JPS6154770B2 - - Google Patents

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JPS6154770B2
JPS6154770B2 JP51010837A JP1083776A JPS6154770B2 JP S6154770 B2 JPS6154770 B2 JP S6154770B2 JP 51010837 A JP51010837 A JP 51010837A JP 1083776 A JP1083776 A JP 1083776A JP S6154770 B2 JPS6154770 B2 JP S6154770B2
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JP
Japan
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elastase
toxoid
pseudomonas aeruginosa
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acid
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JP51010837A
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Son Honma
Kazuyuki Morihara
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Shionogi and Co Ltd
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Shionogi and Co Ltd
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は緑膿菌から産生されるエラスターゼの
トキソイドおよびその製造法に関する。また、動
物をエラスターゼで免疫して緑膿菌症のエラスタ
ーゼによる障害を予防・治療する方法に関する。 今日医療の著しい進歩に伴つて一層注目される
ようになつたOpportunistic infections（日和見
感染）の代表的な病原として緑膿菌は医学、獣医
学両分野で種々の大きな問題を提起している。 新生児の生理的免疫不全、癌白血病、移植、熱
傷患者の免疫機能低下、ステロイド、イムラン等
の投薬治療による免疫機能抑制時に本菌感染症は
おこりやすく、重篤である。 獣医学方面ではミンクの本菌による出血性肺
炎、ウシの本菌による乳房炎は蓄産経済上の大問
題である。 緑膿菌に対する２〜３の抗生物質は最近開発さ
れてはいるが、個体の免疫機能不全時または低下
時ではほとんど効を奏さない。また、前述の獣医
学方面の本菌感染症についても、ミンクの場合に
数千〜数万頭に対して抗生物質治療を行うことは
実施上不可能であり、価格の面でも成立しない。
ウシ乳房炎についてもほぼ同様の事情にある。そ
こで化学療法に代つて免疫療法またはその両者の
併用療法が強く待望されている。 免疫療法としては緑膿菌の血清型別（現在13種
類以上ある）の種類に拘らずすべての本菌感染を
防御する共通抗原OEPが本間等により分離され
既に応用されつつある〔J.Y.Homma et al.
Japan.J.Exp.Med.、45、355−360（1975）；J.
Y.Homma et al、Japan.J.Exp.Med、42、23−
34（1972）；J.Y.Homma、Microbial Drug
Resistance、Tokyo University Press、
Tokyo、267−279、（1975）；J.Y.Homma、The
Fourth International Congress of Animal、
Plant and Microbial Toxins、Plenum
Publisher、London（1975）〕。 一方、緑膿菌は菌体外にプロテアーゼ、エラス
ターゼおよびその他の物質を産生するが、この二
種の酵素が病原因子として作用していることが確
認された〔J.Y.Homma et al、Japan.J.ExP.
Med.、45．79−88（1975）；J.Y.Homma et
al、Japan.J.Exp.Med.、45、515（1975）；K.
Kawaharajo et al、Japan.J.Exp.Med.、44、435
−442（1974）；J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、45、89−100（1975）〕。それはヒトの
本菌による慢性気道感染症およびウシ乳房炎の血
清中にOEPと共にブロテアーゼ、エラスターゼ
の高い抗体価があることで充分に推定される〔J.
Y.Homma、Japan.J.Exp.、45、361−366
（1975）〕。 実際に動物実験でプロテアーゼ、エラスターゼ
が皮膚の壊死、角膜の潰瘍を微量でおこし、内臓
諸器官に著しい病理変化をおこさせることが明ら
かになつている〔J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、45、79−88（1975）；J.Y.Homma
et al、Japan.J.Exp.Med.、45、515（1975）；
K.Kawaharajo et al、Japan.J.Exp.Med.、44、
435−442（1974）；J.Y.Homma et al、Japan.J.
Exp.Med.、45、89−100（1975）〕。また、プロテ
アーゼ、エラスターゼ産生菌と非産生菌をマウス
の角膜に接種すると、前者では潰瘍を形死する
が、後者では形成しないことによつて両者の病原
性の差が明らかにされた〔J.Y.Homma et al、
Japan.J.Exp.Med.、45、515（1975）〕。 そこで、免疫療法の完全を期するためには本間
等の共通の感染防御抗原OEPによつてその増殖
阻止を計ると共に代謝産物による有毒作用の中和
を行うことが必要となる。 この目的のためにはプロテアーゼおよびエラス
ターゼをトキソイド化して免疫を行わなければな
らない。 本発明者らはエラスターゼのトキソイド化の研
究を行ない、抗原活性を保持し、酵素活性を失つ
ているエラスターゼのトキソイドを得ることに成
功し、本発明を完成した。 本発明の緑膿菌エラスターゼのトキソイドは下
記の如くして製造される。 本発明に使用する緑膿菌の産生するエラスター
ゼの製造方法およびその性質は特公昭40−
27315；K.Morihara et al、J.Biol.Chem.、240、
3295−3304（1965）；K.Morihara、J.Bacteriol.
、88、745−757（1964）；K.Morihara et al、
Arch.Biochem.Biophys.、123、572−588
（1968）；K.Morihara et al、Agr.Biol.Chem.、
39、1123−1128（1975）に記載されている。 エラスターゼをトキソイド化する場合、エラス
ターゼをホルマリンまたはオキシメタンスルフイ
ン酸塩で処理してトキソイド化すれば良い。 ホルマリンでトキソイド化して得られるエラス
ターゼのトキソイドの物理化学的性質を下記に示
す。 (1) 分子量：4.7万（ゲル濾過法） (2) 紫外線吸収スペクトル：最高278ｍμ（Ｅ２７８ １
％
＝21.2、0.1MKCl）最低252ｍμ (3) 等電点：PH6.5（アセテート膜による電気泳
動） (4) アミノ酸組成：アミノ酸残基（ｇ／100ｇ蛋
白）、アスパラギン酸（14.2）、スレオニン
（5.0）、セリン（5.6）グルタミン酸（6.5）、プ
ロリン（2.9）、グリシン（5.6）、アラニン
（5.8）、バリン（4.9）、メチオニン（2.9）、イソ
ロイシン（2.7）、ロイシン（4.3）、チロシン
（9.9）、フエニールアラニン（7.0）、リジン
（3.9）、ヒスチジン（2.6）、アルギニン（6.5）、
シスチン／２（1.2）、トリプトフアン（2.3）、
アンモニア（0.9）（計94.7ｇ） (5) 物質の色：無色粉末 (6) 抗原活性：有り (7) 酵素活性：なし 以上の物理化学的性質を有する緑膿菌エラスタ
ーゼのトキソイドは新規な物質である。 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこの
実施例に限定されるものではない。 実施例 １ 精製エラスターゼ溶液〔10〜15mg酵素蛋白質／
ml（50mPU※（プロテイナーゼ単位）１mg酵素
蛋白質）、5M食塩、10ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍ
Ｍ塩化カルシウムおよび0.1ｍＭ塩化亜鉛を含
む〕を酵素濃度２−５mg/mlとなるように硼酸塩
緩衝液（PH９）で稀釈（最終硼酸塩濃度約
0.1M）し、それに最終濃度１％となるようにホ
ルマリンを加えて室温に保つ。１日でほぼ完全に
エラスターゼ活性を消失する。その失活したエラ
スターゼ溶液を水に対して透析し、次いで凍結乾
燥してエラスターゼトキソイドを得る。その収率
は約60〜100％である。 エラスターゼのホルマリンおよびオキシメタン
スルフイン酸処理での残存酵素活性をそれぞれ表
１および表２に示す。 酵素（プロテイナーゼ）活性測定法：２％カゼ
イン（PH7.4）１mlを適当に稀釈した酵素液に混
し、40℃、10分間反応後、直ちに反応停止液
（0.1Mトリクロル酢酸、0.2M酢酸および0.2M酢
酸ナトリウムを含む溶液）を２ml添加し、その温
度で20分間保つて未反応のカゼインを完全に沈澱
させた後、濾過し、濾液の１mlについてFoline法
でチロシン量を測定した。すなわち、濾液の１ml
に0.4MNa2CO35mlを添加し、1/5に稀釈した
Phenol Reagent Solution（酸濃度1.8N、フエノ
ール試薬、半井化学、京都）１ml添加し、15〜20
分後、670ｍμで吸光度を測定する。なお、反応
０時間で同様の処理したものをコントロールと
し、その差からエラスターゼ作用による遊離チロ
シン量が算出される。 ※プロテイナーゼ活性は１分間当りの増加チロ
シン１mgを１単位（PU）とした。mPUはその1/
１０００である。 残存酵素活性は相対活性（％）で示す。
【表】
【表】 に同じ。
表１から明らかなように、硼酸塩緩衝液存在下
にエラスターゼをホルマリン１％濃度以上で処理
すると３日間以内でほぼ完全に失活する。しか
し、酢酸ソーダを使用する時には失活はそれ程顕
著でない。さらに、燐酸塩、グリシン−、トリス
−緩衝液（いずれもPH8.5）などを使用したが、
硼酸塩程の効果はなかつた。PHの影響を７〜９で
測定したが、９の方がよかつた。 オキシメタンスルフイン酸もホルマリンと同様
の効果を示した（表２）。 本発明の緑膿菌エラスターゼのトキソイドが抗
原活性を有することを以下の実験例で示す。 実験例 １ エラスターゼトキソイドのウサギ免疫試験 １ 実験方法：ニユージーランドホワイト種家兎
３匹にエラスターゼトキソイド１mgをFreund
のインコンプリートアジユバントと共に皮下注
射し、さらに２週間後にエラスターゼトキソイ
ド１mgをFreundのインコンプリートアジユバ
ントと共に皮下注射する。さらに、２週間間隔
でエラスターゼトキソイド１mgを節肉注射す
る。経時的に家兎の耳静脈から採血する。血清
を分離して非働化してHA価を測定する。 HA価の測定法はJ.Y.Homma、Japan.J.Exp.
Med.、45、361−365（1975）に記載されてい
る。すなわち、エラスターゼを抗原とする受身
血球凝集反応の方法で作つた。 ２ 実験結果 この実験結果を表３に示す。HA価は512−
4096倍になつた。 同様にして、マウスにおいてもエラスターゼ
トキソイドを接種して免疫すると非常に抗体が
あがり、エラスターゼトキソイドHA価として
2048〜8192まで上昇した。
【表】 実験例 ２ ミンク（サフアイヤ）20数頭にエラスターゼト
キソイド500μｇをアジユバント（カリ明ばん）
と共に皮下に注射し、約２週間後に再び500μｇ
をアジユバントと共に皮下注射した。更に３週間
後に1000μｇをアジユバントと共に皮下注射し
た。最終注射後18日後に採血した大多数のミンク
の血清には16ないし60倍にエラスターゼHA価の
上昇が認められた。注射前ではエラスターゼHA
価は認められない。 実験例 ３ 抗エラスターゼトキソイドウサギ血清のエラス
ターゼ中和活性 (1) エラスターゼ中和活性を酵素活性で判定。 (イ) 被検血清：エラスターゼトキソイドで免疫
したエラスターゼ−HA価2048と256の２種
のウサギ免疫血清を用いた。 対照として正常ウサギ血清（プロテアーゼ
−HA、エラスターゼ−HA、OEP−HAはす
べて陰性）を用いた。また、 ※プロテアー
ゼトキソイド抗血清はプロテアーゼHA価
7860、エラスターゼ−HA価およびOEP−
HA価は陰性である。 (ロ) 測定方法：被検血清は56℃、30分で非働化
し、血清0.2mlにエラスターゼ溶液0.2mlを加
え全量を生理食塩水で２mlとした。37℃、60
分後、この反応液１mlに２％カゼイン溶液１
mlを加え、残存酵素活性を測定する。残存酵
素活性の測定は実施例１記載の方法で行なつ
た。 (ハ) その結果を表４に示した。 この結果から明らかなように、正常ウサギ
血清、溶媒には中和抗体はない。また、プロ
テア−ゼトキソイド抗ウサギ血清にもエラス
ターゼ活性を中和する抗体はない。これに対
してエラスターゼトキソイド免疫ウサギ抗血
清のみ著しい中和能を示した。また、HA価
の高い方がよく中和している。 (2) エラスターゼ中和活性を角膜潰瘍の有無で判
定。 一定量のエラスターゼ液と一定量の被検エラ
スターゼトキソイド免疫血清を37℃、５分ない
し１時間反応させ、K.Kawaharajo et al、
Japan.J.Exp.Med.、44、435−442（1974）文
献記載の方法に従つてマウスの角膜に滴下し、
角膜潰瘍を含む病変の強弱、有無で判定する。
【表】 その結果、HA価によつて異なるが、エラス
ターゼトキソイド抗血清は１ml当り約100〜400
γのエラスターゼを中和した。 (3) エラスターゼ中和活性をマウスの内臓の諸病
変および生存で判定。 エラスターゼとエラスターゼトキソイド抗血
清の反応液おびその沈降物をマウスの腹腔内に
注射した場合、抗血清を加えない場合に生ずる
内臓の諸病変がみられず、また致死量が中和さ
れたマウスは生残する。 抗血清の代りに正常ウサギ血清を加えても中
和の効果は認められない。 実験例 ４ OEP単独ワクチンとOEP、プロテアーゼトキ
ソイドおよびエラスターゼトキソイドを含む三
種混合ワクチンによる免疫ミンクの血清中の
HA価と感染防御効果 現在緑膿菌感染症のワクチンとしてOEPワク
チンが知られている。このOEP抗原にプロテア
ーゼトキソイドおよび本発明のエラスターゼトキ
ソイドを混合して三種混合ワクチンを製造する
と、この三種混合ワクチンは単独のOEPワクチ
ンより緑膿菌感染症予防治療に著しい効力を存す
ることが明らかになつた。 １ 実験方法 動物：ミンク（サフアイア種）、５〜６月令
の〓。ワクチン投与方法：皮下または筋肉注射
でワクチンを投与した。 攻撃試験：緑膿菌No.5株を使用した。生菌
による感染はエーテル麻酔下・鼻腔によりビニ
ール管で菌液0.5mlを注入する方法で行なつ
た。 感染免疫の方法：免疫月日、投与量、感染月
日、剖検月日を表５に示した。 OEPワクチンおよび三種混合ワクチンの製
造法：
【表】 ２ 実験結果 ミンクに生菌感染（攻撃試験）を行ない、
OEPおよび三種混合ワクチンの免疫効果を調
べその結果を表６に示した。 カリ明ばん単独の場合にはLD50は約3.0×106
であつた。OEP単独の場合LD50≦3.6×106であ
り、カリ明ばんとの差は認められなかつた。し
かし、三種混合免疫Ｃ群ではLD50＞1.9×109で
あり、Ｂ群、Ａ群とは明らかに差が認められ
る。 無処理でLD503.4×105であつた。カリ明ばん
単独またはOEPとカリ明ばん免疫群では高々
10倍量の生菌量に耐えるようになる。しかし、
これにプロテアーゼトキソイドとエラスターゼ
トキソイドを加えた三種混合ワクチンとして用
いると約10000倍量を耐過する。
【表】 本発明のエラスターゼトキソイドの毒性は下記
の通りである。 １mg／マウスを腹腔内投与しても急性毒性は認
められなかつた（エラスターゼの最小致死量
0.125mg／マウス）。 以上の実験例から明らかなように、本発明のエ
ラスターゼトキソイドを接種した動物ではHA価
中和抗体価の上昇が認められるが、無接種動物で
はHA価、中和抗体価が認められない。それ故、
本発明のエラスターゼトキソイドは動物およびヒ
トの緑膿菌感染症予防ワクチンおよび治療用の抗
体（抗血清）の製造に不可欠であることは明らか
である。 本発明エラスターゼトキソイドの具体的応用例
を下記に示す。 (1) エラスターゼトキソイドを動物およびヒトに
接種してエラスターゼトキソイド抗体を含む血
清または抗体を製造し、その抗血清または抗体
を用いて緑膿菌症のエラスターゼによる障害
（たとえば角膜潰瘍など）を防御、治療するこ
とができる（血清療法）。 (2) また、エラスターゼトキソイドまたはアジユ
バントを含むエラスターゼトキソイドをワクチ
ンとして動物およびヒトに接種（皮下、皮内、
筋肉注射など）して、緑膿菌症のエラスターゼ
による障害を予防、治療することができる。 エラスターゼトキソイドを抗原としたワクチ
ンは通常の動物用および人間用ワクチンを製造
する方法に準じて製造できる。すなわち、エラ
スターゼトキソイドに溶媒を加えて溶液を作
り、もし必要ならアジユバントおよび／または
防腐剤を加えればよい。溶媒として、たとえば
蒸留水、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水が
ある。アジユバントとして、たとえば水酸化ア
ルミニウム・リン酸アルミニウム、リン酸カル
シウム、明ばんまたはFreundのインコンプリ
ートアジユバントなどがある。防腐剤としてチ
メロサール、フエノール、石炭酸またはホルマ
リンなどがある。 (3) さらに、本発明のエラスターゼトキソイドは
非常に活性の高い有効な緑膿菌ワクチンを製造
する上でも非常に有効な物質である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 緑膿菌から産生されるエラスターゼをトキソ
    イド化して得られ； (1) 分子量：4.7万（ゲル濾過法） (2) 紫外線吸収スペクトル：最高278ｍμ（Ｅ２７８ １
    ％
    ＝21.2、0.1MKCl）最低252ｍμ (3) 等電点：PH6.5（アセテート膜による電気泳
    動） (4) アミノ酸組成：アミノ酸残基（ｇ／100ｇ蛋
    白）、アスパラギン酸（14.2）、スレオニン
    （5.0）、セリン（5.6）、グルタミン酸（6.5）、プ
    ロリン（2.9）、グリシン（5.6）、アラニン
    （5.8）、バリン（4.9）、メチオニン（2.9）、イソ
    ロイシン（2.7）、ロイシン（4.3）、チロシン
    （9.9）、フエニールアラニン（7.0）、リジン
    （3.9）、ヒスチジン（2.6）、アルギニン（6.5）、
    シスチン／２（1.2）、トリプトフアン（2.3）、
    アンモニア（0.9）（計94.7ｇ） (5) 物質の色：無色粉末 (6) 抗原活性：有り (7) 酵素活性：なし の理化学的性質を有する緑膿菌エラスターゼのト
    キソイド。 ２ 緑膿菌から産生されるエラスターゼをホルマ
    リンまたはオキシメタンスルフイン酸でトキソイ
    ド化することを特徴とする緑膿菌エラスターゼの
    トキソイドの製造法。 ３ 抗体を形成させるのに十分な量のエラスター
    ゼトキソイドを動物に接種することを特徴とする
    緑膿菌症のエラスターゼによる障害を予防・治療
    する方法。
JP1083776A 1976-02-05 1976-02-05 Toxoid of pseudomonas aeruginosa elastase Granted JPS5296728A (en)

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