SU1735779A1 - Способ получени ауксинрецепторного белка из растений - Google Patents
Способ получени ауксинрецепторного белка из растений Download PDFInfo
- Publication number
- SU1735779A1 SU1735779A1 SU894749876A SU4749876A SU1735779A1 SU 1735779 A1 SU1735779 A1 SU 1735779A1 SU 894749876 A SU894749876 A SU 894749876A SU 4749876 A SU4749876 A SU 4749876A SU 1735779 A1 SU1735779 A1 SU 1735779A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- protein
- plants
- receptor protein
- obtaining
- auxin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биохимии и физиологии растений. Цель изобретени - повышение чистоты выдел емого ауксинре- цепторного белка. Данна цель достигаетс выделением всей суммы растворимых аук- синсв зывающих белков методом аффинной хроматографии на индолилуксусной кислоте - ацетоамидогексилсефарозе и дополнительной очисткой элюанта на гидрофобной колонке с политетрафторэтиленом дл выделени индивидуального белка. Ё
Description
Изобретение относитс к биохимии и физиологии растений, а именно к способу получени ауксинрецепторного белка из проростков хлопчатника, который может быть использован дл скрининга пестицидов ауксинподобного действи .
Известен способ выделени ауксинсв - зывающих белков специфической культуры клеток табака, требующий дл своего роста гербицид 2,4-Д, т.е. 2,4-дихлорфеноксиук- сусную кислоту, и обогащенный тип ауксин- св зывающих белков, методом аффинной хроматографии на колонке с 5-гидроокси- ИУК-эпоксисефарозе (ИУК-индолилуксус- на кислота). В результате был выделен белок с мол.мае. 150-200 кД, стимулирующий в присутствии ИУК синтез РНК в экспериментах .
Однако в нативном растении присутствует несколько ИУК-св зывающих белков, в св зи с чем применение одностадийного выделени не пригодно дл получени ре- цепторного белка в чистом виде. Кроме того, рецептор выделен из специфической мутан- тной культуры клеток, а не из нативного растени .
Сравнительный анализ предлагаемого изобретени с другими техническими решени ми показал, что в литературе отсутствуют данные по выделению и характеристике ауксинсв зывающих белков из проростков хлопчатника.
1
СО
ел
4
VJ о
Цель изобретени - повышение чистоты выдел емого белка - рецептора индолилук- сусной кислоты (ПУК) из проростков хлопчатника .
Поставленна цель достигаетс выделением всей суммы растворимых ауксинсв - зывающих белков методом аффинной хроматографии на ИУК-ацетамидогексилсе- фарозе и дополнительной очисткой элюата на гидрофобной колонке с использованием в качестве адсорбента политетрафторэтилена дл выделени индивидуального белка и характеристики его рецепторных свойств,
Пример.
Приготовление водного экстракта.
В работе использованы проростки хлопчатника (Gossypium hirsutum L), сорт 175-Ф. Семена обрабатывают концентрированной серной кислотой дл сн ти опушен- ности, замачивают в воде 12 ч и проращивают в темноте на влажной фильтровальной бумаге при 28°С 2-3 сут.
40 г этиолированных проростков измельчают ножницами и гомогенизируют в 10 объемах трис-HCI 50 мМ, рН 7,8, 50 мМ KCI. 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ ЭДТА (этилендиа- минтетрауксусна кислота), 2 мМ дитиотре- итола, 250 мМ сахарозы, в гомогенизаторе Поттера. Гомогенизацию и все операции по выделению провод т при 2-4°С. Гомогени- зат фильтруют через слой б зи и центрифугируют 30 мин на центрифуге при 20 тыс.д., при этом осаждаетс фракци грубых мембран .
В супернатант объемом 430 мл добал - ют сухой сульфат аммони до 80% насыщени , выдерживают на холоду и осадок собирают центрифугированием при 20000 д. в течение 20 мин. Осадок перераствор ют в 5 мл буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,8), нерастворившиес частички удал ют центрифугированием . Супернатант, содержащий 47,8 мг белка, обессоливают на колонке (50x2,5 см) с седафексом G-25, уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,8, и элируют тем же буфером при скорости 30 мл/ч. Белковую фракцию, выход щую в свободном объеме колонки, используют дл дальнейшей работы.
Синтез аффинного сорбента.
Синтез сорбента осуществлен по известной методике. В 120 мл диоксана раствор ют 2,79 г йодуксусной кислоты и 2,7 г N-гидроксисукцинимида. К полученному раствору добавл ют 3,7 г N.N-дициклогек- силсукцинимида. Через 70 мин выпавший осадок дициклогексилмочевины удал ют фильтрованием. 90 мл фильтрата добавл ют к 60 мл суспензии АН-сефарозы, содержащей 10-13 мкМ NH2-rpynn в 0,1 М фосфатном
буфере, рН 7,5, добавление ведут при 4°С. Дл тестировани экранировани аминогрупп к аликвотам добавл ют тринитробен- золсульфонат и по исчезновению
оранжевой окраски суд т об окончании реакции (30 мин). Затем 60 мл йодацетоамидо- гексилсефарозы перенос т на шотовскую воронку и промывают холодным раствором 0,1 М NaCI (2 л). В йодацетоамидный гель
внос т раствор ИУК-индолилуксусной кислоты в концентрации 10 М, предварительно растворенную в диметилформамиде и смешанную с 0,1 М раствором NaHCOs (рН 8,5) в соотношении 1:1. Смесь выдерживают
в течение 3 сут при комнатной температуре. В полученную ИУК-ацетоамидогексилсефа- розу добавл ют 0,2 М раствор 2-аминоэта- нола дл маскировки непрореагировавших йодацетильных групп. По окончании реакции (через 24 ч) аффинный сорбент промывают 0,1 М NaHCOs, рН 8,5 (3 л). Полученный сорбент содержит 10 мкМ ПУК на 1 мл гел . Схема получени сорбента следующа :
25
-кад6шг+ -
(
АН-сефарщ хСНгЗ
щад6нн-с4 0 он
йоЗацетоакиоогексилсефарош
-ЩСНг)6Ш-сЛС6 - LitjJ i|
йобацгтоамидогексип- Н сефароааШ
40
ВДСК ОгСС-ОО 3
сн
ЙУК -аигтоачиОогексилсгфароза
Выделение ИУК-св зывающих белков. Белковую фракцию, содержащую 33,3 мг белка, нанос т на ИУК-ацетоамидогексилсефарозный гель в колонке, размеры которой 10x2,6 см. Аффинную колонку промывают до получени элюата с посто нной оптической плотностью, при 280 нм. Элюцию св завшихс белков осуществл ют
1 М NaCI, при скорости 3 мл/мин. Белковую фракцию диализуют против воды и лиофильно высушивают. Количество белка , св зывающегос с ИУК-ацетоамидогек- силсефарозным гелем, составл ет 4,3 мг,
что дает 9% белка от наносимого на колонку .
Характеристика ИУК-св зывающих белков .
-ООценка рецепторноп св зывани .
Эксперименты по св зыванию провод т , использу фильтрование на нитроцел- люлозных фильтрах марки Сымпор с размером пор 0,4-0,8 мкм по известной методике . Св зывание с водорастворимыми фракци ми провод т в 20 мМ трис-HCI, рН 7,6. При этом используют Н-ИУК с удельной активностью 21 Ки/мМ. Дл оценки уровн неспецифического св зывани примен ют немеченную МУК в концентрации М. Кривые св зывани указывают на один тип св зывающего участка с Кд 6 мМ и с плотностью св зывающих участков 20 пМ/мг белка,
2) Оценка РНК-полимеразной активности.
Из проростков хлопчатника выдел ют хроматин обычным способом. Дл этого проростки хлопчатника гомогенизируют в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 50 мМ трис-HCI, рН 7,8, 0,1 М MgCIa и 0,02 М 2-меркаптозтанол Гомогенат фильтруют через слой нейлоновой сетки и центрифугируют при 1000 д.в течение 10 мин. Осадок, содержащий дра, ресуспендируют в буфере выделени , содержащего 1%-ный трион- Х-100, дважды промывают буфером того же состава, но без триона и центрифугируют при 20000 д. в течение 20 мин. Осадок раствор ют в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI, рН 7,8, 0,02 М MgCte, 1 мМ 2-меркаптоэтанола и 10%-ный глицерин.
Реакционна смесь дл определени РНК-полимеразной активности содержит 0,2 мМ АТФ, ГТФ, УТФ и 0,02 мМ 3(-ЩТФ с удельной активностью 20 Ки/мМ, 0,1 М KCI, 2 мМ ацетата натри , 20 мМ трис-HCI с рН 7,8, 1 мкг, выдел емого ауксинсв зывающе- го белка, 10 мкМ ИУК и 20 мкг хроматина. Реакцию начинают внесением суспензии хроматина. Смесь инкубируют 30 мин при 20°С и останавливают добавлением 50 мкл 10%-ной трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирок фильтруют на фильтрах Сынпор, аналогично эксперименту по св зыванию (1 г). Фильтры высушивают, поме- щают во флаконы со стандартным толуольным сцинтилл тором и измер ют их радиактивность на счетчике Бета-2.
Выделение гомогенного ИУК-св зываю- щего белка с помощью гидрофобной хроматографии .
Очистку ауксинсв зывающего белка
провод т на колонке (12x1 см) с сорбентом Полихром-Г .4,3 мглиофильно высушенного белка перераствор ют в 500 мкл буфера трис-HCI 50 мМ с рН, 7,8 и нанос т на колонку . Элюцию с колонки провод т этанолом
ступенчато: 20 - 40 - 60 - 80 - 96 соответственно . Профиль элюции представлен шестью пиками. П тый пик, элюируемый 96%-ным этанолом, в присутствии ИУК стимулирует РНК-полимеразную активность в препарате хроматина и специфически св зывает Н-ИУК. Получено 0,5 мг белка.
Дл оценки молекул рной массы полученного белка, элюат после аффинной колонки раздел ют на колонке Glas Рас. HW
- 3000 (8x300 мм) с помощью аппаратуры дл высокоэффективной жидкостной хроматографии фирмы LKB. Пик с кажущейс молекул рной массой около 200 кДа, обладает РНК-полимеразной активностью. Электрофорез в ПААГ с ДДС-натри , как дл этого пика, так и дл п того пика, дает одну полосу , соответствующую мол,массе 43 кДа.
Предлагаемое изобретение позвол ет впервые осуществить эффективное выделение ауксинрецепторного белка из нативно- го растени (хлопчатника), который может быть использован в качестве инструмента при проведении скрининга новых пестицидов ауксин подобного действи .
Claims (1)
- Формула изобретениСпособ получени ауксинрецепторного белка из растений, включающий получение водного экстракта растений, осаждение белков и очистку ауксинрецепторного белкахроматографическими методами, отличающийс тем, что, с целью повышени чистоты выдел емого белка, очистку ведут методом аффинной хроматографии с использованием в качестве адсорбентаиндолилуксусна кислота - ацетоамидогек- силсефароза, а затем дополнительно очищают белок методом гидрофобной хроматографии с использованием в качестве адсорбента политетрафторэтилена.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894749876A SU1735779A1 (ru) | 1989-10-25 | 1989-10-25 | Способ получени ауксинрецепторного белка из растений |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894749876A SU1735779A1 (ru) | 1989-10-25 | 1989-10-25 | Способ получени ауксинрецепторного белка из растений |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1735779A1 true SU1735779A1 (ru) | 1992-05-23 |
Family
ID=21474905
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU894749876A SU1735779A1 (ru) | 1989-10-25 | 1989-10-25 | Способ получени ауксинрецепторного белка из растений |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1735779A1 (ru) |
-
1989
- 1989-10-25 SU SU894749876A patent/SU1735779A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Libbenga K.R. et al. Hormones receptor and cellular interactions in plants. Cambridge: Cambridge Univ. press, 1986, p. 1-68. Cuatrecasas P. Advances in enzymology. Interscience. - N.Y., 1972, p. 29-38. Нейрохими , 1985, т. 4, № 3, с. 260-267. Селиванкина С.Ю, и др. Физиологи растений, 1982, т. 29, вып. 2, с, 274. Nature, 1970, v. 227, 1st 5259, p. 680. Mennes A.M. et al. NATO ASI Series, v. 10. - Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, 1987, p. 51-62. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kreuger et al. | Arabinogalactan-protein epitopes in somatic embryogenesis of Daucus carota L. | |
Woodin | Fractionation of a leucocidin from Staphylococcus aureus | |
Riggs et al. | A simple fractionation method for preparation of fluorescein-labeled gamma globulin. | |
Fraenkel-Conrat et al. | Avidin. I. Isolation and characterization of the protein and nucleic acid | |
US4469630A (en) | Purification of monoclonal antibodies | |
Cutler et al. | Carboxyatractyloside: A Compound from Xanthium strumarium and Atractylis gummifera with Plant Growth Inhibiting Properties. The Probable" Inhibitor A" | |
Imoto et al. | Chitin coated cellulose as an adsorbent of lysozyme-like enzymes preparation and properties | |
Chang-Chen et al. | Purification of estradiol-17β dehydrogenase from human placenta by affinity chromatography | |
EP0162462B1 (en) | Purification of type igm monoclonal antibodies | |
DE3230996A1 (de) | Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung | |
SU1735779A1 (ru) | Способ получени ауксинрецепторного белка из растений | |
Smith et al. | B12 vitamins (cobalamins). 1. Vitamins B12c and B12d | |
Romanov et al. | Receptor-like cytokinin-binding protein (s) from barley leaves | |
Ray et al. | A biologically active receptor for the carbohydrate-binding protein (s) of Dictyostelium discoideum | |
US3591678A (en) | Method of purifying intrinsic factor | |
Berglund et al. | [18] ATP-and dATP-substituted agaroses and the purification of ribonucleotide reductases | |
US3846937A (en) | Production of allergens by plant tissue culture technique | |
Silhavy et al. | The “Hidden Ligand” of the Galactose‐Binding Protein | |
Takeuchi et al. | Nicotinamide as a plant growth regulator isolated from rice hulls | |
Dabrow et al. | Specificity of synexin-induced chromaffin granule aggregation | |
SU1154329A1 (ru) | Способ получени фосфорибулокиназы | |
SU1615174A1 (ru) | Способ раздельного получени бесклеточных экстрактов листьев папортника и цианобактерий из симбиотической системы AZoLLa-АNаваеNа aZoLLa | |
Kornberg et al. | [131] Preparation of coenzyme A | |
Maas et al. | A method for selective staining of damaged yeast cells | |
Krivut et al. | Method for the quantitative determination of adlumine in Corydalis sempervirens and as the isolated substance |