定化酵母３ｇに対しグルコース２０％、酵母
エキス０．５％から成るグルコース培地３０−を加え、
３０℃２４時間静置培養させたところ粒状ゲル中の酵母
総画数は６Ｘ　１０’個／ｍｌに増殖し、生成アルコー
ル濃度は１０％であった。また培地への漏菌数は２Ｘ１
０７個／−であった。

これと比較して上記光硬化性樹脂−酵母混合液をアスコ
ルビン酸ナトリウムを含まない５％塩化カリウム溶液に
滴下し光照射して得られた粒状固定化酵母中の酵母総画
数はｌＸｌ０’個／ｗＪであった。この粒状固定化酵母
３ｇに対しグルコース２０％、酵母エキス０．５％から
成るグルコース培地３０ｗＪを加え、３０℃２４時間静
置培養させたところ粒状ゲル中の酵母総画数は５ＸＩＯ
’個／−であり、生成アルコール濃度は５％であった。

また培地への漏菌数は９Ｘ１０’個／ｄであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ａ）１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結
   合を有する親水性光硬化性樹脂 （ｂ）光重合開始剤 （ｃ）少なくとも１種の多価金属イオンとの接触により
   ゲル化する能力のある水溶性高分 子多糖類、及び （ｄ）酵素又は微生物菌体 を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンとアスコル
   ビン酸又はアスコルビン酸ナトリウムを含有する水性媒
   体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させ、次いで得
   られる粒状ゲルに活性光線を照射して該粒状ゲル中の光
   硬化性樹脂を硬化させることを特徴とする酵素又は微生
   物菌体の粒状固定化成形物の製造方法。