JPS62163687A - 細胞培養方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光ユ皇ユ景 Ａ８発■少分立 本発明は細胞培養法に関し、特に、外筒内に配置されて
、生体外の細胞を成長させたり維持したりするための複
数本の実質的に等間隔をへたてた中空ファイバを使用す
る細胞培養に関する。

Ｂ、先丘葺止立註皿 外筒内に束状に配置された複数本の無秩序に配列された
中空ファイバを有する装置で生体外の細胞を培養するこ
とが知られたのはつい最近のことであった。酸素、栄養
物およびその他の化学刺激剤を含む媒体を中空ファイバ
の穴を通して移送する。中空ファイバの外面と外筒の内
壁との間に形成される細胞培養空間で細胞を成長させる
。

中空ファイバを有する培養装置は多くの種類の生体外の
細胞の維持に適していることがわかった。

中空ファイバの質量移送特性は栄養物を細胞培養に送り
出したり老廃生成物を細胞培養から取り出したりする効
率的な手段をなす。老廃物がファイバの壁を通過してフ
ァイバの穴の中に流入する間、細胞の出した生成物を細
胞培養空間の中に維持するために、適当な孔径をもつ中
空うアイバを選択する。

細胞が成長し、繁殖しかつ生成物を分泌してこの生成物
が細胞培養空間に維持されると、分泌生成物は濃縮され
る。濃縮生成物の生産により、中空ファイバ培養装置が
細胞誘導生成物を商業的規模で経済的に製造することが
できるようになる。

しかしながら、先行技術の中空ファイバ培養装置は、細
胞培養空間内の中空ファイバの分布が非常に良くないた
め、細胞密度について自ら制限している。通常、先行技
術は、中空ファイバ装置の多くの例を含み、これらの装
置では、細胞培養空間は、弛く軸線方向に配向した束に
配列させた複数本のファイバで満され、この東では、個
々のファイバが互いに隣り合って細胞培養空間の大きな
割合をふさいでしまう。この無秩序なファイバ配列の存
在では、束の内側には細胞の成長に十分な空間がないの
で、細胞は束の外側に位置するファイバの上で成長する
傾向がある。細胞の培養においてこの状態が生じると、
栄養物の可成りの部分が細胞成長の非常に低いあるいは
存在しない培養空間の領域に分配されて高密度成長の領
域への栄養物の供給およびこの領域からの老廃物の取り
出しが不十分になる。

先行技術の中空ファイバ培養装置のいくつかの例が下記
の特許に記載されている。

発皿煮　　　　　　　　　芽−一一許 マツムラ　　　　　　　　第３，７３４．８５１号ナゼ
ク等　　　　　　　　第３，８２１，０８７号ナゼク等
　　　　　　　　第３，８８３．３９３号オスポーン等
　　　　　　第３．９１１，１４０号デレンテ　　　　
　　　　第３．９９７．３９６号フェダー等　　　　　
　第４．０８７，３２７号ナゼク等　　　　　　　　第
４，１８４，９２２号ナゼク等　　　　　　　　第４，
２００，６８９号フェダー等　　　　　　第４．２０１
．８４５号ナゼク等　　　　　　　　第４，２０６，０
１５号ナゼク等　　　　　　　　第４，２２０，７２５
号チック等　　　　　　　　第４，２４２．４６０号ヨ
シダ等　　　　　　　　第４，３９１．９１２号ヒセイ
　　　　　　　　　第４，３９６，５１０号ミカエルズ
等　　　　　　第４，４４０，８５３号ミカエルズ等　
　　　　　第４，４４２，２０６号下記の特許は透析に
使用する中空ファイバカートリッジの構造を示している
。下記の特許に記載されている透析カートリッジは、細
胞培養装置として使用するのに幾分か適しているが、高
密度環境で成長する細胞のニーズを満たすようには設計
されていない。

光凱音　　　　　　　　　　特−一−−正シエエール等
　　　　　　第４，１４１，８３５号ボドナー等　　　
　　　　第４，２２７，２９５号シエネル　　　　　　
　　第４，２７６．６８７号シェネル　　　　　　　　
第４，２８３，２８４号フィツゲラルド等　　　　第４
，２２６，３７８号シェリーＪｒ、等　　　　　第３，
４９２，６９８号シェリーＪｒ、等　　　　　第３，４
４２，００２号メタ等　　　　　　　　　第４．１７６
、０６９号また、エリカ社（ナショナル・メディカル・
ケア・オブロックレイ、ニュージャシイの一部）および
ＣＤメディカル社（マイアミレーク、フロリダ）により
配布されたパンフレットには、市販の透析カートリッジ
が記載されている。

発凱皇凰要 本発明は、生成内の生きている組織において組織毛細管
が間隔をへだてているのと一般的に同じ距離、間隔をへ
たてた中空ファイバを有する装置で細胞を培養する方法
を含む。この細胞培養装置は外筒および外筒を通して延
び、媒体を通すための複数本の中空ファイバを有する。

中空ファイバは栄養物および化学的刺激剤を細胞に通す
ことができかつ老廃物を中空ファイバの中へ通すための
選択的に半透過性の壁を有している。外筒の内壁と中空
ファイバの外面との間には、生きている細胞を成長させ
たり維持したりするための細胞培養空間が形成される。

中空ファイバは栄養物および化学的刺激剤の効率的な移
送を行ないかつ老廃物を効率的に取り出すように配列さ
れている。好ましくは、中空ファイバは、１つの中空フ
ァイバから次の中空ファイバまでの距離が生体内の生き
ている組織の１つの血液毛細管から次の血液毛細管まで
の距離とほぼ同じであるように縫い糸によって互いに連
結されている。好ましくは、この距離はほぼ２５〜２０
０ミクロンの範囲にある。

好１５ｍ口しｌ對」狡葭匪 本発明の生物反応器を第１図および第２図に一般的に１
０で示しである。この生物反応器１０は外筒１２を有し
、外筒には端キヤツプ部分１４゜１６を有している。第
３図に示すように、外筒１２の中には、内側コア１８が
ほぼ同心に配置されている。外筒１２の中には、−ｉ的
に２２で示す複数の中空ファイバが配置され、これらの
ファイバは外筒の一端から他端まで延びている。コア１
８と外筒１２との間には、ファイバの外側に細胞培養空
間２０が形成されている。

端キャップ１４は入口ポート２４を有し、入口２４によ
り、媒体を矢印２６の方向にコア１８の開口部２８を通
して細胞培養空間の中へ流入させることができる。ポー
ト２４は主として細胞系統を培養空間に接種するのに使
用される。細胞系統を空間２０に定着させたら、ポート
２４を通る流れが一般には止められる。

端キャンプ１６は出口ポート３０を有する。このポート
３０により、媒体を矢印３４で一般的に示すようにコア
１８の開口部３２を流通することによって空間２０から
流出させることができる。

ポート２４に流入して空間２０に入り、ポート３０を通
して空間２０から出る栄養溶液の流れは接種後に止めら
れてもよいし、あるいは栄養物または化学的刺激剤を細
胞培養空間２０内の細胞に供給し続けてもよい。

ファイバ２２は、当業界でよく知られているように外筒
１２の両端で参照符号３６．３８で示すように注封材料
で注封される。キャンプ１４は入口ポート４０を有し、
キャンプ１６は出口ポート４２を有する。入口ポート４
０および出口ポート４２は好ましくは米国特許第４．１
４１．８３５号（シェニール等）に記載されているよう
に接線方向に配置される。またシェニール等の特許に記
載されているように、端キャップ１４と注封材料３６と
の間には、リング状マニホルド室４４が形成され、この
マニホルド室４４はポート４０に流体連結されている。

室４４を使用して媒体を中空ファイバの穴に一様に供給
する。同様に、端キャップ１６と注封材料３８との間に
は、リング状室４６が形成され、このリング状室４６は
出口ポー］・４２に流体連結されている。ポート４２は
中空ファイバ２２を出る媒体の出口をなす。ファイバを
通る流れを逆にするだけで出口ポート４２を入口として
、又入口ポート４０を出口として使用することができる
ことは当業者にはわかるで、あろう。

中空ファイバは、血液毛細管が生きている組織の中で互
に間隔をへだてているように、組織毛細管と、実質的に
同じ距離互いに間隔をへだてている。生体内の生きてい
る！！Ｉｌ織を構成する細胞は組織毛細管または他の同
様な導管からほぼ１００ミクロン以下であると思われる
。個々の中空ファイバを互い最大でほぼ２００ミクロン
へたてることによって、生体内の生きている組織の細胞
密度に等しい細胞密度が達成されることがわかった。更
に、ファイバ間の間隔の範囲は２５〜２００ミクロンで
あれば十分であり、特に１００ミクロンが好ましいとい
うことがわかった。

好ましくは、中空ファイバ２２は第４図に示すように間
隔をへだてて複数の縫い糸４８によって互いに間隔をへ
だてている。中空ファイバを縫い糸によって連結して一
種のマントを形成し、次いで中空ファイバのマントをコ
アに巻きつけることは透析カートリッジの構成において
よく知られている。また、２５〜２００ミクロンの好ま
しい範囲に間隔をへだてたファイバを有する透析カート
リッジが市販されている。このような一種のカートリッ
ジはエリカ社〔ナショナル・メディカル・ケア・オプ・
ロックレイ部にュージャジイ）〕から入手することがで
きる。しかしながら、本発明は、知られていなかった細
胞の培養に上記のような間隔を使用するものである。本
出願人は、中空ファイバの相互の間隔が栄養物の効率的
な移送および中空ファイバから最も遠い位置にある細胞
からの老廃物の効率的な除去に重要であることがわかっ
た。この目的で、第４図に示し、参照符号２２ａ〜２２
ｆで示す個々のファイバは縫い糸４８によってほぼ１０
０ミクロンの距離、間隔をへたてられかつ間隔をへだて
た状態に保持されている。

細胞培養装置の横断面図を示す第５図に図示するように
ファイバの縫い付マントを中空ファイバが細胞培養空間
全体をらせん状に実質的に満すまで中心コア１８に巻き
つける。第６図には、中空ファイバのら旋巻きマットの
３層部分が拡大横断面図で示しである。これらの層は参
照符号５０゜５２．５４で示しである。３層はすべて好
ましくは同一の中空ファイバマットの一部であることが
わかるであろう。これらのＪｉＷ５０，５２．５４は縫
い糸４８によって互いにほぼ１００ミクロン、一般的に
半径方向に間隔をへだでかつ分離されている。縫い糸４
８は本縫いで縫い付けられた２本の個々の糸４８ａ、４
８ｂによって形成される。

各個々の中空ファイバ、例えば、中空ファイバ５０ａを
その周囲の一方の半分を囲む一方の糸４８ａによって又
その周囲の他方の半分を囲む他方の糸４８ｂによって縫
い系内に保持する。次いで、糸４８ａ、４８ｂをほぼ１
００ミクロンの距離互いに結合し、再び分離して次の中
空ファイバ５０ｂを保持する。

糸４８ａ、４８ｂはまた中空ファイバ層５０゜５２．５
４を互に分離する。糸４８ａ、４８ｂは、各中空ファイ
バ例えば中空ファイバ５２ｂが中空ファイバ５０ａ、５
０ｂ、５４ａ、５４ｂからほぼ１００ミクロンに位置決
めされかつ保持されるほどの太さのものである。縫い糸
４８によるファイバの軸線方向の連結かつファイバの相
互の分離は、中空ファイバ表面から１００ミクロン以上
の細胞がないような中空ファイバの３次元網状体を作る
。その結果、最も遠い細胞でも細胞密度の高い環境で十
分な量の栄養物を受けることになる。

また、老廃物が効率的に除去され、細胞の生長または細
胞からの生成物の生産に及ぼす悪影響を最小にする。生
体内の生きている組織に見られる細胞密度と同様の高い
細胞密度が認められた。

細胞培養空間２０内における良好な栄養物の移送および
老廃物の除去を更らに促進するために、本発明の生物反
応器は第１図および第３図に示すように循環ポート５８
，６０．６２を有する。これらのポー）５８．６０．６
２は細胞培養空間２０に流体連結されている。好ましく
は、ポート５８は注封材料３６に近接して外筒の一端に
位置決めされ、ポート６０は注封材料３８に近接して外
筒の反対側の端に位置決めされ、ポート６２はポート５
８．６０から１８０’のところで外筒のほぼ中間に位置
決めされている。ポート６２を入口として使用し、又ポ
ート５８．６０を出口として使用してもよいし、或は流
れを逆にしても良い。

「改良した中空ファイバ培養装置および操作方法」と称
する特許出願第６５８５４９号（クラコウア等、１９８
４年１０月９日出願）および「改良した栄養潅流・生成
物濃縮および操作方法」と称する特許出願第６５８５５
０号（ウォーカ等；　　１９ａ４年ｌθ月９日出ｌｌ１
）〔両出願とも本願の譲受人に譲渡〕には、栄養物を含
有する媒体を細胞培養空間内に循環させることが論じら
れている。

カプロファン中空ファイバを備えた本発明の織成ファイ
バ生物反応器組立体を２種の市販生物反応器と比較した
。市販生物反応器の一方はけん化セルロースアセテート
ファイバを収容しており、他方の市販生物反応器は本発
明の生物反応器と同様のカプロファン中空ファイバを収
容している。

両市販生物反応器では、中空ファイバを束に無秩序に配
列された。本発明の生物反応器は先に述べたような循環
ポート構造すなわち３つのポートを有していなかった。

本発明の生物反応器と両市販生物反応器との間でファイ
バ間隔の確実な比較が行えるようにポート構造５Ｂ、６
０．６２を有していなかった。これらの２つの市販生物
反応器を市販生物反応器＃１および市販生物反応器＃２
と称する。各生物反応器を使用前に１！！の無菌蒸留水
および５００＋＋１の細胞培養媒体で洗浄して湿潤剤お
よび他の水溶性化合物を除去した。媒体溜め器を各生物
反応器と螺動ポンプとの間にシリコーン配管を使用して
直列に設置した。螺動ポンプを使用して市販の媒体を２
００ｍ／／分の流量で生物反応器のファイバに圧送した
。新しい媒体を、系のｐＨを７．０に維持するのに十分
な流量で溜め器の中へ圧送し、使用済みの媒体を約同じ
流量で取り出した。系を３７℃の温度に保った。ガス交
換カートリッジを生物反応器と媒体溜め器との間に直列
に設置しかつ濾過した二酸化炭素１０％および空気９０
％の源に連結した。注射器を使用してＩｇＧ生産ハイブ
リドマ細胞系統の４億個の細胞を試料ポートから各生物
反応器に導入した。１週間に１回、胎児牛の血清１０ｍ
ｊ２を細胞を収容する毛細管外の空間に注入した。ブラ
ッド・ガス・アナライザを使用してｐＨおよび酸素と二
酸化炭素の圧力を監視するために、１週間に３回、毛細
管外の空間および媒体溜め器から試料を取り出した。

また標準分析手順を使用してグルコース、乳酸および抗
体の濃度を監視した。約２週間後、媒体を毛細管外の空
間からｌ＋ｎｊ２／ｈｒ取り出すことを伴う連続収穫を
開始し、抗体の濃度について分析した。

桔ニー、肢 ３つのパラメータ、すなわち、グルコースの消費率、乳
酸の生産率および抗体の生産率の測定により生物反応器
における細胞の成長および代謝を監視した。グルコース
の消費率は初め９日間では３つの生物反応器すべてにお
いて非常にＩ（ＩＩしていた。９日後、本発明の織成フ
ァイバ組立体中の細胞ははるかに速い速度でグルコース
を消費し始め、３５日の終りでは、本発明の織成ファイ
バにおけるグルコースの消費率は第７図に示すようにい
ずれの市販生物反応器におけるグルコースの消費よりぼ
ぼ５倍大きかった。乳酸の生産率は大変似たパターンを
たどり、生産率は初めの９日間では３つの生物反応器す
べてにおいてほぼ同じであったが、織成ファイバ組立体
では、その後、第８図に示すように急速に増大し始めた
。３５日の終りでは、織成ファイバ組立体における乳酸
の生産率は市販生物反応器における生産率より５倍以上
大きかった。また、織成ファイバ組立体における抗体の
生産率は第９図および第１０図に示すように一貫して高
く、市販生物反応器で生産される抗体の生産率の２倍か
ら５倍あたりに及ぶほど大きかった。

猪−一部 ３つのパラメータすべて、すなわち、グルコースの消費
率（第７図に示すような）、乳酸の生産率（第８図に示
すような）および抗体の生産率（第９図および第１θ図
に示すような）は、本発明の生物反応器が、細胞の成長
、代謝および抗体の生産率の裏付けのために市販生物反
応器のいずれのものよりも優れていたことを大変強力に
指示した。また生物反応器の毎日の目視検査により、織
成ファイバにおける細胞密度が市販生物反応器の細胞密
度より著しく大きいことがわかった。

本発明を好適な実施例について説明したが、当業者には
本発明の精神および範囲から逸脱することなしに形態お
よび細部に変形を行い得ることがわかるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養装置の立面図；第２図は第１
図の装置の端面図；第３図は第２図の線３−３に沿った
装置の横断面図；第４図は縫い糸によって作られる中空
ファイバ間の相互の間隔を示す中空ファイバの一部の平
面図；第５図は第３図の線４−４に沿った装置の拡大横
断面図；第６図は縫い糸によって作られる個々の中空フ
ァイバ間の間隔を示す中空ファイバの数層の拡大横断面
図；第７図は本発明の生物反応器と２つの市販生物反応
器との間でＩｇＧ生産ハイブリドマ細胞系統による毎日
のグルコース消費率を比較するグラス；第８図は本発明
の生物反応器と２つの市販生物反応器との間でＩｇＧ生
産ハイブリドマ細胞系統の毎日の乳酸生産率を比較する
グラフ；第９図は本発明の生物反応器と２つの市販生物
反応器とにおける毎日の試料中のＩｇＧの濃度を示すグ
ラフ；第１０図は本発明の生物反応器と２つの市販生物
反応器とにおける１日あたりのＩｇＧの全生産■を示す
グラフである。 １０・・・・・・生物反応器、１２・・・・・・外筒、
１４．１６・・・・・・キャップ部分、１８・・・・・
・内側コア、２０・・・・・・細胞培養空間、２２・・
・・・・中空ファイバ、４８・・・・・・縫い糸、５０
．５２．５４・・・・・・層。 ６枚 日枚 ８牧 ８牧 昭和　　年　　月　　日 １、事件の表示　　昭和６１年特許願第２５０６０８号
２、発明の名称　　　　　細胞培養方法及び装置３、補
正をする者 事件との関係　　出願人 名称　　　エンドトロニックス　インコーホレーテッド
４、代理人 住　所　　東京都千代田区丸の内３丁目３番１号電話（
代’）　２１１−８７４１ ４、′　　。 氏　名　（５９９５）弁理士　中　　村　　　　　稔　
　　゛４査（り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生体外の生きている細胞の維持方法であって、生体
   内の生きている組織に見られる組織毛細管の間隔と実質
   的に同一の距離、互いに間隔をへだてた複数本中空ファ
   イバが延びている生物反応器の細胞培養空間に生きてい
   る細胞を導入し、 媒体を中空ファイバに通すことを 特徴とする方法。 ２、中空ファイバはこれらを複数の縫い糸によって互い
   に連結することによって互いに間隔をへだてられること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、ファイバが互いに平行になるようにファイバを細胞
   培養空間内でコア上に配列することを特徴とする特許請
   求の範囲第２項に記載の方法。 ４、中空ファイバをコアのまわりにら旋状に巻きつけて
   中空ファイバのら旋層を形成することを特徴とする特許
   請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、各ら旋層の最も近い中空ファイバを隣接したら旋層
   の最も近い中空ファイバからほぼ２５〜２００ミクロン
   へだてることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載
   の方法。 ６、中空ファイバを隣接した中空ファイバからほぼ１０
   ０ミクロンへだてることを特徴とする特許請求の範囲第
   ５項に記載の方法。 ７、各ら旋層中の中空ファイバを同じら旋層の隣接した
   中空ファイバからほぼ２５〜２００ミクロンへだてるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ８、中空ファイバを隣接した中空ファイバからほぼ１０
   ０ミクロンへだてることを特徴とする特許請求の範囲第
   ７項に記載の方法。 ９、細胞培養空間内で媒体の循環が行われるように、媒
   体を生物反応器の外側の源から細胞培養空間を通して導
   入することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。 １０、中空ファイバを互いにほぼ２５〜２００ミクロン
   へだてることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 １１、中空ファイバを隣接した中空ファイバからほぼ１
   ００ミクロンへだてることを特徴とする特許請求の範囲
   第１０項に記載の方法。 １２、外筒を通して延び、媒体を通すための複数本の半
   透過性中空ファイバおよび外筒内に形成された細胞培養
   空間を有し、生きている細胞または微生物を維持するた
   めの生物反応器において、中空ファイバは、生体内の生
   きている組織に見られる組織毛細管が互いに間隔をへだ
   てている距離と実質的に同様な距離互いに対して配列さ
   れかつ保持されており； 細胞培養空間で循環が行われるように媒体を外筒を通し
   て細胞培養空間に導入するための手段を備えていること
   を特徴とする生物反応器。 １３、媒体を細胞培養空間に導入するための手段は、実
   質的に全細胞培養空間内で循環が行われるように外筒に
   配置された第１および第２流体ポートを有することを特
   徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の装置。 １４、媒体を細胞培養空間に導入する手段は第１、第２
   および第３の流体ポートを有し、第１および第２流体ポ
   ートは外筒の両端に近接して配置されかつ細胞培養空間
   と流体連通しており、第３ポートは第１および第２ポー
   トから１８０°のところで第１ポートと第２ポートとの
   間のほぼ中間に位置決めされていることを特徴とする特
   許請求の範囲第１２項に記載の装置。 １５、中空ファイバは複数本の縫い糸によって互いに連
   結されてマットを形成し、該マットは細胞培養空間内で
   ら旋状に巻かれていることを特徴とする特許請求の範囲
   第１２項に記載の装置。 １６、各ら旋層は縫い糸によって隣接したら旋層から分
   離され、各中空ファイバが隣接した中空ファイバ、すな
   わち、同じ層内の隣接した中空ファイバまたは隣接した
   層の隣接した中空ファイバのいずれかからほぼ２５〜２
   ００ミクロン隔てられていることを特徴とする特許請求
   の範囲第１５項に記載の装置。 １７、各中空ファイバは隣接した中空ファイバからほぼ
   １００ミクロン隔てられていることを特徴とする特許請
   求の範囲第１６項に記載の装置。