JPH0376575A - ２型―制限エンドヌクレアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃａｘ上の両用分野〕 本発明は鳳証−制限五ンドヌクレ７−ゼＤａ　ａＶ。

七〇取得法及び七〇使用に関する。

〔従来の技術〕

Ｉ鑞−１１１＠エンドヌクレアーゼは、特定のＤＮ入−
配列ｆ：緒處し、切断するこｔので在るエンドデノキシ
リボヌクレ７−ででｈ　ｈ　＊　ＣＣ’　ｔｉｋ目儂目
動配列々のポリヌクレオチド＊ｃｆ２ｒ各々１個Ｏホス
ホジエステル僑が加水分解６れる。

従って、Ｉ証−制限工ンドヌクレ７−＝−ｔ”はＤＮ入
−分子の分析のためにＸ要である。

Ｃａ明がＳ決しようとする課題〕 既に、多くのＤＮＡ−配列に対して置換的な１証−１Ｗ
ＩＪ＠エンドスクレ７−−ｅは公知でめゐが、新しい待
Ａ性留有する他の制限エンドヌクレアーゼの！ＪＩ！が
ｂる。

〔線域を解決するための＋段〕

この＆ｌ鳩は、本発明により、ｌｌＩ！處配列及び標識
により定ｍδれた切断位置 ｋ［するｊＩａｉｔ−ａ＠エンドヌクレアーぜにより解
決番れる。

仁の酵素は、有利にダクチｔ２ツコグシス属Ｏ倣生ｉｔ
ｌ！ｌから得られる。

本発明による新規の制限エンドヌクレアーゼ（以後ｃｔ
′１．七ＤａｔｈＶε称丁Ｊは、蛍適温度約６υ℃を有
する。この＃巣は、ｐ’７−６〜８．２で、（ＣＨ３Ｃ
ＯＯ）ｓＭ＆　１０１１１％ル／　ｌ　、　　ＣＨ，Ｇ
ＯＯＫ　６６　Ｉｎ七ル／ＪＪＬＱ’Ｄ’ｌ’Ｊｉｌ（
ジチオエリスリトールノ０．５ｍ七ル／Ｉｔ−含有する
トリスアセテート緩ｌＩ液３３ｍ七ル／ｌ中で良好な活
性を有する。

苗過−−値は約７．９である。　ＤａａＶ、は、　　Ｂ
ｏｒＷ工（？ｉｔｌｉｇ＠ｒ！、）４　　、　　Ｇ、Ｆ
ｓ　　Ｄａコ、ｙ、　　　Ｃ，Ｂｒｏｗｎ、　　　１コ
アＲ６及びＧｉｎｇｅｒａａ、　ＴＡＲ，（１９８２）
ＮｕｏｌｅｉｃＡＯ１ａ５　Ｒａｇ、　　１　０．８１
　７１〜８１７９）、！：ｌｌ’１じｇ織配列を有する
。しかしながら、ＢｏｘＦＸは異なる切断位置即ち ＣＣＩＮＧ　Ｇ ＧＧ穎ＣＣ ｔ″有する。

らの線繊配列は、ウィルス８ｖ４０及び７ｆノ２のＤＮ
Ａ％７７−ジλ及びプラスくドｐσ１８の完全消化に、
Ｃｊ）確認丁ゐらεがでａゐ、これらＣ）　ＤＮ人−分
子ｔ−ＤｓａＶで処理する。

第１訳に、妃列ＣＣＮＧＧ倉紹處する呼累に関する、残
線に、ＣＪ）測定δれた切断位置特異性辷３ンビ具−タ
測定番れた切航位＆特異性この比軟上 結果示す。

仁の＃素の紹織配列同のｌ断位置は、具二パーナル配列
決定グライマーの結合位置に対して約６ｕ〜２００塩基
の間隔でこの＆Ｉ織配列ｔ−有するＭｌｓ−ａｓｔ導体
（Ｍｕｓｓｉｎｇ等によ４　Ｎｕａｌ。

人ａｉｄｓ　　Ｒｅｓ、　　９　　（１９８１）　、３
　０９〜３２１　ノで測定するｃｔができる。ＣのＭ１
３−誘導体の１本１１［ＤｈＪ８の所で、ｘｆ、ユニパ
ーナル配列決定プライマー金量いて、ジアンキシ−４鎖
切断法により配列決定反応全実施する（Ｓ改ｎｇａ　ｒ
　。

１．４！のＰｒｏａ、　Ｎａｔｌ、　Ａａａｄ、　８ａ
ｉ、　Ｕ、８．Ａ。

（１９７７）　７４．５６０〜５６４、Ｍｅｓｓｉｎｉ
５、Ｊ、呼（ＤＮｕＯｌ、　ＡｏｉｄｓＲ＠ａ　（１９
８１）、９．３Ｕ９情６２１＃照）。

（れに平行して、ｃの配列決定ブライマー金、Ｔ４−ポ
リヌクレオチド−Φナーゼ及び（ｒ−３１ＸＩＩＩＡＴ
Ｐ　’ｋ　用イテ、５′−末ａｉｔ’放＃ｔ　Ｍｕ　Ｊ
ｓ織Ｙる。ＣＯゴー末端櫨繊された配列決定ブライマー
０１本＠Ｍｉ　５−　ＤＮ８へｔＺ）／％イｆｕ　：、
／　）’７１ｉ成の恢に、ＤＮＳ−ポリメラーゼエ、ク
レノ７−７ラグメント及びｄガＰ、ｃＬｃＴＰ％ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰからのデソ中ジヌクレオチド王燐酸−混
酋物εの充積反応で、Ｓ静的２本鎖ＤＮ８　ｔｌ−装造
する。

新しく酋成場れた連鎖のゴー末端で放射能標識とれてい
るにのＤＮ１９の７リクオート（Ａｍ土ｑｕａｔ　）切 を、次いで制限エンドヌクレフ　−ｔ’　ＤｓａＶ　テ
ｆ所する。平？ＩｆＤＮ８−末４を侍ゐために、谷切断
バッチの半分を付方Ω的に、盆て０４’１Ｍのグンキシ
ヌクレオチドミ燐ｅＲＯ混を齋の存在で、Ｔ４−　ＤＮ
ａ−ポリメラーゼで処理する。

反応生成物の分析は、配列決定グル（尿素８ｍモル／ｉ
、ボリアクリルア（ド５優〕上での１を気泳動及び引続
くオート２ジオグラフイにょフ行なり。Ｍ釆０解続金グ
ツウン（Ｂｒｏｗｎ　）　。

Ｎ、Ｉ、、及びス（ス（Ｓｍ１ｔｈ〕、Ｍ、の方法（Ｍ
ａｔｈｏｄ、ａ　ｊ、ｎ　ｌｎｚｙｍｏｌｏｇ７６５　
（１９８０）、５９１〜４０１　参ｆｉ）　Ｖｃ！　ｆ
ｆ実ｍｆル、　放射ｈＥ襟歳された７ラグメントＯ移動
距離（Ｌ龜ｕｆ５　ｔｒ−ｅａｋｌｎ　）　辷配列ラダ
ー（Ｓｅｑｕｅｎｇｌｅ、ｔｔｅｒ）辷の比較ｆｃより
切断位置Ｑ座を決定する。付加的な’ＩＩ’　４−　Ｄ
ＮＳ　−１１！ｔリメツーゼ処理６れた試料は、単にＤ
ｓａＶ−切断δれた試料こ比べで、５塩藻だけ＃！、長
δれたバンド合本す。従りで、ＤａａＶは５塩轟対だけ
突ｍしていゐ５′−末端を虫ｒるＣεが明らかで必る。

従りて、ＤａａＶのｃＯ切酎耐、絡織配列Ｑ外で次の特
異性で６復う＝ ぎ、　、　、１ＣＣＮＧＧ−，５ ぎ、。、−０゜、５′ 実験に工ｐ副定成れた切断位置の畝は１配列ＣＣＮＧＧ
　１ＣＦＪＩａ　７　ｂ　ａ　ｈ　ｔＤ　ＤＮａ　ｉ　
用Ｖｈ　４ａ　：ｘ　ンｅ　ｓ−−−夕分析に、１得ら
れた切断位置Ｏ畝辷同じでわる（第１我ン、付加的に、
これらのデータを〇ｅａｌｔ）（１９８０）３５７〜３
７［）Ｊｌからの表ε比戦した。

本発明によｎば、ダクチ目ココプシス＾Ｏ砿生柳時にダ
クｆ　Ｃ＋：２シブシス・ナリナ（ＤａＯｔ７−１ｏｏ
ｏｏａｏｐｓｉａ　ｓａ：Ｌｉｎａ　）　ｆｔ場寮しへ
細胞から蝉巣を取得するＣ辷によりＤａａｙが得られる
。特にダクチロＪコブシスーサリナＤａＭ　４　Ｌｌ　
ａ　Ｏｔ’使用するのか有利でるる、取得０ためには、
成用の生化学約捕＃法金使用する仁εがで哀、この際、
その都度侮られる７ラクシジン中で、線繊配列の切断に
より酵素の存在倉容易に立証することができる。基質こ
しては例えばう轟ダー６　ａｘ−−ＤＮＡが好適でめる
。４られるＤＮＡ　−７ラグメント金、美化エチジウム
の存仕下で、７ラグメント分離の比めに真用Ｑ酸備剤希
中の７ｆロースｒル中で４′：Ａ本勘により分層する。

ｃの＃巣紮取侍するために便用される砿生物ｄ、　Ａ、
Ｉｅ、フォルスキイ（Ｗｈｌｓｋｙ　）　、Ｌ　ｖａｎ
すｙ　（Ｒｌｊｎ　）　、Ｘｓ　”−へン（ｅａｋｌｎ
　）による培地（Ｐｒｏｏ、　Ｒｏｙａｌ　８ｏａｌｅ
ｔｙ　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｂ　２１７（１５）８３ノ、４１
７〜４４７＃雇２中で好気的ｋｃｇ：、長する。

この微生’！２ｙは、１°イツテエン・ずムルング・７
オンａξクロオルガ＝スメンーｒｅルシヤ７ト・７３−
７　ｅごオテヒノロギツシ鳳ン・７オルシュングーｍｂ
Ｈ（Ｄｅｕｔａｃｈｅｎ　８ａａｕｎｌｕｎｇ　ｗｏｎ
ＭｉｋｒＯＯｒｇａ！１１ｍ６！！、　ＧｅＪＩＪｌ：
ＬＪｌＯｈａｆｔ　ｆｕ６Ｆ　ｂｉｏｔｅａ−ｈｎｏｌ
ｏｇｉａｏｈｅ　Ｆｏｙｓａｈｕｎｇ　ｍｂＨ；　Ｍａ
ａａｈｏｒｏｄｅｒＷ’ｅｇ　　１６．　３３００　Ｂ
ｒａｕｎｓｏｈｖａＪｃ、　　ＢＲＤ　）　Ｋ寄託δれ
で訃り、寄託番号ＤＡＭ　４０８０　ｆｔ有する。らの
苗適先長条件は、２０〜３０℃、−６，５〜７．５でめ
る０倍増時間は約３日でるる。

この酵素は、慣用の化生的及び機械的方法例えば高圧分
散、超ｆ波又は＃素的溶解により単離番れかり清ａ４δ
れる。不発明方法の有利な１夾施形で１１、プロテア−
ｔ”阻害剤を含有するトリス／　ＨＣＩ緩衝液（ｐｔｉ
　８．０　）中にａ胞をａ清迩せる。細胞金７レンチプ
レス金通して崩解６＜、ボＶｔｙｐで沈殿場せる、上澄
みの史なる槓真グ は、骨にアク４二ティクローｖ　）−＃’Ｆ　フイ、イ
オン交換体りａｙ）グラフィ及びヒトｏＪ？ジルアパタ
イトを通すりａマトグツフイにより実施する。アフイニ
テイクロｖトグラフイ用材料こしテハ、例えばヘパリン
−セファロースＣＬ　−（５Ｂ（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｅｌ
ａｐｈａｒｏａｅ＠　ＣＬ　−（５Ｂ、　　ｐｈａｒｍ
ａｅｉａ、］が好適である。

７＝牙ン又換体こしては、ＤＪＩ態セフ７セル（ｎＪｃ
ＡＪｌ　８ｅｐｈａａｅ辺’　”””””　の名称で入
−ｔＮａ−ｘホｘ７．：ｃ　−ｋ＝　Ｐ　ｌ　ｌ　（Ｃ
ｅ１ｌｕｌｏｓｅＰｈｏｓｐｈａｔ　Ｐ　１１　、　Ｗ
ｈａｔｘｎａｎ　）が好適でるる。

ヒドロ中ジルアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉ
ｔ　；ａｍ）４同様に好適でるるか、当東者に公知であ
る他のり１２１　トグラフイ有料も好適でるる。

〔夷Ｍ例〕

仄Ｏ実施例につ龜不発明金説明する。

ｉ１ ダクチαプコグシス・ナリナＤＳＭ　４む８０を２１℃
で浸出法で、連続的に７に殻蒸気灯で照射とれるガラス
ｍ＃装置中で２１８間培養し、後期対ａ％しくは定常期
で績＃６せる。場地辷して、１１当ｊｌ　ＮａＣＪ　１
２５１　＝＝　ＭｇＣＪｇ　・６ＨｚＯ１０ｉｓ　Ｍｇ
８０４７ＨｓＯ５−５１ｓ　ＫＣｊ　２−５１１ｓＮａ
ＮＯ５０−７５ｊ’　ｓ　　Ｃ＆、Ｃ１１１”　２Ｈ忌
０Ｏ−０８ｊ’ｘＫ１ＨＰＯ４７−８Ｊｖ％ＮａＣＯ３
２０ｌ！ｖｓクエン酸鉄（Ａｌｌ）アンモ二りＪ１１３
９、クエン酸６９及び兄りでＡ−Ｎａ黛少 ６９１：使用し、（れに、次の倣−元素浴液（１１当夕
の織度）１−を添刀りする：　Ｈ，ＢＯ３２，８６ＩＩ
ｓ　　”ｇｃｉｇ”４Ｈ２０１−８１７！ｓ　　Ｚ！１
１８０４＠７ｎ、。

Ｏ−２２２Ｊ’　％ＮａｌＭｏＯ４”　２ＨｓＯＯ−０
５９ＪｌｓＣｕ８Ｏ４’　５ＨｉＯＯ−０７９ＩＩ及び
ＣｏＣＪ２・６Ｈ２００−０６１、ＣｉＺ）［胞ヘーｘ
ト邊湿ｘ重１５０．９）を、グロテアーゼ阻沓剤を含有
する緩衝液入（トリス−Ｈ”　ｓ　ｐ’　８−０　４０
　ｍ　モル／　ｌ　５１ｉ１Ｄ’Ｉ’Ａ　Ｏ−１ｍ七ル
／ｌ、２−メルカグトヱタノール７ｍ母ル／ｌ　Ｊ　１
谷童中１１：再＃濁δぜる。

引続！、１２００バールの７レンチグレスｆｃ２囲通す
らとｉＣより細胞を崩解δせゐ。引続きポリ（ンＰを添
加し、沈ＩＲ金分縫する。上置魯虻、緩ｉ［Ｂ（）リス
−’ｌ１ＣＩｓｒ８．ｕ　　４Ｑｍ−ｒ：：ル／Ｊ％１
ＤＴＡυ、１　ｘｎ七ル／ｌ、２−メルカプトエタノー
／ｌ／　７　ｍ−Ｔニル／　Ｊ　％グリ叱リン１１Ｊ　
ｙ／ｖ％】に対する透析により脱塩し、緩衝液Ｂで予１
１ｆｆｉ？’Ｊ’ｌれたヘパリン−永ファロースーカラ
ムで分別する。溶離のために、　ＮａＣＪ　　Ｏ〜１七
ル／ｌの勾配浴液を用いる。　ＤａａＶがＮａＣＪυ、
６２−［Ｊ、４５七ル／ｌの７２クシヨン中に認められ
６、＜：、Ｑ活性７２りＶｇ　ンｒＩＩ＆ｗ液Ｂに対し
て透析ぢせゐ、り１絖き、にれを緩衝液Ｂで平衡化され
２ｐｍＡｉセ：ｙ７−ｔＪ−力ｔａｃ　ＤＥＡＪＩ８＊
ｐｈａｏｌ＠　−８ａｅｕｌｅ　）上に装入する＠　ｍ
ｍｏ−ｈめにｌ＆ｇＩｌ液Ｂ中のＮ改（’Ｊ　　Ｏ〜１
モル／ｌの勾配液ヲ使用する。　ＤｓａＶ、＃Ｎａ、Ｃ
Ｊ　　［）、１　［Ｊ〜０．２　Ｄモル／ｊの７ラクシ
町ン中に關められる。

ｃの＠性フラクション金緩Ｗ液ＢＫ対して透析させ、緩
衝液Ｂで平衡化番れたＰｌｌ−カラム上で分別曝せる。

溶離の沈めに、緩衝液Ｂ中のＮａＣＪ　　Ｏ〜１七ル／
ＩＪｃ）勾配置ｔ−ｔｓｔ用する。

Ｄａａ、ＶがＭａｉｌ　　０．３５〜０．４５　Ｍのア
ラクシ１ン中にＮめられる。Ｃの活性７ラクシヨン金、
緩衝液Ｃ（Ｘ１ＨＰＯ４／’］ｉＣＨｇＰＯ４，ｐ　ｇ
、Ｑ　　ｉ　Ｑ　ｍ毫ル／　ｌ　％　ＩＩＤＴＡ　　Ｑ
、１　ｔｎ　％　ル／　ｌ　ｓ　２−メルカプトエタノ
ール７ｍ−Ｅニル／ｌ、グリセリン１０　ｖ／ｖＩｓ）
に対して透析６ぜ、緩衝液で平衡化６れたし）’ｏキＶ
ル７バタイトーカ２ム上で分別曝せる。浴−の比めに、
緩衝液中（Ｄ　Ｋ　２ＨＰＯ４／”ＫＪｉａＰＯ４１［
）−５ＤＯｍモル／ＩＣ）勾配液倉使用する。

Ｄａａｙが燐ｊ１ｍ！塩２ＵＬ１〜３５０ｍ−ｔ＝ルの
７２りＶジン申に、認められる。Ｃれら０活性フラクシ
藁ンを一緒にし、貯′ｌｔｉ＆衝液（トリス−ＭＣＩ　
。

ｔ”　７−５　２０　ｍ　％　７Ｂ、／　ｌ　Ｘ　　２
−メルカグトｘ、ｐノール１０ｍ−ｂル／ｌ及びＮａ、
Ｃｊ　　ｉ　Ｑ　Ｑ　Ｉｌｌ　％ル／ｌ、グリセリン５
　Ｄ　ｖ／ｖ　係）　ｆｃ対して透析δぜる。

例　　２ 活性の測定 μＩＩｆ：切断する。

インｄＰ５．ベージ曹ンａｍ液（トリス−７セテート、
ｐ１４７．９／３７℃　３３ＣＪｍモに／ｌ）２．５４
ｊ％酢酸カリウム６６０Ｉｎ％ル／Ｊ、酢酸マグネＶク
ム１００ｍ％に／ｌ及びＤＴＪｌｌ　５　ｍ％ｋｌＩＣ
）７Ｍｓ’ｆ！ｒ’ｍＶｃ％水１７．５　、ａＪ及びラ
ムダ−＋ｌＬ傭−−ＤＮＡ　（光学密度：４［］Ｄ／１
ｉｔ）５μＪ並びにＤｓａＶ　−ｍｆｆ１ｔ　（１σ／
μＩ）１μ盆ｔｉｍする。ｃｏ浴液を６０℃で１詩聞４
ンキ具ベートレ、氷上で冷油し、尿素７ｍ４ル／　Ｊ　
％サツカロース２０ （ｗ／ｖ） 噂、 ＫＤＴＡ　６０　ｒｒｒモル／ｌ及 える。引続き、１優７ガロースグル中の電気泳動による
分＊に１００Ｖで２〜３時閲実施する。

得られるバンドをＤＮＡ−長さ＃１４との比較によｐ同
定する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、認識配列及び標識により特徴付けられた切断位置 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するII型−制限エンドヌクレアーゼ。 ２、ダクチロココプシス属の微生物から得られる、請求
   項１記載の制限エンドヌクレアーゼ。 ３、ダクチロココプシス・サリナＤＳＭ４０８０から得
   られる、請求項１記載の制限エンドヌクレアーゼ。 ４、至適温度約６０℃及び至適ｐＨ値７．６〜８．２を
   有する、請求項１又は２記載の制限エンドヌクレアーゼ
   。 ５、認識配列及び標識により特徴付けられた切断位置 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するII型−制限エンドヌクレアーゼを用いることを
   特徴とする、２本鎖ＤＮＡ配列 ５′−ＣＣＨＧＧ−３′及びその補足配列を認識し、切
   断する方法。