JPS62186790A - ↑１↑５ｎ含有物質および植物細胞培養によるその生産 - Google Patents
↑１↑５ｎ含有物質および植物細胞培養によるその生産Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＩＩＩＮ含有物質および植物細胞培養によるそ
の生産、特に１５Ｎ原子を含有する植物細胞培養用培地
、該培地を用いる植物細胞培養方法、該培養方法によっ
て得られる植物細胞培養物、該培養物から１５Ｎ原子含
有物質を採取する方法および該採取方法によって得られ
ろ１５Ｎ含有物質に関する。
の生産、特に１５Ｎ原子を含有する植物細胞培養用培地
、該培地を用いる植物細胞培養方法、該培養方法によっ
て得られる植物細胞培養物、該培養物から１５Ｎ原子含
有物質を採取する方法および該採取方法によって得られ
ろ１５Ｎ含有物質に関する。
（従来の技術）
１５Ｎ原子はいわゆる標識化合物を製造する際の安定核
種の一つとして汎用されており、これまで１５Ｎ原子で
標識した多数の無機および有機化合物が知られている。
種の一つとして汎用されており、これまで１５Ｎ原子で
標識した多数の無機および有機化合物が知られている。
しかｌ−／、、ｉから、これらの化合物は、通常、化学
合成によって製造されており、分子構造が複雑になるに
つれ、１Ｎ原子含有率の高い化合物を合成することは困
難となる。他方、１５Ｎ原子含有率の高い化合物は、近
年、坦ｔへ物に対する生理活性研究用試剤としてその需
要が高まりつつある。
合成によって製造されており、分子構造が複雑になるに
つれ、１Ｎ原子含有率の高い化合物を合成することは困
難となる。他方、１５Ｎ原子含有率の高い化合物は、近
年、坦ｔへ物に対する生理活性研究用試剤としてその需
要が高まりつつある。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者ろは植物細胞の物質生産能を利用し、かつ細胞
培養法を適用ずろことにより１５Ｎ原子含何率の高い化
合物を効率よく生産することを企図し、研究を進めた。
培養法を適用ずろことにより１５Ｎ原子含何率の高い化
合物を効率よく生産することを企図し、研究を進めた。
従来、植物細胞については、これを１５Ｎ原子を高濃度
に含有する培地中で培養した例はなく、従って植物細胞
がそのような１５Ｎ原子含有培地中で生育するか否か、
生育するとして６１５Ｎ原子含有物質を回収可能な程度
に充分に生産ずろことが出来るか否か全く不明であった
。
に含有する培地中で培養した例はなく、従って植物細胞
がそのような１５Ｎ原子含有培地中で生育するか否か、
生育するとして６１５Ｎ原子含有物質を回収可能な程度
に充分に生産ずろことが出来るか否か全く不明であった
。
１１り記したところ明らかなように、本発明の究極の目
的は１５Ｎ原子を高い含有率で含んだ化学物質を植物細
胞の化学物質生産能を利用して効率よく製造することに
ある。植物細胞には普通の”Ｎ原子と”Ｎ原子とを識別
する能力はないものと考えられるから、生産される化学
物質中に１５Ｎ原子を高い含有率で含有さＵ”ろノこめ
に１よ、ｈｔｌ物８４１１胞を培養・１−ろ培地中にｌ
ｂ Ｎ原子を高濃度に含有ｕ°Ｌめろ必要がカろ。そ
のような高ａ度の１５Ｎ原子（−７−（Ｅ下で１ＩＣＩ
物細胞か生育することが出来るか否か晶た疑問視された
のであるが、現実には多少の抑制か認められろものの、
概ね良好に生育オろ事実が見出だされた。特に培地中の
１５Ｎ原子濃度を徐々に高めて植物細胞を次第に１５Ｎ
原子に順応せしめろことにより、生育は順調に進行する
。また、生育の進行に応じて目的とする１５Ｎ原子を高
濃度に含有する化学物質が生産される事実が明らかとな
った。
的は１５Ｎ原子を高い含有率で含んだ化学物質を植物細
胞の化学物質生産能を利用して効率よく製造することに
ある。植物細胞には普通の”Ｎ原子と”Ｎ原子とを識別
する能力はないものと考えられるから、生産される化学
物質中に１５Ｎ原子を高い含有率で含有さＵ”ろノこめ
に１よ、ｈｔｌ物８４１１胞を培養・１−ろ培地中にｌ
ｂ Ｎ原子を高濃度に含有ｕ°Ｌめろ必要がカろ。そ
のような高ａ度の１５Ｎ原子（−７−（Ｅ下で１ＩＣＩ
物細胞か生育することが出来るか否か晶た疑問視された
のであるが、現実には多少の抑制か認められろものの、
概ね良好に生育オろ事実が見出だされた。特に培地中の
１５Ｎ原子濃度を徐々に高めて植物細胞を次第に１５Ｎ
原子に順応せしめろことにより、生育は順調に進行する
。また、生育の進行に応じて目的とする１５Ｎ原子を高
濃度に含有する化学物質が生産される事実が明らかとな
った。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたしのであって
、培地中の全窒素原子のうち５０％以上、好ましくは９
５％以上が１６Ｎ原子である植物細胞用培地を使用して
植物細胞の培養を行い、その培痒物から１５Ｎ原子を高
濃度に含有する化学物質を採取する点に特徴がある。
、培地中の全窒素原子のうち５０％以上、好ましくは９
５％以上が１６Ｎ原子である植物細胞用培地を使用して
植物細胞の培養を行い、その培痒物から１５Ｎ原子を高
濃度に含有する化学物質を採取する点に特徴がある。
（作用）
以下、主としてヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕ
ｒａ ｔａｔｕｌａ）を利用した１５Ｎ化アトロビンの
製造を例にとって本発明を説明するが、本発明の技術思
想がこれのみに限定されるものでないことは１１１記お
よび後記の開示から明らかであろう。すなイっら、本発
明はヨウシュチョウセンアサガオに限らず種々の植物細
胞を利用して種々の化学物質を生産する場合に応用され
得るものである。
ｒａ ｔａｔｕｌａ）を利用した１５Ｎ化アトロビンの
製造を例にとって本発明を説明するが、本発明の技術思
想がこれのみに限定されるものでないことは１１１記お
よび後記の開示から明らかであろう。すなイっら、本発
明はヨウシュチョウセンアサガオに限らず種々の植物細
胞を利用して種々の化学物質を生産する場合に応用され
得るものである。
本発明方法により、１５Ｎ原子含打率の高い化学物質を
生産するためには、ＩｓＮ原子を含有する培養培地に所
望の化学物質を産生ずる能力を存する植物細胞を無菌的
に添加する。培養に使用される培地は、液体、固体のい
ずれの培地であってらよく、目的に合イつせて適宜選択
されてよい。たとえばヨウノユヂョウセンアサガオの場
合には、通常ヨウシュチョウセンアサガオの培養に使用
されているリンスマイヤー・スクーグ培地を用い、その
組成物中の窒素を１５Ｎで置き換えたしの（１５Ｎ原ｒ
含〈丁半５０％以上、好ましくは９５％以上）を使用す
ればよい。１５Ｎ含貞率は１００％以上に近い乙のの方
が置換率が高く好上しいが、５０％以上、好上しく（よ
り０％以上、より好ましくは９５％以上のものが適当で
ある。これによって１００％１５Ｎ原子で置換された物
質を得ることが出来る。
生産するためには、ＩｓＮ原子を含有する培養培地に所
望の化学物質を産生ずる能力を存する植物細胞を無菌的
に添加する。培養に使用される培地は、液体、固体のい
ずれの培地であってらよく、目的に合イつせて適宜選択
されてよい。たとえばヨウノユヂョウセンアサガオの場
合には、通常ヨウシュチョウセンアサガオの培養に使用
されているリンスマイヤー・スクーグ培地を用い、その
組成物中の窒素を１５Ｎで置き換えたしの（１５Ｎ原ｒ
含〈丁半５０％以上、好ましくは９５％以上）を使用す
ればよい。１５Ｎ含貞率は１００％以上に近い乙のの方
が置換率が高く好上しいが、５０％以上、好上しく（よ
り０％以上、より好ましくは９５％以上のものが適当で
ある。これによって１００％１５Ｎ原子で置換された物
質を得ることが出来る。
その他の高等植物細胞ではたとえばホワイト培地、ムラ
シゲ・スクーグ培地などを用い、その中の窒素を１５Ｎ
で置換したものが用いられる。クロレラなど藻細胞では
たとえばポルボックス培地、ブリストール培地、ブトマ
ー培地などを用い、その中の窒素を１５Ｎで置換したも
のを使用する。
シゲ・スクーグ培地などを用い、その中の窒素を１５Ｎ
で置換したものが用いられる。クロレラなど藻細胞では
たとえばポルボックス培地、ブリストール培地、ブトマ
ー培地などを用い、その中の窒素を１５Ｎで置換したも
のを使用する。
次に添加した植物細胞の種類や性質に応じて適宜の培地
ｐｌ−１を保持しつつ、適宜の温度で適当期間培養を行
う。たとえばヨウシュチョウセンアサガオの場合には約
２５℃において約２週間にわたり培養を行う。培養方法
は、振とう培養、撹拌培養、静置培養等のどれを選択し
ても構わないが、用いるＮｒＩ物細胞の種類、性質に応
じて適宜決定される。また、培養期間も用いろ培養の種
類や目的とする物質の採取効率に応じて決定される。
ｐｌ−１を保持しつつ、適宜の温度で適当期間培養を行
う。たとえばヨウシュチョウセンアサガオの場合には約
２５℃において約２週間にわたり培養を行う。培養方法
は、振とう培養、撹拌培養、静置培養等のどれを選択し
ても構わないが、用いるＮｒＩ物細胞の種類、性質に応
じて適宜決定される。また、培養期間も用いろ培養の種
類や目的とする物質の採取効率に応じて決定される。
本発明でいう植物細胞培養物とは、培養後の培養液全体
をいい、増殖した植物細胞と使用した培地から成る。ま
た、１５Ｎ原子含有物質には、培谷物から単離される化
合物たけてなく、抽出液、抽出物、細胞乾燥物、その粉
砕物等が含まれる。
をいい、増殖した植物細胞と使用した培地から成る。ま
た、１５Ｎ原子含有物質には、培谷物から単離される化
合物たけてなく、抽出液、抽出物、細胞乾燥物、その粉
砕物等が含まれる。
培養物から植物細胞を分離するには、通常用いられてい
る適宜の分離方法（たとえばろ過、遠心分離、抽出）を
採用すればよい。得られた植物細胞や培地は、凍結乾燥
や熱風乾燥などの方法によって乾燥物にすることが出来
る。乾燥あるいは生の植物細胞や培地からｌ’ｌＮ原子
含有化合物を単離するには、対応する１５Ｎ原子非含有
化合物に適用される分離方法がそのまま採用されてよい
。たとえば化合物がアルカロイドやクロロフィンのよう
な、油溶性のものであればメタノール、アセトン、エー
テル、ベンゼン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて抽
出し、アミノ酸のような水溶性のものであれば熱水、水
性アルコールなどを用いて抽出すればよい。たとえばヨ
ウシュチョウセンアサガオを培養して１５Ｎ化アトロビ
ンを生産する場合、培養物をろ過して液体培地と細胞に
分離した。得られた細胞を有機溶媒（たとえばアセトン
、メタノール）で抽出し、この抽出液から有機溶媒を留
去し、残渣をカラ１、クロマ）・グラフィーに付して１
５Ｎ化アト〔１ビシを採取ずろ。
る適宜の分離方法（たとえばろ過、遠心分離、抽出）を
採用すればよい。得られた植物細胞や培地は、凍結乾燥
や熱風乾燥などの方法によって乾燥物にすることが出来
る。乾燥あるいは生の植物細胞や培地からｌ’ｌＮ原子
含有化合物を単離するには、対応する１５Ｎ原子非含有
化合物に適用される分離方法がそのまま採用されてよい
。たとえば化合物がアルカロイドやクロロフィンのよう
な、油溶性のものであればメタノール、アセトン、エー
テル、ベンゼン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて抽
出し、アミノ酸のような水溶性のものであれば熱水、水
性アルコールなどを用いて抽出すればよい。たとえばヨ
ウシュチョウセンアサガオを培養して１５Ｎ化アトロビ
ンを生産する場合、培養物をろ過して液体培地と細胞に
分離した。得られた細胞を有機溶媒（たとえばアセトン
、メタノール）で抽出し、この抽出液から有機溶媒を留
去し、残渣をカラ１、クロマ）・グラフィーに付して１
５Ｎ化アト〔１ビシを採取ずろ。
口゛Ｎ化物か得られｌこかとうかの確認は、通信１マス
スペクトルて行う。ｌことえば前記１５Ｎ化アト［１ピ
ンの場合、培地中１５Ｎ原子含打率か１００％でなけれ
ば１５Ｎ化アトロビンの親ピークは標桑物質の分子ｆｆ
１１ｃ ｌ？１１２３Ｎ Ｏ，＝ ２８９から完全１５
Ｎ化アｉ・ロビンＣ，７［１，３”Ｎ０２＝２９０にな
ると考えられる。
スペクトルて行う。ｌことえば前記１５Ｎ化アト［１ピ
ンの場合、培地中１５Ｎ原子含打率か１００％でなけれ
ば１５Ｎ化アトロビンの親ピークは標桑物質の分子ｆｆ
１１ｃ ｌ？１１２３Ｎ Ｏ，＝ ２８９から完全１５
Ｎ化アｉ・ロビンＣ，７［１，３”Ｎ０２＝２９０にな
ると考えられる。
培養物から単離された化合物ではなく、抽出物や細胞乾
燥物なとか＋５Ｎ化物であるかどうかの確認は、抽出物
や細胞乾燥物から代表的な成分を単離して、その化合物
が１５Ｎ化物であるかを確認することによって行う。
燥物なとか＋５Ｎ化物であるかどうかの確認は、抽出物
や細胞乾燥物から代表的な成分を単離して、その化合物
が１５Ｎ化物であるかを確認することによって行う。
（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明の実施態様を具体的に説明
する。
する。
実施例１
ヨウシュチョウセンアサガオ（ナス科）の葉から誘導し
て得たヨウンユチョウセンアザガオ培養細胞（０，５ｇ
）を下記組成を有するリンスマイヤー・スクーグ液体培
地中で２５℃において暗所下４週間［４０ｒｌ）ｍで回
転振とう培養した。培地としてはシヨ糖３０ｇ／克、１
５Ｎ化硝酸アンモニウム１．６５ｇ／兇、１５Ｎ化硝酸
カリウム１．９ｇ／４、塩化力ルンウム４４０ｍｇ／ｆ
ｌ、硫酸マグネシウム３７０ｍｇ／４、リン酸二水素カ
リウム１ツ０ｍｇ／児、ホウ酸６゜２ｍｇ／克、硫酸マ
ンガン２２．３ｍｇ／１１．硫酸亜鉛８．６ｍｇ／４１
ヨウ化カリウム０゜８３ｍｇ／克、モリブデン酸ナトリ
ウム０．２５ｍｇ／乏、塩化コバルト２５μｇ／４、硫
酸銅２５μｇ／１、エチレンジアミン四酢酸す）・リウ
ム３７゜３ｍｇ／克、硫酸第一鉄２７．８ｍｇ／４、ミ
オイノノトール＋００ｍｇ／４、グリシジ２ ｍｇ／
ｆｌ、塩酸ピリドキシン０ 、５ ｍｇ／克、ニコチン
酸０ 、５ ｍｇ／１、塩酸チアミン０ 、 ｌ ｍｇ
／克、２，４−ジクロルフェノキン酢酸１０−６Ｍ１カ
イネチン１０−５Ｍを１００Ｊのイオン交換水に溶解さ
せ、ｐＨを６．０に：Ｊ、”Ｊ整し、更に０．２２ｍμ
のメンブランフィルタ−で除菌ろ過したしのを用いた。
て得たヨウンユチョウセンアザガオ培養細胞（０，５ｇ
）を下記組成を有するリンスマイヤー・スクーグ液体培
地中で２５℃において暗所下４週間［４０ｒｌ）ｍで回
転振とう培養した。培地としてはシヨ糖３０ｇ／克、１
５Ｎ化硝酸アンモニウム１．６５ｇ／兇、１５Ｎ化硝酸
カリウム１．９ｇ／４、塩化力ルンウム４４０ｍｇ／ｆ
ｌ、硫酸マグネシウム３７０ｍｇ／４、リン酸二水素カ
リウム１ツ０ｍｇ／児、ホウ酸６゜２ｍｇ／克、硫酸マ
ンガン２２．３ｍｇ／１１．硫酸亜鉛８．６ｍｇ／４１
ヨウ化カリウム０゜８３ｍｇ／克、モリブデン酸ナトリ
ウム０．２５ｍｇ／乏、塩化コバルト２５μｇ／４、硫
酸銅２５μｇ／１、エチレンジアミン四酢酸す）・リウ
ム３７゜３ｍｇ／克、硫酸第一鉄２７．８ｍｇ／４、ミ
オイノノトール＋００ｍｇ／４、グリシジ２ ｍｇ／
ｆｌ、塩酸ピリドキシン０ 、５ ｍｇ／克、ニコチン
酸０ 、５ ｍｇ／１、塩酸チアミン０ 、 ｌ ｍｇ
／克、２，４−ジクロルフェノキン酢酸１０−６Ｍ１カ
イネチン１０−５Ｍを１００Ｊのイオン交換水に溶解さ
せ、ｐＨを６．０に：Ｊ、”Ｊ整し、更に０．２２ｍμ
のメンブランフィルタ−で除菌ろ過したしのを用いた。
培養液をろ過して細胞と培地とに分離し、細胞（約３ｇ
）ヲヘンセンに浸漬した。培地（５０Ｊ）にベンゼン（
５０ｍｊｉｊ）を加え、分岐ロートで振とうしてベンゼ
ン抽出液を得た。細胞のベンゼン抽出液と合わせて、溶
媒を留去し、培養物のベンゼン抽出物（約４ ｍｇ）を
少虫のベンゼンに溶解し、シリカゲル薄層にスポツティ
ングして、 ｎ−ヘキサジと酢酸エチルから成る溶媒で
展開した。風乾した後、標品アトロピンと同一のＲｆ値
を有し、紫外線で発光する。スポットをかき取り、マス
スペクトルで測定した。標品アトロピンはｍ／ｚ２８９
に親ピークか検出される。本サンプルにはｍ／ｚ２９０
に現ピークが観察され、その結果本サンプル中にはアト
ロピンの同位体物質が存在することが確認された。
）ヲヘンセンに浸漬した。培地（５０Ｊ）にベンゼン（
５０ｍｊｉｊ）を加え、分岐ロートで振とうしてベンゼ
ン抽出液を得た。細胞のベンゼン抽出液と合わせて、溶
媒を留去し、培養物のベンゼン抽出物（約４ ｍｇ）を
少虫のベンゼンに溶解し、シリカゲル薄層にスポツティ
ングして、 ｎ−ヘキサジと酢酸エチルから成る溶媒で
展開した。風乾した後、標品アトロピンと同一のＲｆ値
を有し、紫外線で発光する。スポットをかき取り、マス
スペクトルで測定した。標品アトロピンはｍ／ｚ２８９
に親ピークか検出される。本サンプルにはｍ／ｚ２９０
に現ピークが観察され、その結果本サンプル中にはアト
ロピンの同位体物質が存在することが確認された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、培地中の全窒素原子のうち５０％以上が＾１＾５Ｎ
原子であることを特徴とする植物細胞培養用培地。 ２、培地中の全窒素原子のうち５０％以上が＾１＾５Ｎ
原子である植物細胞培養用培地において植物細胞を培養
することを特徴とする植物細胞の培養方法。 ３、培地中の＾１＾５Ｎ原子含量を徐々に高めることに
より植物細胞を＾１＾５Ｎ原子に順応させながら培養を
行う特許請求の範囲第２項記載の培養方法。 ４、培地中の全窒素原子のうち５０％以上が＾１＾５Ｎ
原子である植物細胞培養用培地において植物細胞を培養
することにより得られた植物細胞培養物。 ５、培地中の全窒素原子のうち５０％以上が＾１＾５Ｎ
原子である植物細胞培養用培地において植物細胞を培養
し、得られた植物細胞培養物から＾１＾５Ｎ原子含有物
質を採取することを特徴とする＾１＾５Ｎ原子含有物質
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61030501A JPS62186790A (ja) | 1986-02-13 | 1986-02-13 | ↑１↑５ｎ含有物質および植物細胞培養によるその生産 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61030501A JPS62186790A (ja) | 1986-02-13 | 1986-02-13 | ↑１↑５ｎ含有物質および植物細胞培養によるその生産 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62186790A true JPS62186790A (ja) | 1987-08-15 |
Family
ID=12305566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61030501A Pending JPS62186790A (ja) | 1986-02-13 | 1986-02-13 | ↑１↑５ｎ含有物質および植物細胞培養によるその生産 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62186790A (ja) |
-
1986
- 1986-02-13 JP JP61030501A patent/JPS62186790A/ja active Pending
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