JPS61500947A

JPS61500947A - 非放射性プロ−ブおよび所定のヌクレオチド配列の特性決定方法および該非放射性プロ−ブの製造手段

Info

Publication number: JPS61500947A
Application number: JP59504392A
Authority: JP
Inventors: アヴラメア，ストラテイス; ダンシン，アントワーヌ; テルニンク，テレーズ; トランカール，フランソワ
Original assignee: アンステイテユ・パストウ−ル; サントル・ナシオナル・ドウ・ラ・ルシエルシユ・シアンテイフイク
Priority date: 1983-11-24
Filing date: 1984-11-23
Publication date: 1986-05-15
Also published as: FR2555606A1; FR2555606B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】非放射性プローブおよび所定のヌクレオチド配列の特性決定方法および該非放射性プローブの製造手段本発明は、非放射性に標識された新規な特異的プローブ、および核酸（ＤＮＡ＝ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）をベースとする組成物中の所定のヌクレオチド配列の存在をハイブリダイゼーションによって検出し、場合によってはその特性を決定するための方法に係る。この非放射性標識プローブはそれ自体、前記配列に対して相補的でかつ検出すべき前記所定のヌクレオチド配列と適切な条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含有する。

ぼた本発明は前記のような非放射性プローブを製造するための方法と手段にも係る。最後に本発明は多くの分野での前記新規な非放射性プローブの応用に係る。

これらの応用では一般ｆこ全て共通に、生物試料からそれに含まれている核酸を単難し、これらの核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは同時にこれら２種）の中に所定のヌクレオチド配列が存在するか否かを本発明のプローブ中に含まれる相補配列とのハイブリダイゼーションによって検出あれ、有効なハイブリダイゼーション実験でＤＮＡ　ＤＮＡ：たはＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリソー〇探知に今日なお最もよく梗われている特異的ＤＮＡプローブはアイソトープで標識されており、オートラジオグラフィーを用いて検出される。

オートラジオグラフィーによるハイブリッｒの検出の主な欠点は、放射活性生成物を操作する実験者が被曝する危険があること１分解能が低いこと１位置決定（ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）が不正やｉであること、フィルム露出時間が長いこと（数時間から数週間）、および放射性壊変のためにプローブが不安定であることである。

この難点を解消するために放射性標識の代わりに別の標識法を用いることが既に提案されている。特に、１９７８年４月１３日付で出願されたフランス特許第７８１０９７５号中に初め？記載された技術が注目される。

上で引用した特許に記載されている。核酸の混み入った試料を、必要に応じ研究する俵酸を予じめ変性した後、探究する核するプローブに接触させることによって、前記試料中の核酸特に遺伝子の所定の配列ヱたは断片さらには前記核酸全体を、存在する場合には検出し、または特性決定する方法の特徴は、使用するプローブが、好ましくはハイブリダイゼーション反応の後で、酵素に結合することによって、または酵素と結合するようにざヒ学修飾されたプローブであり請求める根板の配列またはは核酸とから形成されたハイブリッド生成物のその後の酵素基質に対する作用によって具現化され得るということである。

この酵素は発色性基質に対する作用能力に応じて選択すると有利である。これにより、光学的またはその勧類似の分析で基質の転換率を定量することが可能？こなる。この場合、この率は探究する核酸配列ヱたは核酸が最初の試料中に存在しているか否かに相関している。

前記特許の発明の好ましい実施態様においては、プローブは酵素とまたはそれ自体がこの酵素に安定に粘合している分子と安定な複合体を形成し得る化学基で修飾されている。前記の化学基と前記の分子がそれぞれビオチンとアビジンであるか＝たはその逆であり、酵素自体はたとえばベーターガラクトシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ。

ペルオキシダーゼでちると有利でろる。

ハイブリダイズしｔプローブの検出または「具現化」には酵素とは別の手段、たとえば螢光抗体法を用いることかでざる。

ハイブリダイズしたプローブと、上に掲げた方法で使用される酵素またはこれとは異なる別の具現化手段との間で生起する結合は、直棒に（たとえばビオチン− アビジン反応または抗原−抗体反応を介して）、または間接に、たとえば以下の一連の反応で達成することができる。すなわち、まず第一にノ・ブテン基を有する・・イブリダイズしたプローブを抗−ノ１ブテン抗体と接触させ、次に、こうして抗−ノ・ブテン抗体を保持しているノ・イブリダイズしたプローブと、非放射性技術のうち上記仁ｆ−１７免疫グロブリンまたはこの免疫グロブリンに対して抗する別のについて詳述する必要はない。これら技術は周知である。必要であれは、これらの技術について記載しているヨーロッパ特許出願第００６３８６９ −Ａ３号も参照されたい。

しかし、このヨーロラー？特許出願は、他の特徴の間で、非放射性核酸プローブの標識可能性の領域も拡張し、い（つかの塩基が置換基を有する核酸のプローブについて記載していることにも注意すべきでちる。これらの置換基はこの特許出願の情報によると炭素原子を少なくとも３個、好ましくは炭素原子を少なくとも５個含有しなければならず、これらの基はこれらに対して高い親和性を示す分子特にポリペプチドによって検出することができるものの内から選択される。この場合プローブは、これに含まわるヌクレオチド断片に相補的なリボ核酸配列ヱたはデオキシリボ核酸と二重らせん型の二本鎖（小］ｐｌｅｘ）を形成する。

上に記載した技術は、２つとも非放射性ブローブーまた；は以後用語の便宜上（放射性アイントープで喋誠されたプローブを指す「ホットプローブ」に対立させて）「コールドプローブ」とする−を使用してお９．これを使用する実験者の最大限の安全性のレベルだけからみて「ホットプローブ」に対する重大な利点を有している。しかし、依然としてこちらのプローブの有効性と感度を同時に上げるために改良する必要性が残されている。

さらに、問題にしているプローブのいわゆる標識の実現が複雑であると共に費用がかかるという特徴にも注意すべざで６る−すなわち、まず、前記特許に記載の条件下で修飾ヌクレオチドを合成するという必要性、次に、ポリメラーゼを使用する一方の鎖の限定された開裂と修復を実施する技術（いわ９る「ニックトランスレーション」の技術）Ｋよって、前記修飾ヌクレオチｒたとえばビオチニル− ヌクレオチドを標識すべき核酸二本鎖中にインビトロで組み込むことである。

また前記のヨーロッ、ｅ特許出願では、末端にボＩＪ　−Ａを有する鋳型（”　ｔｅｍｐｌａｔｅ″）の存在下でＲＮＡリガーゼを存在させて。

予しめ得られた修飾ヌクレオチドたとえばビオチニル−ｄｔ、７ＴＰを重合させることも提案されている。

したがって本発明は以下の目標に応答するコール−プローブを提供することを目的とする。

−これらプローブ：；核酸と容易にハイブリダイズしなければならない。

−いくつかのヌクレオチド塩基の１６飾は、これらのプローブが相補核酸骨格とハイブリダイズし得る１まであるように最小限にしなげればならない。

−この方法の感度は放射性プローブを用いて得られたものと少な（とも同じでなければならない。

また不発明は、前記プローブよｆｃはよジ一般的には標識ＤＮＡを迅速にしかも比べ的安上りに得ることを可能にする製造手段および技術５：目的としている。

一般に、ハイブリダイゼーションによってヌクレオチドの所定の配列を慌出す６ための本発明のコールドプローブはそれ自体、ヌクレオチドの前記配列の相補配列を含む挿入萄を含有しており、その核酸を構成する種類のヌクレオチＰの少な（とも１種の塩基の少なくとも一部が、ポリメラーゼによって認識され得かつ炭素原子を多くとも２個有する基を含肩している修飾塩基で置き換えられていることを特徴としている。この基がハロゲンを少なくとも１個有しているかまたはハロゲンによって構成されていると好ヱしい。

一般に、前記の条件に応答し、かつこのように修飾された核酸が天然の相補核酸かぼたは類似の修飾塩基を含有する相補核酸とワトンンークリック対を形成する能力の庫ＩＦとならない全ての修飾塩基を使用することがでざる。

修飾塩基は天然ヌクレオチド塩基から誘導されたものが好デしい。その修飾は、ピリミジン塩基に関しては５位、デアザプリンまたはプリン塩基では７位もしくは８位または同時にこれら２つの位置での、前記基による置換である。

好ましいプローブは、修飾ヌクレオシドが５−ハロデノーウリジンヱたは５−ハロデノーデオキシーウリジン残基であるものであり、さらに特定的には、修飾塩基が５−ブロモ−ウリジンまたは５−プロモーデオキシ−ウリジン残基であるものである。本発明の範囲内で使用し得る別の好ましいグループにはヨウ素もしくはフッ素またはＣＦｘ基で置換された対応する銹導体がある。

本発明のコールドプローブは、ハイブリダイゼーション後。

抗体、好ましくは修飾塩基に対して選択的に抗するモノクローナル抗体によって後刻検出することができ、インビトロ技術、たとえばヨーロツ、ｅ特許出願第００６３８７９号に開示のものに類似する技術を用いて前記修飾塩基、を二本鎖ＤＮＡ中に組与込むときにも、ある置換率を以ってその天然の塩基の１種を対応する修飾塩基で置換できるという顕著な利点を有し、しかもこれらのプローブが天然の相補的ヌクレオチド配列と〕・イブリダイズする（特に温度Ｔｍの低下によって評価される）能力には何ら影響を与えることはない。このようなことは今日まで実現できなかったものである。

別々に修飾された各々の塩基−その製造は時としである場合には従来技術によりプローブの場合よりも困難であるかもしれないが、いつもそうというわけではない−を用いる抗原−抗体反応のレベルにおりる選択性は、得られるプローブの相補ＤＮＡとハイブリダイズする能力を最終的にほとんど損なうことなく、実現し得る天然塩基を修飾塩基で置換した高い置換率さらにはほとんど全部の置換によって、大ぎくという程度以上に償わトている。

上に定義したような挿入物を含有する本発明のプローブの１群はまた次の構造で定義することができる。

ンまたはピリミジン残基を表わし、これら残基ｆ３　、　ｇ′、　Ｂｌはその適正な位置Ｎ１で、対応する糖残基の０１位と共有結合的に結合しており。

−ＡはＢ、Ｂ’、Ｂ“・・・・・の修飾基を表わし、場合シ′こ応じて、多（とも２個の炭素原子を含み、好ましく：２さらに・・ロゲン化されている薯換基から成り、この基Ａは含蓋素塩基の複素環に、Ｂ、Ｂ’、Ｂ“・・・一つ≦ピリミジン残基である場合には５位で、Ｂ、Ｂ’、Ｂ“・・・がデアザプリンまたはプリン残基である場合には７位、もしくは８位、デたば（同時にこれら２つの位置で、直接結合して２す、−２は−Ｈ型たは−ＯＨを表わし。

−ｍとｎはそｒ、ぞれＯ〜ｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ　の整数を表わし。

−ｐは１〜７５，０００の整数である。

ただし、和ｒｒｒ　十ｎ　＋　ｐは少なくとも２に等しく、好ましくは少なくとも　１００に等しい。

上記で１−挿入物」という表現は、コールドプローブの他の構成部分に対して異種すなわち外来起源の核酸配列を意味するものとは必らずしも理解されない。挿入物とその他の構成部分は同じ起源に由来することができるしまたは率−の同じ核酸から欝導されることができる。たとえば、過当なベクター中でクローンし、次いでこｎをたとえば、問題とするＤＮＡ＠片内のいずれの切、ｒｒ部位にも対応しない制限隙素によって切除した断片全体からプローブを構成する場合かめる。しかし多くの場合に同じではなく特に、と９わけそして明らかなことであるが挿入物が真核生物に由来する場合、この挿入物を含有する組換えプラスミＰもしくはコスミＦまたに組換えファージＤＮＡで実際にプローブを構成するときはいつも、同じでほない。

上記の条件でプローブの塩基の少なくとも１個を修飾してもプローブ全体には影響がないということにも注意されたい。修飾姉は挿入物自体にあってもよく、またはプローブの他の部分ＶＣあってもよい。これは、修飾塩基を有する断片とこｎとは別の、対応する塩基が修飾されていない断片との間のインビトロ遺伝子組換えによってプローブをつくるときはいつもそうでろろう。さらに本発明による修飾は、プローブの１方の末端または対向する両末端に集中していてもよく、特にこの末端（または両末端）が適当なＲＮＡ−リガーゼ只たはターミナル−トランスフェラーゼによってこの（またはこれらの）末端に固定されたポＩＪ　Ａ− ポ’ＪＵのような１つまたは２つの二本鎖を有するときがあり、この場合ボＩＪ　Ａ鎖であれポＩＪ　Ｕ鎖であれその塩基を上記のように修飾することができる。

本発明の好ましいコールドプローブの内には、使用する修飾塩基が微生物のゲノムＤＮＡ中に生物学的に取り込まれ得るものから選択されているものがある。

この点本発明は何人かの著者らによって既に確かめられている事実を有利に利用する。それによると、デオキシプロモーウリジン（ＨｒｄＵｄ　）はチミジンの代わりに真残細胞ＤＮＡ中に取り込まれ得る〔ラット（Ｌａｔｔ、）　、　−ｓ：一エヌアーエス　ニー、ニス。

（ＰＮＡＳ　Ｕ、Ｓ、）　、第７０巻、第３３９５頁（１９７４年）〕。一方、たとえばハロゲン化塩基（５−プロモークラシル）はチミ／の代わりに細菌ＤＮＡ中に取り込まれ得〔ツアーメンホ７（ＺＡ−ＭＥＮＨＯＦ）およびグリボッ（ＧＲＩＢＯＦＦ）、４イチヤー（Ｎａ　ｔｕｒｅ　）　＊１９５４年〕、また取り込む収率が大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のチミン依存性株を用いることによって改良された〔／・ケラト（ＨＡＣＫＥＴＴ　）ら、パイオケム、　バイオフイズ、　アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

入ｃｔａ、）　＋第１２３巻、（１９６６年）、第３５６〜３６３頁〕　ことが既に記載されている。臭素化塩基を認識する抗体の製造につの複製を確めてお９〔グラツノナー（ＧＲＡＴＺＮＥＲ）ら、エクスプ。

セル、　リス、　（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ、　ｅａｓ、）　、　５ｍ９５巻、第８８頁（１９７５年）〕、また同様にモノクローナル抗体を用いている〔アシュ、ジエー　グラツツナー　（ＨｌＧ　ＧＲＡＴＺＮＥＲ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　。

第２１８巻、１９８２年〕。

しかしこれらの技術では得られたＢ、（ｌＪｄを取り込んでいる倣生物株は一般に安定ではないことが確かめられた。こちらの目的とした応用では安定であることは他の理由から必要ではなかったのである。

核酸を構成している種類のヌクレオチドの少なくとも１個が、ポリメラーゼによって認識され得かつ多くとも２個の炭素原子を有する基を含有している修飾塩基で置き換えられているコールドプローブの場合には、こちらの炭素原子を通人２涸有する基がほとんど常に存在する、いい換えれば修飾塩基が多くとも２個の炭素原子を肩する基をもっていないことはないことが特に好ましい。

したがって、この基が少なくとも１個の／・ロデンを有しているかまたはハロゲン１個マ゛構成されている好ましい場合には、を構成する通常の種類のヌクレオチドの１個と置き換えられる）修飾塩基がコールドプローブ中にほとんどないのが好ましい。

たとえば、チミンの少なくとも一部が５−ノ翫ロデノーウラシル残基で置き換えられているプローブの場合、こちらのプローブが遊離のウラシル残基をほとんどもたないのが好ヱしい。さらに、これらのプローブがピリミジン残基の５位間に形成されたＣ−Ｃ架橋によって互いに連結したピリミジン残基をほとんどもたないのが好ましい。ＤＮＡ中の上記の基の存在の検ａｖｃついてさらに詳細Ｖこは　に発行されたアー、ワツカー（Ａ、ＷＡＣＫＥＲ）の「モレキュラーＩメカニズムスオブ　ラジエーション　エフエクツ（”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｒｎｓ　ｏｆｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ”　）Ｊ　と題する章を参照されたい。これらの基が少なくとも実質的な割合で存在することが、本発明のプローブの通用を考えているハイブリダイゼーションテストの再現性を極めて大きく変化させる。一般に、本発明のプローブまたくこｎを含Ｃ組成物力）光分解産物を金工ないのが望ましい。

この理由で光の遮断下、よ！ｌｌ特定的には約４００ナノメーター未溝の波長含有する放射線の遣ｄｒ下にプローブを維持するのが好ましい。

本発明のプローブは凍結乾燥状態で、しｔ−し好ましくは４００ナノメ一ター未満の波長を吸収する材料ででき九フラスコまたは容器内に保存することができる。また本発明のプローブは溶液状態で、たとえば上記条件に応答する容器中、ヱたはこの溶液自体が４００ｎｍ未、情の波長を吸収する不活性染料を含有している場合には壁が吸収性でない容器内に保存することもできる。

本発明はまた。上記種類のプローブを微生物、荷に細菌、さ本発明のプローブが微生物を転換し得かつ上記挿入物を含有する組換えＤＮＡまたはベクターＤ　Ｎ　Ａ　、たとえはプラスミド。

コスミドまたば７アージＤＮＡから誘導される場合、二つプローブを製造する本発明方法の特徴は、予じめこの組換えＤＮＡで形質転換した微生物を、対応する天然塩基の代わりに修飾塩基を含有する培地を用いて培養しかつ維持し、その後組換ＤＮＡまたはベクターＤＮＡを回収することである。前記修飾塩基は遊離状態であれ結合状態でわれ、前記塩基に対応するヌクレオシｒまたはヌクレオチド中にある。

上記操作全体は、４００ナノメ一ター未満の波長を有する放射線を遮断して（この放射線は特に５−）・ロゲノーウラシル残基で修飾された核酸の場合ハロゲンを消失せしめる）行なうのが好ましい６ｔ＃に１本発明のプローブをインビボおよびインビトロで製造するには暗くしてまたは４００ナノメーターより長い波長を有する放射線で得成される光の下で実施する。プローブの製造に用いようとする核酸（挿入物）を有するベクターで形質転換した宿主と、宿主とベクターに対して非毒性でかつ４００ナノメーター未＜７４の波長を吸収する不活性染料とを培地中に入れると、使用すべき光の性答に関する前記要件による拘束から免れることができる手段となるまたとえば、黄色エオシンで培地に薄い色がつけられよう。例を挙げると、培地中の最終濃度がＯ，Ｏｔ％（重量／ｇｉ）になるようにエオシン浴液を使用することができる。

核酸、特に遺伝子工学の技術によって予じめ微生物中に導入された前記組換えＤＮＡ＞よびベクターＤＮＡ、の内部に含まれる塩基の少なくとも１個を上に特定したような対応の修飾塩基によってインビボでｒｉ換する最初に夏用する双生物は突然変異を起こさせた細菌、好まし−菌株はたとえばプラスミ）−″（他の全てのベクター特にウィルスも使用することができるはずでらる）または外来ＤＮＡで形質転換することによって受け入れることができな（ケ？’Ｅ−ばならない。すなわち、本質的に「制限−」でなけｎばならない。

−菌体は通常の塩基に類似する塩基を高レベルで取り込むことができなければならない。したがって、生化学的または遺伝子的手段によって、通常の塩基の同化作用が弱められているかまたは欠損されて２ジ、またヌクレオチド（通常、異常またはアナログ）の異化作用が弱められているかぼたは欠損されていなげればならない。

−菌株は安定でなければならず、この菌株に導入されたベクターも同様でなければならない。またベクターは、天然塩基の増幅でざる。

「制限−」（制限マイナス）とい５形質は本発明の好ヱしい方法に直接１更用するために必須である。直接夏用と′ハうこと：ま自身が制限＝（制限マイナス）でろる中間菌体を予じめ通ることがないということを意味す机この形質によっである注の外米残飯を微生答中ＶＣ４人し維持することが可能（てなる。この形質がないと、微生物内に入った修飾ベクターは％１」限酵素ですぐに加水分解されてしまうであろう。こ几ら酵素の微生物中での特定の役割は（教１Ｐｌ中に入って来た外来核酸を波鈑すもことである。

不発明の修飾塩基８１ンビｒ口で導入することに制限＋（５Ｔ、・ｊ限プラス）のｍＪＭ体中に行なうこともできる。た疋し、ｊ蝉埴基の導入を受けるべき挿入饗をＭするベクターの前置っての製造がそｎを可能にする範囲において、すなわち、前記ベクターが宿主へ移入する際にしろ宿主内で＊＝する闇にしろ宿主の制限系に対して感受性でない範囲においてで”ｈる。

（以下栄白）また、偕株が対応天然塩基に対する栄重發＊任にされていると好まし１，４．　Ｌかしこの栄養要求性は、杉貿転換微生物の修篩イ弐ＴｈＱ塩基を蜂り込む能力を強化し伜る突然＾異（あるいは他の生化の酵素を阻害することによシ代替し得る。

い；′：ニラリジン導体で−ｆｂ−９−％　５位において２つまπパの炭素原子と好ましくはハロゲン原子を有する基によシ置換されているものであ！７％微生物は好ましくはチミンあるいは対応するヌクレオシドあるいはヌクレオチドに対する栄養要求性を有する。さらに格別には、ウラシルあるいはウリジンの誘導体はへロデノーウラシルあるいはハロゲノ−ウリジンであり、好ましくはプロモーウラシルあるいはブロモ−ウリジンである。

後者の場合使用微生ｖｌＪは、チミジル酸シンターゼの制御下の内因性チミン合成をコードした遺伝子の少くともいくつかに影響する突然変異、特にｔｈ７Ａ遺伝子座丙つＴ濱°、ｆ異を有してい（ＭＩＬＬＥＲ）他により記載された方法（ ”エクスペリメンツイン　モレキュラー　−ノエネテイフス［”　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｈｔ＋−１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ″〕、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　］　ｅ　１９７２　）　Ｋより、トリメトプリムの存在下で選択し傅るこ乙力＼’、　ｌｙ　’７ＪＣ’Ｉ”　ｉとが出来、同時にハロゲン４Ｌウリジン％にブロモ−ウリジン（ＢｒＵ　）の良好な最終取り込みを確保し得る。この選択は、パダンシン［ＵＬＬＭＡＮＮ　ＤＡＮＣＨＩＮ：１．１９８３．７ドブ、サイましくはデオキシリボースホスフェートの分解を制御する遺伝子、特にオ滅ロンｄｅｏ　（パックマン、に、Ｂ、（ＢＡＣＨＭＡＮＮ。

Ｋ、　Ｂ、　ｍｌ、　１９８０．４４　：　１−５６．マイクロバイオロジカルレビューズＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　）及びミラーＣＭ　Ｉ　ＬＬＥＲＩ　（１９７２）、時にホスホペントムターゼＥＣ２，，７，５゜６、の合成を制御する遺伝子ｄｅｏＢ、及び／又はデオキシリボースホスフエートフルドラーゼＥＣ４，１，２，４，の合成を制／−）を要求するｔｂ）ｒ　Ａ株から秀≠寺皐鴫１女低水準（ｆｉｌえは前に既に述べたよう罠、本発明に好ましい菌株は炭素源０異４ヒを殆んど行なわない突然変異体であり、これ等の突然変異体は％く、アデニルシクラーゼをコードする遺伝子座（ｃｙａ）あるいはサイクリックＡＭＰ受容体をコードする遺伝子座（ａｒｐ　）あるＡは同時にその両方に突然変異を有して３す、これによ゛り細胞内に高水準の、　−た≠ 典−＝ミマ外因性塩基の＃；ラムダフマージに対するこれらの突然変異体の既知の抵抗力を利用して選択し得る。これ等の菌株は下記のような笑験条件により選択し得る。

最初の菌株で満たされた培％物１００μノを、１０倍多す数の毒性のバクテリオファージλの存在下で、大蜘菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）に−■−−−−１−１−険 −■■■■關−榔―とって余小致死濃度の抗生物質を補元したマツコンキー　マルトース（Ｍａｃ　Ｃｏｎｋｅｙ　Ｍａｌｔｏｓｅ　）　（ミラー（ｉ）Ｉ　Ｉ　ＬＬＥＲ）　、　１９７２年）＠地全含有するぺ）　ＩＪ皿上に瓜げる。この抗生物質によって実際、アデニル酸シクラーゼ（Ｑｙａ　）またはサイクリックＡＭＰ受容体（ｃｒｐ）を欠く突然変異体の有効な選択が勇断になる〔エール、アオノ（Ｒ，ＡＯＮＯ）、エム、ヤマザキ（Ｍ−ＹＡＭＡＺＡＫＩ）＝ジエー、タムラ（Ｇ、ＴＡＭＵＲＡ）、（１９７９年）。

ジー、パクト、（Ｊ、　Ｂａ＝ｃｔ、）、第１３７壱〇第８３９〜８４５頁〕。

さらに、菌株ｃｙａまたはｃｒｐは毒性ファージλに耐性であシ（改訂、ウルマン（ＵＬＬＭＡＮＮ）およびダンシャン（ＤＡＮＣＨＩＮ）、１９８３年）　マルトースを醗酵しないのでマツコンキ（Ｍａｃ　Ｃｏｎｋｅｙ　）培地上に白色コロニーの形態でみえる。

鳥本発明の方法の好ましい実伸榛では使用する微生物はこれら突然変弄全体を同時に含有している、また上記の突然変異の他に、ホスホトランスフェラーゼ系（ホスホエノールピルビン酸グリコース依存系：ホスホトランスフエラーセ：特にｐｔｓＨ工ｅｒｒ遺伝子座に影響を与え関連する系にもまた異化抑制に関連する別の系にも影響を与える突然変異を有していると好ましいであろう（改訂ウルマンダン／ヤ／（ＵＬＬ２ＭＡＮＮ　ＤＡＮＣＨＩＮ））ｒ突然変異ｅ７ａは異化作用の抑？に大きく７与すると考えることができる。

使用するド株の好ましい、特にｌ大ｆ別の本性はそのＤＮＡの安定性であることに注意すべきである。し友がって、ＤＮＡ修復系に関与するエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子内に突然変異、たとえば大腸菌（ ’Ｅ−ｃｏｌｉ　）同のｒｅｅ　Ｂもしくはｙｅｃ　Ｃ型または同時にこれら２つの突然変異（エキソヌクレアーゼＶ）を有する菌株を選択する必要がある。エキソヌクレアーゼと共にエンドヌクレアーゼに影響する別の突然変異、ならびｋたとえは複製レベルでの読み取りエラーの修正系（ＳＯ８系）も上記菌株中にみられる突然変異の代わり４　ｆｃはそれに加えて用いることができる。

文献に記載されている突然変異または上記に示した突然変異（またはこの技術の専門的実験者が及；範囲内の他の突然に異）に関し、前記突然変異を起こさせ得る種々の操作はもちろん何家は、選択して使用する最初の菌株の性質に応じて、実施すべき連続した選択操作の最も好ましい順序について必要とされる選定をなすことができる、舟に形質転換されるときの効率とＤＮＡの制限系が存在しないこととが知られて論る次の菌株を最初の菌株として用いる場合、以下の条件で処理すると有利である。すなわちＣ６００ＳＦ８株〔セーアー、シュドルール（ＣＡ、５ＴＲＵＨＬ）、ジ−エール、カメロン（ＪＲ，ＣＡＭＥＲＯＮ）、エールドウブルベ、ダビ（ＲＷ、ＤＡＶＩＳ　）、（１９７６年）、ペーエヌアーエス（ＰＮＡＳ）。

リナム（ＭＥＣＩＬＬＩＮＡＭ）”（４μｇ／−）及びマルトース（１容量％）の存在下で前記した条件において選択操作にかけ上に白色のコロニーを形成して出現する。それに対してその絞眸中にマルトースを消費するコロニーＪ白色である。

ｃｙａ突然変異を有するクローンＴＰ　６００２は安定であり、況カ存在下での選択（ミラーＣＭＩＬＬＥＲ１，１９７２により記載された方法による。）により、チミンに対して栄養要求性を有する突然変異体（ｔｈｙ　Ａ　）を単離し、安定な菌株ＴＰ　６０３０を得とが出来、また同時に最大で１μＩ／−の水準１でチミンを徐々〈減少させた培地中のこの菌株の培養くよジＢｒＵの良好な最定性によりクローンＴＰ　６０３３を以下使用した。

該菌株の他の本質的な特徴はそのＤＮＡの安定性であること菌株中に存在するｒｅｃ　Ｂ　ｒｅｃ　Ｃ（エキソヌクレアーゼＶ）突然変異の存在、及び異化作用に影響する突然変異（特Ｋ　ｃｙａ　）の存在によるものである。

最終的に得られる肉扶は　Ａｗ＋”　、ニー、−７，、、、−景係のジメチルスルホキシド、最終濃度が０１重量％のマン斗−ル、及び任意に牛血腹由来のヌーパーオチサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）を伽適礒−−−１番虫に２μＩ／ゴ（あるいは３０００ン　−　ｍ　−、、’Ｉ４．つ邪でゝ゛−＝つ不発明のコールドプローブのλ法は又、少ｌくとも１部が対応の修飾塩基で脣僕されているのはチミンではなく異なる塩基明方法の応用は、培養細胞中でのりポヌクレ万テドとデ万キシヌクレオシドの場合にはそうではない。関連塩基も対応塩基のレイルで修飾されている場合には、リボヌクレオチドとデオキ分しかけれはならない、例えば、リボヌクレオシドニリン酸リダクターゼのコード遺伝子（ＥＣ１−１７，４，１，）、特にｎｒｄ　Ａ及びｎｒｄ　Ｂ遺伝子座（上記リパツクマン（ＢＡＣＨＭＡＮＮ）参照）のレベルで突然変異を行うことによりこの区分は可能となる。そのため、得られた突然ＫＡ株はデオキシリボヌクレオシ７８表昭６１−５００９４７　（１Ｑ）ドに対して栄養安来性である。

インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）でのプローブの製造について前記したウラシル以外の修飾塩基の例として、５−ブロモシトシン。

８−ブロモグアニン及び８−ブロモアデニンを挙げることができる。

又、使用する微生物は既に言及したと同様の突然変異を示すであろう、他の突然変異も同僚の雨月性と同様の必要性を有してＷト不発明の好ましい標識プローブの製造方法は、検出すべき所定のヌクレオチド配列に相補的な挿入物を含有するＤＮＡベクターをインビボ（ｉｎ　ｖｔｖｏ　）で化学的に修飾し、同時にプローブいるＤＮＡ組換え体による形質転換方法は、文献例えばマニーアチス（Δ４ＡＮＩＡＴＩＳ）らの「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）　Ｊに記載のものと同じである。

利であり、培養は好ズしくは少なくとも４世代の間できｎはそれ以上維持する。

培養の終９に採取した微生物中で１鴨さｎたプローブはそれ自身公知の全ての方法で楕製しうる。ビルンボイム、エイチ。

シー、（ＢＩＲＮＢＯＩＭ、Ｈ，Ｃ−）及びダニ−。ドリー（Ｊ。

ＤＯＬＹ）（１９７９，ｒ組換えプラスミドＤ　Ｎ　Ａをスクリーニングするための迅速なアルカリ抽出法（Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｒｔｒＢｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　）　Ｊ　夛ヌクレイク　アシツズ　リス、　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７　：　１５１３）がＭａ　ｙヱシた方法を用いると頁牙ｌである。

プラスミドの開裂及び必要があれにプローブとプラスミドの他の部分の分離も又、伏えはティー、マニアテス（Ｔ、ＭＡＮＩＡＴＩＳ）、イー、ピー、７リツケユ（Ｅ、Ｐ、ＦＲＩＴＳ（１）ｉ）及びジエー、ブンブロック（Ｊ、ＳＡＭＢＲＯＯＫ）（’Ｃ，Ｓ、Ｈ，）の「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）　Ｊ　、　ｒ実験マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）　Ｊに記載の遺伝子工学の従来の方法を用いる。

特に微生物の培地中に修飾塩基を高み度で用いることによりほとんど全部の天然塩基を修飾塩基で置換することができる。

もちろん、本発明プローブはインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）での化学的又は酵素的合成法によって作ることもできる。、特に、例えはリグピー、ピー、ダヴリュ、（ＲＩＧＢＹ、Ｐ、Ｗ、）ら（１９７７、ジュー１モル　、６イオール、　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）１１３、２３７−２５１　）に記載の、但し、ブロモデオキシウリジン三リン酸（ＢｄＵ）で同じ濃度のチミジン三リン酸（ＴＴＰ）乞置換した条件下で「ニックトランスレーション」と呼ばれる方εを用いることがでざる。最終的に得たプローブは２５％を越えるＢｄＵｉ含んでいる。得られたプローブはＴＥバッファー液（トリス、Ｈｃｌ、、１０ｍＭ、ｐＨ８，０，ＥＤＴＡ　１　ｒｒ＋Ｍ、ｐＨ８，０）中に保存しうる。

本発明方法は本発明プローブすなわち修飾塩基が炭素原子をる相補核酸とワトソンークリック対を形成する能力に影響を及は石ない限りにおいて、天然塩基の少なくともいくつかが８１１記修飾により得られる塩基でＭ挨さｎている書忙ローフ−％ｉｉ°”Ｊ（ａｌｌ乞とれた塩基でありうるプローブの製造にも及んでいる。これら飾塩基が上記に示した意味で生物学的に組み込まれうろことである。

この点では、上記の条件をも満足させる限りにおいて、上記欧州特許出願明細書に記載されている塩基、リボ−及びデオキシリボヌクレオシド並びにリボ−及びデオキシリボヌクレオチドがある。

（以下余白）本発明は５上記の条件でインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）でプローブを本発明は、特に、好手りヰ楼ＪＩＪ！ｔ＜ｌコ２〜Ｍ値−い・厩マイナス）であること。

−天然のヌクレオシドの構築に関与する塩基の１種の内因性の合成を調節する遺伝子の少なくともいくつか、好ましくは全部に影響する突然変異、 −炭素源および細胞内デオキシリポースの異化を調節する伝子の少なくともいくつか、好ましくは全部に影響する突然変異という突然変異または特性の組合せを特徴とする微生物、好ましくは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のような細菌類に係る。

本発明は、場合によっては、ベクター又はその１部が後にプローブとして使用されることに決っている場合には挿入物を含−天然のヌクレオシドの構築に関与する塩基の１種の内因性の合成を調節する遺伝子の少な（ともいくつか、好ましくは全部、 −炭素源および細胞内デオキシリボースの異化を調節する遺伝子の少なくともいくつか。

−内部ＤＮＡに作用するヌクレアーゼの合成を調節する遺伝子の少なくともいくつか、好ましくは全部。

好ましい（形質転換した又はしない）微生物はｔｂｙ　Ａ、　ｃｙａもしくはＣｒｐまたは同時にこｎら２つ、ｄｅｏ　、　ｒｅｃ　Ｂ　、　ｒｅｃ　Ｃ遺伝子座に同時に影響する突然変異の組合せを特徴とする。

従って５本発明方法は容易にそして比較的安価に、全てのプローブ又はより一般的には列えば欧州特許出願中００６３８６９−　Ａ３で検討された方法のようなマーカー法で認識されうる全てのＤＮＡ組換え体を再製でざる方法を提供する。

この欧州特許出願の好ましい使用方法は下記に述べる。それにもかかわらず。

検出はポリクローナル又は好てしくはモノクローナル抗体を使用して行うと好ましい。この点に関しては、（それ自身１″５標識されていない）ＤＮＡ組換え体により形質転換した本発明の休は培養物のままで鎮埼０でもよ（、場合によっては凍結乾燥状態であってもよい。問題の株が上記塩基の１つに対し栄養要求性であるとぎには、（株が凍結乾燥状態ではない場合）当然天然塩基をわずかに含む保存培地中に維持することが望ましい。促つて、対応する天然塩基の代りに生物学的に取り込むことができる修飾さｎた１つの塩基を含有する培地中で接触させる又は培養することにより、株は挿入物で（じむした（コールドプローブの場合）又は修飾していないベクターの材料を提供することができる。プローブ自身は４００　ｎ、ｍ未満の波長を有する放射線をＢｉして保存するのが好ましい。

なくとも１搾の塩基が修飾塩基で少な（とも部分的に置換さ几ておす、修飾塩基中の修飾基は多くとも２つの炭素原子と場合によってはハロゲンとを含むか又は１つの）・ロゲンである。

組換え体が上記の意味でのプローブを構成する、すなわち、生物学的検体中で検索するヌクレオチＰの所定配列の相補性挿入物で修飾されているときには、上記欧州特許出願中に記載された全用途、ｆ′Ｉ］えは医学的な診断、遺伝子地図の作製、核型の実行、遺伝子的な異常の検出、特異的な微生物の同定又は検出への応用に組換え体を用いることができる。

ぐ゛　Ｖノ、丁　づ１゛：　１−１　）て用いることができる。実施する操作の性質により従来のエンドヌクレアーゼ又はリガーゼを使って、ベクターを制限酵素で切り、他の核酸配列と再び結合することができる。換言すれば、ベクターは遺伝子二ダの手法に使用することができる。

４００　ｎｍ未満の奨＃波長を有する放射線を遮断して全操作を行うのが好ましい、ベクターが有する修飾塩基により、ベクターは選択マーカーとしても使用できる。この点で、特にａ＠内での発現を探索するときに、必要に応じ挿入物と共にベクターを導入した（原核又は真核）細胞の修飾塩基を検出する際ベクターは特に興味深い用途を有する。

特に修飾塩基に選択的に対する抗体で修飾した塩基の検出は形質転換したａ＠からの核酸を予め抽出することを必要としないので、このマーカーはより興味深い。この検出は全細胞すなわちインタクトな細胞で実施できる。

ブロモウリジンに対するモノクローナル抗体の製造例を以下に記す。

好ましく特にヨードウリジンで修飾したヌクレオチドを認識する適当なモノクローナル抗体は下記のように友造し得る。

云≠＃≠乎宇を蛋白質（アルブミン及びオボアルブミン）と結合させた。過沃素酸ナトリウムでヌクレオチドのリボースを酸化する方法によりこの結合を行った。このよ５１７Ｃして産生されたアルデヒド基は第２段階で蛋白質のアミン基と反応する［エルランガ−（ＥＲＬＡＮＧＥＥ’ｌ）及びベイサー（ＢＥＩＳＥＦＩ）、ＰＮ人Ｓフａインド完全アジュバント中に懸濁した、オボアルブミンに結合したヨードウリジン２００　ｔＬ９／マクス／注射により、ＢＡＬＢ／ＣとＣ５７ＢＬ／６とを交配して得たマウスを免疫した。

−ケ月間隔で２〜３回マウスに注射した。ケラ−（ＫＯＨＬＥＲ）及びミルスタイン（ＭＩＬＳＴＥＩＮ）が記載し〔ネイチャー（Ｎａｔ、ｕｒｅ）、２５６．４９５（１９７５）’）、ガ／Ｉ／７しくＣ）ＡＬＦＲＥ）らが改変した〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　、２　ｓ互、５５０（１９７７）：１手法により、予め追加注射したマウスの牌臓及び腋窩リンパ節の細胞をポリエチレングリコールを介してネ＆’５ｓｐｚｏ骨郵腫と融合した。＠胞りローンを含有するウェルの上清を免疫酵素学的方法で試験した。すなわち、！ＢｒＵｄ又はメチルウリジン（チミジンのアナ口−グ）と結合したアルブミンをポリスチレンのプレートに固定した。プレートを上清と次いでβ−ガラクトシダーゼと結合したマウス抗Ｉｇとインキュベートする。アルブミン−ＢｒＵｄ　アルブミン−チミジンのみな認識するクローンを選択し、クローン化し、その細胞をモノク【・−ナル抗体に冨む腹水を得るためにマウスに注射したつセファロースに結合させたプロティン −Ａのカラムでこの腹水から抗体を単離した。ＢｒｄＵａの存在下又は不存下に培饗した哩乳類の細胞（線維１細＠）の核上でＢ　ｒＵｄのみを認識しチミジンを認識しないことに関して、精製した抗体を免疫酵素学的手法で試験した。

そのような抗体を分泌するＩ−イブリドーマは１９８３年１１月２３Ｂにラ　コレクション　ナショナル　ドウ　キュルテユール　ドウ　マイクローオ／＋／ガニスムス　ドウ　リンステイテユト　パスツール　ドウ　パリ（ｌａ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ　− Ｏｒｇａｐｉｓｚｅｓ　ｄｅ　ｌ’Ｉｒ１ｓｔｉｔｕｔｐａｓｔｅｕｒ　ｄｅＰａｒｉｓ　）　（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、）Ｋ寄託され、ｎ７ｍ−２６３とされた。

従来の方法を用いて、このモノクローナル抗体とプローブ又はＢｒＵｄ塩基を含有するＤＮＡベクターとを接触させろことができる。

特に、ニトロセルロース・フィルター（又は適当な他の全ての支持体）に（研究試料例えば繊維芽細胞から得た）−重鎖又は２本鎖ＤＮＡを不動化した後にこの接触を行うことができろうこの方法は、フィルターを抗ＤＮＡマウスモノクローナル抗体と共ニインキュベートし、洗浄し、ペルオキシダーゼで標識したマウスの抗イムノグロブリン抗体と共にインキュベートし、洗浄し、酵素を組織化学的に染色することからなる。対応の「天然」ＤＮＡでは染色は全く見られないが、この方法により、ニトロセルロースフィルター上のＢｒＵを取り込んだＤＮＡは０．１ｐｇまで明らかにできる。いかなる増幅システムケも使用することなく実験的に使用した条件で高性能の検出感度が得られることが結−’４ついう行・１果から示される〜ｊ１１ｉＪ／イズがなげれば感度は少なくとも１０倍に増強されると予想することができろ。

公知の検出法は拍然全て使用でとる。特に下記の問題について以下に参照する論文中に記載の方法が特に好ましい。

−一細胞内ＫＷ在する抗体と結合したペルオキシダーゼの免疫細胞化学的検出（Ｄｅｔｅｃｔ工ｏｎ　ｉｍ＋ｎｕｎｏｃｙｔｏｃｈｉｍｉｑｕｅ　ｄｅ　］、ａｐ５ｒｏｘｙａａ、９ｅ　ｃｏｕｐＬ５ｅ　；ｘ　ｄａｓ　ａ！１ｔｉｃｏｐｓ　ｐｒｓｓ’ｅｎｔｓ　ｆ、ａｎｓｄｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｅｓ　：アブラミニス（ＡＶＲＡＭＲＡＳ　）（イムノケム。

（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、）、１９６９、第６巻、８２５頁）；−組織中に存在する非結合ペルオキシダーゼの検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｄｅ　ｌａ　ｐｓｒｏｘｙａａ５ｅ　二Ｏｎ　ｃｏｕｐ１５ｅ、ｐｒｅｓｅｎｚａｄａｎｓ　ｄｅｓ　ｔｉｓｓｕｓ　：グラハム（（）ＲＡＨＡＭ）ら（ヒストケム。

アンド　ザイトケム、　（Ｈｌｓｔｏｃｈａｍ、　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）、１９６５、第１３巻、１５０頁）ニー免疫酵素学的定量におしするマーカーとしてのβ−ガ２クトシダーゼの使用ＣＵｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ　ａｓ　上ａ　ｂｅｔａ　−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＣＯＩｎｍ８　ｍＡｌ”ＹｕｅｌＪｒ　ａａｎｓ　ｕＩ！　ｄｏｓａｇｅ　１ｍｍｕｎｏ＠ｎＺＹｍａｔｌｑｕｅ　）　ニゲストｙ（ＧＵｎＳＤＯＮ）、チェリー（Ｔ４ＪＩＥＲＦＩＹ）、アブラミニス（ＡＶＲＡＭＥＡＳ）（ジュー。アレルギー　タリフ。イムツール。（Ｊ　、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、Ｉ：ｚｚｕｎｏｌ、　）、１９７８．第６１巻、２３頁）。

稽々の操作を実施しうる条件の記載の中にも本発明に関する補足的な情報がある。これらは限定的な性質を狩っていないことはもちろんである。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌＬ　）　、より特定的にはＴＰ６０３３クローンの株を用いろ。例えば大腸菌の形質転換手段についてのティ、マグナチス（Ｔ、ＭＡＣ）、ＩｒＮＡＴＩＳ　）らによる「分子りα−ニング、実験手法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊ中に記載の手法により、クローンＴＰ６０３３は任意のＤＮＡ−ペクチミン（０，１〜１μ ９７Ｍ１）を加えた最小−φ培地又は６３Ｂ１培地中で細菌を培養する。株に挿入ンれＥ；特異的プラスミドに不となるまで３７℃で培養した　−　− 螺後、試料を採取し、同じ条件下でチミＩンを含有せず５−ブロモウラシル（１〜１１００ｕ／ＩＬｔ）ｔｔ添加した酌メごｅ培地中に（最終０ｒ）０．１〜Ｏ −３で）移す。少なくとも２世代の間培養を及びドリー（ＤＯＬＹ）、ＮＡＲ，第７巻、１５工３頁〕でｆｆ製する。例えば、５−ブロモウラシル１ａｐ／ｄと多（とも０．１μｙ／ｄの濃度の残留チミンとの存在下で４世代培養すると、取り込まれたプラスミド中に封入されたチミジンが２５％置換ニドａセルａ−スフイルターＢＡ−８５［シコライシャー（ＳＣＨＬＥ工ＣＨＥＲ）及びシューエル（５ｃａｔｙＥｔＬ）　］を使用した。

小さな点ｒＤｏｔ−ｂ１ｏｔｓＪで定着させるために予め音波処理し、熱変性させた（１００℃で５〜１０分次いで過融解水中で急冷）又はさせていないさげの精子のＤＮＡ（ＤＮＡキャリア）１５〜／Ｉｆｆを含むＴＢＳ（トリスＨＣｅ？　２０　ｃＭ　ｐ＝　７．８　。

Ｎａ（Ｊ　０．１５　Ｍ　）又はＴＥ中でＤＮＡを希釈する。同じ方法で標的ＤＮＡを予め支柱させる。欠いで、空気乾燥したフィルターを真空のオーブン中で２時間８０℃で焼く。

サザーン（Ｓ＋矛ＵＴＨＥＲＮ　）　（Ｃ，Ｍ、１９７５、シュー８モル。

バイオ−＃　、　（Ｊ　、２．４ｏ１．ＥｌｉｏＬ、　）　９８，５０３−５１７）Ｉｃよる）−マス（Ｔ！（ＯＭＡＳ）　（Ｐ−３，１９８０；　ＤＮＡ５７７．５２０１−５２０５　）の方法で、アカ′ロースゲル（を気泳動分離）からＢＡ８５フ１ルターへ移す。

■−ブレハイブリデーションプレハイブリデーションのバッファはリーリー　シュー。

エル、　（ＬＥＡＲＹ　Ｊ、Ｌ、）らが１９８３年に記載したものである〔　［ニトロセルロース上に不動化したＲ　Ｎ　Ａ−又はＤＮＡｋＣハイプリダイスしたビオチンｍ識ＤＮ人プローブを可視化するための迅速で感度の高い比色法（Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅａｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｌｏｒｉｚｅｔｒｉｃｍｅ”ｕｈｏｄ　ｆｏｒ　ｖｉｓｕａｌｉｓｉａｇ　ｂｉｏｔｉｎ　−１ａｂｅｌｌｅｄ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅｓｈｙｂｒｉｄｉｚａｄ　ｔｏ　ＤＮＡ　Ｏｒ　ＲＮＡ　ｉｍｒｒ、ｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｏｎｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌＯｓ＝　）　ｊ　：バイオープロンッ（Ｂ工Ｏ−ｂＬ　Ｏｔｓ）　−ｐ２．ｔ、＝、３　８０．４０４５−４０４９、これはウー＃（ＷＡ、ＨＬ）ら、１９７９　ＰＮＡＳ　７６．３６８３−３６８７による〕。そのバッファ中では、１≧ンの精子のＤＮＡＹｆ波処理した烏の精子のＤＮＡ　２５０１１９／Ｒ１３で置き換えている。何も添加していない羊又は山羊の正常皿清（ＳＮ）（１０％ｖ／ｖ）及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１％を−４ＩＣ加えることにより、免疫酵素学的な検出に必要な蛋白質を予め飽和させる。

約１ｊＩ７！／フ・丁ルター１０α２の割合で、４２℃で２時間インキュベートする。すなわち、「密封した袋」　（シュａバッグ（ｓｃｅｌｌｏｂａｇ　）　）　中でゆっくり攪拌することによりインキュベ−卜する、ハイブリデーションバソファで代替するためにバッファを取ブローブーＢＵは１００　℃（５〜１０分間）で変性させ、次いで（氷で）急冷する。脱イオンホルムアミド４５％と音波処理したサケの精子のＤＮ、Ａ−２５０ｔ１ｇ／ｄｙｚ含有しくジュー。エル、リーリー（Ｊ、Ｌ、ＬＥＡＲＹ）ら、１９８３、［迅速で感度の高い比色法゛−−−（Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓ１ｔｉｖｅ　ｃｏＬｏｒｉｍｅｔｒｉｃ山９ド讐キキキハイブリデーション千国ｌヱ奸（、ジュー。エル、リーリー（、Ｔ、Ｌ、　ＬＥＡＲＹ　）ら（１９８３、「迅速で感度の高い比色法−（Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ−− −−−−）Ｊバイオ−プロット（Ｂｉｏ　−ｂｌｏｔｓ　）　ＰＮＡＳ　、　８０　。

４０４５−４０４９　）に一致する洗浄を行う。

フィルターを空気乾燥させる。

２本鎖ＤＮＡより１本領ＤＮＡビよ（認識する抗−ＢＵ抗体をフィルター上で＾性させろ。フィルターをＮａＯＨｆＬ５Ｍ。

ＮａＣＪｌ、５Ｍ中に１５〜３０秒、次いで中和溶液（トリＸＨＣｅＯ，５Ｍ、　ｐＨ８，０、ＮａＣｄ　１．５　Ｍ　）中に５〜１０分含浸させる。

その後、フィルターを室温で乾燥させる。

■−免疫酵素学的検出フィルターをＴＢＳ＋ツウイーン（ＴＷＥＥＮ）ｃ、ｏ、１％）マウスの抗ＢＵ抗体をｌｄ／フィルターα２の割合で入れる。

１ａｇ／ｍ〜２０μｍ７７ｍ１の抗体濃度で、ゆっくりと攪拌しながら３７℃で２時間又は室温で一晩インキュベートスロ。

室温で（ゆっくり攪拌しながら）ＴＢＳ７−ｔ？１５分間３回すすぐ。

次いで、同じ条件下（１〜ｓａｇ／ｍｌ）でマウスのγ−グロブリンに対する、ペルオキシダーゼに結合した羊の抗体を添加し、室温で２時間フィルターと接触させる。次に、上記のようにフィルターをすすぐ。

ペルオキシダーゼの存在により、不溶性生成物を与えるＤＡＢ（ジアミノベンジジン）基質の量が示される。

■−結果（数字はフィルター上のＤＮＡｔｔｐｇで表わす）ｒ　Ｄｏｔ　−ｂｌｏｔ　Ｊでこの方法により０５〜５ｐｇＩ７）Ｋ性したＤＮＡ−ＢＵ（各々イン　ピボ（ｉｎ　ｖｉ−ｚｏで標識又は「ニックトランスレーション」）の検出感度が得られろ。

バイブリプ−ジョン後に５０　ｐｇのオーダーのＤＮＡの検出が保障される。

はシステムの非常に高性能の水準である。

ａノ１ｚｂｓ　１９　Ｂ　３年１１月２２日Ｋ　Ｃ，Ｎ、Ｃ、Ｍ、　Ｋ寄託した一一大腸菌　Ｔｐｆｉ００２株　ｐ”ｌ−２５９、−大腸菌　ＴＰ６０３０株　ｎ”ｌ−２６０、−大腸菌　ＴＰ６０３３株　ニー　Ｔ−２６１゜国際調査報告 λ）！ＮＥＸ　Ｔｏ　７”＝　工Ｎτ：λコλＴ：ＯＡ＋入二　５ＥＡＲＣＦ、ＲＥ？ＯＲ：　ＣＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヌクレオチドの所定配列をハイブリダイゼーシヨンによつて検出するためのコールドプローブであり、それ自身が、ヌクレオチドの前記所定配列に相補的な配列を含有する挿入物を含んでおり、その核酸を構成するヌクレオチド種の少なくとも１種の塩基の少なくとも一部がポリメラーゼによつて認識され得る修飾塩基で置き換えられており、この修飾塩基は、微生物のゲノムＤＮＡ中に生物学的に取り込むことができ、かつこれから得られる修飾核酸が天然の相補核酸または類似の修飾塩基を含有する相補核酸とワトソン−クリツク対を形成する能力に影響を及ぼさない、前記コールドプローブの取得方法であつて、対応する天然の塩基が修飾されていないプローブで予じめ形質転換した微生物を、対応する天然の塩基の代わりに修飾塩基を含有する培地で培養し維持し、前記修飾塩基は遊離状態であれ結合状態であれ前記塩基に対応するヌクレオシドまたはヌクレオチド中に存在し、その後組換えＤＮＡまにはベクターＤＮＡを前記微生物の培養物から回収することを特徴とする前記方法。２．４００ナノメーター未満の波長を有する放射線をプローブから確実に遮断する条件下で行なわれることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。３修飾塩基が多くとも２個の炭素原子および好ましくは少なくとも１個のハロゲンを含有する基またはハロゲンで構成されている基を有することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。４．微生物が細菌の突然変異体好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。５．微生物が前記修飾塩基に対応する天然の塩基に対する栄養要求性であるかまたは該栄養要求性にされていることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。６．修飾塩基が、多くとも２個の原子を有しかつ好ましくはハロゲン化された基で５位が置換されているウラシルまたはウリジンの誘導体であり、微生物がチミンまたは対応するヌクレオシドに対して栄養要求性であることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。７．修飾塩基がハロゲノ−ウラシルまたはハロゲノ−ウリジン、好ましくはブロモ−ウラシルまたはブロモ−ウリジンであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。８．微生物が、チミジル酸シンターゼの制御下で内因性チミンの内因性合成をコードする遺伝子または遺伝子群に影響を及ぼす突然変異、特にｔｈｙＡ遺伝子座内の突然変異を有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。９．生物学的に修飾された塩基がチミジンもしくはウラシルとは異なる天然塩基またはこの別の塩基に対応するヌクレオシドから誘導されており、微生物がデオキシリボヌクレオシド栄養要求性であり、培養を対応する修飾塩基（遊離または結合状態）だけでなく同時に他の天然塩基から誘導されたデオキシリボヌクレオシドも存在させて実施することを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。１０．前記徴生物がリボヌクレオシドニリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を、特にｎｒｄＡ遺伝子座またはｎｒｄＢ遺伝子座または好ましくは同時にこれら２つの遺伝子座内に有することを特徴とする請求の範囲第９項に記載の方法。１１．菌株が炭素源をほとんど異化し得ない突然変異株であり、この突然変異株が特にアデニルシクラーゼをコードする遺伝子座（ｃｙａ）またはサイクリツクＡＭＰの受容体をコードする遺伝子座（ｃｒｐ）または同時にこれら２つの内に突然変異を有していることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．前記微生物がホスホトランスフエラーゼの合成に関与する遺伝子内、特にｐｔｓＨＩｃｒｒ遺伝子座内にも突然変異を有することを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．前記微生物がデオキシリボースホスフエートの減成を調節するオベロン内、特にオベロン（ｄｅｏ）、より特定的にはオベロン（ｄｅｏＢ）またはオベロン（ｄｅｏＣ）または同時にこれら２つのオベロン内にも突然変異を含むことな特徴とする請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．特に使用する微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である場合、ＤＮＡの修復系に関与するエキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子内の突然変異、たとえばｒｅｃＢもしくはｒｅｃＣタイプまたは同時にこれら２つの内の突然変異を特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．――「制限マイナス」であること、――天然のヌクレオシドの構築に関与する塩基の１種の内因性の合成を調節する遺伝子の少なくともいくつか、好ましくは全部に影響する突然変異、 ――炭素源および細胞内デオキシリボースの異化を調節する遺伝子の少なくともいくつかに影響する突然変異、内部ＤＮＡに作用するヌクレアーゼの合成を調節する遺伝子の少なくともいくつか、好ましくは全部に影響する突然変異という突然変異または特性の組合せを特徴とする、訴求の範囲第１項〜第１４項のいずれかに記載の方法の実施用の微生物、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌類。１６．ｔｈｙＡ、ｃｙａもしくはｃｒｐまたは同時にこれら２つ、ｄｅｏ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ遺伝子座に同時に影響する突然変異の組合せを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の微生物。１７．組換えベクターを有していることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の微生物。１８．チミンとは別の天然塩基の内因性の合成を調節する遺伝子座、ならびにｃｙａ、ｃｒｐ、ｄｅｏＢ、ｄｅｏＣ、ｒｅｃＢｃ、ｎｒｄＡおよびｎｒｄＢ遺伝子座に同時に影響する突然変異の組合せを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の微生物。１９．ヌクレオチドの所定配列をハイブリダイゼーシヨンによつて検出するにめのコールドプローブであり、自身がヌクレオチドの前記配列と相補的な配列を有する挿入物を含有する前記プローブを形成する組換えＤＮＡであつて、その核酸を構成するヌクレオチドの種類の少なくとも１種の塩基の少なくとも一部が、ポリメラーゼによつて認識れ得かつ多くとも２個の炭素原子を有する置換基を含有する修飾塩基で置き換えられており、前記コールドプローブが、前記種類で前記置換基のない修飾塩基を実質的に有さないことを特徴とする前記組換えＤＮＡ。２０．この基が少なくとも１個のハロゲンを含有するかまたはハロゲンで構成されていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の組換えＤＮＡ。２１．前記挿入物に上つて変容された、フアージＤＮＡまたはプラスミドのような微生物中で複製し得るベクターと相同であることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の組換えＤＮＡ。２２．修飾塩基が微生物、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡ中に生物学的に組み込み得るものから選択されることを特徴とする請求の範囲第１９項〜第２１項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。２３．修飾塩基が天然ヌクレオチドの塩基から誘導されており、その修飾がビリミジン塩基に関しては５位、デアザプリンまたはプリン塩基に関しては７位もしくは８位または同時にこれら２つの位置での前記基による置換からなることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の組換えＤＮＡ。２４．修飾塩基が５−ハロゲノ−ウラシル、好ましくは５−ブロモーウラシル基であることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の組換えＤＮＡ。２５．構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、文字Ｂ、Ｂ′、Ｂ′′……の各々はプリン、フーデアザプリンまたはビリミジン残基を表わし、これら残基Ｂ、Ｂ′、Ｂ′′…の各々が、プリンまたはフーデアザプリン残基ではその適正な位置Ｎ９のレベルで、ビリミジン残基ではその適正な位置１Ｎ１のレベルで、対応する糖残基のＣ１位と共有結合的に結合しており、＿ＡはＢ、Ｂ′、Ｂ′′……の修飾基を表わし、場合によつて多くとも２個の炭素原子を有する置換基から成り、好ましくはさらにハロゲン化されており、この基Ａは、Ｂ、Ｂ′、Ｂ′′…がビリミジン残基の場合５位、またはＢ、Ｂ′、Ｂ ′′……がデアザプリンもしくはプリン残基である場合７位もしくは８位または同時にこれら２つの位置で、含窒素塩基の複素環に直接結合しており、 −ｚは−Ｈまたは−ＯＨを表わし、 −ｍとｎはそれぞれＯ〜１００，０００の整数を表わし、＿ｐは１〜７５，０００の整数を表わし、ただし、和ｍ＋ｎ＋Ｐは少なくとも２に等しく、好ましくは少なくとも１００に等しい〕を特徴とする請求の範囲第１９項に記載の組換えＤＮＡ。２６．天然塩基の修飾塩基による置換が前記プローブの対応する天然塩基の総含有量の少なくとも２５％、好ましくは７５％を越える割合であることを特徴とする請求の範囲第１９項〜第２５項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。２７．ヌクレオチドの前記所定配列を含有する核酸の検出方法であつて、この核酸を、単独かまたは請求の範囲第２０項〜第２６項のいずれかと組み合せた請求の範囲第１９項に記載のコールドプローブと、必要に応じこれらがそれぞれ予じめ変性し得かつ相互にハイブリダイゼーシヨンし得る条件で接触させ、前記ハイブリダイゼーシヨンに関与しなかつた過剰のプローブを分離しー以上の操作は４００ｎｍより短波長の放射線を遮断して行なうのが好ましい一次に、場合によつて形成されたハイブリツドを、特にプローブの修飾塩基に対する抗体との反応によつて直接または間接に検出し、場合に上つてはこの抗体自体が前記第１の抗体に対する別の抗体または近似する別の分子に上つて検出され得ることを特徴とする前記検出方法。