JPS61501607A

JPS61501607A - Ｔ−細胞レセプタ−−抗原特異的ポリペプチド及びポリヌクレオチド

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Publication number: JPS61501607A
Application number: JP60501144A
Authority: JP
Inventors: エムデイビス，マーク; ヘドリツク，ステイーブン　エム
Original assignee: ザ　ボ−ド　オブ　トラステイ−ズ　オブ　ザ　リ−ランド　スタンフオ−ド　ジユニア　ユニバ−シテイ−
Priority date: 1984-03-01
Filing date: 1985-02-28
Publication date: 1986-08-07
Anticipated expiration: 2013-08-06
Also published as: JP2783404B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｔ−細胞レセプターー抗原特異的ポリペプチド及び関連ポリヌクレオチド衾」Ｌ旦」Ｌ員主皿ｑ分亘造血系は非常に複雑であり、このことは宿主の維持及び生存において血液細胞が演する中枢的役割の観点から驚くべきことではない。非常に重要な１つの観点は、宿主が種々の病原体に対して自らを保護する態様である。２群の細胞すなわちＢ−細胞及びＴ−細胞が、宿主の保護において顕著な役割を演する。

Ｂ−細胞がいかにして非常に多様な免疫グロブリンを生産することができるかというミステリーは実質的な程度に説明されている。Ｂ−細胞が成熟するに従って、ジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）ＤＮＡが組み替え（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎ　ｔ）　られて種々のエクソンが連結され、これによって可変領域が形成され、そしてこの領域が異る不変領域に連結されることが今や知られている。ＤＮＡが組み替えられそしてこれに続いて転写物がスプライスされて特異的な免疫グロブリンをコードするメツセンジャーＲＮＡを生成する機構は、分子生物学の発達によってもたらされる手段の可能性を示す刺激的な冒険であった。

宿主の免疫系にとって重要な他の群はＴ−細胞である。この細胞は、類似する範囲の抗原特異性を有するが免疫グロブリンを分泌しない点においてＢ−細胞と異る。特に、Ｂ−細胞の増殖を刺激することに関与するヘルパーニー細胞は、自己 −主要組織適合性決定基をも同時に認識しなければならないと言う追加の要求を伴って、Ｂ−細胞の特異性に類似する特異性を有する。

Ｔ−細胞の特異性は、広範囲の状況において適用を見ることができる。外来性レセプター（受容体）部位を導入することによってヘルパーニー細胞を改変することができれば、外来性抗原に対する宿主の応答を変化せしめることができるであろう。さらに、多くの状況において、細胞がヘルパーニー細胞であるか他のタイプの細胞であるかを決定することに興味あることである。さらに、宿主におけるモノクローン性を決定する機会を有することは、Ｔ−細胞白血病の診断に有用である。さらに、Ｔ−細胞抗原特異的レセプターの部分をコードするＤＮＡ配列を有することは、レセプターとして機能することができる新規な蛋白質を生産するために天然Ｔ−細胞配列と外来性配列との組合せを含む造成を可能にするであろう。さらに、合成ペプチドを使用することにより、又は発現ベクターにおいて蛋白質を生産することによって、蛋白質の特異的部分に対する抗血清又はモノクローナル抗体を生成せしめることができるであろう、ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを用いることにより、Ｔ−細胞のサブセットを、遺伝的差異及び欠陥と共に決定することができよう。

ｌ米茨歪二Ｒ塁ＨＬＡ−ＤＣの第２ドメインが免疫グロブリンと相同であることが示されている。アラフライ等、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・オプ・ザ・ユナイテッド・スティッ狸ｖＬ基匹り態到」」」胆紅（１９８２）■、６３３７−６３４１゜免疫グロブリン可変領域中の領内ジスルフィド結合の近傍の配列がカバソト等、ジ−ケンシス・オブ・イムノロジカル・インチレスト（Ｓｅ　ｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａｌＴｎｔｅｒｅｓｔ）　、！ヘルス・アンド・ヒユーマン・サービシス（Ｈａｅｌｔｈ　ｓｎｄ　ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ）、ワシントンＤ、Ｃ（１９８３）に検討されている。Ｂ−細胞抗一イデオタイブ抗血清とＴ−細胞との間の交差反応性が、アイヒマン及びラゼウスキー、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）（１９７５）　５　：　６６１−６６６、ビンッ及びウィグラエル、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディシン（ム詠ムム虹）　１４２　：１９７−２１１；及びアウグスチン等、レギュラートリー・Ｔリンポサイト（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　Ｔ　Ｌ　ｍ　ｈｏｅ　ｔｅ）、ペルニス及びフォゲル編、１７１−１８４　、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１９８゜に報告されている。Ｔ−細胞特異的遺伝子と免疫グロブリンコード遺伝子との間のヌクレオチド配列の類似性の欠落がクロネンベルグ等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（ム■Ｌ九虹）、前掲、（１９８３）　１並：２１０−２２７により報告されている。ネズミＴ−細胞特異的蛋白質がカプラー等、セル（並置）　（１９８３）旦、７２７−７３７　、及びマクィンタイレ及びアリソン、前掲（１９８３）３４．７３９−７４６に報告されている。

アリソン等、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）（１９８２）　１社：２２９３−２３００；ハスキンス等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ステイク７（Ｌ力上」郵工）（１９８３）　１５７：１１４９ −１１６９；ミュール等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８３）　３０鉦８０８−８１０；及びサムエルメン等、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシス・オブ・ザ・Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　（１９８３）　８０１　：６９７２−６９７６は、３７〜５０ｋｄのサイズの２つの異る糖蛋白質から成るジスルフィド結合したヘテロダイマー〇Ｔ−細胞からの免疫沈澱を報告している。マクインタイル及びアリメン、前掲（１９８３）　；及びアクト等、セル（Ｃｅｌｌ）（１９８３）３４　ニア１７−７２６は、ペプチドマツプ分析により、前記ヘテロダイマーが可変部分及び不変部分を有するらしいことを報告している。ヘーベルーカッツ等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（ム■Ｌ顕虹（１９８２）１５５　：１０８６　：１０９９．及びヘトリック等、セル（辿）　（１９８２）皿：１４１−１５２は、Ｍ　ＨＣ−制限Ｔ−へルバーハイプリドーマの生成を報告している。この開示を引用によりこの明細書に組み入れる。デービス等、ＢアンドＴセル・チュモアス（Ｂ　ａｎｄＴ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｕｍｏｒｓ）、ＵＣＬＡシンポジウムＶｏｌ　２４（ピッテラ及びフォックスり２１５−２２０、アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８２は、Ｔ及びＢリンパ球が、それらの遺伝子発現の非常に小部分により異ることを報告している。

サイト−、ネイチュア−（Ｎｓｔｕｒｅ）（１９８４）　３０９　ニア５７−７６２は、細胞毒性Ｔ−細胞ＤＮＡ中に組み替えられておりそして可変、不変及び連結領域に相同な要素を有するＴ−細胞特異的ｃＤＮＡ３９３−４０１及びカバラー（Ｋａｖａｌｅｒ）等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８４）３１０　：４２１−４２３は、β鎖中の多様な要素の存在を報告している。Ｔ−細胞レセプター分子のα−鎖はβ−鎖と同様に光」Ｌ叫Ｊｌ希少なメツセンジャーＲＮＡを単離する方法が提供される。

この方法により、Ｔ−細胞中の抗原特異的レセプターをコードするＤＮＡ配列、及び他のＴ−細胞特異的遺伝子生成物が得られる。このＤＮＡが、多（の方法において、例えば、抗体と同様に使用することができる、外来性ＤＮＡ配列と組合わされて新規なＴ−細胞レセプターを形成するヌクレオチドプローブとして使用することができ、あるいは、染色体外要素をもたらすか又は宿主のゲノムに組込まれる造成物（バイブリド蛋白質が発現されそして膜に輸送される）を得ることができる。

垣ｎ狛臨肌第１図は、Ｔ−細胞抗原レセプター断片の制限地図であり、陰を付した部分は異るｃＤＮＡクローン間の主要相同性を示す。

配列決定はマリサム及びシルバード、ブロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイク・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　（１９７７）　７４：５６０の方法により行われた。

太い矢印は３′〜末端ラベル（フレノウ）を示し、そして矢印は５′−末端ラベル（ポリヌクレオチドキナーゼ）を示、す。

第２図は、８６ＴＩの完全ヌクレオチド配列及び他のｃＤＮＡクローンの部分配列を示し、５′−非翻訳領域（ＵＴ）、リーダーポリペプチド、可変、連結及び不変領域を示し、番号付与は８６Ｔ　Ｉのアミノ酸配列に従い、そして可能性ある炭水化物結合部位（ＣＨＯ）　（Ｎ−Ｘ−Ｓ又はＮＸ−Ｔ）が示されていル。

第３図は、ＴＴ１１ｃＤＮＡクローンの配列決定ストラテジーを示し、細線はポリヌクレオチドキナーゼによる５′−末端ラベリングを示し、そして太い線はＤＮＡポリポリーゼ■のフレノウ断片による３′−末端ラベリングを示す。これはさらに、ヌクレオチド配列、推定されるアミノ酸を示し、そして一般に個々の領域を示す。“ＣＨＯ”はＮ−リンクグリコジル化のための潜在的なシグナル配列を示す。

具　的な態様の記この発明に従えば、抗原特異的Ｔ−細細胞レゾブタ−しくはその断片のための全体的もしくは部分的コード配列、特にジャームライン及び組み替えられたＤＮＡ中の１又は複数のエクソン上に見出される機能的領域を含む新規なりＮＡ配列、又は成熟メツセンジャーＲＮＡからの全体的もしくは部分的ｃＤＮＡが提供される。

哺乳動物Ｔ−細細胞レゾブタ−、α−及びβ−サブユニットと称する約４０〜５０ｋｄ　（キロダルトン）の２つの異る糖蛋白質から成りそしてジスルフィド連結されている８０〜９０ｋｄのヘテロダイマーのようである。これらの２つの糖蛋白質は、ペプチドマツプ分析により、可変及び不変領域はドメインを有する。

このヘテロダイマーの糖蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、免疫グロブリンと同様に可変、連結及び不変領域に分けられ、このことは免疫グロブリン配列と実質的な相同性を有する配列により、及びＪ一様要素の独立の類別（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）により明らかにされる。各サブユニットは免疫グロブリンのヘビー鎖に匹敵する多様（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）　（Ｄ）領域を有する様である。

α−及びβ−サブユニットは、それら自身間、他のＴ−細胞膜蛋白質及び免疫グロブリン又はＢ−細胞レセプター蛋白質との間で多くの類似性を有する。はとんどの場合、全体的な相同性は低く、不変領域においてアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の少数の類似性が存在する。（リーダー配列のメチオニンがアミノ酸配列のための１として使用される。）システィン間隔が、可変領域（α−６５；β −６９；　Ｉｇλ又はに−６５）中のおよそ６５〜７０アミノ酸間に見出される。さらに、α−鎖の可変領域中およそ残基５５における配列“ＷＹＲＱ”は、β −鎖中“−ＹＫＱ″における相同性、及び免疫グロブリン中の匹敵する位置における類似の配列を見出す。可変領域において、およそ１００−１１５の残基の領域中に１又は２個のアミノ酸の相違を伴って配列＠ＤＳＡ−Ｙ−ＣＡＶ”が見出される。

Ｊ領域はα−鎖の１６残基中７残基がβ−鎖と同一であり、そしてネズミのヘビー及びライト鎖の共通配列との有意な相同性を有し、最も高度に保存されている。

さらに、Ｔ−細胞レセプター配列に特徴的なのは、トランスメンプラン領域中に塩基性アミノ酸を有する配列“ＩＬＬＸＫ”（ここでＸはＬ又はＧである）である。

Ｄ又は多様性領域中、およそ残基１１５−１２０における″ＳＧＮ’配列への５ ′はヌクレオチド配列“Ｇ、”である。β−鎖推定上のＤ領域１４中の７において、Ｃ′−側に’Ｇ３−７”の列が見出され、これは免疫グロブリンヘビー鎖Ｄｆｉｌ域中に相同性を見出す。

α−及びβ−鎖はジで−ムラインＤＮＡ中でコードされ、これは組み替えにかけられて転写物がもたらされ、これがさらにプロセスされる。後記の目的のためにゲノム性ＤＮＡ又は成熟転写物からのｃＤＮＡを使用することができる。

各鎖は３〜５個の、通常４〜５個のＮ−グリコジル化部位を有し、それらの幾つか又はすべてが用いられ得る。

ヘテロダイマーの２本の鎖は異り、そして異る遺伝子座に由来すると考えられる。β−鎖及びα−鎖の配列がそれぞれ第２図及び第３図に示される。これらの鎖は、免疫グロブリンと同様に特定のエクソンと関連する領域に分けられる。−次領域はリーダー領域、可変領域（Ｖ）、多様領域（Ｄ）（これはＶの部分であることができる）、連結領域（Ｊ）、不変領域（Ｃ）、トランスメンプラン領域（ＴＭ）、及び細胞質領域（Ｃｙ）である。

グリコジル化を伴わないα−鎖は約２５〜３０ｋｄ　（、キロダルトン）であり、他方β−鎖はおよそ同じか又はこれより太き（、約２５〜３５ｋｄであろう。

グリコジル化を伴えば、サブユニ７）はそれぞれ約３５〜５０ｋｄであり、８０〜９０ｋｄのスルヒドリン連結されたヘテロダイマーをもたらすであろう。

各サブユニットについて、イントロンを含むヘルパーニー細胞中組み替えられたＤＮＡは一般に約６〜８　ｋｂｐであり、個々のエクソンは実質的に一層小さく、そしてドメイン＋含まれるなんらかのフランキング配列のためのｃＤＮＡ配列のサイズにおよそ等しいであろう。

不変領域（トランスメンプラン及び細胞質領域を含む）をコードするＤＮＡ配列は一般に約４００〜６００ｎ　ｔ　（ヌクレオチド）＋約３００ｎｔの３′非翻訳領域である。これらの配列は、約１００〜２００ｎｔ　、通常約１００〜１５０ｎ　を離れて配置されるシスティン間の分子内ジスルフィド連結をコードするコドンにより特徴付けられる。

主として疎水性アミノ酸を含みそして約４５〜１０５ｎｔを有する可能性あるトランスメンプラン配列が不変領域と関連する。

この配列は不変領域の３′一端を定義し、そして細胞の細胞質に伸びるアミノ酸をコードする約５〜１５コドン（１５〜４５ｎｔ）を含有するであろう。

機能的意義を有すると考えられる次の領域又はドメインは免疫グロブリンのＪ領域に類似する領域である。免疫グロブリンについて知られているように、与えられた１個のＣ９Ｊ［域に隣接して約１〜６個、一層一般的には４〜５個にわたる複数のＪ領域が存在する。Ｊ領域は約１５〜２０アミノ酸をコードし、ヘビー鎖Ｊ　ｅＸ域が典型的には１７アミノ酸であり、他方ライト鎖Ｊ領域が典型的には１３アミノ酸である点において、１６アミノ酸を有するβ−鎖は免疫グロブリンヘビー鎖Ｊ領域と一層大きな類似性を有する。

Ｊ　ＳＪ域は、他のＤＮＡ配列、例えば非−野性配列に連結されるトランスメンプラン配列及び細胞質配列を含む又は含まない不変領域と組み合わせて、Ｔ−細胞上の新規なバイブリド蛋白質を可能にするバイブリド配列を形成するために使用することができる。（“非野性”なる語は、野性タイプ又は天然配列以外の配列を意図し、他方“外来性”なる語は、Ｔ−細胞抗原レセプターＤＮＡ配列源と遺伝情報を通常交換しない源からのものを意図する。）表面に輸送されるバイブリド蛋白質を得るため、Ｔ−細胞抗原レセプターと共に存在する第２リーダー配列が５′一端として使用される。この配列は約１５〜２０アミノ酸、一層普通には１８〜２４アミノ酸から成る。非−コードフランキング領域を含むことができるＴ−細胞抗原レセプターＤＮＡ配列の種々のドメインが非−野性タイプＤＮＡにより分離される場合に前記の造成物を製造することができる。

Ｔ−細胞抗原レセプター、個々のサブユニット、その断片、又は断片と非−野性ＤＮＡ　（外来性ＤＮＡを含む）との組み合わせをクローン化しそして／又は発現せしめるために新規なりＮＡ造成物を使用してバイブリド蛋白質を製造することができる。これらの断片は少なくとも約１５ｎｔ、一般に少なく式：％式％（）この式において、 “ＲＳ”は、原核生物もしくは真核生物、プラスミド、ファージ、又はウィルスに由来することができる複製系を意図し、ここで、異る宿主、例えば、単細胞微生物中での複製及び染色体外要素としての維持を可能にする１又は複数の複製系が含まれることができ；複製系又はベクターの例にはラムダ、シミアンウィルス、パピローマウィルス、アデノウィルス、酵母２ｍμプラスミド、ＣｏＩＥＩ、ｐＲＫ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ６又はこれらに類似するものが含まれ、ここで複製系は完全であってもよく、又はヘルパープラスミドともしくはゲノム中に存在する１もしくは複数の遺伝子（例えばＣＯ８細胞）と相互作用する部分的複製系であってもよく；クローニングのためには、単細胞宿主、例えば細菌、酵母等、特にＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）により認識されるプラスミド又はウィルス複製系のごとき複製系が使用され； “ａ”はＯ〜３、普通１〜３の整数であり、染色体への組込みが望ましい場合にはＯであり（但し、組込みは天然の又は外来性複製系が存在しても達成され得る）；“Ｍ”は、造成物を含有する宿主細胞を選択するための手段を提供するその転写及び翻訳制御シグナルと共にマーカーと称される構造遺伝子又はシストロンを意図し；マーカーは殺生物耐性、例えば、抗生物質、例えばアンピシリン・クロラムフェニコール、ネオマイシン、Ｇ４１８、又はこれらに類似するもの、毒素、重金属等に対する耐性；免疫性；栄養要求性宿主に原栄養性を付与する補完、又はこれらに類似するものを包含し； “ｂ”はＯ〜３、一層普通には０〜２、好ましくは１〜２の整数であり； “ｔｉｓ”は転写開始を制御するための転写開始配列を意図し、そして１又は複数のプロモーター（これには、それ自体による又は他のプロモーター、例えばウィルスプロモーターもしくは外来性プロモーターと組み合わされた天然プロモーターが含まれる）、該プロモーターに影響を与える配列、例えばオペレーター、アクチベーター、エンハンサ−、キャンピング配列、ＴＡＴＡ及びＣＡＡＴ配列、あるいはこれらに類似するものを含み、ここで、これらの配列はそれらの機能を満たすことができるように造成物中に組織化されており；“ｅｉｓ”は、発現を制御するための発現開始配列を意図し、そしてリボゾーム結合部位、適当であれば、開始コドン、リポゾーム結合部位と開始コドンを分離するオリゴヌクレオチド（ここで、これらの配列は発現に影響を与える）、及びこれらに類似するものを含み； “Ｔ−ＡｇＲ”は、Ｔ−細胞抗原レセプター、又はＴ−細胞抗原レセプターの断片を含んで成るバイブリドＤＮＡ配列及びバイブリドＤＮＡ配列を意図し、ここで、これらの配列は一諸になって抗原レセプター又はバイブリド蛋白質をコードするオーブンリーディングフレームをもたらし；“ｅｔｓ”は、１又は複数の終止コドン及び適当であれば他の配列を含むことができる発現停止配列を意図し；そして“ｔｔｓ”は、転写停止配列を意図し、この配列は、通常は転写プロモーターと均衡しておりそしてｌ又は複数の終止コドンと組み合わされた１又は複数のターミネータ−であることができる転写ターミネータ−、ポリアデニル化シグナル配列、又はこれらに類似するものを含むことができる。

Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニット又はバイ細胞抗原レセプターレセブターは、はとんどの場合衣の式：％式％（）式中、 ”Ｓ、Ｌ、’は第２リーダー配列を意図し、このものは約１５〜２５アミノ酸、さらに一般的には１７〜２４アミノ酸、そして好ましくは約１９〜２３アミノ酸をコードし、４５〜７５ｎ　ｔ、一般に５１〜７２ｎ　ｔ、好ましくは５７〜６９ｎ　ｔを有し；Ｃ″はＯ又は１であり； “Ｖ−ｓｅｑ“は、Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットの可変領域をコードし又は異るポリペプチドをコードする配列により置き換えられることができ、このＤＮＡ配列は適当であれば第２リーダー配列（Ｓ、Ｌ、）とリーディングフレームが合っており又は第２リーダー配列の非存在下でそれ自体の開始コドンを有することができ；この可変配列は一般に少なくとも約６０ｎｔでありそして約６００ｎｔ以下であり、一層通常には約４００ｎ　を以下であり；この配列がＴ−細胞レセプター可変領域をコードする場合、この配列は一般に約２７０〜３３０ｎｔ　、一層普通には約２８５〜３１２ｎｔの範囲であり；Ｊ”は連結領域であり、そして一般に約４２ｎ　ｔ〜約６０ｎ　ｔであり、一層普通には約４５ｎ　ｔ〜５７ｎ　ｔであり、そしてしばしば約４８〜５４ｎｔであり、ここでＪ領域は、Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットの連結領域エクソンと関連する限定された数の配列から選択され； “ＴＭ”は、約５１〜９０ｎ　ｔ、一層普通には約８４〜９６ｎｔの疎水性配列であるトランスメンプランインチグレーター配列を意図し； ″ｄ”はＯ又は１であり； “ｃｙ”は膜から細胞質内に延びる配列を意図し、これは一般に約１２〜２０ｎ　ｔであり、一層普通には約１５〜２４ｎ　ｔであり、特に約１５〜１８ｎｔであり；そして “ｅ″は０〜１の整数である。

２つのサブユニットα−及びβ−のそれぞれは異る宿主中で又は同じ宿主中で独立して発現することができる。２つのサブユニットが同一宿主で発現される場合は、微生物宿主が使用されるから哺乳動物細胞が使用されるかによって、サブユニットのプロセシング及びサブユニットのＴ−細胞レセプターの集成に影響を与えるであろう。プロセシングには折りたたみ、グリコジル化、小胞体及びゴルジ体を介する輸送、第２リーダー配列の除去を伴う開裂、及びアセチル化によるＮ −末端のキャンピング又はブロッキングが含まれる。プロセンジグめ部分として又はプロセンジグとは独立に、サブユニットの折りたたみ及びサブユニットのＴ −細胞レセプターへの集成が生じなければならない。哺乳動物細胞については、生じた蛋白質はその化学的、物理的及び生物学的性質において天然Ｔ−細細胞レゾブタ−実質的に一致することが予想される。しかしながら、下等真核生物及び原核生物については、種々のプロセス段階が全体的に又は部分的に異って生じ、あるいは全く生じない。従って、これらの配列は野性タイプ第２リーダー配列を発現宿主により認識される第２リーダー配列で置き換えることにより、又は可変領域の始めに開始コドンを設けることにより変形することができる。次に、サブユニットは細胞質中で単離され、そして再生条件下でα−及びβ−サブユニットを一緒に連結することにより受容体が形成される。

生物学的活性を有する、例えば免疫的活性を有するポリペプチドをもたらすために、レセプターサブユニット断片をコードするＤＮＡは少なくとも８アミノ酸、普通は少なくとも１５アミノ酸（それぞれ２４ｎ　を及び４５ｎｔ）のポリペプチドをコードすべきである。

示されるように、造成物は、Ｔ−細胞レセプターサブユニットの一部分のみをコードするＤＮＡを挿入することによって調製することができ（ここで、ベクターは１又は複数の適切な制限部位を有する）、あるいは例えばアダプターにより変形することにより、プロモーター及び関連制御配列、例えば転写のためのＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び適当な翻訳制御配列、例えばりボゾーム結合部位に対して適切な部位に挿入を行うことができ、又はリーダー配列にリーディングフレームを合わせることができる。

Ｔ−細胞抗原レセプターのドメイン又は領域は、個々的に又は組み合わせて使用することができる。ｃＤＮＡを用いることにより、プロセンジグ、例えば第２リーダーの除去、グリコジル化等の前の蛋白質であるプレ蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム内に遺伝子を得ることができる。

ｃＤＮＡの制限地図を作成することにより、上記の式中に示されている個々のドメイン間の境界に隣接する便利な制限部位の存在を決定することができる。制限部位が境界に存在しない場合、適当な場合には適切な制限酵素を用いて、境界の近傍においてさらに開裂せしめることができる。切除された配列を有するようにヌクレオチドが除去されている場合、注目のドメインを適切なリーディングフレーム内に他のヌクレオチド配列と連結することを可能にする適当なアダプターを用いて、そのヌクレオチドを置き換えることができる。余分のヌクレオチドが存在する場合、例えばＢ　ａ１３１を用いる制限処理、プライマー修復等によりそれらを除去することができる。他の方法として、特定のアミノ酸のコドン内に縮重が存在する場合、イン−ビトロ変異誘発を用いて１又は複数個のヌクレオチドを変更し、こうして制限酵素のための適切な認識配列を設けることができる。これらの技法は広範囲に文献に記載されており、そしてここで例示することを必要としない。

使用されるＤＮＡ配列は、この発明に従って単離される配列と同一でも異っていてもよい。Ｊ又はＣドメイン配列をそれ自体として又は他の配列例えばトランスメンプラン配列と組合わせて使用することにより、これらの配列を、同一の又は異る種中の相同配列の存在を決定するための、及び、同等な機能を有する配列を単離するためのプローブとして使用することができる。こうして、Ｔ−細胞抗原レセプターがらの断片の種々の組合わせを用いて、−緒に連結してＴ−細胞抗原レセプター又はバイブリド蛋白質をコードする種々のシストロンをもたらすことができる配列の集積を得ることができる。

Ｔ−細胞抗原レセプターの第２リーダー配列を非−野性ＤＮＡ配列に連結することにより、バイブリド蛋白質の培地への分泌及びプロセシングを与えて哺乳動物宿主からの成熟蛋白質生成物を得ることができる。蛋白質が真核生物蛋白質である場合、それを適切にプロセスして天然真核生物蛋白質と同一か又は実質的に同一な生成物を与えることができる。

上記の方法に代えて、Ｔ−細胞表面又は異る哺乳動物細胞の表面に特定の蛋白質をもたらすことを望む場合には、第２　＋Ｊ−ダー配列とトランスメンブラン配列との間に、Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットの可変、Ｊ及び不変領域の代りに外来性蛋白質をコードする外来性配列を挿入することができる。こうして、細胞表面に全体として異る表面膜蛋白質を与えて細胞の表面特性を変化せしめることができる。

この造成物の発現生成物を用いて発現生成物に対する抗体を得ることができ、次にこれを用いて、Ｊ又はＣ８Ｎ域に対するイデオタイブ決定基又は共通決定基の共有に基いて、Ｔ−細胞抗原レセプター又は個々のサブユニットの存在を検出することができる。

特にＣ頭埠の５′−末端から細胞質領域の３′−末端に延びる配列のクローン化ＤＮＡ配列をプローブとして用いることができる。通常、プローブは相同配列の少なくとも約１５ｎ　ｔ、一層普通には少なくとも約３０ｎｔであり、そして一般に約１０００ｎｔを超えず、好ましくは約５００ｎ　ｔを超えない。さらに、５ｋｎ　を又はそれより大である非−相同フランキング配列が存在することができる。

プローブとして使用されるヌクレオチド配列はＲＮＡ又はＤＮＡであってよく、そして種々の方法でラベルされていてもよい。一般に、プローブは３ｔｐによりラベルされ、そしてオートラジオグラフィーにより検出することができる。別法として、ビオチン、新規な糖類、又は他の任意の分子を、オリゴヌクレオチドを調製するための合成技法を用いて含めることができる。こうして、任意の末端基を導入して、検出可能なシグナル源として機能せしめることができる。これらの基は直接的に又は間接的に、すなわち共有結合、リガンド−受容体結合、例えばハブテン及び抗体、又はこれらに類似するものにより導入することができる。検出可能なシグナルをもたらすラベルの例には、螢光物質、化学発光物質、酵素、放射性ラベル、磁性粒子、及びこれらに類似するものが含まれる。

Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットと関連する希少なメツセンジャーＲＮＡを単離するために、希少なメツセンジャーＲＮＡを得るための種々の方法が用いられた。β−サブユニットのために用いられた方法は、非−膜結合ＲＮＡがらの膜結合ポリゾーム性ＲＮＡ０単離を含む。次に、ＲＮＡの膜結合ポリゾーム画分を逆転写して単鎖（ｓｓ）　ｃＤＮＡを生成せしめた。次にこのｃＤＮＡを２Ｚｐによりラベルし、そして反復してβ−細胞ｍＲＮＡとハイブリダイズせしめ、そしヒドロキシアパタイト上で分画した。カラムを通過した残りの５ｓｃＤＮＡを単離した。

次に、第２のＴ−へルバーハイブリドーマを用いてｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして第１Ｔ−へルバーハイブリドーマから調製されたｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。

これが、Ｔ−細胞特異的膜関連配列の実質的な濃縮（約２００倍）をもたらした。

減少した数の選択されたクローンを、最初に調製したプローグを用いて再スクリーニングした。次に陽性クローンをニックトランスレートし、そしてノーサンブロッティング条件下でＢ−細胞ｍＲＮＡにハイブリダイズせしめた。Ｂ−細胞ｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったクローンをＴ−細胞特異的であるとして選択した。

次に、これらのクローンを用いて、次のようにして体細胞組み替えを研究した。

１０００ｎｔより大きいＲＮＡにハイブリダイズするそれらを、ヘルパーニー細胞ハイブリドーマ及び胸腺腫を含む分離源からのゲノム性ＤＮＡのサザンプロットにハイブリダイズせしめた。ＤＮＡを標準的方法により調製し、特定の制限酵素、この場合上ｖｕＵ、により消化し、０．９％アガロースを通して電気泳動し、そしてニトロセルロース上にプロットした。穏和な〜激しい厳格さが用いられ、そして胸腺腫及びハイブリドーマの両者が、他の非Ｔ−細胞ＤＮＡとは実質的に異るパターンを与えることが見出された。

α−サブユニットのために用いられた方法は、異る特異性のＴ−細胞間の可変領域特異的な削減された（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｃＤＮＡプローブを用いた。ヘルパーハイブリドーマのｍＲＮＡからランダムプライムされたラベル化ｃＤＮＡを合成した。約３００〜４００ｎｔの平均サイズに断片化した後、２本鎖核酸から単離を分離するためにヒドロキシアパタイトを用いながら、少なくとも２つの異るＴ−へルバーハイブリドーマ又はＴ−ヘルパ一様リンパ腫系からのｍＲＮＡにより削減した。次に、残りの単１１ｃＤＮＡを、もとのｃＤＮＡを与えるセルラインから調製されたｃＤＮパライフ゛ラリ−にハイブリダイズせしめた。同じＴ−ヘルパーハイブリドーマからのオリゴ−ｄＴプライムｃＤＮＡ　（ここで、ｃＤＮＡは、マクロファージ又は他のリンパ球系からのｍＲＮＡにより削減された膜結合ポリゾームａ＋ＲＮＡがら逆転写される）により陽性クローンを再スクリーニングすることにより関連のない配列の追加の除去を達成することができる。得られるハイブリダイズするクローンはＴ−細胞レセプターの可変領域に関連することが見出される。

バイブリドＤＮＡ技法を用いることにより、α−及びβ−サブユニットを別々に調製することができ、あるいは有機分子、例えばポリペプチド、ポリサンカライド、リビド、ハプテン及びこれらの組合わせの特定の配置に対する高い特異性及び親和性を有するレセプターとして組み合わせることができる。レセプターの一群が実質上同様の方法で使用され得る免疫グロブリンに類似してもたらされるが、免疫グロブリンに関連する性質、例えばＦｃ決定基、補体関連細胞毒性、又は免疫グロブリンと特に関連する他の特性を欠いている。この発明のレセプターは、血液中インービボで表面膜結合Ｔ−細胞レセプターと競争して類似抗原により活性化されたヘルパー細胞の増殖を阻害することができる。

Ｔ−細胞レセプターは、免疫グロブリンが使用されるほとんどの状況において、例えば診断測定、アフィニティークロマトグラフィー、部位特性療法又は診断において使用することができ、この場合Ｔ−細胞レセプターは放射性核種、ｎｏ＋ｒ活性化合物、螢光物質、毒素、例えばアブリン、リシン等、又はこれらに類似するものに直接的又は間接的に接合され得る。

α−及びβ−鎖のために用いられる遺伝子を手にすることにより、鎖、及びそれ故にレセプターを、ヒト細胞に比べて増殖要件が厳格でないヒト細胞以外の細胞から多量に製造することができる。Ｔ−細胞レセプターは細菌、例えばＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｔ）　、Ｂ、ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）等、真核生物、例えば酵母、糸状菌類、ネズミ細胞等において製造することができる。

次の例は、限定のためではなく例示のために与えられる。

大−一一致ヘルバーＴ−細胞抗原特異的レセプターサブユニットα−及びβ−（ＴＭ−へｇレセプター、α−又はβ−サブユニット）をコードする遺伝子の遺伝子単離法は次の通りである。

まず、β−サブユニットの単離が考慮されよう。膜結合Ｔ−ヘルパー細胞ｃＤＮＡプローブが、Ｂ−細胞メツセンジャーＲＮＡを用いて削減され、そして他のＴ、−Ｂ−細胞リンパ腫組合せ生成物であるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用された。ライブラリーは、Ｂ−細胞特異的ライブラリ−〔デービス等、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイク・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　（印刷中）〕について下記するようにして、そしてフフリカツメガエル胚段階特異的ライブラリー〔サーゼント及びダウイド、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８３）２２２：１３５−１３９　）についての方法と同様の方法により、ＴＮ−ハイブリドーマＭ１２又は２Ｂ４［ヘトリック等、セル（辿）　（１９８２）並：１４１−１５２〕を用いて造成された。Ｂ−細胞リンパＩＩＩＬＩＯＡ及びＢａ１１７〔キム等、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）（１９７９）１２２　：　５４９−５５４　）からＢ− 細胞ｍＲＮＡを得た。ｃＤＮＡは検出のために３２ｐ−ラベルされた。Ｔ、−Ｂライブラリーは、ヒドロキシアパタイト段階における削減において９５％のｃＤＮＡが除去されたことに基いて、Ｔ−細胞特異的配列について２０倍濃縮された。

（Ｂ−細胞ライブラリーについての例示的方法は次の通りである。セルラインＢａ１１７　、Ｂ−細胞リンパ腫（ＩｇＭ”　ＩｇＤ”Ｉａ”）　（キム等、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）（１９７９）　１２２：５４９−５５４）　、及びＢａ１４、Ｔ−細胞胸腺腫（Ｔｈｙｌ”Ｌｙｔｌ”　ｔ、ｙｔ２°ＴＬ”　）　Ｃキム等、前掲（１９７Ｂ）匪：３３９−３４４）をＲＰＭＩ、グルタミン、７０％ウシ胎児血清及び５Ｘ１０−’Ｍβ−メルカプトエタノール中で５％ＣＯ２雰囲気下で増殖せしめた。高濃度（１〜２　Ｘｌ０− ”／ａｊｌ　）に増殖した後新培地により２〜４時間時間レフラッシュ細胞をＰＢＳと共に冷却し、そして収得した。この細胞を冷ＰＢＳ中で数回洗浄し、そして０．１４Ｍ　ＭＣＩ！　、　０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，０，００１５Ｍ　ＭｇＣｌ　２中に再懸濁し、ＮＰ−４０を１％に加えることによって細胞溶解し、そして核をペレット化した。細胞質両分を０．５％５０５．５　ｍＭＥＤＴＡとし、そして飽和フェノールで２〜３回、Ｓｅｖａｇ　（ＣＨ（１，：イソアミルアルコール２４：１）で１回抽出し、エタノールで沈澱せしめ〔ムシンスキ等、プロシープ・ｆングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイク・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　（１９８０）　？？ニア４０５−７４０９）　、そしてポリＡ”ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロース上で選択した（１〜２回）。

Ｂ−細胞リンパ腫からのｃＤＮＡを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　５ｐＨ８，３，６ｍＭ　Ｍｇｃｆ　ｚ　、７０ｍＭ　ＫＣＩ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、第１鎖に１０’ ｃｐｍ／μｇの比活性を得る”Ｐ−ｄＣＴＰ　、　１０＃ｇ／ｍＪオリゴーｄＴ、２０ｍＭジチオスレイトール、１００μｇ７ｍｌアクチノマイシン“Ｄ”を含む１００μｌの反応混合物中で１〜５μｇの鋳型ポリＡ”ＲＮＡから合成した。

１μｇのポリＡ”ＲＮＡ当り１０ユニツトのＡＭＶ逆転写酵素を加え、そして４２℃にて２時間インキュベートした。同容積の０．２　Ｍ　ＮａＯＨを添加した後、混合物を７０℃にて２０分間インキュベートし、氷上で冷却し、ＩＭＨＣ４により中和し、そして酢酸ナトリウム（ｐＨ６，５）及びＳＤＳをそれぞれ０．２Ｍ及び０．１％に添加した。室温において、１００ｍＭ　Ｎａｃｌ　％　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．０２％ＳＤＳのランニング緩衝液により、パスツールピペットカラム中のＧ−５０ＦセフアデツクスからｃＤＮＡを排除した。１５μｇのｔＲＮＡを担体として加え、そしてｃＤＮＡをシラン処理されたエフペンドルフチューブ（１，５ａｌｌ）中で沈澱せしめた。沈澱を７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥し、そして０．５Ｍリン酸緩衝液、５　ｍＭ　ＨＤＴＡ　、０．１％ＳＯ５中に再懸濁し、そしてシールしたガラス毛細管中でＴ−細胞胸腺ＲＮＡと、１０倍過剰１〜１．５　ｍｇ／ｍｌにてハイブリダイズせしめた。反復配列を吸着するために、剪断されたマウスゲノム性ＤＮＡ（１，２ｏ＋ｇ／ａ＋ｊ＋　。

１０μｇ／反応）を含めた。６０秒間煮沸した後、混合物を１６〜２０時間６０ ℃にてインキュベートした。次に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、０．１２Ｍリン酸緩衝液、０．１％ＳＯ５中で６０℃にて材料を両分した。

単鎖画分をＤＮＡポリポリーゼ■　（チレノウ断片）を用いて２本鎖にし、ＳＩヌクレアーゼにより切り取り、そしてｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位にＧ−Ｃテイル化した０次に、プラスミドをＥ、コリ中に高効率（５０〜４００　Ｘ　１０３ μｇ／挿入）で、平均挿入部サイズ約５００ｎ　ｔでクローン化した。

５ｏｏｏの選択されたクローンのライブラリーをスクリーニングし、そして標準的方法〔マニアチル等、モレキュラー・クローニング（ム圏匹圏り叶装置Ｌ）１コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−１１９８２）により、Ｔ−ハイプリドーマ２Ｂ４からの膜結合Ｔ−ヘルパー細胞ｃＤＮＡプローブ（これから、Ｂ−細胞ＬＩＯＡからのＢ−細胞メツセンジャーに共通な配列が削減されている）　（ＭＢ７２１４−ＢＬＬ。ハを用いて再スクリーニングした。３５の明確な陽性が得られ、これはライブラリーの約１０％であった。どれが同じ遺伝子に由来しそしてどれが異るかを決定するため、及び間違ったにすぎない陽性を除去するため、これらのプラスミドクローンのそれぞれをニックトランスレートし、そして代表的ナサンプロットとハイブリダイズせしめた。５個がＢ−細胞ｍＲＮＡと反応性であり、そして残りの３０個がｍＲＮＡサイズの１０種類の異るパターンの１つに属し、そして表現を次の表に示した。

＊Ｔ−ハイブリドーマ、２Ｂ４及びＣＩＯ：Ｔ−リンパ腫、Ｂａ１４及びＢａ１１３：　Ｂ−リンパ腫、ＬＩＯ＾及びＢａ１１７゜７Ｍ８はラフトｔｈｙ−１ｃＤＮＡクローンと強く交差ハイブリダイズした。ｔｈｙ−１は古典的なＴ−細胞膜抗原である。

今や、ｃＤＮＡライブラリーがハイブリドーマ３．３７　（ヘーベルーカフツ等、前掲）から調製された。

１０００ｎ　を以上のメツセンジャーにハイブリダイズする７つのクローンのそれぞれをラベルし、そして胸腺腫ＢＷ５１４７　（マウス系ＡＫＲから、ヘーベルーカッツ等、前掲）　、ＡＫＲ肝、抗原特異的Ｔ−細胞２　Ｂ　４　（Ｂ１０．ＡマウスからのＴ−細胞とＢＷ５１４７との融合）、及びＢ１０．Ａ肝からのＤＮＡから成るサザンプロットにハイブリダイズせしめた。ＤＮＡは標準的方法（マニアチス等、前掲）により調製し、制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、０．９％アガロースを通して電気泳動し、そしてニトロセルロース上にプロットした。サザンプロットからのオートラジオダラムは、ＴＭ　８　（ｔｈｙ−１）と共に見られるＡＫＲ及びＢ１０．Ａの間の制限多形性を除き、各クローンとのハイブリダイゼーションのパターンは７Ｍ８６の場合を除（ＤＮＡ源のすべてについて同一であった。親株のいずれかからの肝ＤＮＡに比べて、ＢＷ５１４７又は２Ｂ４のいずれかのクローンにハイブリダイズするヱ…■断片の非常に異るパターンが存在した。

検査されたクローンはまた、ゲノム性ＤＮＡのＥｃｏＲＩ及び且旦ｄ！消化物にハイブリダイズせしめ、そして各場合において７Ｍ８６のみがＴ−細胞ＤＮＡと肝ＤＮＡとの間の有意の相異を示した。７Ｍ８６クローンはｐＢＲ３２２からＰｓｔＩにより切出し可能である。

レセプター遺伝子のゲノム性組み替えが異る抗原特異性のＴ−細胞についてユニークであるか否かを試験するため、５種類の抗原特異的Ｔ−細胞ハイブリドーマからのＤＮＡから成るゲノム性プロットをクローンＴＭ８６からのニックトランスレートされた挿入部とハイブリダイズせしめた。その結果は、抗原特異的Ｔ− 細胞のそれぞれからのＤＮＡはユニークパターンをもたらすということであった。３種類の異るＢ−細胞リンパ腫瘍ＤＮＡは肝臓のそれと同じパターンを与え、組み替えがＴ−細胞にユニークであるらしいことが示された。

さらに、一連の細胞毒性ラインがＴヘルパー細胞のそれと類似するメツセンジャーＲＮＡを発現しくここに記載される遺伝子との交差反応による）、そしてさらにこれらのゲノム性ＤＮＡの組み替えを示す。

異るＴ−リンパ球において独立して生ずる他のｃＤＮＡクローンを得るため、ラムダベクターｇｔｌｏ（ロナルド・デービス、スタッフォード大学、スタンフォード、カリホルニアから一般に入手可能である）を用いて胸腺細胞ｃＤＮＡライブラリーを調製した。このライブラリーを、標準的条件〔マニアチス等、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　）　（コールド・スプリング・ハーバ−・プレス）コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）　）を用いて７Ｍ８６クローンによりスクリーニングした。このライブラリーは、若いＢａ１ｂ／Ｃ系マウスからの全胸腺ポリＡ”　ＲＮＡから造成した。ＡＭＶ逆転写酵素（アマ−ジャム）を用いてｃＤＮ＾を調製した。

ｃＤＮＡがメチル化されず、これが３′−側上ｍＲＮＡ配列内での開裂を説明した。ＤＮＡポリポリーゼＩによりフィルインした後、各端にＥｃｏＲＩリンカ− を連結した。次に、生じた断片を所望のサイズ範囲に両分し、そしてラムダベクターｇｔｌｏのファージレプレッサー遺伝子中に位置する１個の旦ｃｏＲＩ制限部位に挿入した。レプレッサー遺伝子へのＤＮＡ断片の挿人は土ヒファージを生成し、このファージは透明なプラークを形成する。μ■゛ファージは濁ったファージを形成し、バイブリドファージの選択が可能となる。ｇｔｌＯライブラリーから親ファージを除去するため、使用された細菌宿主はｃ６゜。

ｒｋ−ｍｋ＋ｈｆ　Ｔであった。この宿主に対して、親ファージは非常に低頻度でプラークを形成する。ｃＩ”親ファージは抑制され、他方ｃＩ−バイブリドファージは正常にプレート増殖する。

陽性にハイブリダイズする組換体をｐＵＣ９Ｃビエラ及びメッシング、ジーン（Ｇｅｎｅ）　（１９８２）　１９：２５９−２６８）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。３個の胸腺由来クローンを得、８６Ｔ１．８６Ｔ３．８６Ｔ５と命名した。部分制限地図を第１図に示す。８６Ｔシリーズの分子はすべて同じ３ ′位置で終り、これはコード配列の３′末端の近位の内部旦ｃｏＲＩ認識部位のためである。

５′末端の変化はおそらくライブラリーの造成中のランダムは鎖停止のためである。

ナサンプロット中に見られる最大のｎ＋ＲＮＡが１３００ｎ　ｔである事実に基いて、ポリＡテイルの１５０〜２５０ヌクルオチドの削減が１０５０〜１１５０ｎｔの予想されるクローンサイズを与える。従って、８６Ｔ１の９３８ヌクルオチドサイズは胸腺細胞分子のためのコード領域配列のほとんどを含有するはずであることが結論ずけられる。第２図に示すように、８６Ｔ１を完全に配列決定し、そして他のクローンの部分配列と比較した。

この比較に基いて、多くの結論を導くことができる。（１１４個のｃＤＮＡクローン中２個の５′末端は同一でなく、しかし第１図において注目されるような例外はあるがすべては同一の３′末端を有する。８６Ｔ３の完全な不変領域が配列決定され、そして１個のヌクレオチドを除き８６Ｔ１について示されたそれと同一であることが見出された。この５′可変及び不変領域構造は免疫グロブリンｃＤＮＡクローンに類似する。（２）メチオニン開始コドンにすぐ続いて、予想されるリーダーポリペプチドに対応する疎水性アミノ酸のストレッチが存在する。

特に、配列Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕは力・７バ一ライト鎖リーダーポリペプチド間で共通である。（３）可変及び不変領域間の１６アミノ酸要素は８６Ｔ１及び８６Ｔ５間でヌクレオチドレベルにおいて共有されるが、しかし８６Ｔ３又はＴ？＋８６とはそうでなく、独立に調和するＪ一様領域が示唆される。（４）システィン及び他の残基の配置は免疫グロブリン及び関連分子との有意な榛造的類似性を示唆する。（５１８６Ｔ３の見かけ上の可変領域は、そうではなければ正常な不変領域とフレームが整合する多く　（５個）の終止コドンのため、機能的でないようであり、そして事実、このクローンはリーディングフレーム内に終止コドンを有し、この遺伝子のすべての転写物が、少なくとも胸腺において、活性な分子を生成するのに有効とは限らないことが示される。

既知蛋白質との進化的関連性についてこのｃＤＮＡクローンの配列を分析するるため、誘導されたアミノ酸配列を、ウィルプル及びリプマン、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイク・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）（１９８３）８０ニア２６−７３０の迅速比較プログラムを用いてデイホフの蛋白質配列データバンクと比較した。データバンクの約２３００の配列から、２５の配列の相同性が、該データバンクの平均相同性からの５標準偏差より大又は同じであった。これらの２５の配列の内、２４個が免疫グロブリンネ変又は領域配列であり、そして１つがクラス■ヒト組織適合性分子であった。さらに、８６Ｔ１の可変部分は免疫グロブリンの可変部分と一致に他方不変部分は免疫グロブリンネ変領域と一致する。

マウス−カッパー可変領域（カバト等、前掲）中の１８個の不変残基の内１３個が８６Ｔ１の配列中に存在し、そしてヘビー鎖可変領域の１０個の不変残基中６個が８６Ｔｌ中に存在する。

免疫グロブリン可変領域のジスルフィドループを形成するシスティン残基間の間隔はカッパー及びラムダ−ライト鎖の両者については典型的には６５アミノ酸であり、そしてヘビー鎖のそれについてはクロアミノ酸である。８６Ｔ１可変領域の最も外側の２個のシスティン間の距離は中間６８アミノ酸である。異る免疫グロブリンＶ　？、！域の整列は、８６Ｔ１のリーダーペプチドが位置２０のアスパラギンのすぐ前で開裂されることを予言する。

おそら（第１不変領域ドメイン、特に位置１６４の近傍にわたって、免疫グロブリンとの顕著な相同性が観察された。この領域において、システィンへの直接５ ′の配列はライト鎖に相同であり、そして配列３′はヘビー鎖に相同であることに注目することは興味あることであった。８６Ｔ１配列の最終システィン（位置２６０）の近傍においても、カッパー及び及びラムダライト鎖の両者との実質的な相同性が観察された。

４種のクローンの内、８６Ｔ１と８６Ｔ５の間で１６アミノ酸が共有されたが、しかし配列決定された他の２個のクローン８６Ｔ３及び７Ｍ８６とは共有されなかった。この相同性は正確に、免疫グロブリン中の連結（Ｊ）領域要素により占められる領域に属す。８６Ｔ１及び７Ｍ８６の両者の推定上のＪ　９ｉ域は、すべての免疫グロブリンＪ　Ｓｉ域との実質的な相同性を示す。サイズに関して、推定的Ｊ領域は、ライト鎖（１３アミノ酸）よりもヘビー鎖（平均１７アミノ酸）と一層関連する。

Ｊ要素に加えて、アミノ酸１０３−１１５間の隣接５′領域は８６Ｔ５及び７Ｍ８６の間に実質的な相同性を有する。特に、これらの２つのｃＤＮＡクローン間の１７ヌクレオチド及び９ヌクレオチドの同一性は、ヘビー鎖免疫グロブリンのＤ％ｉ域におそらく類似するであろう他の可能性ある“ミニ−遺伝子”要素を示唆する。他方、これらの相同性は、関連可変領域遺伝子の幾つかの高度に保存された領域を代表するであろう。

ヒドロパティシティ（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロット〔カイト及びドーリットル、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ）　（１９８２）１５７：１０５−１３２）が行われ、そして次のことが示された：８６Ｔ　１分子は球状蛋白質に特徴的な交互に現われる疎水性−親水性ストレッチを有し；予想されるリーダーポリペプチドが疎水性環境中に存在し；トランスメンプラン延長領域が８６Ｔ１配列の末端に示され、これに続いて、多数のリンパ球細胞膜マーカーの細胞質部分に特徴的す正電荷（ｌｙｓ−ａｒｇ −１ｙｓ）の連鎖が存在する。

結論において、８６Ｔ１の構造は１９アミノ酸リーダーポリペプチド、９８アミノ酸可変領域、１６アミノ酸Ｊ領域並びに１個の球状不変領域ドメインとこれに続くトランスメンプラン及び細胞質蛋白質から成るそれである。免疫グロブリンとの類似性により、各球状ドメイン中の２個の最外側システィンは連結されており、そして位置２６０の最終システィンは受容体へテロダイマーの他の鎖に結合するであろう。

さらに、８６Ｔ１の合成ペプチド断片に対して生じた抗血清は、Ｔ−ヘルパーハイブリドーマによるＩＬ−２の抗原依存性放出を有意に阻害することが見出された。従って、上記の座はＴ−リンパ球の少なくとも幾つかのサブセント中で特異的に組み替えられそして発現される免疫グロブリン遺伝子の１つのタイプを代理すること、及びこれはＴ−細胞による抗原の認識において役割を演することが結論される。

今や、ＴＭ　Ａｇレセプターα−ユニットの単離及び特徴付けが記載されよう。

β−サブユニットの単離及び特徴付けにおいて前に記載された方法は反復されないであろう。

ウシ胸腺ＤＮＡを用いて、標準的方法（マニアチス等、前掲）により、ポリＡ１細胞質２Ｂ４ｎ＋ＲＮＡからランダムプライム３ｚＰ−ラベルｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡは最初７００ｎ　ｔの平均長さであり、そして２週間にわたりオートラジオリシス（ａｕｔｏｒａｄｔｏ−１ｙｓｉｓ）により約３００〜４００ｎｔに断片化された。Ｔ８ハイブリドーマＣ１０ｍＲＮＡそして次にＴＭ一様リンパ腫セルラインＥＬ−４からのｍＲＮＡによるハイブリダイゼーション及びヒドロキシアパタイト選択を用いて削減ハイブリダイゼーションを行った。次に、２回削減されたプローブをベクターλｇｔｌｏ中２Ｂ４　ｃＤＮパライフ゛ラリ− のフィルターにハイブリダイズせしめた。約２０．０００のプラークをスクリーニングした。７個の陽性を拾い上げ、そしてＰ３８８Ｄ１マクロファージラインからｍＲＮＡにより削減された、２Ｂ４からの膜結合ポリゾーム性ｍＲＮＡからの調整されたオリゴ−ｄＴ−プライムｃＤＮＡのプローブ（ＭＢ’ｈ”−Ｍａｃ）により再スクリーニングした。７個の陽性の内３個がＭＢＴ、”−Ｍａｃについて陽性であり、そしてこれら３個の内２個は相互に交差ハイブリダイズした。

交差ハイブリダイズするプローブの１つをＴＴＩＩと命名し、そしてさらに研究するために選択した。ＴＴ１１ｃＤＮＡクローンをニックトランスレーションによりラベルし、そして次のｍＲＮＡのパネルを含むナサンプロットにハイブリダイズせしめた：　ａ）Ｂａｌ１７　、Ｂ−細胞リンパ腫；　ｂ）Ｍ１０４ｅ形質細胞腫；　ｃ）３Ｔ３線維芽細胞系、　ａ）Ｐ３３８Ｄ＋。

マクロファージ系；　ｅ）２Ｂ４；　ｆ）ＥＬ−４；　ｇ）ＢＷ５１４７　、すべては標準的方法により調製されたポリＡ１細胞質ＲＮＡである。２Ｂ４について約１．８　ｋｂに単一バンドが観察され。他方ＥＬ−４について２個のバンド、すなわちＥＬ−４レーン中１．８　ｋｈにおける一層弱いバンド及び１．３　ｋｂにおける第２バンドが観察された。

ＴＴＩＩの配列をコードする遺伝子が組み替えの結果としてであることを証明するため、異るマウス系の肝臓からのゲノムＤＮＡ、種々のＴ−細胞系及びＢ−細胞リンパ腫ＬＩＯＡのバイブリドを、ａ）　Ｈｉｎｄ　ｍ；　ｂ）Ｅｃｏ　ＲＶ：　ｃ）　Ｘｂａｌ；　ｄ）旦ＬＬＩ［で消化し、そして０．７％アガロースを通して電気泳動し、ニトロセルロース上にプロットし、そして標準的方法によりＴＴｌｌの５′半分からのプローブ（Ｅｃｏ　Ｒ１−ｌ９ＲＶ　、第３図）にハイブリダイズせしめた。ＦＮＩ及びＦＮＩ３と命名される２つのレーンはＢＡＬＢ／ｃＸ　Ｃ５７Ｂ／６系マウス由来のＫＬＨ反応性Ｔ８ハイブリドーマ及びＡＫＲ系胸腺系ＢＷ５１４７からのものであった。ｆＩｊＬＤＮＡに対してＦＮＩのＨｉｎｄｎ［消化物中に親バンドが現われ、他方ＡＫＲ肝臓ＤＮＡのＥｃｏＲＶ消化物中の１つのバンドがＢＷ５１４７中で消失し、そして旦ｃｏ　Ｒ１消化物は親肝臓ＤＮＡに対してＢＷ５１４７中に現われる親バンドを示す。Ｃ５７Ｂ／６　ＤＮＡのＸｂａｌ消化物について多形性である２つのバンドが観察される。これらのバンドの両者がＦＮＩバイブリド中に存在し、しかしＦＮＩ３中には１個のみが存在し、これは単に染色体の組み替え又は部分的欠失の結果かもしれない。親に対するＦＮＩ中の新バンドが狂１１消化物中に観察される。

１つの消化物は、すべてのＴ−細胞ＤＮＡ中の組み替えの証拠を示さないが、ＴＴＩＩがＴ−細胞レセプター様遺伝子であることを信するのに十分なそのような事象徴候が存在する。

マキサム及ヒジルバート、メンズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　ｍ、）（１９８０）６５：４９９　５６０の方法により、第３図に示すストラテジーを用いてＴＴ１１ｃＤＮＡクローンを部分配列決定し、そして配列を第３図に示した。クローンは３′−末端においてポリＡのストレッチ（約１５０ｎ　ｔ）により方向付けられ、そして５′側半分の配列決定が最初の１２ｎｔ内に開始コドン（ＡＴＧ）を伴う８１０ｎｔの長いオーブンリーディングフレームを示した。この配列は、ちょうどＴ−細胞リセプターβ−７６２のＨＤＳ４クローンがそうであるように、Ｉｇ　リーダーに類似する領域、可変領域、連結（Ｊ）領域、及び不変領域を示した。

この配列の特徴は、不変領域中の推定上のドメイン内システィン（後者の２種のＴ−細胞特異的遺伝子に共通）の外側の余分のシスティン、前記領域に続＜トランスメンプラン領域及び細胞質領域であり、これらのすべてはβ−鎖遺伝子中の分離されたエクソンとしてコードされる。異るβ−鎖配列中に見出される４個又は５個と同様に、４個の可能性あるＮ−リンクグリコジル化部位が存在する。はとんどのカルボキシ末端部位はトランスメンプラン領域に埋め込まれるので、これらの４個の可能性ある部位の内３個のみがグリコジル化のために利用可能のようである。

Ｔ−細胞レセプターα−サブユニットのプロセッシングの正確な位置は確定されていないが、免疫グロブリンタイプに対する類推により、第３図に示す＋１のグルタミンのすぐ前であろう。他方、ＲＥＸ　Ｔ−細胞からのヒトβ−鎖のＮ−末端アミノ酸配列〔アクト等、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・オプ・ザ・ユナイテッド・ステイク（Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）（１９８４）　８１：３８５１−３８５５に基いて、プロセシング点は＋３のアスパラギンのすぐ前かもしれない。第１の場所においては、分子量２７．８ｋｄであっ゛て、これはアリソン等により観察された分子量と一致する（彼らは、エンドＦと共にＮ−リンク糖が除去されたネズミα−鎖から２７ｋｄの分子量を得た）。

１ｇ対応物のＶ及びＣ領域との全体的相同性は相対的に低い（１０〜２６％）。

しかしながら、５種類の既知のＩｇ様遺伝子中に見出される保存された残基の多くが、特に■領域及びＪ領域要素中に存在する。ＴＴＩＩ可変領域中のシスティンの間隔は６５アミノ酸であり、これはライトさのそれと同一であり、そして残基３５で始まる配列“ＷＹＲＱ”及び残基８３−９１における“ＤＳＡ　−Ｙ− ＣＡＶ”もほとんどのＩ−、Ｇ−、及びＴ−細胞レセブタ−■領域にといて高度に保存される。α−鎖及びＨＤＳ４、はとんどの高度に保存された部分中Ｊ　Ｉｆ、ｐ域のように、βネ等、前掲）と同じ９／１６゜ＴＴＩＩはトランスメンプラン領域にＴ−細胞レセプター配列に特異的な配列“ＩＬＬＬＫ”を有し、免疫グロブリンスーパーファミリーの他の構成員中には荷電アミノ酸（リジン又はアルギニン）の保存は一般的ではなくそして見出されない。

確立されてはいないが、α−サブユニット中にＤＳＩ域が存在するという強い支持が存在するようである。特に、Ｊ領域の“ＳＧＮ“アミノ酸配列のすぐ５′　（β遺伝子コンプレックス中のＪア３の５′境界を標示する）に、ヌクルオヂド配列“ＧＧＧＧ”が存在する。これはβ−サブユニットの遺伝子り領域に特徴的であり、１４の内７はそれらの３′側の３−７Ｇ間の列を含む〔トネガワ、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９８３）３０２：５７５−５８１　）。前に記載したナサンプロットデータもＤ領域の存在を支持する。ＥＬ−４レーン中に明瞭に見られそして他のＴＨ系中に観察される２つのバンドは、ＶＤＪＣ転写物〔カバレル等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９８４）皿４２１−４２３）より３００ｎ　を短いα−鎖のＤＪＣ転写物に特徴的である。

α−及びβ−サブユニットのｍＲＮＡの比率を確立するため、胸腺細胞、ｃｏｎＡ　（コンカナバリンＡ）で刺激された肺臓及び２Ｂ４ｃＤＮＡライブラリーを、ＴＴＩＩ、ＨＤＳ４及びＧβプローブより試験した。ＴＴＩＩ及びＣＴβはそれぞれ２Ｂ４及びｃｏｎＡＨ１ｉ！！臓ライブラリー中に非常によく似た頻度１：１〜１：３で存在するが、ＨＤＳ４は非常にまれである。未成熟Ｔ−細胞対成熟Ｔ−細胞におけるＴＴＩＩ　：α−鎖の比率の実質的な変化が観察され、Ｂ− 細胞においてライト鎖免疫グロブリンの発現がヘビー鎖のそれに続くのと同様に、ＴＴＩＩ遺伝子の発現がα−鎖の発現の後に生ずることが示唆された。

上記の結果から、Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニ−／　）及びその断片の発現をもたらす新規なりＮＡ配列及び造成物が提供されることが明らかである。このＤ　Ｎ　Ａ配列は、表面膜蛋白質として保持され得るバイブリド蛋白質を製造するための種々の方法において使用することができ、リンパ球の由来又はタイプを決定するため、Ｔ−細胞からＤＮＡ配列を単離するため、Ｔ−細胞レセプターサブユニットをコードするＤＮＡ配列を製造するためのプライマーとして使用するため、又は哺乳動物宿主からの外来性蛋白質の分泌のために使用するためのプローブを得るためにラベルすることができる。ペプチドは、Ｔ−細胞抗原レセプターの単離のため、細胞混合物からのＴ−細胞の除去のため、又はＴ−細胞にインービボ又はイン−ヒドロで細胞してそれらの生存性、増殖、因子の分泌等に影響を与えるための抗体を製造するために使用することができる。

前記の発明は理解を明確にする目的で説明及び例により幾分詳細に記載されたが、添付された請求の範囲内において幾つかの変化及び変法を実施することができることは自明であろう。

浄書（内容に変更なし）＝　口　＝　含　ｌ−１−）−）− 一一一一ロ　ロ　Φ　Σ　［Ｆ］　１　ψ　のＣＯ０３０３）＋　中　１）　ロ　ψ 手続補正書（方式）昭和６１年６月！；　臼特許庁長官　宇　賀　道　部　殿１　事件の表示ｐａｒ／ｖｓ８５１００３６７２　発明の名称Ｔ−細胞レセプターー抗原特異的ポリペプチド及び関連ポリヌクレオチド３　補正をする者事件との関係　特許出願人名称　ザ　ボード　オブ　トラスティーズオプ　ザ　リーランド　スタン７オードジユニア　ユニバーシティ４代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（外４名）６　補正の対象図面の翻訳文７　補正の内容図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８　添付書類の目録浄書した図面の翻訳文　１通 ″Ｎ′に□”’ＰＣＴ／ＵＳ８Ｓ１００３６７

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｔ−細胞抗原レセプターの少なくとも１つの断片をコードする約５０ｎｔ〜２ｋｎｔのｃＤＮＡ配列。
２．Ｔ−細胞抗原レセプター又はその断片をコードする約２０ｋｎｔ以下のＤＮＡ配列。
３．前記コードがα−サブユニットのためのものである請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。
４．前記コードがβ−サブユニットのためのものである請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。
５．非野性タイプＤＮＡに連結されており、微生物により露識される複製系を含むハイプリドＤＮＡを形成する請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。
６．検出可能なシグナルをもたらすためにラベルされている請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列。
７．少なくとも１５ｎｔのそしてＴ−細胞抗原レセプターサブユニットの不変領域の少なくとも部分をコードするＤＮＡ配列。
８．前記サブユニットがα−サブユニットである請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配列。
９．前記サブユニットがβ−サブユニットである請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列。
１０．非野性タイプＤＮＡに結合した請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列。
１１．前記不変領域コードＤＮＡ及び前記非野性タイプＤＮＡがＪ領域をコードする配列により分離されている請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ配列。
１２．Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットの少なくとも１つの特異的ドメインをコードする約１５〜２０００ｎｔのｃＤＮＡ配列。
１３．発現のための転写及び翻訳制御シグナルに連結された請求の範囲第１２項記載のｃＤＨＡ配列。
１４．請求の範囲１２項記載のｃｎＮＡ配列及び選択のためのマーカーを含む、原核性宿主中でのクローニングのためのクローニングベクター。
１５．転写及び翻訳シグナル並びにこのシグナルの転写及び翻訳制御のもとにある請求の範囲第１２項記載のｃＤＮＡを含む発現ベクター。
１６．第２図中の８６Ｔｌの配列中に存在しそして非野性タイプＤＮＡに連結されている少なくとも約１５ｎｔのＤＮＡ配列。
１７．第３図中のＴＴｌｌの配列中に存在しそして非野性タイプＤＮＡに連結されている少なくとも約１５ｎｔのＤＮＡ配列。
１８．Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットの少なくとも部分をコードするｃＤＮＡを得る方法であって；Ｔ−細胞から膜結合ポリＡ＋ＲＮＡを単離し；この膜結合ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し；′このｃＤＮＡＢ−細胞からのメッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズせしめ；ハイプリドデュプレックスｃＤＮＡ／ＲＮＡから単鎖ｃＤＮＡを分離し；この単鎖ｃＤＮＡをクローン化してＴ−細胞特異的ｃＤＮＡを得；このクローン化されたＴ−細胞特異的ｃＤＮＡをゲノム性Ｔ−細胞ＤＮＡ及びゲノム性非Ｔ− 細胞ＤＮＡの制限断片とハイプリダイズせしめ；そしてＴ−細胞断片とハイプリダイズするが非Ｔ−細胞断片とはハイブリダイズしないクローン化ＣＤＮＡを単離する；ことを含んで成る方法。
１９．Ｔ−細胞抗原レセプターサブユニットの少なくとも部分をコードするｃＤＮＡを得る方法であって；第１のＴ−ヘルパー細胞からのポリＡ＋細胞質性ｍＲＮＡからランダムプライムｃＤＮＡを調製し；該ｃＤＮＡを約３００〜４００ｎｔの平均サイズに断片化し；少なくとも２種類のＴ−ヘルパー細胞又はＴ−ヘルパー様細胞からのｍＲＮＡとの削減ハイブリダイゼーションを行ってＴ−細胞レセプター可変領域ＤＮＡについて濃縮されたプローブ混合物を得る；そしてこのプローブ混合物を前記第１Ｔ−ヘルパー細胞から作られたｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズせしめ、ハイプリダイズするクローンを推定上のＴ−ヘルパー細胞受容体サブユニット遺伝子として遜択する；ことを含んで成る方法。