JPS6152281A - 細胞培養床の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、細胞培養床の製造方法に関する。

従来の技術 一般に接着依存性細胞の培養床は、その性質上、表面の
親水性が良好であることが必要上され、ノに親水性の物
質を接着依存性細胞の培養床として用いるときには、表
面を親水化処理することが必要であるとされている。

発明が解決しようとする問題点 従来、物質の表面を親水化するための処理方法として、
酸素プラズマ中あるいは空気プラズマ中で基体表面を酸
化する方法が知られている。しかしながら、この方法に
おいては次のような欠点がある。すなわち酸素原子や酸
素分子は電子親和力が大きく、プラズマ中で容易に負イ
オンになるため自動イオン化（Ａｕｔｏ　１ｏｎｉｚａ
ｔｉｏｎ）現象が起る。

そのため反応容器内のプラズマ状態は、外部から加える
エネルギー、例えば高周波電力やマイクロ波電力等によ
って一義的に決定されるものとはならず、空間的にイオ
ンの疎な所と密な所が生したり、それらが振動したりす
るので不安定となる。

酸素プラズマによる表面処理は、このような理由から均
一な表面処理を行うことが難しく、また酸素プラスマ処
理によって表面を親水化しても、親水性が不安定で経時
変化を起こし、時間とともに親水性が悪化する欠点があ
る。

上記ブラスマ処理以外の表面親水化方法として、酸化性
の強い溶液中にポリマーを浸漬したり、ポリマー分子中
に親水性官能基を導入するなとの化学的処理方法、ポリ
マーに紫外線を照射して光酸化する方法等が知られてい
る。しかしながら、いずれの方法も親水性が経時変化を
起こし７て劣化する欠点かある。

問題点を解決するだめの手段 本発明は、１記欠点を解決し、プラズマ重合により得ら
れる優れた親水性を自１−７シかもその親水性が経時変
化しない均一・な）■膜（以ト“プうスマ重合体膜と称
す。）を細胞培養用ノ、ζ体の表面に形成してイ！れた
親水性表面を有し、かつ接着依存性細胞の接着率の高い
細胞１ｔＳ養床の製造方法を提供するものである。

本発明の要旨は、下記一般式（＋）で示される化合物お
よび二重結合を含む環状炭化水素化合物から選ばれる１
種以」二の化合物と酸素との混合ガスを用いてプラズマ
重合を行い、細胞培養床用基体の表面に薄膜を形成する
ことを特徴とする細胞培養床の製造方法ムこある。

一般式（Ｉ） Ｒｚ　　　　　　Ｒａ （式中、Ｒ，、Ｒ２、Ｒ３およびＲ１はそれぞれ独立に
水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキ
ル恭およびビニル基、プロペニル基、アリル基等のアル
ケニル基からなる群から選ばれる。）上記一般式（Ｔ）
で示される化合物としては、例えば、エチレン、プロピ
レン、２−ブテン、イソブチレン、２−メチル−２−ブ
テン、２，３−ジメチル−２−ブテン、１−ブテン、３
−ヘキセン、２−エチル−１−ブテン、３−エチル−３
−ヘキセン、３．４−ジエチル−３−ヘキセン、１．３
−ブタジェン、１．３．５−ヘキサトリエン、２−ビニ
ル−１，３−ブタジェン、３−ビニル−１，３，５−ヘ
キサトリエン、３，４−ジヒニル−１，３，５−ヘヰザ
トリエン、２−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、２
．３−ジメチル−２−ペンテン、３−メチル−３−ヘキ
セン、３−コニチル−２−ペンテン、３−メチル−４−
エチル−３−ヘキセン、２−メチル−３−エチル−２−
ペンテン、２．３−ジメチル−３−へ４−セン、イソプ
レン、■＋３−ペンタジェン、３−メチル−１，３−ペ
ンタジェン、４−メチル−１，３−ペンクジエン、３，
４−メチル−１，３−ペンタジェン、３−メチル−１，
３，５−ヘキサトリエン、３−ビニル−１，３−ペンタ
ジェン、３−メチル−４−ビニル−１，３，，５−ヘキ
サトリエン、３−ビニル−４−メチル−１，３−ペンタ
ジェン、３．４−メチル−１，３，５−ヘキサトリエン
、１，３−ヘキサジエン、２−エチル−１，３−ブタジ
ェン、３−エチル−１，３−へキサジエン、４−エチル
−１，３−へキサジエン、３，４−ジエチル−１，３−
ヘキサジエン、３−ビニル−１，３−ヘキサジエン、３
−エチル−１，３，５−へキサトリエン、３−エチル−
４−ビニル−１，３，５−ヘキサトリエン、３，４−ジ
エチル−１，３，５−ヘキサトリエン、３−ビニル−４
−エチル−Ｒ３−ヘキサジエン、３−メチル−１，３−
へキサジエン、４−メチル−Ｉ＋３−ヘキサジエン、３
−エチル−１，３−ペンタジェン、３−エチル−４−メ
チル−１，３−ペンタジエン、３，４−ジメチル−１，
３−ヘキ゛す・ジエン、３−メチル−４−エチル−１，
３−へキサジエン、３−エチル−４−メチル−１，３−
ヘキサジエン、３−メチル−４−エチル−１，３，５−
ヘキサトリエン、３−ビニル−４−メチル−１，３−へ
キサジエン、１，４−ペンタジェン等を挙げることがで
き、好ましくは、エチレン、プロピレン、１，３−ブタ
ジェン、１−ブテン、２−ブテンおよびイソブチレンを
挙げることができる。

二重結合を含む環状炭化水素としては、例えばベンゼン
、トルエン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、クメ
ン、プチルヘンゼン、キシレン、エチルトルエン、シメ
ン、ジエチルベンゼン、トリメチルベンゼン、テトラメ
チルベンゼン、スチレン、メチルスチレン、アリルベン
ゼン、ジビニルヘンゼン、ｌ−フェニル　１，３−フタ
ニ／エン等の芳香族炭化水素、シフ１：１ペンテン、シ
フ１１ペンタジエン、フルヘン、シクロへ；１−セン、
メチル−゛・クロヘキセン、シクロ−＼−１−ザシコニ
ン、シフし！フ′テン、シクロオクタテトラエン、メン
テン、リモネン、ジ−ペンテン、テルピノレン、テルペ
ネン、フエランドレン、シルヘストレン、カレン、ピネ
ン、ボルネン等の脂環Ｉ（炭化水素等を挙げることがで
き、好ましくは、ヘンセン、スチレン、１ルエン、エチ
ル−＼ンゼン、キシレン、エチルトルコーン、ジエヂル
ヘンゼンおよびメチルスチレンを挙げることができる。

これ等の化合物心よ、プラズマ反応系においてガス化が
可能なプラズマ重合性物質である。

本発明においては、前記一般式（Ｉ）で示される化合物
および二重結合を含む環状炭化水素化合物から選ばれる
１種以」の化合物と酸素との混合ガスが用いられるが、
該混合ガス６：：　Ｌｌ、例えば水素、−酸化炭素、二
酸化炭素、水蒸気、窒素、アル：１ン、ヘリウム、キセ
ノン、ネオン等のガスを２０モル％程度以下の１１１合
で加えてもよい。

上記一般式（＋）で示される化合物（Ａ）および／また
は二重結合を含む環状炭素水素化合物（Ｒ）と酸素との
配合比（（Ａ）＋（Ｂ）／酸素、（Ａ）／酸素または（
Ｂ）／酸素）はモル比でｉｌｌ常０．１〜１０、好まし
くは０．２〜６、さらに好ましくは０．２〜４であり、
０．１未満であるとプラズマ重合体膜の生成速度が遅く
て実用性に乏しいとともに得られるプラズマ重合体膜の
性能の耐久性が悪＜ｔＩ″す、また】０を超えると得ら
れるプラズマ重合体１１９の親水１ノ１が不十分である
と開時に局所的に親水化されない箇所が発生ずる。

上記一般式（Ｉ）で示される化合物を２種以」二あるい
は二重結合を含む環状炭化水素化合物を２種以」−混合
して混合ガスとする場合、または上記一般式（Ｉ）で示
される化合物と二重結合を含む環状炭化水素化合物とを
／１１合して混合ガスとする場合において、その混合比
に特に制限はない。

本発明において用いる細胞培養床用基体としては、プラ
ズマ重合処理を施して得られるものが所要の細胞の培養
に支障のない固体であれば特に制限はなく、例えば天然
高分子、合成樹脂、合成ゴム、ガラス、セラミック等を
＋Ａ質とするものであり、具体的にはこれらの祠質から
なるシャーレ、ボトル等の容器および接着用担体として
用いられる粒子を例示することができる。

更にプラズマ重合の条件、例えば反応容器内の真空度、
前記の混合ガスの流量、放電電力等については、通常の
プラズマ重合反応におけると同様の条件が用いられ、例
えば反応容器内の真空度は１ミリＴｏｒｒ〜１０　Ｔｏ
ｒｒ、前記の混合ガスの流量（−１反応容器の容量が５
０７！の場合には標準状態で１分間当り０．１〜１００
ｃｃか適当である。また放電電力はプラズマの電子温度
（例えば特開昭５１１−１３５５７４号公報記載の方法
によって測定することができる。

）が５千〜８万度となるようにするのが好ましい。

５千度未満の場合にはプラズマ重合体ＩＩＩの生成速度
が遅く、８万度を超える場合にはプラズマ重合体膜の表
面の親水性が場所によって不均一・Ｑになる場合がある
。さらに高い耐久性能をプラズマ重合体膜にイ；Ｊちす
るためには、５千〜６万度とするのが特に好ましい。プ
ラズマ重合時間は、基体−にに形成すべきプラズマ重合
体膜の厚さによって異なる。該プラズマ重合体膜の厚さ
は、特に限定するものではないか、通常は１〜５０００
人程度の厚さであればよく、従ってプラズマ重合時間は
短くてずみ、例えば数十分間以下である。

」二重プラズマ重合に用いる装置Ｃ３１、例えば第１図
に示すように、真空ポンプ（図示せず）に接続された反
応容器１の一端小径部にコイル２を設りてこれに高周波
電源３を接続し、反応容器１内における支持台４上に細
胞培養床用、！ン体Ｓを保持し、反応容器］内を真空排
気しながら、ガス入Ｌ１５を介して反応容器１内に一般
式（Ｉ）で示される化合物および二重結合を含む環状炭
化水素化合物から選ばれる１種以」二の化合物と酸素と
を混合したガスを導入し、前記コイル２に高周波電源３
から高周波電圧を印加して反応容器１内にプラズマを発
生せしめ、このプラズマを前記細胞培養床用基体Ｓの外
面に作用セしめてこれに前記化合物と酸素によるプラズ
マ重合体膜を形成−Ｌ’シ、ぬる。

あるいは第２図に示すよ・うに、−、ルジャーに、１、
り構成される反応容器１０内に互に対向する一月の電極
ＩＬＩＩ’を設＆Ｊてその間に細胞培＃：庄用基体Ｓを
保持し、電極ＩＩ、Ｉ＋”間Ｃ１目３１例えば交流電源
１２を接続してこれにより電極ｆｍ１１’間にプうズマ
を発生−１しめ、このプラズマを１１１ｊ記細胞培養床
用県体Ｓの外面に作用−μしめてこれＧ、二曲記化合物
と酸素によるプラズマ重合体膜を形成−ヒしぬる。なお
１３し１排気管、１４．１４’は一般式（＋）で示され
る化合物および二重結合を含むＩｇｔ状炭化炭化水素化
合物ｊ巽ばれるＩ　ｌｆ！Ｉｉ以−にの化合物および酸
素のカス勇入族である。

またプラズマ重合のための装置とし７ては、第１図およ
び第２図に示したｔ）のに限られることなく、例えばプ
ラズマ発生のためのエネルギー源は的ノンまたは交流の
何れの電源であってもよい。そし７で交流の場合には、
低周波、高周波ま人工１１マイク１！波の何れの周波数
の電源であってもよい。、二ごてマイクロ波の場合の増
幅器とプラズマ系とのカップリング方法は、ハシゴ型、
キャビティー型等の何れでもよい。さらにプラズマ発生
用電極の型、すなわち誘導型、容量型等についても、何
ら制限されるものではない。

以上のようなプラズマ重合によって細胞培養床用Ｗ体の
表面に形成されるプラズマ重合体膜は、親水性に優れて
いてしかもその親水性が経時変化せず、接着依存性細胞
に対する適合性が優れていてしかも安定であり、従って
本発明によれば、接着依存性細胞の培養に好適に使用で
きる細胞培養床を簡華な方法で製造することができる。

実施例 次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例によって何ら制約されるも
のではない。

実施例１、比較例１ 第２図に示す反応容器において、支持台上にポリスチレ
ンシャーレを基体として保持し、化合物としてエチレン
を用い、エチレンの流量を７．５ｃｃ（ＳＴｒ’）／ｍ
ｉｎ、酸素の流■を］Ｏｃｃ　（ＳＴｒ’）　／　ｍｉ
ｎとじて両者を反応容器内に導入しながら当該容器内を
５０ミリＴｏｒｒの真空Ｊｌに保った状態で、電極に１
０旧１１の交流電力を加えて電了渇度２．５．！０３万
度（））プラズマを発生ゼしめ、ごれを１０分間に自°
１．て反応さ・口るごとにより、ノ、Ｉ、体の表面にプ
ラズマ重合ｊ合１ｔ、膜を形成して細胞培養用ノヤーレ
を＋！ｌ！、！ｉｉｉ！Ｕ７だ。ここに、プラズマの電
子／ｌ！！を度は、加熱ざわた探月（図示せず：特開昭
５４　、、、、　＋　３５５７４号公４１３に記載）に
より測定した値である。

また、形成されたプラズマ市合体１１りの厚さを測定す
るために、前記ノヤーレの横にシリ−ノンｌ”ノエハー
を置き、同時にプラズマ重合を行い、ごのウェハーをエ
リプソメーターｒＧＡＥＲＴＮＩｉＲエリプソメータ１
．１１７型」を用いて測定したと、二ろ４０（Ｉ：’−
１００人であった。

上記プラズマ重合体膜を形成したソート−レの表面の水
の接触角を、液滴法によって求めた。また、同一ザンブ
ルを用いて、水の接触角についてその経時変化を求めた
。結果を第１表に示す。

第　　１　　表 上記で得られた１０個のシャーレを２４時間の間空気中
に保存した後、２４時間に亘って高温殺菌処理を施し、
別途培養しておいたチャイニーズハムスター肺由来の細
胞株ｖ−７９を０．２５重■％のトリプシン溶液によっ
て遊離の細胞として各シャーレに仕込み、１０重量％の
牛胎児血清を含有するイーグルＭＥＭ培地（日永製薬社
製）を用い、炭酸ガス５体積％、空気９５体積％の雰囲
気のインキフ、ヘークー中において、温度３７℃で細胞
培養を行った。

培養時間が１２０分間に達した時に各シャーレをインキ
ュベーターより取り出して培地を除き、リン酸緩衝生理
食塩水により洗浄した後、プロナーゼＥＤＴＡ　溶液１
ｍｌを各シャーレに加えることによリ、シャーレ表面に
接着していた細胞を遊離さ一ロ、血球計算盤を用いて細
胞数を測定した。そＬ２て接着していた細胞数の仕込み
細胞数に対するＮｔ１１合（接着率）を求めた。結果を
第２表に示す。

またプラズマ重合体膜を形成さ一ロないノヤーレを用い
たほかは本実施例と同様に試験を行なった比較例１によ
る結果を第１表お、１、び第２表に示′づ。

第　　２　　表 実施例２ 実施例１において、化合物として１．３−ブタジェン１
０ｃｃ　（ＳＴＰ）　／　ｍｉｎを用い、酸素の流量を
５ｃｃ（ＳＴＰ）／ｍｉｎとした点を除いたほか番、１
実施例１と同様にして細胞培養用シャーレを製造し、実
施例１と同様の方法によって細胞培養を行った。なおプ
ラズマの電子温度は、放電電流を調節するごとにより実
施例１と同し２．５±０３万度に設定しｌ：。

結果を第３表に示す。

実施例３ 実施例１において、化合物としてヘンビン５ｃｃ（ＳＴ
Ｐ）　／　ｍｉｎを用い、酸素の＞ＭＵを１５ｃｃ（Ｓ
ＴＰ）／ｍｉｎとした点を除いたほかは実施例１と同様
にして細胞培養用シャーレを製造し、実施例１と同様の
方法によって細胞培養を行った。なおプラズマの電子温
度は、放電電流を調節するごとにより実施例１と同じ２
５±０．３万度に設定した。結果を第３表に示す。

比較例２ 実施例１において、化合物を用いずに酸素］０ｃｃ（Ｓ
ＴＰ）　／　ｍｉｎのめを用いたほかは実施例１と同様
にして細胞培養用シャーレを製造し、実施例１と同様の
方法によって細胞培養を行った。なおプラズマの電子１
品度は、放電電流を調節することにより実施例１と同し
２．５±０．３万度に設定した。結果を第３表に示す。

第　　３　　表 実施例４〜６、比較例３〜４ 実施例１〜３および比較例１〜２において、培養細胞と
してＩＩ　ｅ　Ｌ　ａ細胞を用い、培養液として１０容
量％の子牛血清を含むミニマル・エソセンシャル培地を
用いたほがは実施例１〜３および比較例１〜２と同様に
して細胞培養を行った。ここで、実施例ｄ〜６（」実施
例１〜３に対応し、比較例３〜４４Ｊ：比較例ｊ〜２６
．二対１１ｓするものである。結果を第４表に示す。

第　　４　　表 １つ 実施例７〜９、比較例５〜６ 実施例１〜３および比較例１〜２において、培養細胞と
してＭＲＣ細胞を用い、培養液として２０容量％の牛胎
児血清を含むｐ−１２００を用いたほかは実施例１〜３
および比較例１〜２と同様にして細胞培養を行った。結
果を第５表に示す。

第　　５　　表 発明の効果 本発明によれば、親水性に優れ、しかもその親水性が経
時変化をしない細胞培養床を１ｉするごとかでき、しか
も接着依存性細胞をｌΔ養するに際して細胞の接着率が
高い細胞培養床を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図Ｊｔよび第２図は本発明方法にお番）るプラズマ
重合に用いる、それぞれ放電管型およびヘルシャー型の
装置の例を示す説明用断面図である。 １・・・０反応容器　　　２・１３．コイル３．１２・
・・・電＃　　　４・１１．支持台５・・・・ガス入口
　　　１０・・・・反応容器１１、ＩＩｏ・・・・電極
　　　１３・・・・排気管１４．１４°・・・ガス導入
管

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記一般式（ I ）で示される化合物および二重結合を
   含む環状炭化水素化合物から選ばれる１種以上の化合物
   と酸素との混合ガスを用いてプラズマ重合を行い、細胞
   培養床用基体の表面に薄膜を形成することを特徴とする
   細胞培養床の製造方法。 一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３、およびＲ＿４はそれ
   ぞれ独立に水素原子、アルキル基およびアルケニル基か
   らなる群から選ばれる。）