JPS6153222A - インスリン作用増強剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、インスリン作用増強剤、詳しくはインスリン
本来の血糖低下作用を増強し、抗糖尿病剤として利用で
きる新しいインスリン作用増強剤に関する。

技術的背飛 一般に糖尿病は、インスリン作用の不足による代謝異常
状態と定義され、その病型は大きく二つに分けられる。

即ち膵臓におけるインスリン分泌奇の絶対的不足に起因
する工型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）と、主とし
てインスリンに対する感受性の低下による■型糖尿病（
インスリン非依存性糖尿病）とに分類される。

工型糖尿病は、インスリン量の欠乏によるものであるた
め、その療法としてはインスリンの投与が不可欠である
。一方、■型糖尿病においては、軽症患者に対しては食
事療法及び運動療法が、また重症度に応じて経口糖尿病
剤の投与やインスリン療法が行なわれている。しかして
上記経口糖尿病剤としては、現在スルホニル尿素系及び
ビグアナイド系の製剤がよく知られているが、いずれも
しばしば低血糖昏睡、アシド−シス、肝臓障害、胃腸障
害、発疹等の副作用を惹起するものであり、それらの使
用に際しては充分な注意が必要とされている。また、丁
型及び■型を問わず、インスリンの長期成いは大量療法
においては、製剤中に含まれる不純物により、或いは現
在多用されているインスリンがブタ、ウシ等の動物由来
のものであること等により、体内で抗体産生が惹起され
、インスリンショックの発現やインスリンの効果が著し
く損われることが知られている。

このように糖尿病の薬物療法、インスリン療法は、糖尿
病合併症の問題をも含め、未だ充分とは言い難い実情に
ある。

及旦ｃｏｅｔ良 本発明者らは、上記の現状に鑑み特に糖尿病患者の大多
数を占める■型砧尿病を対象として、その主たる病因で
あるインスリン感受性の低下を改善するという新しい作
用礪作を有する薬剤を得ることを目的として鋭意研究を
重ねた結果、先に動物の血清アルブミンを蛋白分界酵素
を用いて限定分解することにより得られる新規なペプチ
ドが上記目的に合致するインスリン作用促進活性を有す
ることを見出し、この知見に基づ〈発明を完成したく特
願昭５８−１４８５５２号及び同５８−１４８５５３号
）。

本発明者らはその後の研究において、ヒト血漿に含まれ
るＨＤＬ（高比重りボタンバク）の偶成蛋白質の一種で
あるアポリポタンパクＡ−ｎ（’以下「アポＡ−Ｉ［Ｊ
という）が優れたインスリン作用促進活性を有し、イン
スリン作用増強剤として、惹いては抗糖尿病剤として有
用であることを見出し、ここに本発明を完成するに至っ
た。

明の信成及び効果 本発明は、アポＡ−ＩＩを有効成分として含有すること
を特徴とするインスリン作用増強剤に係わる。

本発明インスリン作用増強剤における［インスリン作用
促進活性］とは、インスリンの作用、即ち生体内におい
て主として筋や脂肪組織へのグルコースやアミノ酸の取
り込み及びグルコースのグリコーゲン・脂肪への転換を
促進して血糖を低下させる働きを促進する生理作用を言
う。この作用の詳細については後述する。

本発明のインスリン作用増強剤は、インスリン作用促進
活性を有することにより、インスリンの感受性の改善を
図り得るものであり、従ってインスリン作用の不足によ
る代謝異常状態と定義される糖尿病、殊に前記■型糖尿
病の治療に有効である。また１型及び■型を問わず、イ
ンスリン療法に際して本発明のインスリン作用増強剤を
併用することにより、インスリン製剤の使用量を大巾に
節約できると同時に、インスリン療法に見られるインス
リン抗体の産生に起因するインスリンショックやインス
リン抵抗性の発現を予防することができる。

本発明において有効成分とするアポＡ−Ｉｆは、ＨＤＬ
を促成するアポリポタンパク質として知られ、下記の一
次購造を有している。尚、下記各７ミノ鼓の表記は、ｆ
ＬＩＰＡｃ−ＩＬＪＢの略号による。

Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ＝Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−ＣＯＯＨｌ　７０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ｅ。

Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｖａｔ　−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ
ｕＧ　Ｉｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｉ　Ｉｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｔ
ｈｒＩＪＳ−８ｅｒ−ＬＪＳ−Ｇ　１０−　Ｐｈｅ−Ｔ
ｙｒ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　１ｕ−Ａ　Ｉ
ａ−Ｇ　ＩｎＬｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ　−Ｇ　
Ｉｕ　−Ｌｙｓ−Ｖａｔ　−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｇ　Ｉｕ　−ＬｅｕＧ　Ｉｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ
−Ｖａｌ　−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇ　
Ｉｎ−５ｅｒ−Ｖａｔ］１０ 午 Ｓ　　　　　　　　　　　　１０ ＰＣＡ−Ａｌａ　−ＬＶｓ−Ｑｌｕ　−ｐｒｏ−ＣＶＳ
−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−３ｅｒ　−１ｅｕＧ　ｌｙ−Ｔｙｒ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｔ　−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈ
ｅ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−５ｅｒ−Ｖａｔ＋　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕ−Ｍｅｔ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−
５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｕ　−ＬｅｕしＶＳ　−Ｓｅｒ
　−Ｌｙｓ　−Ｇ　ＩＬＩ　−Ｐｈｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓ
ｅｒ　−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ　−Ｇ
　ｌｎ＋　　　　　　　　　５０ Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−７ｈｒ−Ｐｒｏ−１ｅｕ−Ｉ
　ｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ｇｌｙ−７ｈｒＬ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ＩＬＩ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−ＣＯＯＨ即ちアポＡ−Ｉ［は、Ｎ末端がピロリド
ンカルボンａ　（ＰＣＡ）　、Ｃ末端がＧｌｎで、残基
ｃ１７７個のポリペプチド鎖２個がその６位のＣｙｓ、
においてジスルフィド結合した溝造を有する分子量約１
７４００のポリペプチドである。

アポＡ−Ｉは、ヒト血清より通常の蛋白質分離将裂手段
により卓ニされる。好ましい単離手段としては、次の方
法を採用できる。即ち、まず原料とするヒト血清に、低
温下に、冷エタノール、冷アセトン、冷メタノール、冷
プロパツール等又は之等の混合溶媒を撹拌しながら加え
、遠心し、上滑を２縮して乾燥し、更にクロロホルム等
の有ｄ溶媒で説脂処理し、次いで透析、乾燥することに
よりアポＡ−［を含む粗分直物を得ることができる。上
記粗分直物の粘製分雌は通常の手段により行なうことが
できる。その例としては、例えばセファデックスＧ−１
００（ファルマシア社製）、バイオ−ゲルＰ−１０（バ
イオ−ラッド社製）等のゲル濾過担体を用いるゲル濾過
法、透析法、電気泳動法、ＳＰ−セファデックス（ファ
ルマシア社１）、ＤＥＡＥ−セルロース（ホワットマン
社製）等のイオン交換法、疎水又は吸着クロマトグラフ
ィー法、更にはこれらの高速液体カラムクロマトグラフ
ィー等及びこれら各方法を組合せた方法を例示できる。

アポＡ−Ｉの好ましいｖＩｐｉ製手段の一個は、次の通
りである。即ち、上記粗分直物の凍結乾燥試料を０．０
５〜０．２Ｍのａ塩を含ムトリスー塩酸、酢醒、クエン
酸等の緩衝液（１）８６．５〜８．０、好ましくは７．
０〜７．５）に溶解させ、予め該緩衝液で平衡化させた
セファデックスＧ−１００等によりゲル濾過し、蒸留水
に対して透析後、凍結乾燥する。次いで上記ゲル濾過て
得られた活性画分をＴＳＫ−Ｃ１ｅｆ　０ＤＳ−１２０
Ａ　（東洋曹達社［）、Ｈｉ　−Ｐａｒｅ　ＲＰ３０４
　（バイオ−ラッド社製）等の逆相カラムを用いた高速
液体りＯマドグラフィーにより精製し、更に必要に応じ
て繰返し高速液体りＯマドグラフィーにかけることによ
り分離精製することができる。

本発明のインスリン作用増強剤は、上記のごとくして得
られるアポＡ−ＩＩを有効成分として常法に従い製剤形
態に調製される。また該増強剤はこれを単独で或いはイ
ンスリンと併用することにより抗糖尿病剤として使用す
ることができる。上記有効成分を含む製剤は、通常の製
剤的担体を用いて調製されるが、中でも注射剤形態に調
製されるのが好ましい。注射剤として調製される場合、
得られる製剤は殺菌され且つ血液と等張であるのが好ま
しい。注射剤形態に成型するのに際しては、希釈剤とし
てこの分野において慣用されているものを使用できる。

個えば水、生理食塩水等を挙げることができる。なおこ
の場合等歪性の溶液を調製するに充分なｍの食培或いは
グリセリンを注射剤の形態の製剤中に含有させてもよい
。また上記製剤には通常の緩箇剤、無痛化剤、保存剤等
や他の医桑品をも含有させることができる。また上記有
効成分は使用時に生理食塩水等に溶解し、同時溶解剤と
しても使用できる。

上記のごとくして調製される本発明製剤は、その形態に
応じた方法で投与される。注射剤の場合には単独で又は
アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与すること
ができる。有効成分の投与量は、使用目的、症状等によ
り適宜増減されるが、通常−人゛−日当り、１〜１００
ｍ０／ｋｏ程度の範囲とするのがよく、また−日に２〜
４回に分割して投与することができる。

ｘｉ」１ 以下、本発明を更に詳しく説明するためアポＡ−■の製
造例を挙げ、次いで試験例を挙げる。尚、製造例及び試
験例１〜３における試呉のインスリン作用促進活性は、
以下の方法により測定した。

くインスリン作用促進活性〉 雄性ウィスター（ＷｉＳｔａｒ　）系ラット（体重１５
０〜３００（＋）より副皐丸脂肪組織を摘出し、脂肪組
織間（Ｅ　ＸＥｌｌａｎｔ）を調製する。１０個の脂肪
組織間（湿気母として７．５〜１０１０Ｇ）を単独で、
或いはこれに供試試料を添加して、Ｄ−（Ｕ−１ムＣ）
グルコース０．０５μＣｉ／讃、重曹１．５ｍＯ／ＩＱ
、ペニシリン３５ｔＪ／ｄ及びストレプトマイシン０　
、１１１ＩＱ／ｍＧを含むＭ−１９９培地（「医学のあ
ゆみ」第６２巻、Ｍ６号、４３５頁、昭和４２年８月５
日発行参照〕に浮かべたシリコン処理レンズペーパー上
に載せ（Ｔｏｐｐｅｒ　、　Ｙ。

Ｊ、　、　ｅｔ　　ａｌ、　ＭｅｔｈＯｄＳ　　ｉｎ　
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　。

３９．４４３　（１９７５））、３％炭鼠ガス含有気相
下に、３７℃で２０時間培養する。培養後、脂肪ａ　識
塊の湿重りを測定し、その全潰を２Ｎ−ＫＯＨの５０％
エタノール溶液１鵬中で、ｉｏ。

℃で２時間加水分解する。６Ｎ−硫醒０．５−で酸性化
した氷解物より３鵬の石油エーテルで脂肪耐を抽出し、
常法により放射能を測定し、グルコースの脂肪酸への転
換ｍを、培地中の比放射能より算出する。

試料のインスリン作用促進活性は、試料とインスリン（
０，２ｍ　Ｕ／ｍＱ）とを培地に添加した場合に得られ
る上記比放射能算出値を、インスリンの単独添加により
得られる同算出値に対する百分率で表わす。

製造例１ ４℃のヒト血清１Ｑに攪拌下、４℃に保ちつつ、−２０
℃に冷即した冷エタノール２Ｑを徐々に加えた。冷エタ
ノールを添加後、更に４℃で３ｇ分間撹拌を続け、その
後同温度下で１０分間遠心し、（１００００ＸＩｊ　）
上清と沈澱層を分離した。

次いで上滑に消泡剤であるＡ　ｎｔｉｆｏａｍ　−Ａ　
Ｆ　−Ｅ　ｍｕｌｓｉｏｎ　（牛丼化学工業社製）を少
量加え、全量を約３００ｍｆ２にまで濃縮した。濃縮液
に等量のクロロホルムを加え、充分に混合した後、４℃
下で一晩放置した。その後、水層をクロロホルム層から
分離して、約２００脱までｉ１！縮し、蒸留水に対して
透析した後、凍結乾燥して１．２ｇの粗分割物を得た。

該粗分割物にっきローリ−（Ｌ　ｏｗｒｙ）法による蛋
白定量を行なったところ、３ｏｏｍｇであった。

上記で得られた粗分割物の凍結乾燥標品１．Ｏｇを、０
．１Ｍの食塩を含む０．０１Ｍのトリス−塩！！ｉ暫Ｈ
（Ｄ　８７．４）１５ｍＧに溶解し、予め同ｍ衝液で平
衡化させたセファデックスＧ−１００（ファルマシア社
製、４．４ｘ９０ｃｍ）のカラムを用いてゲルＩ濾過（
流速２５ｍＧ／時間、Ｂ、７ｖＡ／フラクシヨン）して
、フラクションＮ０．６３〜８３の活性画分を集め、蒸
留水に対して透析した後、凍結乾燥して０．５ｇの粉末
ヲ得た。該粉末は、ローリ−法による蛋白定量の結果１
８０１１１（＋であった。

上記セファデックスＧ−１００を用いたゲルｔ濾過にお
ける溶出活性パターンを第１図に示す。第１図において
、横軸はフラクションＮＯ０を、縦軸は２８０　ｒｖで
の吸光度及びインスリン作用促進活性（９６）を示す。

また図において（１）は２８Ｏｒ＋ｍでの吸光度曲線で
あり、（２）はインスリン作用促進活性（％）のグラフ
である。

上記で（ユた凍結乾燥標品３１１１１１１を下記条件下
に逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り諸口して活性画分０．５ｍｇを得た。

く高速液体クロマトグラフィー条件〉 機器；ウォーターズ社、ＡＬＣ／ＧＰＣモデル２４４、
液体クロマトグラフィーシステム、Ｍ−６６０溶媒プロ
グラマ− カラム：　ＴＳＫ−ｇｅｌ　０ＤＳ−１２０Ａ　（東洋
曹達社製、７．８ｍｍ＋ｘ３００ｖｎ） 流速：１鯨／分 温度：２２〜２５℃ チャートスヒート＝３０ｃ飄／時間 注入量：３ｍＭ１００μＱ 溶出；４８〜９０％アセトニトリル（直線温度勾配） その結果を第２図に示す。第２図において横軸は保持時
間（分）を、縦軸は２２０ｎｍでの吸光度、インスリン
作用促進活性（％）及びアセトニトリルの濃度勾配（％
）を示し、図中（１）は２２０ｎｍでの吸光度曲線、（
２）はインスリン作用促進活性のグラフ及び（３）は濃
度勾配である。

上記活性画分０．１１１１（ｌを更に下記条件下に逆相
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、０
．０６５１Ｇの活性画分を得た。同一条件下で再クロマ
トグラフィーを行ない最終精製両分（アポＡ−■）０．
０４５ｍσを得た。ヒト血清１Ｑ当りに換算した最終精
製物の収旦は、１６．８ＩＩｇであった。

〈高速液体クロマトグラフィー条件〉 は器；ウォーターズ社、Ａ　Ｌ　Ｃ／Ｇ　Ｐ　Ｃモデル
２４４、ｎ体りロマトグラフィーシステム、Ｍ−６６０
♂媒プログラマ− カーｙム：　Ｈｉ　−Ｐｏｒｅ　ＲＰ３０４　（バイオ
−ラッド社製、４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ＞ 流速；１脱／分 ）３度；２２〜２５℃ チャートスヒート：　３０　Ｃｍ１時間注入ｆｆｌ：１
００μ！Ｉ＋／１００μＱ溶出；０〜９０％アセトニト
リル（直ａ濃度勾配）上記ｔＭ　’Ｎ　ｔＰ、作におい
て再クロマトグラフィーに供した結果を第３図に示す。

第３図において横軸は保持時間（分）を、縦軸は２２０
ｎｍでの吸光度、インスリン作用促進活性（％）及びア
セトニトリルの湿度勾配（％）を示し、図中（１）は２
２０ｎｎでの吸光変曲ね、（２）はインスリン作用促進
活性のグラフ及び（３）は湿度勾配である。

該図より、約４８分に最大活性を示すピークが現われる
ことが判る。

かくして得られた最終精製物は、以下の理化学的性質を
有し、アポＡ−Ｉｔであると同定された。

（ａ　）分子量 後述するアミノ醒配列自動分析観（アプライド　バイオ
システム社製、４７０−Ａ型）によるアミノ酸配列の一
茨構造から求めた分子ｎは、１７３８２であった。

（ｂ）２外線吸収スペクトル（ＬＩＶ：ｎｍ）０．０４
％水溶液を用いてＵＶスペクトルを測定した結果を第４
図に示す。該第４図より２７６ｎｍに極大吸収を示し、
吸光係数（Ｅ、１％、１ｃｍ＞は１４．１であった。

（Ｃ）溶剤に対する溶解性 水、０．５％水酸化ナトリウム水溶液、食塩水及び酢酸
水溶液に溶解し、メタノール、エタノール、アセトン、
クロロホルム及びエーテルには不溶である。

（ｄ　）呈色反応 呈色反応試験結果は次の通りであった。

・ローリ−フォーリン反応（ペプチド結合）陽性 ・ニンヒドリン反応（アミノ酸）陽性 ・フェノール硫酸反応（Ｅ！り　　　　　　陰性・エル
ソンモルガン反応（アミノ糖）　陰性（ｅ）物質の色及
び性状 白色不定形である。

Ｃｆ＞等電点 オファ−Ｌ／／Ｌｌ　（０−Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ、　
Ｈ，）の方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　、、２５０．
４００７（１９７５））に準じて等電点電気泳動を行な
った結果、等電点（ＰＩ）は４．７±０．２であった・ （ｇ）梧成アミノ酸 最終ｖ４引物（乾燥品）を、４Ｎメタンスルホン（ｍ（
０，２％の３−（２−アミノエチル）インドールを含有
）を用いてシンプソンら（Ｓｉｍｐｓｏｎ　　Ｒ，Ｔ、
、ｅｔ　　ａｌ）の方法（Ｊ。

Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、、２５１．１９３　（１９７６
））に従い、１１０℃で２４Ｒ間、４８時間及び７２時
間加水分解した。各加水分解物を中和後、日立８３５型
アミノ酸自動分析計を用いて各々分析した。結果をその
平均値として下記第１表に示す。尚表中各アミノ酸は、
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの略号で示し、各アミノ酸組成は試
料１２μｇ当りの各アミノ酸のｎｍｏ　Ｉ　ｍで表わす
。

また１／２０ＶＳはモノヨード酢酸で処理して、Ｓ−カ
ルボキシメチルシスティンとして測定した。

（ｈ）アミノ醒配列 最終時製物（乾燥品）２０μｇをアプライドバイオシス
テム社％４７０−Ａ型アミノ晟配列自動分析薇を用いて
分析した結果、前記したアポＡ−ＩＩの一次倍造と一致
した。

試豚例１ ！Ｆ！造例１で得た冷エタノール処理後の上清画分と沈
Ｆ１画分とについて、脂肪ｔｆｉｍにおける脂肪醒・合
成を指標として、前記方法によりインスリン作用促進活
性を測定した。結果を下記第２表に示す。

上記第２表より、沈ｎ画分ではインスリンの添加の有焦
によらず、脂肪酸合成の先進は認められないのに対し、
上清画分においては単独では活性は認められないが、脂
肪酸合成の先進をほとんど示さないｎ度のインスリン共
存下で著明な脂肪酸合成の大通が見られ、インスリン作
用促進活性を有することが明らかである。

試験例２ 製造例１で得た最終賞製物（アポＡ−ＩＩ）のインスリ
ン作用促進活性を試験例１と同様にして測定した。その
結果を下記第３表に示す。

上記第３表よりｆｆｉ柊’ａｍ物は、単独では作用をほ
とんど示さないが、脂肪酸合成の亢進をほとんど示さな
い３度のインスリンの共存下において著明な脂肪酸合成
の冗進が見られ、このことよりインスリン作用促進活性
を有することが明らかである。

試験例３ 製造例１で得た最終精製物（アポＡ−ＩＦ）の各ｆｆ１
ａ［！！下におけるインスリン作用促進活性を、前記し
た脂肪相０の脂肪聞合成はを指標として測定した。その
結果を第５図に示す。

第５図において償軸は試料（アポＡ−ＩＩ）添加９度を
、Ｆｒｉ軸は脂肪酸合成量を示す。また図において綜（
１）は０．２ｍ　Ｕ／−インスリン共存下での脂肪り合
成量を、ｔａ　（２）はアポＡ−Ｉ［単独の場合の脂肪
酸合成口をそれぞれ示す。

第５図より、アポＡ−ＩＩ単独では、２０μｇ／ｖＱの
３度においても脂肪υ合成の大通は認められないが、イ
ンスリン共存下では２μｇ／戒の濃度において既に明確
な脂肪酸合成の大通が見られ、優れたインスリン作用促
進活性を有することが判る。しかもその活性は濃度に依
存して増加し、１５μｇ／ｒｐｆＪにてほぼ最大値とな
ることが判る。

試験例４ ＫＫマウスに対するインスリン感受性増強作用試験 （１）実験方法 体重２０ｇ前後、１０〜１５週齢の雄退的Ｋマウス（実
験動物中央研究所より入手）を実験に使用した。

ＫＫマウスのインスリン感受性の測定は、タケトミ（Ｓ
、　Ｔａｋｅｔｏｍｉ　）らの方法（ＨｏｒｍｏｎＭｅ
ｔａｂｏｌｉｓｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、工４．１４　（
１９８２））に従って行なった。即ち、エビネフイリン
（メルク社’Ｉ）１０μｇ／噌、プロプラノロール（住
友化学工業社１）０．５ｍＭｍ及びグルコース０．３Ｑ
／−を含む生理食塩液混液の１２．５ｍＱ／ｋＱをマウ
スの背部皮下に投与し、定常高血糖状態を作成した。イ
ンスリン（結晶ブタインスリン、シグマ社製）の投与は
、０．２５Ｕ／ｋｏ！を同じくマウス背部皮下より行な
った。

試料とし又は、製剤例１で得た最終蹟裂画分〈アポＡ−
Ｕ）を凍結乾燥し、これを生理食塩液に溶解して用いた
。

２０時間絶食させた１５匹のＫＫマウスを、無作為に１
群５匹よりなる３群に分け、第１群（定常高血糖群）及
び第２群（定常高血糖＋インスリン投与群）にはそれぞ
れ５航／　ｋｇｆｆｉの生理食塩液を、また第３群（定
常高血糖士インスリン＋試料投与群）には２００　ｍａ
／ｋｏ量のアポＡ−Ｉ［を含む試料液を、いずれもマウ
スの腹腔内に投与した。

投与２４時間後に、前記エビネフィリン、プロプラノロ
ール及びグルコースを含む生理ｆ！ｉｍ液混液を全群の
マウスに投与し、更に第２群及び第３群のマウスには、
前記の方法によりインスリンを同時投与した。生理食塩
液混液或いはインスリンの投与２時間後に全群のマウス
の尾動脈を切断し、出血させ、ヘパリン処理を行なった
毛細ガラス管を用いて血１２０μＱを採取し血糖値の測
定に供した。

血糖値の測定は、全血２０μＱに０．３Ｎ−３ａ　　（
ＯＨ）２液及び５％−ＺｒｌＳＯｔ液を各々１００ｕＱ
加え除蛋白し、遠心分１１ｆｆ（３０００回転／分、１
０分間）を行なった後、その上清１００μＱにつき、グ
ルコースオキシダーゼ法によった。

（２）結果 自然発症糖尿病動物の一種であるＫＫマウスは、インス
リンの感受性が低下しており、ヒトの前糖尿病状態（ｐ
ｒｅｄｉａｂｅｔｅｓ　）の病態モデル動物として知ら
れている。

本発明インスリン作用増強剤有効成分とするアポＡ−Ｉ
Ｉを含む試料を腹腔内に投与して、ＫＫマウスに対する
インスリン感受性増強作用を検討した結果を第６図に示
した。

第６図より、第１群のマウスではエビネフィリン、プロ
プラノロール及びグルコースの投与により、血糖は２５
２±５８ｍａ／１００ｍＧと高値を示し定常高血糖状態
にある。これに０．２５Ｕ／ｋ。

ｍのインスリンを同時投与した第２群のマウスでは、第
１群に比べほとんど血糖値の低下はなく、ＫＫマウスで
はインスリンの感受性が低下していることが判る。これ
に対し、予め２４時間前に本発明試料を投与し、且つ第
２群と同様にインスリンを投与した第３群のマウスでは
、第２群に比べ著明な血ｔ！！Ｊ値の低下（危険率１％
以下で有意）が見られ、本発明有効成分がインスリン感
受性増強作用を有することが判る。

試験例５ 自然発症ね尿病マウスに対する血糖降下作用（１）莢肋
方法 体圧５０ｏ前後、１５〜２０週齢の０退的ＢＬ／ＫＳＪ
−ｄｂｍ系の雌雄マウス（Ｊ　ａｃｋｓｏｎ　　Ｌ　ａ
ｂ。

より入手）を２０時間絶食させて試験に供した。

試料としては、製造例１で得た最終Ｎ製画分（アポＡ−
Ｉ）を凍結乾燥して用いた。

上記試料を生理食塩液に溶解した後、その１００１ｆｆ
！ＩＩ／ｋ（ｌをマウスの腹腔内に投与した。投与後一
定詩間毎に尾動脈をメスにて切断し、出血させ、ヘパリ
ン処理した毛細ガラス管を用いて点液２０μＱを採取し
、血糖値の定量に供した。対照群のマウスには、試料溶
液に代え生理食塩液を投与した。なお、実験中マウスは
給食下におき、水のみを与えた。血糖値の定量は、前記
試験例１と同様の方法によった。

（２）結果 本発明インスリン作用増強剤有効成分（アポＡ−Ｉ［）
を含む試料を、Ｃ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂＩｌ＋系の自
然発症糖尿病マウスに１！！１１２内投与し、その血ｍ
値の変化を調べた結果を下記第４表に示す。

第　　４　　表 Ｃ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｂｄｍ系自然発症糖尿病マウスに
おける血糖降下作用（Ｍｅａｎ　ｔｈｓＤ、ｎ　−５） 尚、表中（１）はＰ＜０．０１％にて有意を示す。

第４表より、本発明試料の投与によれば、投与２４時間
俵より血糖の低下が見られ、２８時間及び３２時間後に
は最も５苔に血糖は低下し、いずれも生理食３ＢＰ！ｉ
投与群マウスの血ｅ２Ｉ値に比較して有意（危険率１％
以下）に低値であることが判る。

なお投与４８時間後には血糖は前値に復した。

以上の通り、アポＡ−ＩＩは、肥満、高血糖及びインス
リン抵抗性を示し、ヒトの危篤な■型糖尿病に類似した
病態モデルとされる０５７ＢＬ“／に３　Ｊ　−ｄｂｌ
ｌｌ系マウスに対し、著明な血糖降下作用を示すと共に
、その効果は投与翌日において持続的に発現されること
が判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は製造例１におけるゲルｉ濾過溶出活性パターン
を示し、Ｍ２図は同側１におけるＴＳＫ−ｇｅｌ　０Ｄ
Ｓ−１２０Ａを用いた高速液体カラムクロマトグラフィ
ーでの溶出活性パターンを示し、第３図は第２図に示ず
活性画分を再クロマトグラフィーに供した結果を示し、
第４図は本発明有効成分のＵ■スペクトル分析図を示し
、第５図は本発明有効成分の各種濃度でのインスリン作
用促進活性を示すグラフであり、また第６図は本発明有
効成分のＫＫマウスにおけるインスリン作用促進活性を
示すグラフである。 （以　上） 第４図 製表（ｎｍ） 第５図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アポリボタンパクＡ−IIを有効成分として含有す
   ることを特徴とするインスリン作用増強剤。