JP2021536226A - 高度細胞接着を有するポリマー製細胞培養表面 - Google Patents
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Abstract
ポリマー支持体は、粗く、親水性であり、且つ内部部分よりも高い酸素原子含有量を有するプラズマ処理接触表面を有する。この処理接触表面は、細胞接着、細胞増殖、及び細胞回収率が向上している。処理中、接触表面は、処理表面近くのガス注入口を通して導入されたプロセスガスと接触し、高周波電力がプロセスガスに導入され、未処理接触表面と比較して改善された細胞回収を有する処理接触表面を形成する。プロセスガスは、任意選択で、窒素ガス、酸素ガス、又は窒素原子、酸素原子、若しくは窒素原子と酸素原子の組み合わせを含むガスであり得る。このプロセスは、任意選択で、処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善する。
Description
本技術は、概して、任意選択で親水性の粗い、プラスチック支持体（時として、本開示では、接触表面と呼ばれる）の表面、若しくは表面処理、又は、任意選択で親水性の粗い表面にし、表面への細胞接着を促進する方法に関する。より具体的には、本技術は、その増強された細胞接着によって、細胞培養及び細胞増殖のための支持体として使用される処理接触表面を備えた、プラスチック支持体、例えば、実験器具の医療装置若しくは品目に関する。こうした医療装置として、限定はされないが、細胞培養容器及びローラボトルなどがある。
本発明はまた、プラズマ処理された細胞増殖及び細胞培養容器並びにプラスチック実験器具に関する。本発明はさらに、例えばプラズマ処理によって提供される、任意選択で親水性の粗い表面に関する。本発明はさらに、細胞接着が促進され、これにより細胞培養及び細胞増殖が改善された、任意選択で親水性の粗い表面の形成に関する。
造血細胞株及び形質転換細胞などのいくつかの細胞は、懸濁液（例えば、３Ｄスフェア培養懸濁液）で増殖するが、他のほとんどの細胞は、高い表面結合（例えば、単層増殖）を好んで増殖する；即ち、増殖するには支持体に付着する必要がある。
表面の親水性は、細胞接着に有利である。伝統的に、ガラス製品は、親水性表面を呈することから、使用され、細胞培養及び細胞増殖のために使用され続けている。しかし、ガラス製品は、割れやすく、非常に高価で、微粒子の問題を被りやすく、ガラスの組成により重金属抽出物をもたらすと共に、細胞増殖及び／又はタンパク質及び他の生物製剤の凝集に悪影響を生じ得る。
これらの問題のいくつかは、ガラス製品の代わりに射出成型プラスチック製品を使用することによって対処することができる。ローラボトルは、非常に多様な用途で細胞培養容器として使用される。ローラボトルは、多くの場合、ポリスチレン（ＰＳ）又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から製造される。これらの材料は、優れた光学的明澄度、高い安定性、破損しにくさ及び多くの他の利点を呈示する。プラスチックは、ガラスの問題のいくつかに対処するが、プラスチックも特定の問題を引き起こす。
上記のように、高い細胞接着は、細胞増殖を促進すると考えられている。従って、細胞増殖容器では、生体物質と共に使用されるプラスチック製品への細胞接着を促進することが望ましい。高い接触表面積及び親水性は、細胞接着に有利である。ポリマープラスチックからなる一般的な実験器具の構成要素の表面は滑らかで疎水性であり、通常は良好な細胞接着性を有していない。これらの問題は、細胞培養容器及びローラボトルへのプラスチック製品の使用を制限する。
従って、高い接触表面積及び親水性を有し、これにより細胞接着を改善するプラスチック細胞培養／細胞増殖容器用の表面を提供することが望まれる。
接触表面を拡張するために、一部のローラボトルは、本体に円周方向のリブ、軸方向のリブ、又はその他のリブが付くように設計されており、増殖表面を増やすことができる。粗面化は、接触表面積を増やすための効率的な方法である。接触表面が粗くなると、より多くの接触表面積が細胞接着に利用できるようになる。
細胞増殖に有利である親水性表面を生成するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び双性イオンポリマーコーティングをはじめとするいくつかの親水性コーティングが使用されており、これらは、優れた細胞接着をもたらす。これらのポリマーコーティングの多くは、流体ペイロード中に移動（溶解、分散）する可能性があり、細胞増殖又は試験を妨害し、それらの有用性を制限する。
従って、プラスチックの表面への細胞接着を促進する、広い表面積の接触表面を提供し、親水性である、細胞培養容器又はローラボトルなどのプラスチック実験器具が必要である。同様に、処理接触表面の材料の移動を防止し、これにより望ましくない粒子の干渉及びプラスチック表面の露出を防止する安定した接触表面を有する細胞培養容器及びローラボトルなどのプラスチック実験器具が必要とされている。
本発明は、粗面化され、高い酸素含有量を有し、親水性であり、これにより細胞接着及び細胞回収速度が向上した接触表面をプラズマ処理されたプラスチック支持体に提供することで上記の問題に対処する。
本発明の一態様は、本質的に接触表面及び内部部分からなるポリマー支持体であり、接触表面は：
・０．０５５％を超える、任意選択で０．０６％〜２％、任意選択で０．１％〜１．５％、任意選択で０．５％〜１．２％、任意選択で０．９％〜１．１％の表面積差Ａ；
・１．９°を超える、任意選択で２°〜２０°、任意選択で４°〜１５°、任意選択で６°〜１２°、任意選択で７°〜１０°、任意選択で７°〜９°の二乗平均平方根表面勾配Ｓｄｑ；
・４４．４／μｍ2を超える、任意選択で４５／μｍ2〜２００／μｍ2、任意選択で５０／μｍ2〜１８０／μｍ2、任意選択で６０／μｍ2〜１７０／μｍ2、任意選択で７０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で８０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で９０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１００／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１１０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１２０／μｍ2〜１５０／μｍ2の頂点密度（ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｓｕｍｍｉｔｓ）、Ｓｄｓ；又は
・３．６２／μｍを超える、任意選択で４／μｍ〜５０／μｍ、任意選択で６／μｍ〜４５／μｍ、任意選択で８／μｍ〜４０／μｍ、任意選択で１０／μｍ〜３５／μｍ、任意選択で１２／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１４／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１６／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１８／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で２０ｘ／μｍ〜２５／μｍの平均頂点曲率（ｍｅａｎ ｓｕｍｍｉｔ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）、Ｓｓｃの４つのパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化される粗さを有し；
パラメータＡ、Ｓｄｑ、Ｓｄｓ、及びＳｓｃは、接触表面の５μｍ×５μｍの画像化面積の測定によって決定される。
・０．０５５％を超える、任意選択で０．０６％〜２％、任意選択で０．１％〜１．５％、任意選択で０．５％〜１．２％、任意選択で０．９％〜１．１％の表面積差Ａ；
・１．９°を超える、任意選択で２°〜２０°、任意選択で４°〜１５°、任意選択で６°〜１２°、任意選択で７°〜１０°、任意選択で７°〜９°の二乗平均平方根表面勾配Ｓｄｑ；
・４４．４／μｍ2を超える、任意選択で４５／μｍ2〜２００／μｍ2、任意選択で５０／μｍ2〜１８０／μｍ2、任意選択で６０／μｍ2〜１７０／μｍ2、任意選択で７０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で８０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で９０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１００／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１１０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１２０／μｍ2〜１５０／μｍ2の頂点密度（ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｓｕｍｍｉｔｓ）、Ｓｄｓ；又は
・３．６２／μｍを超える、任意選択で４／μｍ〜５０／μｍ、任意選択で６／μｍ〜４５／μｍ、任意選択で８／μｍ〜４０／μｍ、任意選択で１０／μｍ〜３５／μｍ、任意選択で１２／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１４／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１６／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１８／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で２０ｘ／μｍ〜２５／μｍの平均頂点曲率（ｍｅａｎ ｓｕｍｍｉｔ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）、Ｓｓｃの４つのパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化される粗さを有し；
パラメータＡ、Ｓｄｑ、Ｓｄｓ、及びＳｓｃは、接触表面の５μｍ×５μｍの画像化面積の測定によって決定される。
以下の参照文字が図面に使用されている：
類似の参照番号は、対応する部分を示す。
詳細な説明
「接触表面」という用語は、サンプル又は他の材料と接触させようとする位置にあると共に、それが接触するサンプル又は他の材料との相互作用を決定する表面特性を有する表面を意味する。接触表面のいくつかの例は、容器の表面（例えば、容器ルーメンと隣接する）又は容器、シート、ブロック、若しくはその他の物体の外側表面の一部若しくは全部である。任意選択で、接触表面は、それがプラズマで処理される前に、内部部分と同じ材料から製造される。
「接触表面」という用語は、サンプル又は他の材料と接触させようとする位置にあると共に、それが接触するサンプル又は他の材料との相互作用を決定する表面特性を有する表面を意味する。接触表面のいくつかの例は、容器の表面（例えば、容器ルーメンと隣接する）又は容器、シート、ブロック、若しくはその他の物体の外側表面の一部若しくは全部である。任意選択で、接触表面は、それがプラズマで処理される前に、内部部分と同じ材料から製造される。
「内部部分」という用語は、接触表面ではないが、バルク製品又はコーティングの内部の部分を形成するバルク製品又はコーティングの一部を示す。
いずれかの実施形態で言及する「プラズマ」は、その構成粒子の広範なイオン化、一般に気体の形態、及び白熱（即ち、グロー放電を発生させる、つまり発光する）を特徴とする、物質の４つの基本状態のうちの１つの物理学におけるその従来の意味を有する。「直接」プラズマ（遠隔プラズマとは対照的に）の場合は、相当な量のプラズマのイオン及び電子が、処理された物品表面に直接接触する。
処理接触表面は、全ての実施形態について、本明細書に記載される通り、プラズマ処理され、且つ、こうした処理の結果、増強された細胞増殖を呈示する接触表面として定義される。
本明細書全体を通して使用される「容器」という用語は、液体、ガス、固体、又はこれらのいずれか２つ以上を含有する、又は運搬するように改変された任意のタイプの物品であってよい。容器の一例は、少なくとも１つの開口部（例えば、用途に応じて１つ、２つ以上）と、内側接触表面を含む壁とを有する物品である。
本開示は、ポリマー製であって、接触表面及び内部部分を有する支持体に関する。接触表面は：
・０．０５５％を超える、任意選択で０．０６％〜２％、任意選択で０．１％〜１．５％、任意選択で０．５％〜１．２％、任意選択で０．９％〜１．１％の表面積差Ａ；
・１．９°を超える、任意選択で２°〜２０°、任意選択で４°〜１５°、任意選択で６°〜１２°、任意選択で７°〜１０°、任意選択で７°〜９°の二乗平均平方根表面勾配Ｓｄｑ；
・４４．４／μｍ2を超える、任意選択で４５／μｍ2〜２００／μｍ2、任意選択で５０／μｍ2〜１８０／μｍ2、任意選択で６０／μｍ2〜１７０／μｍ2、任意選択で７０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で８０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で９０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１００／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１１０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１２０／μｍ2〜１５０／μｍ2の頂点密度、Ｓｄｓ；又は
・３．６２／μｍを超える、任意選択で４／μｍ〜５０／μｍ、任意選択で６／μｍ〜４５／μｍ、任意選択で８／μｍ〜４０／μｍ、任意選択で１０／μｍ〜３５／μｍ、任意選択で１２／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１４／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１６／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１８／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で２０ｘ／μｍ〜２５／μｍの平均頂点曲率、Ｓｓｃの４つのパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化される粗さを有し；
パラメータＡ、Ｓｄｑ、Ｓｄｓ、及びＳｓｃは、接触表面の５μｍ×５μｍの画像化面積の測定によって決定される。
・０．０５５％を超える、任意選択で０．０６％〜２％、任意選択で０．１％〜１．５％、任意選択で０．５％〜１．２％、任意選択で０．９％〜１．１％の表面積差Ａ；
・１．９°を超える、任意選択で２°〜２０°、任意選択で４°〜１５°、任意選択で６°〜１２°、任意選択で７°〜１０°、任意選択で７°〜９°の二乗平均平方根表面勾配Ｓｄｑ；
・４４．４／μｍ2を超える、任意選択で４５／μｍ2〜２００／μｍ2、任意選択で５０／μｍ2〜１８０／μｍ2、任意選択で６０／μｍ2〜１７０／μｍ2、任意選択で７０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で８０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で９０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１００／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１１０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１２０／μｍ2〜１５０／μｍ2の頂点密度、Ｓｄｓ；又は
・３．６２／μｍを超える、任意選択で４／μｍ〜５０／μｍ、任意選択で６／μｍ〜４５／μｍ、任意選択で８／μｍ〜４０／μｍ、任意選択で１０／μｍ〜３５／μｍ、任意選択で１２／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１４／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１６／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１８／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で２０ｘ／μｍ〜２５／μｍの平均頂点曲率、Ｓｓｃの４つのパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化される粗さを有し；
パラメータＡ、Ｓｄｑ、Ｓｄｓ、及びＳｓｃは、接触表面の５μｍ×５μｍの画像化面積の測定によって決定される。
接触表面は、任意選択で、上記の４つの値のうちの任意の２つ、或いは上記の４つの値のうちの任意の３つ、或いは上記の４つの値のすべてによって定量化される粗さを有する。
ポリマー支持体は、接触表面に加えて、この接触表面に隣接する内部部分を含む。接触表面は、初期表面の処理後に形成される。初期表面は、処理前の表面である。
任意選択で、処理後、内部部分のＸＰＳ原子組成は、接触表面のＸＰＳ原子組成よりも少ない割合の酸素及び多い割合の炭素を含む。言い換えれば、処理後、接触表面は、内部部分よりも多くの酸素を含む。任意選択で、接触表面のＸＰＳ原子組成は、内部部分のＸＰＳ原子組成よりも０．１〜３０原子％、任意選択で２〜３０原子％、任意選択で５〜２０原子％、任意選択で１０〜２０原子％、任意選択で１３〜１６原子％多い酸素を含む。任意選択で、酸素原子は、接触表面にグラフトされる。任意選択で、接触表面のＸＰＳ原子組成は、０．１〜２０原子％、任意選択で５〜１５原子％、任意選択で９〜１２原子％の、酸素がグラフトされた炭素原子を含む。
任意選択で、処理は、電力としてＲＦを使用するプラズマ処理である。任意選択で、少なくとも処理の時間の一部の間、注入口は支持体のルーメンに挿入される。
任意選択で、接触表面は、０〜２０ｎｍ、任意選択で０．１〜１０ｎｍ、任意選択で０．２〜１ｎｍ、任意選択で０．２〜０．７ｎｍ、任意選択で約０．６ｎｍの厚さを有し；接触表面は、親水性であり、未処理以外は同一の表面又は生物学的コーティングが施された表面又はマイクロ波プラズマ処理表面よりも高い細胞接着性を有し；内部部分は、本質的に炭素原子及び水素原子を含む。
任意選択で、接触表面は、０．６ｎｍ未満の厚さを有し、内部部分のＸＰＳ原子組成は、０．６ｎｍの深さで１％〜１０％の酸素を含む。
任意選択で、処理後、接触表面は、親水性であり、未処理よりも低い接触角を有する。任意選択で、接触表面は、３８°〜６２°、任意選択で５０°〜７０°、任意選択で５５°〜６５°、任意選択で６０°〜６４°、任意選択で３０°〜５０°、任意選択で３０〜４０°、任意選択で３５°〜４５°、任意選択で３７°〜４１°の接触角を有する。
任意選択で、支持体は、ルーメンを取り囲む内側表面、外側表面、及び少なくとも内側表面と外側表面との間で離間した内部部分を有する壁を有する容器を含む。任意選択で、容器は、例えば、ローラボトル、リブ付きローラボトル、プレート、皿、フラスコ、ボトル、又はチューブであり得る。任意選択で、支持体は細胞増殖に使用される。
任意選択で、支持体は、炭化水素ポリマー、例えば、オレフィンポリマー、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、水素化ポリスチレン、ポリシクロヘキシルエチレン（ＰＣＨＥ）、又はこれらの２つ以上の組み合わせ、又はヘテロ原子置換炭化水素ポリマー、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶｄＣ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ポリ乳酸、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリウレタンポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、イオノマー樹脂、又は上記の材料の任意の２つ以上の任意の組み合わせ、複合材料、配合物、又はラミネート；任意選択でポリスチレンを含む熱可塑性材料から形成される。
任意選択で、支持体は、ＲＦによって生成されるプラズマで処理される。任意選択で、接触表面は、この接触表面をプロセスガスと接触させること；及び接触表面に隣接するプロセスガスに高周波（ＲＦ）電力を導入して、接触表面に隣接するプラズマを発生させ、これにより処理接触表面を有する処理ポリマー支持体を形成することを含むプロセスで処理される。任意選択で、処理は、初期接触表面と比較して、処理接触表面からの細胞回収を改善するのに効果的である。任意選択で、細胞は、ニワトリ胚細胞培養物である。このプロセスは、任意選択で、初期接触表面と比較して、処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善し、任意選択で、少なくとも１３２％、任意選択で１３２％〜３００％、任意選択で１４０％〜２５０％、任意選択で１４０％〜２３０％の、処理接触表面からの細胞回収率をもたらす。ニワトリ胚細胞培養物の細胞回収率は、細胞培養物をウシ胎仔血清を含む培地ＤＭＥＭと接触させ、１０ｍＬの細胞培養及び培養培地を１Ｌのローラボトルに入れるか、又は２０ｍＬの細胞培養及び培養培地を２Ｌのローラボトルに入れ、空気中５％ ＣＯ２を含む３９℃の加湿チャンバー内でローラボトルを０．２５ｒｐｍで４８時間回転させ、０．１８ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリプシンを使用して細胞を収集し、そしてサンプルを０．４％トリパンブルーと混合して、それをＢｉｏＲａｄＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒにロードして記録することによって回収率を決定することによって決定される。
任意選択で、プラズマは、（遠隔プラズマとは対照的に）直接プラズマである。直接プラズマの場合、プラズマのかなりの量のイオン及び電子が、処理された物品の表面と直接接触する。任意選択で、プロセスガスは本質的に水を含まない。任意選択で、プラズマ処理中に、初期接触表面に隣接する排出口を有するガス注入導管を介してプロセスガスを移送することによって、表面がプロセスガスと接触される。任意選択で、ガスは、容器に挿入されたガス注入口を通して容器に導入される（図１〜３に示すように）。
プロセスガスは、任意選択で、窒素ガス、酸素ガス、又は窒素原子、酸素原子、若しくは窒素原子と酸素原子の組み合わせ、及び他の種類の原子、例えば希ガスを含む不均一ガスであり得る。適切なプロセスガスの非限定的な例には、酸素ガス、窒素ガス、亜酸化窒素ガス、又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせが含まれる。
任意選択で、高周波電力は、初期接触表面に隣接するプロセスガスに導入されて、初期接触表面に隣接するプラズマを発生させる。結果として、処理接触表面を有する処理ポリマー支持体が形成される。
任意選択で、処理後、接触表面は、初期未処理表面の表面積差Ａ２値と比較して、より高い表面積差Ａ１値を有する。任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞５×Ａ２、任意選択でＡ１＞１０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１５×Ａ２、任意選択でＡ１＞２０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２５×Ａ２、任意選択でＡ１＞３０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞３５Ａ２、任意選択でＡ１＞４０×Ａ２、任意選択でＡ１＞５０×Ａ２、任意選択でＡ１＞６０×Ａ２、任意選択でＡ１＞７０×Ａ２、任意選択でＡ１＞８０×Ａ２、任意選択でＡ１＞９０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１００×Ａ２、任意選択でＡ１＞１１０×Ａ２。
Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラー（米国特許第６，６１７，１５２号明細書に記載）は、本発明とは異なる接触表面を形成した。特に、本発明の接触表面は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラーの処理接触表面には存在しない高密度の小さな粒子状構造を有する。この差は、以下の粗さパラメータの少なくとも１つによって、実施例５で説明されるように定量化することができる。
任意選択で、処理後、接触表面は、２ＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラーの内側表面の表面積差Ａ２値と比較して、より高い表面積差Ａ１値を有する。任意選択で、Ａ１は０．０５５％を超える。任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞５×Ａ２、任意選択でＡ１＞１０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１５×Ａ２、任意選択でＡ１＞２０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２５×Ａ２、任意選択でＡ１＞３０×Ａ２。
任意選択で、処理後、接触表面は、処理接触表面と接触して増殖され、収集されるニワトリ胚細胞培養物の回収を可能にし、初期接触表面と比較して、少なくとも１３２％、任意選択で１３２％〜３００％、任意選択で１４０％〜２５０％、任意選択で１４０％〜２３０％である。
任意選択で、処理後、接触表面は、処理接触表面と接触して増殖され、収集されるニワトリ胚細胞培養物の生存を可能にし、初期接触表面と比較して、少なくとも８８％、任意選択で８８％〜９９％、任意選択で８８％〜９７％、任意選択で９４％〜９６％である。
本発明に従ってプラズマ処理によってそれぞれ形成される接触表面の表面粗さ、より高い酸素原子組成、及び親水性が組み合わさって、細胞接着、細胞増殖、及び細胞回収を効果的に高めることは驚くべき発見である。表面粗さは、表面積差（Ａ）、二乗平均平方根表面勾配（Ｓｄｑ）、頂点密度（Ｓｄｓ）、及び平均頂点曲率（Ｓｓｃ）のうちの少なくとも１つの粗さパラメータによって定量化される、高密度の小さな粒子状構造によって特徴付けられる。
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して表面の粗さを評価する。粗さは、表面積差、二乗平均平方根表面勾配（Ｓdq）、又は頂点密度（Ｓds）などのパラメータによって定量化することができる。
同じ支持体の場合、これらのパラメータは、撮影された画像のサイズに応じて変化し得る。２つの表面の粗さを比較する際には、各サンプルから取得する画像を同じサイズにする必要がある。
本発明の支持体は、処理後、より高い表面積差値（Ａ１）、より高い二乗平均平方根表面勾配（Ｓｄｑ）、より高い頂点密度（Ｓｄｓ）、又は平均頂点曲率（Ｓｓｃ）を有する接触表面を有する。本発明者らはまた、少なくともいくつかの例において、処理接触表面が、未処理接触表面よりも高密度の小さな粒子状構造を有することを観察した。この理論の正確さに拘束されることを意図するものではないが、本発明者らは、本発明に従った処理接触表面における高密度の小さな粒子状構造が、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラーの接触表面における間隔の広い低密度のバンプ構造よりも効率的に接触表面積を増加させることができると理論付けている。
Ａ１
「画像化面積」は、完全に平坦であるとすると、調べたエリアの平面図の面積である。
「画像化面積」は、完全に平坦であるとすると、調べたエリアの平面図の面積である。
「表面積」は、表面積を増加させる平面からの偏差を考慮に入れた、画像化面積の３次元表面積である。表面積は、画像全体で３つの隣接するデータ先端部によって形成される三角形の面積を合計することによって計算される。
「表面積差」Ａは、画像化面積を超える表面積の量である。表面積差は、パーセンテージで表され、以下の式に従って計算される：
表面積差＝１００［（表面積／Ｓ1×Ｓ1）−１］
式中、Ｓ１は、スキャンされたエリアの長さ（及び幅）から停止域（ｓｔｏｐｂａｎｄ）によって除外された面積を減じた値である。
表面積差＝１００［（表面積／Ｓ1×Ｓ1）−１］
式中、Ｓ１は、スキャンされたエリアの長さ（及び幅）から停止域（ｓｔｏｐｂａｎｄ）によって除外された面積を減じた値である。
本開示はまた、接触表面及び内部部分を有するポリマーからなる支持体に関する。接触表面は：
・任意選択で１％〜２０％、任意選択で５％〜１５％、任意選択で１０％〜１３％、任意選択で１１％〜１３％の表面積差Ａ；
・任意選択で１０°〜３０°、任意選択で１５°〜３０°、任意選択で２０°〜３０°、任意選択で２５°〜３０°、任意選択で２６°〜２８°の二乗平均平方根表面勾配（Ｓdq）値；
・任意選択で１０００／μｍ2〜３０００／μｍ2、任意選択で１５００／μｍ2〜２５００／μｍ2、任意選択で１５００／μｍ2〜２０００／μｍ2、任意選択で１７００／μｍ2〜１９００／μｍ2の頂点密度（Ｓds）値；又は
・任意選択で５００／μｍ〜８００／μｍ、任意選択で６００／μｍ〜８００／μｍ、任意選択で７００／μｍ〜８００／μｍの平均頂点曲率（Ｓｓｃ）値の４つのパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化される粗さを有し；
２μｍ×０．５μｍのエリアが表面に画像化される。
・任意選択で１％〜２０％、任意選択で５％〜１５％、任意選択で１０％〜１３％、任意選択で１１％〜１３％の表面積差Ａ；
・任意選択で１０°〜３０°、任意選択で１５°〜３０°、任意選択で２０°〜３０°、任意選択で２５°〜３０°、任意選択で２６°〜２８°の二乗平均平方根表面勾配（Ｓdq）値；
・任意選択で１０００／μｍ2〜３０００／μｍ2、任意選択で１５００／μｍ2〜２５００／μｍ2、任意選択で１５００／μｍ2〜２０００／μｍ2、任意選択で１７００／μｍ2〜１９００／μｍ2の頂点密度（Ｓds）値；又は
・任意選択で５００／μｍ〜８００／μｍ、任意選択で６００／μｍ〜８００／μｍ、任意選択で７００／μｍ〜８００／μｍの平均頂点曲率（Ｓｓｃ）値の４つのパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化される粗さを有し；
２μｍ×０．５μｍのエリアが表面に画像化される。
接触表面は、任意選択で、上記の４つの値のいずれか２つ、或いは上記の４つの値のいずれか３つ、或いは上記の４つの値のすべてによって定量化される粗さを有する。
任意選択で、接触表面の表面積差Ａ１は、未処理以外は同一の接触表面の表面積差Ａ２よりも大きく、任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞５×Ａ２、任意選択でＡ１＞１０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１５×Ａ２、任意選択でＡ１＞２０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２５×Ａ２、任意選択でＡ１＞３０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞３５Ａ２、任意選択でＡ１＞４０×Ａ２、任意選択でＡ１＞５０×Ａ２、任意選択でＡ１＞６０×Ａ２、任意選択でＡ１＞７０×Ａ２、任意選択でＡ１＞８０×Ａ２、任意選択でＡ１＞９０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１００×Ａ２、任意選択でＡ１＞１１０×Ａ２である。
Ｓｄｑ
二乗平均平方根表面勾配（Ｓｄｑ）は、すべての方向にわたって評価された、表面テクスチャーを構成する勾配の尺度である。二乗平均平方根表面勾配には、振幅と間隔の成分が含まれる。
より低いＳｄｑ値は、より広い間隔のテクスチャー成分を示し得る。
二乗平均平方根表面勾配（Ｓｄｑ）は、すべての方向にわたって評価された、表面テクスチャーを構成する勾配の尺度である。二乗平均平方根表面勾配には、振幅と間隔の成分が含まれる。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面のＳｄｑ１は、未処理以外は同一の接触表面のＳｄｑ２よりも大きく、任意選択でＳｄｑ１＞２×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞３×Ｓｄｑ２（即ち、Ｓｄｑ１はＳｄｑ２の３倍よりも大きい）、任意選択でＳｄｑ１＞４×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞５×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞６×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞７×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞８×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞９×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞１０×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞１１×Ｓｄｑ２である。
頂点密度（Ｓｄｓ）は、単位面積あたりの頂点の数である。頂点はピークから得られる。ピークは、８つの最近傍すべての上に延在する連続する点の直線配列における任意の点として定義される。頂点は、３Ｄ測定エリアを含む「Ｘ」又は「Ｙ」の最小寸法の少なくとも１％分離されるように制約されている。加えて、頂点は、平均平面よりも最大高さの５％高い閾値より上でしか検出されない。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面のＳｄｓ１は、未処理以外は同一の接触表面のＳｄｓ２よりも大きく、任意選択でＳｄｓ１＞２×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞３×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞４×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞５×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞６×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞７×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞８×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞９×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞１０×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞１１×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞１２×Ｓｄｓ２である。
平均頂点曲率（Ｓｓｃ）は、様々なピーク構造の平均頂点曲率である。Ｓｓｃは、頂点ごとに評価され、エリア全体で平均化される：
Ｓｓｃ＝１／Ｎ∫∫［｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｘ２｝＋｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｙ２｝ｄｘｄｙ］
Ｓｓｃ＝１／Ｎ∫∫［｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｘ２｝＋｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｙ２｝ｄｘｄｙ］
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面のＳｓｃ１は、未処理以外は同一の接触表面のＳｓｃ２よりも大きく、任意選択でＳｓｃ１＞２×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞３×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞４×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞５×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞６×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞７×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞８×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞９×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞１０×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞１１×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞１２×Ｓｓｃ２である。
Ｒｑ及びＲａ
ＲＭＳ（Ｒｑ）は、画像におけるＺ値（又はＲＭＳ粗さ）の標準偏差である。Ｒｑは、以下の式に従って計算される：
式中、Ｚａｖｇは画像内の平均Ｚ値であり；ＺｉはＺの現在の値であり；Ｎは画像内の点の数である。この値は、画像の平面の傾きに対して補正されていない；従って、データを平面フィッティング又は平坦化すると、この値が変化する。
ＲＭＳ（Ｒｑ）は、画像におけるＺ値（又はＲＭＳ粗さ）の標準偏差である。Ｒｑは、以下の式に従って計算される：
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面のＲｑ１は、未処理以外は同一の接触表面のＲｑ２よりも大きい。
平均粗さ（Ｒａ）は、中心平面を基準とする表面の平均値であり、以下の式を使用して計算される：
Ｒａ＝［１／（ＬｘＬｙ）］∫０Ｌｙ∫０Ｌｘ｛ｆ（ｘ，ｙ）｝ｄｘｄｙ
式中、ｆ（ｘ、ｙ）は中心平面を基準とする表面であり、Ｌｘ及びＬｙは表面の寸法である。
Ｒａ＝［１／（ＬｘＬｙ）］∫０Ｌｙ∫０Ｌｘ｛ｆ（ｘ，ｙ）｝ｄｘｄｙ
式中、ｆ（ｘ、ｙ）は中心平面を基準とする表面であり、Ｌｘ及びＬｙは表面の寸法である。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面のＲａ１は、未処理以外は同一の接触表面のＲａ２よりも大きい。
本発明の支持体は、処理後、より高い二乗平均平方根表面勾配（Ｓdq）、より高い頂点密度（Ｓｄｓ）、及び平均頂点曲率（Ｓｓｃ）をもたらす高密度の小さな粒子状構造を有する接触表面を有する。
酸素種
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、処理接触表面１０２よりも少ない酸素及び多い炭素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、処理接触表面１０２よりも少ない酸素及び多い炭素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理接触表面１０２のＸ線光電子分光ＸＰＳ原子組成は、次の通りである：
・１０％〜２５％酸素、０〜５％窒素、及び７０％〜９０％炭素；
・任意選択で、１５％〜２４％酸素、０．１％〜５％窒素、及び７０％〜８０％炭素；
・任意選択で、２０％〜２４％酸素、０．１％〜１％窒素、及び７０％〜７９％炭素。
・１０％〜２５％酸素、０〜５％窒素、及び７０％〜９０％炭素；
・任意選択で、１５％〜２４％酸素、０．１％〜５％窒素、及び７０％〜８０％炭素；
・任意選択で、２０％〜２４％酸素、０．１％〜１％窒素、及び７０％〜７９％炭素。
処理接触表面は、ＸＰＳ組成が深さの浅いゾーンを介して測定されるため、支持体内にわずかな深さを有するものとして扱われる。本目的のために、接触表面の適切なＸＰＳ分析は、５．８オングストローム又は約０．６ｎｍの深さでその組成を測定する。任意選択で、いずれかの実施形態では、内部部分及び接触表面は、本質的に同じポリマーからなり、接触表面のＸＰＳ原子組成は、内部部分のＸＰＳ原子組成よりも０．１〜３０原子％、任意選択で２〜３０原子％、任意選択で５〜２０原子％、任意選択で１０〜２０原子％、任意選択で１３〜１６原子％多い酸素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面の組成は、０〜２０ｎｍ、任意選択で０．１〜１０ｎｍ、任意選択で０．２〜１ｎｍ、任意選択で０．２〜０．７ｎｍ、任意選択で約０．６ｎｍの深さで測定され；任意選択で、接触表面は、親水性であり、未処理以外は同一の表面又は生物学的コーティングが施された表面よりも高い細胞接着性を有する。任意選択で、内部部分は、炭化水素からなる場合と同様に、炭素原子及び水素原子を本質的に含む。別の選択肢として、内部部分は、かなりの割合の炭素、水素、及び酸素、窒素、硫黄、又は塩素などのヘテロ原子を含み得る。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面は、０．６ｎｍ未満の厚さを有し、０．６ｎｍの深さでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、１％〜１０％の酸素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面は１．２ｎｍ未満の厚さを有し、深さ１．２ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．５％〜５％酸素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面は１．７ｎｍ未満の厚さを有し、深さ１．７ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．３％〜３％酸素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面は２．３ｎｍ未満の厚さを有し、深さ２．３ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．１％〜１％酸素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面は２．９ｎｍ未満の厚さを有し、深さ２．９ｎｍでの処理ポリマー支持体１０１の内部部分１０３のＸＰＳ原子組成は、０．１％〜１％酸素を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面のＸＰＳ原子組成は、酸素がグラフトされた炭素原子を０．１〜２０原子％、任意選択で５〜１５原子％、任意選択で９〜１２原子％含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面は、０．１〜２０原子％、任意選択で５〜１５原子％、任意選択で９〜１２原子％の水素結合受容体基を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、グラフトされた酸素は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって測定されるように、Ｃ−Ｏ、ＣＯ3、Ｃ＝Ｏ、又はＯ−Ｃ＝Ｏから選択され、任意選択でこれらの部分のうちの２つ以上から選択される部分の形態又はこれらの任意の組み合わせで存在する。
接触角
本発明に記載の処理は、接触表面の親水性を高める。同じことを別の言い方で表現すると、処理は、接触表面と水との接触角を下げる（特段の記載がない限り、本明細書で言及される接触角はすべて、脱イオン水を基準にしている）。親水性が高いほど、細胞接着及び細胞増殖に有益であると考えられている。
本発明に記載の処理は、接触表面の親水性を高める。同じことを別の言い方で表現すると、処理は、接触表面と水との接触角を下げる（特段の記載がない限り、本明細書で言及される接触角はすべて、脱イオン水を基準にしている）。親水性が高いほど、細胞接着及び細胞増殖に有益であると考えられている。
任意選択で、いずれかの実施形態では、接触表面の表面接触角は、３８°〜６２°、任意選択で５０°〜７０°、任意選択で５５°〜６５°、任意選択で６０°〜６４°、任意選択で３０°〜５０°、任意選択で３０°〜４０°、任意選択で３５°〜４５°、任意選択で３７°〜４１°である。
支持体
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１は、ルーメン１０８を囲む内側表面１０７、外側表面１０９、及び内側表面１０７と外側表面１０９との間に位置し、且つそれらから間隔が置かれた内部部分１０３を備える壁１０６を有する容器１０５を含む。本明細書に別に指示のない限り、内部部分１０３内の位置は、内側表面１０７からのそれらの距離によって決定される。内側表面１０７は、任意選択で、概して円筒形であり、任意選択で、処理接触表面１０２は、容器１０５の内側表面１０７の少なくとも一部を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１は、ルーメン１０８を囲む内側表面１０７、外側表面１０９、及び内側表面１０７と外側表面１０９との間に位置し、且つそれらから間隔が置かれた内部部分１０３を備える壁１０６を有する容器１０５を含む。本明細書に別に指示のない限り、内部部分１０３内の位置は、内側表面１０７からのそれらの距離によって決定される。内側表面１０７は、任意選択で、概して円筒形であり、任意選択で、処理接触表面１０２は、容器１０５の内側表面１０７の少なくとも一部を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、容器１０５は、図１及び２などに示すように、ローラボトルを含む。任意選択で、ローラボトルは、処理接触表面１０２を画定する内側表面１０７を含み、接触表面１０２は、多数のリブ１１０を備える。接触表面１０２の一部又は全部、例えば、ローラボトル又は他の容器１０５の細胞接触側面若しくは末端壁におけるリブ又は他の構造の複雑さは、接触表面１０２の表面積を増大する上で有用であることがわかっている。任意選択で、いずれかの実施形態では、容器１０５は、１ｍＬ〜１００Ｌ、任意選択で１００ｍＬ〜５Ｌ、任意選択で約１Ｌ、任意選択で約２Ｌの容積を有する。任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１は、図１及び３に示すようにプレート、皿、フラスコ、ボトル、図２に示すようにチューブ、又はいずれか他のタイプの実験器具若しくは生成装置を含み得る。
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１は、射出成型可能な熱可塑性又は熱硬化性材料、例えば、熱可塑性材料、例えば、熱可塑性樹脂、例えば、射出成型熱可塑性樹脂を含む。任意選択で、いずれかの実施形態では、熱可塑性材料は、炭化水素ポリマー、例えば、オレフィンポリマー、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、水素化ポリスチレン、ポリシクロヘキシルエチレン（ＰＣＨＥ）、又はこれらのうち２つ以上の組合せ、又はヘテロ原子置換炭化水素ポリマー、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶｄＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ポリ乳酸、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリウレタンポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、アイオノマー樹脂、又は任意の組合せ、複合材、ブレンド、又はこれら上記の材料のいずれか２種以上の積層体を含む。任意選択で、いずれかの実施形態では、熱可塑性樹脂は、ポリスチレンを含み、これは、一般に、ローラボトル、マイクロプレート、ペトリ皿など、多くの実験器具用途に使用されている。
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理ポリマー支持体１０１はポリスチレンを含む。
処理プロセス
任意選択で、接触表面はプロセスで処理され、このプロセスは、接触表面をプロセスガスと接触させ、高周波マイクロ波又は他の電力を、初期接触表面に隣接するプロセスガスに導入して初期接触表面に隣接するプラズマを発生させ、これにより処理接触表面を有する処理ポリマー支持体を形成することを含む。任意選択で、プロセスは、初期接触表面と比較して、処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善するのに有効な条件下で実施される。
任意選択で、接触表面はプロセスで処理され、このプロセスは、接触表面をプロセスガスと接触させ、高周波マイクロ波又は他の電力を、初期接触表面に隣接するプロセスガスに導入して初期接触表面に隣接するプラズマを発生させ、これにより処理接触表面を有する処理ポリマー支持体を形成することを含む。任意選択で、プロセスは、初期接触表面と比較して、処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善するのに有効な条件下で実施される。
いずれかの実施形態では、処理は、（ａ）接触表面を有する支持体、例えば、容器を用意するステップ；（ｂ）接触表面に隣接して真空引きするステップ；（ｃ）接触表面の近傍に、任意選択で窒素を含有する、Ｏ２を含むガスを供給するステップ；及び（ｄ）ガスからプラズマを発生させ、これにより処理接触表面を形成するステップを含む。形成された接触表面は、高度の細胞結合表面である。
任意選択で、ステップ（ｃ）において、支持体が、ローラボトル又は他の容器である場合、ガスは、任意選択で、容器に挿入されるガス注入口を通して容器内に導入される（図ＸＸに示すように。任意選択で、この実施形態では、ＲＦを用いて、プラズマを発生させる。
驚くことに、ＲＦ電力を、ガス混合物を容器内に導入するガス注入口の使用と組み合わせると、細胞増殖実験の結果を向上させる上で大きな利点が得られることが判明した。これらの結果は、コーティングされていない以外は同一の表面よりも優れており、また、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｂｉｎｄ（商標）処理表面よりも優れている。ガス混合物を送達するためのガス注入口を容器に挿入せずに、ＲＦ電力を用いて容器を処理すると、より少ない反応性官能基が表面上に生成されるため、所望の処理が得られない可能性がある。ガス混合物を送達するための、容器に挿入されるガス注入口の使用は、より多くの反応性官能基を表面に生成するのに役立ち、従って、表面活性化及び表面均一性を改善して、優れた細胞接着／細胞増殖結果を達成する。
マイクロ波源と比較してＲＦ電力源の使用にはいくつかの利点がある：ＲＦは、低電力で作動するため、支持体／容器の加熱が少ない。本発明の焦点は、プラスチック支持体のプラズマ表面処理であるため、支持体の融解／変形を防止するためにより低い処理温度が望ましい。高周波マイクロ波は、プラスチック支持体内に残留する水、オリゴマー、及び他の物質などの揮発性物質のガス放出も引き起こし得る。このガス放出は、処理を妨害し得る。
図１〜３を参照すると、本方法は、一般に、初期接触表面１０２を含むポリマー支持体１０１を提供し、初期接触表面１０２をプロセスガス１０４（図１にガス源として、また図１及び３には容器内のガスとして示す）と接触させ、高周波、マイクロ波、又は他のプラズマ発生電力をプロセスガス１０４中に導入し、未処理接触表面１０２と比較して、細胞回収が改善された処理接触表面１０２を形成することによって実施することができる。
任意選択で、いずれかの実施形態では、ポリマー支持体１０１は、初期接触表面１０２に加えて、初期接触表面１０２に隣接する内部部分１０３を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、プロセスガス１０４は、窒素ガス、酸素ガス、又は窒素原子、酸素原子、若しくは窒素及び酸素原子の組合せ、並びに他の種類の原子を含有する異種ガスであり得る。好適なプロセスガス１０４の非制限的例として、酸素ガス、窒素ガス、亜酸化窒素ガス、又はこれらのうちいずれか２種以上の組合せが挙げられる。任意選択で、プロセスガス１０４は、キャリアガス、例えば、希ガス、例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、若しくはキセノン又はこれらのうちいずれか２種以上の混合物を含み得る。
任意選択で、いずれかの実施形態では、高周波又はマイクロ波電力は、初期接触表面１０２に隣接するプロセスガス１０４に導入され、初期接触表面１０２に隣接するプラズマを発生させる。その結果、処理ポリマー支持体１０１は、処理接触表面１０２を有するように形成された。
任意選択で、いずれかの実施形態では、プロセスガス１０４は、酸素原子、窒素原子、又は酸素及び窒素原子の両方を含み、好ましくは、酸素、窒素、亜酸化窒素、又はこれらのうちいずれか２種以上の組合せを含む。任意選択で、いずれかの実施形態では、プロセスガス１０４は、ほぼ水を含まない。
任意選択で、いずれかの実施形態では、本方法は、接触表面１０２をプロセスガス１０４と接触させることによって実施される。これは、例えば、初期接触表面１０２と隣接する排出口１１２を有するガス注入導管１１１を通してプロセスガス１０４を運搬することによって行われ得る。
任意選択で、高周波エネルギが使用されるいずれかの実施形態では、プラズマを発生させるために使用されるＲＦ電力の周波数は、１〜５０ＭＨｚ、任意選択で１３．５６ＭＨｚであり得る。任意選択で、いずれかの実施形態では、プラズマを励起するために用いられる電力は、１〜１０００ワット、任意選択で１００〜９００ワット、任意選択で５０〜６００ワット、任意選択で２００〜７００ワット、任意選択で４００〜６００ワット、任意選択で１００〜５００ワット、任意選択で５００〜７００ワット、任意選択で１〜１００ワット、任意選択で１〜３０ワット、任意選択で１〜１０ワット、任意選択で１〜５ワットであり得る。
任意選択で、高周波電力が使用されるいずれかの実施形態では、高周波電力は、初期接触表面１０２をほぼ取り囲む外部アプリケータ１１３によって、少なくとも一部が導入され得る。任意選択で、いずれかの実施形態では、高周波電力は、ルーメン１０８内に少なくとも部分的に位置する内部アプリケータ１１４により、少なくとも一部が導入される。任意選択で、いずれかの実施形態では、ルーメン１０８内に少なくとも部分的に位置する内部アプリケータ１１４は、さらに、初期接触表面１０２をプロセスガス１０４と接触させるためのガス注入導管１１１を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態において、図１に示す装置を用いて、容器１０５の初期接触表面１０２を処理することができる。図１及び３は、ローラボトルとして作製された容器１０５の一例を示す。典型的な１リットル又は２リットル容積のローラボトルのよりわかりやすい図を図４〜６に示す。
ローラボトル又は他の容器の容積について本明細書に示す参照値は、それを完全に満たすのに必要な流体の量を必ずしも示すわけではない。こうした容器の指定容積は、一般に、容器がその容積まで充填されるときの頭隙を残す。ローラボトルの場合、例えば、ボトルは、細胞を容器内で増殖させているとき、横向きに置かれ、機械作用により回転させるため、接触表面１０２に接着した細胞は、頭隙及びボトルの液体内容物（増殖培地など）を交互に通過し、増殖を促進する。
ローラボトル又は他の容器１０５は、ルーメン１０８を囲む内側表面１０７と、外側表面１０９とを備える壁１０６を有する。容器壁１０６は、内側表面１０７と外側表面１０９との間に位置し、且つそれらから間隔が置かれる内部部分１０３を有す。内側表面１０７の少なくとも一部、任意選択で全部が、接触表面１０２を画定し、これは、本処理前の初期接触表面又は本処理後の処理接触表面と呼ばれる。接触表面１０２は、本開示に従って処理された内側表面１０７の任意の部分である。
図１、２、又は３に示す装置は、いずれの実施形態に従って容器１０５を処理するのにも適しているが、他の装置を使用することもできる。この装置は、図１及び２に示す円筒形セラミックチャンバー１１５を含むことができ、これは、アルミニウム底１１６及びアルミニウム蓋１１７（使用中は密閉されているが、ロード及びアンロードの際は開放され得るため、図ｘでは開放状態で示される）を備える。チャンバー１１５は、直径約１２インチ（３０ｃｍ）、深さ８インチ（２０ｃｍ）であってよいが、いずれか他の好適な寸法を使用することもできる。
任意選択で弁１２１により制御される真空ポンプ１２０に真空導管１１９を送るチャンバー１１５のポンピングポート１１８は、アルミニウム底１１６に位置してよく、直径約４インチ（１０ｃｍ）であってよく、ポンピングポート１１８を通って処理エリア１２２に同心円状に突出する直径１／２インチ（１２ｍｍ）のガス注入導管１１１を備える。ポンピングポート１１８上方にプラズマスクリーン（図示していない）を設置してもよく、これは、銅スクリーン及びスチールウールから作製することができる。プロセスガス１０４は、チャンバー１１５下方のガスシステム１２３を介してガス注入導管１１１に供給することができる。圧縮プロセスガス１０４の場合には、１２４などのマスフローコントローラを使用することができる。
セラミックチャンバー１１５は、チャンバー１１５の外側を同心円状に包むことができる銅製外部アプリケータ１１３を備えてもよく、これは、高さ約７インチ（１８ｃｍ）であってよい。外部アプリケータ１１３は、ＣＯＭＤＥＬ（登録商標）マッチングネットワーク１２５に接続してよく、これは、ＣＯＭＤＥＬ（登録商標）１０００ワットＲＦ（１３．５６ＭＨｚ）電源１２６の５０オーム出力を最適電力供給（低反射電力）に適合させることができる。ＣＯＭＤＥＬ（登録商標）装置は、Ｃｏｍｄｅｌ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡにより販売されている。電源１２６は、同軸ケーブル１２７を介してＣＯＭＤＥＬ（登録商標）マッチングネットワーク１２５に取り付けることができる。プロセス圧力を測定するために、２つのキャパシタンスマノメータ（０〜１Ｔｏｒｒ及び０〜１００Ｔｏｒｒ）（図示していない）を真空導管１１９（ポンプラインとも呼ばれる）に取り付けることができる。
容器１０５を処理するための図２に示す装置は、図１の装置と同じであってもよいが、図示するように、単一処理サイクル内に２つ以上の容器１０５を収容するために、２つ以上のガス注入導管１１１を有する。
図１又は２に示す装置は、任意選択で、図３に示す真空バイパスライン１２８を含む。
任意選択で、いずれかの実施形態では、フラスコ、ボトル、又はチューブとして作製された実験器具を、図１〜３に示すものと類似の装置で処理することができる。
任意選択で、いずれかの実施形態では、プレート、マイクロプレート、皿、又は処理しようとする比較的平坦な外側表面を有する他の物体として作製された実験器具を、図１〜３に示すものと類似するが、より平坦な製品を処理するように改変された装置で処理することができる。任意選択で、いずれかの実施形態では、本明細書に示すセラミックチャンバー１１５の内部を、本明細書に記載の処理中に、複数のマイクロプレート又は他の比較的平坦な物体を支持するために、国際公開第２０１６／１７６５６１号パンフレットの図６に示すように改変することができる。任意選択で、いずれかの実施形態では、マイクロプレート又は他の平坦な物体は、処理しようとする表面が、セラミックチャンバー１１５の中心に向くように配向して、処理のために供される表面に対し直接プラズマ励起ガスを適用するのを促進することができる。
いずれかの実施形態では、プラズマは直接プラズマである。仮説に制限されることなく、直接プラズマは、イオンと表面の直接相互作用により、遠隔プラズマよりも表面の粗面化に効率的である。
ＶＳ Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラー（米国特許第６，６１７，１５２号明細書に記載）は、本発明とは異なる接触表面を形成した。特に、本開発の接触表面は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラーの処理接触表面には存在しない高密度の小さな粒子状構造を有し得る。この差は、実施例５で説明されるように、以下の粗さパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化することができる。
Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラー（米国特許第６，６１７，１５２号明細書に記載）は、本発明とは異なる接触表面を形成した。特に、本開発の接触表面は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラーの処理接触表面には存在しない高密度の小さな粒子状構造を有し得る。この差は、実施例５で説明されるように、以下の粗さパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化することができる。
任意選択で、処理後、接触表面は、２ＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトラーの内側表面の表面積差Ａ２値と比較して、より高い表面積差Ａ１値を有する。任意選択で、Ａ１は０．０５５％を超える。任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞５×Ａ２、任意選択でＡ１＞１０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１５×Ａ２、任意選択でＡ１＞２０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２５×Ａ２、任意選択でＡ１＞３０×Ａ２。
任意選択で、本発明による処理後、接触表面は、０．０５５％を超える、任意選択で０．０６％〜２％、任意選択で０．１％〜１．５％、任意選択で０．５％〜１．２％、任意選択で０．９％〜１．１％の表面積差Ａを有し；Ａは、接触表面上の５μｍ×５μｍの画像化面積の測定によって決定される。
任意選択で、処理後、接触表面のＳｄｑ１は、同じサイズのＣｅｌｌｂｉｎｄローラボトルの接触表面のＳｄｑ２よりも大きく、任意選択でＳｄｑ１＞２×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞３×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞４×Ｓｄｑ２である。
任意選択で、処理後、接触表面のＳｄｓ１は、同じサイズのＣｅｌｌｂｉｎｄローラボトルの接触表面のＳｄｓ２よりも大きく、任意選択でＳｄｓ１＞２×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞３×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞４×Ｓｄｓ２である。
任意選択で、処理後、接触表面のＳｓｃ１は、同じサイズのＣｅｌｌｂｉｎｄローラボトルの接触表面のＳｓｃ２よりも大きく、任意選択でＳｓｃ１＞２×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞３×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞４×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞５×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞６×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞７×Ｓｓｃ２である。
細胞接着及び細胞増殖
任意選択で、本発明の支持体を細胞増殖に使用し、増殖プロセスが完了した後、細胞を収集する、又は回収する。
任意選択で、本発明の支持体を細胞増殖に使用し、増殖プロセスが完了した後、細胞を収集する、又は回収する。
任意選択で、支持体は、ＲＦプラズマを使用して一実施形態に従って処理される。処理中、プロセスガスは、支持体に挿入された、又は処理された表面に隣接した注入口を通して導入される。この処理により、高密度の小さな粒子状構造の特徴が形成され、これにより、高い二乗平均平方根表勾配（Ｓｄｑ）、頂点密度（Ｓｄｓ）、及び平均頂点曲率（Ｓｄｃ）のうちの少なくとも１つによって定量化される高い表面積及び高い粗さが増大する。細胞接着は、細胞と接触表面との間の相互作用によって起こり、高い接触表面積は細胞接着に有益である。
多くのポリマー表面、例えばポリスチレン表面は、細胞接着に不利な疎水性である。任意選択で、いずれかの実施形態に従った処理は、より多くの酸素原子を接触表面に組み込み、これにより表面の親水性が高まる。表面の親水性及び高い酸素含有量は、細胞接着を促進すると考えられる特性である。
それぞれ本明細書に記載のプラズマ処理によって任意選択で生成され得る接触表面の表面粗さ、より高い酸素原子組成、及び親水性が組み合わさって、細胞接着、細胞増殖、及び細胞回収を効果的に高めることができることは驚くべき発見である。表面粗さは、高密度の小さな粒子状構造によって特徴付けられ、表面積差（Ａ）、二乗平均平方根表面勾配（Ｓｄｑ）、頂点密度（Ｓｄｓ）、及び平均頂点曲率（Ｓｓｃ）のうちの少なくとも１つの粗さパラメータによって定量化される。
回収率は、任意選択で、生物学的コーティングで処理されている以外は同一の支持体での場合よりも高い。回収率は、任意選択で、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）支持体の場合よりも高い。
任意選択で、支持体が容器として具体化される場合、容器は、クロージャをさらに備える。クロージャは、あらゆる種類であり得る。例えば、クロージャは、あらゆるストッパー、キャップ、蓋、トップ、コルク、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、プラスチック又はエラストマーのストッパーをキャップに挿入してクロージャを形成することができる。
細胞増殖は無菌環境を必要とする。細胞培養／増殖容器のキャップの頻繁な開閉は、汚染源の１つである。任意選択で、細胞培養／増殖容器（例えば、ローラボトル）を無菌移送キャップで閉じて、培地の供給、接種、サンプルの追加／収集、移送などの際のキャップの開閉による汚染を防止することができる。任意選択で、クロージャは、任意選択で、高温、低温、オートクレービング、照射、又はその他の通常とは異なる条件での無菌プロセスに適している。例えば、クロージャは、細胞培養／増殖プロセス中にキャップを開く必要をなくすために、他の付属品を備えた無菌トランスファーキャップであり得る。任意選択で、クロージャは、ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）無菌トランスファーキャップであり得る。任意選択で、クロージャは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＭＹＣＡＰ（登録商標）クロージャであり得る。ＭＹＣＡＰ（登録商標）クロージャは、キャップにディスペンスされるシリコーンエラストマーを含む。キャップは、このキャップの事前に形成された孔にチューブ及びガス交換カートリッジを挿入することによって組み立てられる。
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理接触表面１０２と接触して増殖され、収集されるニワトリ胚細胞培養物の生存率は、初期接触表面１０２と比較して、少なくとも８８％、任意選択で８８％〜９９％、任意選択で８８％〜９７％、任意選択で９４％〜９６％である。細胞培養試験は、細胞培養、細胞収集、及び回収プロトコル、並びに実施例１に従って実施される。
任意選択で、いずれかの実施形態では、処理接触表面１０２と接触して増殖され、収集されるニワトリ胚細胞培養物の回収率は、初期接触表面１０２と比較して、少なくとも１３２％、任意選択で１３２％〜３００％、任意選択で１４０％〜２５０％、任意選択で１４０％〜２３０％であり得る。細胞培養試験は、細胞培養、細胞収集、及び回収プロトコル、並びに実施例１に従って実施される。
この方法は、任意選択で、初期接触表面１０２と比較して、処理接触表面１０２からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善し、細胞回収試験の開始時に、処理接触表面１０２に提供される細胞の少なくとも１４０％の処理接触表面１０２からの細胞回収を達成する。細胞培養試験は、細胞培養、細胞収集、及び回収プロトコル、並びに実施例１に従って実施される。
細胞はまた、接触表面積をやはり増大する別のタイプの支持体であるマイクロキャリア表面でも増殖することができる。マイクロキャリアは、粘着性細胞増殖を可能にする支持マトリクスである。マイクロキャリアは、通常、１２５〜２５０マイクロメートルの球体（ビーズ）であり、その密度のために、穏やかに攪拌しながら、培地中にそれらを懸濁状態で維持することが可能になる。マイクロキャリア又はビーズは、ＤＥＡＥ−デキストラン、ガラス、ポリスチレンプラスチック、アクリルアミド、コラーゲン、及びアルギン酸塩を含め、多種の材料から製造することができる。これらのマイクロキャリア又はビーズ材料は、様々な表面化学と共に、形態及び増殖をはじめとする細胞挙動に影響を与え得る。マイクロバリア（又はビーズ）技術の使用によって、例えば、必要な培地及び実験器具が少なくて済むなど、多くの利点がある。
細胞接着及び細胞増殖を増大することは重要であるが、一般に、増殖工程の完了後に細胞を採取し、細胞の質を保持することも重要である。任意選択で、マイクロキャリアを使用する場合、細胞の採取は、次の２つのステップを含むと考えることができる：第１に、細胞をマイクロキャリアから脱離させて、細胞−マイクロキャリア懸濁液を作製するステップ；及び第２に、細胞を、マイクロキャリアの存在しない懸濁液に残す、さらなる分離ステップ。
典型的に、第１のステップ、すなわち、マイクロキャリアからの細胞脱離は、酵素消化により達成される。マイクロキャリアの種類、細胞の種類などに基づいて、様々な酵素を使用することができる。酵素は、例えば、トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ又はトリプシン−アキュターゼ混合物であってよい。第２のステップ中に、フィルター又は遠心分離を使用して、細胞をマイクロキャリアから分離する。
本発明はまた、任意選択で、高親水性表面を提供することにより、細胞接着及び細胞増殖を増強することを目的とする、マイクロキャリア（例えば、ビーズ）表面のプラズマコーティング又は処理にも関する。コーティング又は処理は、細胞接着、細胞増殖及び細胞回収工程中、細胞の完全性にマイナスの影響をもたらさない。
細胞培養、細胞採取及び回収プロトコル
本開示での使用のために以下の材料、装置、及び方法が考慮される。材料：ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標）１，０００ｍＬローラボトル（Ｐｒｏｄｕｃｔ ２２９５８２）、ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標）Ｔ−１８２フラスコ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ２２９３５１）、培地ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯１９９５−０６５）、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ＠１６１７０−０７８）、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯１４１９０−１３６）、１×ＰＢＳで希釈した０．１８ｍＭ ＥＤＴＡを含む１×トリプシン（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯２５２００−０５６）、カウンティングスライド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｃａｔ＃１４５−００１１）、セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｍｏｄｅｌ ＴＣ１０）、トリパンブルー溶液０．４％（Ａｒｍｅｓｃｏ，Ｃｏｄｅ：Ｋ９４０−１００ＭＬ）、ペニシリン・ストレプトマイシンＳｏｌｎ、１００×（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｒｅｆ＃３０−００２ＣＩ）、競合物２，０００ｍＬローラボトル。
本開示での使用のために以下の材料、装置、及び方法が考慮される。材料：ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標）１，０００ｍＬローラボトル（Ｐｒｏｄｕｃｔ ２２９５８２）、ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標）Ｔ−１８２フラスコ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ２２９３５１）、培地ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯１９９５−０６５）、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ＠１６１７０−０７８）、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯１４１９０−１３６）、１×ＰＢＳで希釈した０．１８ｍＭ ＥＤＴＡを含む１×トリプシン（Ｇｉｂｃｏ；Ｒｅｆ♯２５２００−０５６）、カウンティングスライド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｃａｔ＃１４５−００１１）、セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｍｏｄｅｌ ＴＣ１０）、トリパンブルー溶液０．４％（Ａｒｍｅｓｃｏ，Ｃｏｄｅ：Ｋ９４０−１００ＭＬ）、ペニシリン・ストレプトマイシンＳｏｌｎ、１００×（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｒｅｆ＃３０−００２ＣＩ）、競合物２，０００ｍＬローラボトル。
金曜日に受け取った際、選択した細胞を計数し、Ｔ−１８２フラスコ（３／３３）×１５に分割した。月曜日に、１５×Ｔ−１８２フラスコの細胞をプールした。１０ｍＬの細胞を１Ｌのローラボトルに添加して、２０ｍＬの細胞を２Ｌのローラボトルに添加した。空気中５％ ＣＯ２を含む３９℃の加湿チャンバー内でローラボトルを０．２５ｒｐｍで回転させた。４８時間後、細胞を採取した。
１Ｌローラボトルの場合、細胞の採取は下記のように実施した。培地をデカントした。細胞を２５ｍＬの１×ＰＢＳですすいだ。次に、０．１８ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＬの１×トリプシンを添加し、１０分間インキュベートした。最後に、４０ｍＬの完全培地を添加した。１ｍＬのサンプルを収集し、細胞計数を実施した。
２Ｌローラボトルの場合、細胞の採取は下記のように実施した。培地をデカントした。細胞を５０ｍＬの１×ＰＢＳですすいだ。次に、０．１８ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＬの１×トリプシンを添加し、１０分間インキュベートした。８０ｍＬの完全培地を添加した。１ｍＬのサンプルを収集し、細胞計数を実施した。
各サンプルを１０×希釈して、細胞の分離を促した。細胞サンプルをもう一度１０×希釈したが、その際、０．４％トリパンブルーを１：１の比で添加した。１０μＬの細胞／トリパンブルーサンプルをカウンティングスライドに載せ、これをＢｉｏ−Ｒａｄセルカウンターにロードして、記録した。
実施した分析では、生存細胞回収率（Ｖｉａｂｌｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を比較したが、これは次のように算出される：
％生存細胞回収率＝採取した生存細胞総数／初期生存細胞総数。
％生存細胞回収率＝採取した生存細胞総数／初期生存細胞総数。
実施例１
この実験は、ポリスチレン製の１Ｌ ＣｅｌｌＴｒｅａｔローラボトルに適用される本発明の表面処理による細胞回収（すなわち、細胞増殖）改善及び接触角を調べるために実施した。また、この実験では、本発明の処理を、細胞増殖に関して、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（ＴＣＴ）ローラボトル及びＣｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトルなどの競合処理と比較した。試験対象の細胞株は、ニワトリ胚細胞であった。処理方法を本明細書に記載する。ローラボトル１〜４は、本発明に従って処理し、使用するパラメータを表１ａに示す。続いて、処理済のボトルに、表１ｂに示す通り、細胞をロードした。表２〜４に記載する結果から、ローラボトル２の処理（本明細書では、処理２と呼ぶこともある）が、一貫して最良の細胞増殖結果（細胞回収データに表示する）をもたらしたことが明らかである。以下の実施例に示す表面分析は、別に明示されない限り、処理２の方法で処理されたローラボトルに対して実施した。
この実験は、ポリスチレン製の１Ｌ ＣｅｌｌＴｒｅａｔローラボトルに適用される本発明の表面処理による細胞回収（すなわち、細胞増殖）改善及び接触角を調べるために実施した。また、この実験では、本発明の処理を、細胞増殖に関して、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（ＴＣＴ）ローラボトル及びＣｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトルなどの競合処理と比較した。試験対象の細胞株は、ニワトリ胚細胞であった。処理方法を本明細書に記載する。ローラボトル１〜４は、本発明に従って処理し、使用するパラメータを表１ａに示す。続いて、処理済のボトルに、表１ｂに示す通り、細胞をロードした。表２〜４に記載する結果から、ローラボトル２の処理（本明細書では、処理２と呼ぶこともある）が、一貫して最良の細胞増殖結果（細胞回収データに表示する）をもたらしたことが明らかである。以下の実施例に示す表面分析は、別に明示されない限り、処理２の方法で処理されたローラボトルに対して実施した。
表５に記載するように、水接触角も決定した。
実施例２．本発明の処理ローラボトル及び未処理ローラボトルのＸＰＳ表面分析
この実施例は、ポリスチレン製の未処理１Ｌ ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（商標）ローラボトルの接触表面、及び処理した以外は同一のローラボトルＢの接触表面の化学組成及び化学結合を決定するために実施した。図６のローラボトルの表面処理方法は、実施例１の処理２と同じである。ＸＰＳは、ボトルＡの接触表面の１つのエリア（中央エリア）と、ボトルＢの接触表面の４つのエリアについて実施した。４つのエリアを図６に示す。元素の濃度は、高解像度スペクトルから決定した。これらのＸＰＳ結果を表６にまとめる。
この実施例は、ポリスチレン製の未処理１Ｌ ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（商標）ローラボトルの接触表面、及び処理した以外は同一のローラボトルＢの接触表面の化学組成及び化学結合を決定するために実施した。図６のローラボトルの表面処理方法は、実施例１の処理２と同じである。ＸＰＳは、ボトルＡの接触表面の１つのエリア（中央エリア）と、ボトルＢの接触表面の４つのエリアについて実施した。４つのエリアを図６に示す。元素の濃度は、高解像度スペクトルから決定した。これらのＸＰＳ結果を表６にまとめる。
これらの結果から、本発明の処理が、同一の未処理表面よりも、処理表面上に３倍多い酸素をもたらすことがわかる。
化学結合の情報を表７に示す。
検出された元素の化学状態は、高解像度スペクトルから決定した。元素Ｃ及びＳｉについて、スペクトルの曲線当てはめを実施して、様々な酸化状態での各元素の相対量を推定した。曲線当てはめの結果は、個々のスペクトルについて示し、表７にまとめる。
実施例３．本発明の処理ローラボトル及び未処理ローラボトルのＸＰＳ詳細分析
この実施例は、本発明の処理ローラボトルＢの接触表面の詳細な化学組成を決定するために使用した。
この実施例は、本発明の処理ローラボトルＢの接触表面の詳細な化学組成を決定するために使用した。
処理ローラボトルＢの接触表面について、サーベイスペクトルを取得した。深さ方向プロファイルは、１ｋＶ Ａｒ＋を用いて取得した。結果を表８に示す。このビーム電圧は、酸素原子の優先スパッタリングを最小にするために選択した。これは、優先スパッタリングを最小にするが、この影響を完全に除去するわけではない。その結果、深さ方向プロファイル中の酸素濃度は、測定値より高いことが予想される。この試験での深さ尺度は、サンプルが、ポリスチレンの８２５Åスピンキャスト薄膜と同じ速度で原子を放出させると想定したことに留意されたい。
実施例４．本発明の処理されたローラボトル及び未処理ローラボトルの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）分析
この実施例は、本発明の処理されたローラボトルの内側表面の粗さを、未処理以外は同一のローラボトルの内側表面の粗さと比較することであった。
この実施例は、本発明の処理されたローラボトルの内側表面の粗さを、未処理以外は同一のローラボトルの内側表面の粗さと比較することであった。
粗さを、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて評価した。ＡＦＭ画像を、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ ＡＦＭ装置（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて収集した。この装置は、ＮＩＳＴトレーサブル標準に対して校正されている。
サンプルを、処理されたローラボトルはＡとして、未処理のローラボトルはＢとして区別した。サンプルを、かみそりで切断することによって各ボトルの側面の約半分の位置に準備した。１つの２０μｍ×２０μｍのエリアを内側表面に画像化した。これらのエリアの上面図を、粗さ測定値と共に図８及び９に示す。これらの画像のトポグラフィーの違いをグレースケール画像で示し、低い特徴は暗い色合いで示し、高い特徴は明るい色合い又は白で示す。ｚ範囲は、画像の右側にある垂直スケールバーに示す。これらの表面の斜視（３−Ｄ）図も含まれ、垂直方向が誇張されていることがキャプションに示されている（図１０及び１１）。各サンプルの１つの２μｍ×０．５μｍのエリアもまた、より高い横方向の解像度で画像化した（図１２−１５）。装置の状態を表９に示す。
粗さ分析を実施し、高さ、空間、及びハイブリッドパラメータとして表した。結果を表１０及び１１にまとめている。
表１０〜１１の結果及び図８〜９の画像は、２つの表面間のテクスチャーの違いを明確に示す。本発明の処理されたボトルの内側表面は、未処理のボトル表面には存在しなかった高密度の小さな粒子状構造を示す。これもまた、粗さパラメータによって定量化することができ、本発明の処理されたローラボトルは、高密度の小さな粒子状構造と一致するより狭い間隔のテクスチャー成分を示すより高いＳｄｑ値を有する。小さな粒子状構造は、より少数のより大きく、より広い間隔のバンプ構造よりも効率的に接触表面積を増加させると考えられている。特に、処理表面の表面積差Ａ１は、未処理表面の表面積差Ａ２よりもかなり大きい。Ｒｑ、Ｒａ、Ｒｍａｘ、Ｓｄｑ、及びＳｓｃなどの他の粗さパラメータも処理後に増加する。
この傾向は、より小さな規模（即ち、２μｍ×０．５μｍ）でより顕著であった。２つの表面間のテクスチャーの違いも、より小さなサイズの画像でより顕著であり；高密度の小さな粒子状構造が、処理されたボトルで観察され、未処理のボトルには存在しなかった（図１２〜１５）。
理論によって制限されるものではないが、上記のこの実施例で説明した処理後のより大きな表面積差値及び他のより高い粗さパラメータによって定量化される、接触表面積の増加は、細胞接着の促進の理由の少なくとも１つであると考えられ；より高い細胞接着は、表面でのより高い細胞増殖を促進すると考えられる。
提供される粗さ値の推定される不確かさは、（ｋ＝２の包含係数を用いて、約９５％の信頼水準で）±５〜１０％以内である。２ｎｍ未満の粗さデータは、この範囲で個別のｚ高さ校正が実施されない限り、「半定量的」と見なす必要がある。「半定量的」データでは、測定の精度が約±１０％であるため、依然としてサンプル間の比較が可能である（しかしながら、絶対粗さ値の不確かさは決定されない）。提供される不確かさの推定値は、サンプリングされた異なる位置間に粗さの変動がないことを前提としていることに留意されたい。
粗さに関連するパラメータの以下の説明は、本開示全体に適用される。
Ｂｒｕｋｅｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ ＡＦＭ／ＳＰＭは、表面の３次元表現をデジタル形式で取得して格納する。これらの表面は、さまざまな方法で分析することができる。
Ｎａｎｏｓｃｏｐｅソフトウェアは、あらゆるＡＦＭ又はＳＰＭ画像の粗さ分析を実施することができる。この分析の結果は、選択した画像を上面図で再現する単色のページである。画像の右上には「画像統計（Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）」ボックスがあり、画像全体の計算された特性から停止域によって除外されたエリアを差し引いたものが一覧表示される（Ｘが入ったボックス）。同様の追加の統計を、画像の選択した部分について計算することができ、これらは、ページの右下部分にある「ボックス統計（Ｂｏｘ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）」に一覧表示される。以下は、これらの統計の記述及び説明である。
一般的な高さパラメータ
ｚ範囲（ＲP）：画像の最高点と最低点との間の差。この値は、画像の平面の傾きに対して補正されていないため；この値は、データを平面フィッティング又は平坦化すると変化する。
ｚ範囲（ＲP）：画像の最高点と最低点との間の差。この値は、画像の平面の傾きに対して補正されていないため；この値は、データを平面フィッティング又は平坦化すると変化する。
平均：画像化面積内のすべてのＺ値の平均。この値は、画像の平面の傾きに対して補正されていないため；この値は、データを平面フィッティング又は平坦化すると変化する。
ＲＭＳ（Ｒｑ）：これは、画像内のＺ値（又はＲＭＳ粗さ）の標準偏差である。Ｒｑは、以下の式に従って計算される：
式中、Ｚａｖｇは、画像内の平均Ｚ値であり；Ｚｉは、Ｚの現在の値であり；Ｎは、画像内の点の数である。この値は、画像の平面の傾きに対して補正されていないため；この値は、データを平面フィッティング又は平坦化すると変化する。
平均粗さ（Ｒａ）：これは、中心平面を基準とする表面の平均値であり、以下の式を使用して計算される：
Ｒａ＝［１／（ＬｘＬｙ）］∫０Ｌｙ∫０Ｌｘ｛ｆ（ｘ，ｙ）｝ｄｘｄｙ
式中、ｆ（ｘ、ｙ）は中心平面を基準とする表面であり、Ｌｘ及びＬｙは表面の寸法である。
Ｒａ＝［１／（ＬｘＬｙ）］∫０Ｌｙ∫０Ｌｘ｛ｆ（ｘ，ｙ）｝ｄｘｄｙ
式中、ｆ（ｘ、ｙ）は中心平面を基準とする表面であり、Ｌｘ及びＬｙは表面の寸法である。
最大高さ（Ｒｍａｘ）：これは、平均平面を基準とする表面の最高点と最低点との間の高さの差である。
表面積：これは、画像化面積の３次元表面の面積である。表面積は、画像全体で３つの隣接するデータ点によって形成される三角形の面積の合計をとることによって計算される。
表面積差：これは、表面積が画像化面積を超えている量である。表面積差は、パーセンテージで表され、以下の式に従って計算される：
表面積差＝１００［（表面積／Ｓ１２）−１］
式中で、Ｓ１は、スキャンされたエリアの長さ（及び幅）から停止域によって除外された面積を減じた値である。
表面積差＝１００［（表面積／Ｓ１２）−１］
式中で、Ｓ１は、スキャンされたエリアの長さ（及び幅）から停止域によって除外された面積を減じた値である。
中心平面：平均平面に平行な平面。中心面の上下の画像表面で囲まれた体積は等しい。
平均平面：画像データが、この平面に関して最小分散を有する。平均平面は、Ｚデータにフィッティングされた一次最小二乗から得られる。
空間パラメータ
最速減衰自己相関関数（Ｓａｌ）：この任意選択の空間パラメータは、任意の方向における、自己相関関数の２０％の最速減衰の長さとして定義される。Ｓａｌの高い値は、表面が低周波成分によって支配されていることを示す。
最速減衰自己相関関数（Ｓａｌ）：この任意選択の空間パラメータは、任意の方向における、自己相関関数の２０％の最速減衰の長さとして定義される。Ｓａｌの高い値は、表面が低周波成分によって支配されていることを示す。
表面のテクスチャー方向（Ｓｔｄ）：この任意選択の空間パラメータは、Ｙ軸を基準とする表面の主なレイ（ｌａｙ）の角度である。このパラメータは、角度パワースペクトル密度関数から決定される。
テクスチャーアスペクト比（Ｓｔｒ）：この任意選択の空間パラメータは、自己相関関数の２０％の相関に対する最速減衰と最遅減衰との比として定義される。レイが強い表面では、Ｓｔｒは０に近くなり；均一なテクスチャーを有する表面では、Ｓｔｒは１に近くなる。
ハイブリッドパラメータ
二乗平均平方根表面勾配（Ｓｄｑ）：すべての方向で評価された、表面テクスチャーを構成する勾配の尺度である。Ｓｄｑには、振幅成分及び間隔成分が含まれる。より低いＳｄｑ値は、間隔の広いテクスチャー成分を示し得る：
二乗平均平方根表面勾配（Ｓｄｑ）：すべての方向で評価された、表面テクスチャーを構成する勾配の尺度である。Ｓｄｑには、振幅成分及び間隔成分が含まれる。より低いＳｄｑ値は、間隔の広いテクスチャー成分を示し得る：
頂点密度、（Ｓｄｓ）：単位面積あたりの頂点の数。頂点はピークから得られる。ピークは、８つの最近傍すべての上の任意の点として定義される。頂点は、３Ｄ測定エリアを含む「Ｘ」又は「Ｙ」の最小寸法の少なくとも１％分離されるように制約されている。加えて、頂点は、平均平面よりもＳｚの５％高い閾値よりも上でしか検出されない。
平均頂点曲率、（Ｓｓｃ）：様々なピーク構造の平均頂点曲率。Ｓｓｃは頂点ごとに評価され、エリア全体で平均化される：
Ｓｓｃ＝１／Ｎ∫∫［｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｘ２｝＋｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｙ２｝ｄｘｄｙ］
Ｓｓｃ＝１／Ｎ∫∫［｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｘ２｝＋｛（∂２ｚ（ｘ，ｙ））／∂ｙ２｝ｄｘｄｙ］
実施例５．本発明の処理されたローラボトル及び未処理ローラボトルの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）分析
この実施例は、本発明の処理されたローラボトルの内側表面（即ち、接触表面）の粗さを、同じサイズのＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトルの内側表面（即ち、接触表面）の粗さと比較することであった。
この実施例は、本発明の処理されたローラボトルの内側表面（即ち、接触表面）の粗さを、同じサイズのＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトルの内側表面（即ち、接触表面）の粗さと比較することであった。
粗さを、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて評価した。ＡＦＭ画像を、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｃｏｎ ＡＦＭ装置（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて収集した。この装置は、ＮＩＳＴトレーサブル標準に対して校正されている。
サンプルを、本発明の処理されたローラボトルはＡとして、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）のローラボトルはＢとして区別した。サンプルを、かみそりで切断することによって各ボトルの側面の約半分の位置に準備した。１つの５μｍ×５μｍのエリアを内側表面に画像化した。これらのエリアの上面図を、粗さ測定値と共に図１６及び１７に示す。ｚ範囲は、画像の右側にある垂直スケールバーに示す。これらの表面の斜視（３−Ｄ）図も含まれ、垂直方向が誇張されていることがキャプションに示されている（図１８及び１９）。装置の状態を表９に示す。
粗さ分析を実施し、高さ、空間、及びハイブリッドパラメータとして表した。結果を表１２及び１３にまとめている。
結果及び画像は、２つの表面間のテクスチャーの違いを明確に示す。本発明の処理されたローラボトルの内側表面は、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）の表面にはほとんど存在しなかった高密度の小さな粒子状構造を示す（図１６及び１７）。これもまた、粗さパラメータによっても定量化することができる。特に、本発明の処理表面の表面積差Ａ１は、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）の表面積差Ａ２よりも大幅に大きい。Ｓｄｑ、Ｓｄｓ、及びＳｓｃなどの他の粗さパラメータも処理後に増加する。理論によって制限されるものではないが、より大きな表面積差値によって定量化された接触表面積の増加は、細胞接着が改善される理由の少なくとも１つであり、より高い細胞接着は、表面でのより高い細胞増殖と正の相関があると考えられる。本発明の処理接触表面が、実施例１に記載されたＣｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）ローラボトルよりも高い細胞回収をもたらすという実験的観察と一致している。
提供される粗さ値の推定される不確かさは、（ｋ＝２の包含係数を用いて、約９５％の信頼水準で）±５〜１０％以内である。２ｎｍ未満の粗さデータは、この範囲で個別のｚ高さ校正が実施されない限り、「半定量的」と見なす必要がある。「半定量的」データでは、測定の精度が約±１０％であるため、サンプル間の比較が可能である（しかしながら、絶対粗さ値の不確かさは決定されない）。提供される不確かさの推定値は、サンプリングされた異なる位置間に粗さの変動がないことを前提としていることに留意されたい。
本技術を詳細に、その具体的な例及び実施形態を参照にしながら説明してきたが、当業者には、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正の実施が可能であることは明らかであろう。追加的開示を特許請求の範囲に提供するが、これらは、本発明の記載の一部であると考慮され、各請求項は、任意選択の実施形態を明らかにする。
Claims (46)
- 本質的に接触表面及び内部部分からなるポリマー支持体であって、前記接触表面が以下：
・０．０５５％を超える、任意選択で０．０６％〜２％、任意選択で０．１％〜１．５％、任意選択で０．５％〜１．２％、任意選択で０．９％〜１．１％の表面積差Ａ；
・１．９°を超える、任意選択で２°〜２０°、任意選択で４°〜１５°、任意選択で６°〜１２°、任意選択で７°〜１０°、任意選択で７°〜９°の二乗平均平方根表面勾配、Ｓｄｑ；
・４４．４／μｍ2を超える、任意選択で４５／μｍ2〜２００／μｍ2、任意選択で５０／μｍ2〜１８０／μｍ2、任意選択で６０／μｍ2〜１７０／μｍ2、任意選択で７０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で８０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で９０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１００／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１１０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１２０／μｍ2〜１５０／μｍ2の頂点密度、Ｓｄｓ；又は
・３．６２／μｍを超える、任意選択で４／μｍ〜５０／μｍ、任意選択で６／μｍ〜４５／μｍ、任意選択で８／μｍ〜４０／μｍ、任意選択で１０／μｍ〜３５／μｍ、任意選択で１２／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１４／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１６／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１８／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で２０ｘ／μｍ〜２５／μｍの平均頂点曲率、Ｓｓｃの４つのパラメータのうちの少なくとも１つによって定量化される粗さを有し；
前記パラメータＡ、Ｓｄｑ、Ｓｄｓ、及びＳｓｃが、前記接触表面の５ ｍ×５ ｍの画像化面積の測定によって決定される、ポリマー支持体。 - Ａ１が、０．０５５％を超える、任意選択で０．０６％〜２％、任意選択で０．１％〜１．５％、任意選択で０．５％〜１．２％、任意選択で０．９％〜１．１％である、請求項１に記載のポリマー支持体。
- Ｓｄｑが、１．９°を超え２０°まで、任意選択で２°〜２０°、任意選択で４°〜１５°、任意選択で６°〜１２°、任意選択で７°〜１０°、任意選択で７°〜９°である、請求項１又は２に記載のポリマー支持体。
- Ｓｄｓが、４４．４／μｍ2を超える、任意選択で４５／μｍ2〜２００／μｍ2、任意選択で５０／μｍ2〜１８０／μｍ2、任意選択で６０／μｍ2〜１７０／μｍ2、任意選択で７０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で８０／μｍ2〜１６０／μｍ2、任意選択で９０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１００／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１１０／μｍ2〜１５０／μｍ2、任意選択で１２０／μｍ2〜１５０／μｍ2である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマー支持体。
- Ｓｓｃが、３．６２／μｍを超える、任意選択で４／μｍ〜５０／μｍ、任意選択で６／μｍ〜４５／μｍ、任意選択で８／μｍ〜４０／μｍ、任意選択で１０／μｍ〜３５／μｍ、任意選択で１２／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１４／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１６／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で１８／μｍ〜３０／μｍ、任意選択で２０ｘ／μｍ〜２５／μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリマー支持体。
酸素種 - 処理ポリマー支持体の内部部分のＸＰＳ原子組成が、前記接触表面のＸＰＳ原子組成よりも少ない割合の酸素及び多い割合の炭素を含み、前記接触表面の前記ＸＰＳ原子組成が、５．８オングストロームの深さで決定される、請求項１に記載の支持体。
- 前記内部部分及び前記接触表面が、同じポリマーから本質的になり、前記接触表面の前記ＸＰＳ原子組成が、前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成よりも０．１〜３０原子％、任意選択で２〜３０原子％、任意選択で５〜２０原子％、任意選択で１０〜２０原子％、任意選択で１３〜１６原子％多い酸素を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面の前記ＸＰＳ原子組成が、酸素がグラフトされた炭素原子を０．１〜２０原子％、任意選択で５〜１５原子％、任意選択で９〜１２原子％含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面が、０．１〜２０原子％、任意選択で５〜１５原子％、任意選択で９〜１２原子％の水素結合受容体基を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記グラフトされた酸素が、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって測定されるように、Ｃ−Ｏ、ＣＯ3、Ｃ＝Ｏ、又はＯ−Ｃ＝Ｏから選択される、又は任意選択でこれらの２つ以上の任意の組み合わせから選択される部分の形態で存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の支持体。
深さによる原子パーセンテージ - 前記接触表面が、０〜２０ｎｍ、任意選択で０．１〜１０ｎｍ、任意選択で０．２〜１ｎｍ、任意選択で０．２〜０．７ｎｍ、任意選択で約０．６ｎｍの厚さを有し；前記接触表面が、親水性であり、且つ未処理以外は同一の表面又は生物学的コーティングが施された表面よりも高い細胞接着性を有し；前記内部部分が、本質的に炭素原子及び水素原子から構成されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面が０．６ｎｍ未満の厚さを有し、且つ０．６ｎｍの深さでの前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が１％〜１０％の酸素を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面が１．２ｎｍ未満の厚さを有し、且つ深さ１．２ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が０．５％〜５％の酸素を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面が１．７ｎｍ未満の厚さを有し、且つ深さ１．７ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が０．３％〜３％の酸素を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面が２．３ｎｍ未満の厚さを有し、且つ深さ２．３ｎｍでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が０．１％〜１％の酸素を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の支持体。
- ２．９ｎｍの深さでの前記処理ポリマー支持体の前記内部部分の前記ＸＰＳ原子組成が０．１％〜１％の酸素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の支持体。
接触角 - 前記接触表面の表面接触角が、３８°〜６２°、任意選択で５０°〜７０°、任意選択で５５°〜６５°、任意選択で６０°〜６４°、任意選択で３０°〜５０°、任意選択で３０〜４０°、任意選択で３５°〜４５°、任意選択で３７°〜４１°である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の支持体。
支持体 - 前記処理ポリマー支持体が、ルーメンを囲む内側表面、外側表面、及び少なくとも前記内側表面と前記外側表面との間に位置し、且つそれらから間隔が置かれた内部部分を備える壁を有する容器を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記容器が、クロージャ、任意選択で、ストッパー、キャップ、蓋、トップ、コルク、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１８に記載の支持体。
- 前記クロージャが、プラスチック又はエラストマーのストッパーをキャップに挿入することによって形成される、請求項１９に記載の支持体。
- 前記内側表面が概ね円筒形である、請求項１８に記載の支持体。
- 処理接触表面が、前記容器の前記内側表面の少なくとも一部を含む、請求項１８に記載の支持体。
- 前記容器がローラボトルを含む、請求項１８に記載の支持体。
- 前記ローラボトルが、処理接触表面を規定する内側表面を備え、前記内側表面が複数のリブを有する、請求項２３に記載の支持体。
- 前記容器が、１ｍＬ〜１００Ｌ、任意選択で１００ｍＬ〜５Ｌ、任意選択で１Ｌ、任意選択で２Ｌの容積を有する、請求項１８に記載の支持体。
- 前記処理ポリマー支持体が、プレート、皿、フラスコ、ボトル、又はチューブを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記処理ポリマー支持体が、熱可塑性材料、例えば、熱可塑性樹脂、例えば、射出成型熱可塑性樹脂を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記熱可塑性材料が、炭化水素ポリマー、例えば、オレフィンポリマー、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、水素化ポリスチレン、ポリシクロヘキシルエチレン（ＰＣＨＥ）、又はこれらのうち２つ以上の組合せ、又はヘテロ原子置換炭化水素ポリマー、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶｄＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ポリ乳酸、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリウレタンポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、アイオノマー樹脂、又は任意の組合せ、複合材、ブレンド、又はこれら上記の材料のいずれか２種以上の積層体を含む、請求項２７に記載の支持体。
- 前記熱可塑性樹脂が、ポリスチレンを含む、請求項２７に記載の支持体。
処理プロセス
ＳｉＯ２処理対未処理 - 前記接触表面がプロセスで処理され、前記プロセスが、前記接触表面をプロセスガスと接触させること；及び、初期接触表面と比較して、前記処理接触表面からのニワトリ胚細胞培養物の細胞回収を改善するのに効果的な条件下で、前記初期接触表面に隣接する前記プロセスガスに高周波電力を導入して、前記初期接触表面に隣接するプラズマを発生させ、これにより処理接触表面を有する処理ポリマー支持体を形成することを含み；
細胞培養物をウシ胎仔血清を含む培地ＤＭＥＭと接触させ、１０ｍＬの前記細胞培養物及び培養培地を１Ｌのローラボトルに入れるか、又は２０ｍＬの前記細胞培養物及び培養培地を２Ｌのローラボトルに入れ、空気中５％ ＣＯ２を含む３９℃の加湿チャンバー内で、前記ボトルを０．２５ｒｐｍで４８時間回転させ、０．１８ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリプシンを用いて細胞を収集し、サンプルを０．４％トリパンブルーと混合して、それをＢｉｏＲａｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒにロードして記録することにより回収率を決定することによってニワトリ胚細胞培養物の細胞回収率を決定する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の支持体。前記プラズマが直接プラズマである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の支持体。 - 前記プラズマがＲＦによって発生させられる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記プロセスガスが、酸素原子、窒素原子、又は酸素及び窒素原子の両方を含み、好ましくは、酸素、窒素、亜酸化窒素、又はこれらのうちいずれか２種以上の組合せを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記プロセスガスが、ほぼ水を含まない、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記初期接触表面と隣接する排出口を備えるガス注入導管を通してプロセスガスを運搬することにより、前記接触表面を前記プロセスガスと接触させる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＳｄｑ１が、未処理以外は同一の接触表面のＳｄｑ２よりも大きく、任意選択でＳｄｑ１＞２×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞３×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞４×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞５×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞６×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞７×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞８×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞９×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞１０×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞１１×Ｓｄｑ２である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＳｄｓ１が、未処理以外は同一の接触表面のＳｄｓ２よりも大きく、任意選択でＳｄｓ１＞２×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞３×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞４×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞５×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞６×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞７×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞８×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞９×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞１０×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞１１×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞１２×Ｓｄｓ２である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＳｓｃ１が、未処理以外は同一の接触表面のＳｓｃ２よりも大きく、任意選択でＳｓｃ１＞２×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞３×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞４×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞５×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞６×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞７×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞８×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞９×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞１０×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞１１×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞１２×Ｓｓｃ２である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＲｑ１が、未処理以外は同一の接触表面のＲｑ２よりも大きい、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＲａ１が、未処理以外は同一の接触表面のＲａ２よりも大きい、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面の表面積差Ａ１が、未処理以外は同一の接触表面の表面積差Ａ２よりも大きく、任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞５×Ａ２、任意選択でＡ１＞１０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１５×Ａ２、任意選択でＡ１＞２０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２５×Ａ２、任意選択でＡ１＞３０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞３５Ａ２、任意選択でＡ１＞４０×Ａ２、任意選択でＡ１＞５０×Ａ２、任意選択でＡ１＞６０×Ａ２、任意選択でＡ１＞７０×Ａ２、任意選択でＡ１＞８０×Ａ２、任意選択でＡ１＞９０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１００×Ａ２、任意選択でＡ１＞１１０×Ａ２である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の支持体。
ＳｉＯ２処理対Ｃｅｌｌｂｉｎｄ - 前記接触表面の表面積差Ａ１が、同じサイズのＣｅｌｌｂｉｎｄローラボトルの接触表面の表面積差Ａ２よりも大きく、任意選択でＡ１＞２×Ａ２、任意選択でＡ１＞５×Ａ２、任意選択でＡ１＞１０×Ａ２、任意選択でＡ１＞１５×Ａ２、任意選択でＡ１＞２０×Ａ２、任意選択でＡ１＞２５×Ａ２、任意選択でＡ１＞３０×Ａ２である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＳｄｑ１が、同じサイズのＣｅｌｌｂｉｎｄローラボトルの接触表面のＳｄｑ２よりも大きく、任意選択でＳｄｑ１＞２×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞３×Ｓｄｑ２、任意選択でＳｄｑ１＞４×Ｓｄｑ２である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＳｄｓ１が、同じサイズのＣｅｌｌｂｉｎｄローラボトルの接触表面のＳｄｓ２よりも大きく、任意選択でＳｄｓ１＞２×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞３×Ｓｄｓ２、任意選択でＳｄｓ１＞４×Ｓｄｓ２である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記接触表面のＳｓｃ１が、同じサイズのＣｅｌｌｂｉｎｄローラボトルの接触表面のＳｓｃ２よりも大きく、任意選択でＳｓｃ１＞２×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞３×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞４×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞５×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞６×Ｓｓｃ２、任意選択でＳｓｃ１＞７×Ｓｓｃ２である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の支持体。
細胞回収率 - 前記処理接触表面と接触して増殖され、収集されるニワトリ胚細胞培養物の生存率が、前記初期接触表面と比較して、少なくとも８８％、任意選択で８８％〜９９％、任意選択で８８％〜９７％、任意選択で９４％〜９６％であり；
細胞培養物をウシ胎仔血清を含む培地ＤＭＥＭと接触させ、１０ｍＬの前記細胞培養物及び培養培地を１Ｌのローラボトルに入れるか、又は２０ｍＬの前記細胞培養物及び培養培地を２Ｌのローラボトルに入れ、空気中５％ ＣＯ２を含む３９℃の加湿チャンバー内で、前記ボトルを０．２５ｒｐｍで４８時間回転させ、０．１８ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリプシンを用いて細胞を収集し、サンプルを０．４％トリパンブルーと混合して、それをＢｉｏＲａｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒにロードして記録することにより回収率を決定することによってニワトリ胚細胞培養物の細胞回収率を決定する、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の支持体。 - 前記処理接触表面と接触して増殖され、収集されるニワトリ胚細胞培養物の回収率が、前記初期接触表面と比較して、少なくとも１３２％、任意選択で１３２％〜３００％、任意選択で１４０％〜２５０％、任意選択で１４０％〜２３０％である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の支持体。
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