JPS6139623B2 - - Google Patents
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- JPS6139623B2 JPS6139623B2 JP52042720A JP4272077A JPS6139623B2 JP S6139623 B2 JPS6139623 B2 JP S6139623B2 JP 52042720 A JP52042720 A JP 52042720A JP 4272077 A JP4272077 A JP 4272077A JP S6139623 B2 JPS6139623 B2 JP S6139623B2
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- fluorescein
- antibiotic
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
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- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫検定に関するものであり、さらに
詳しくいえば生物学的液体中のジエンタマイシン
ならびに同様のアミノグリコシド抗生物質を検定
する方法に関するものである。
詳しくいえば生物学的液体中のジエンタマイシン
ならびに同様のアミノグリコシド抗生物質を検定
する方法に関するものである。
ジエンタマイシンはアミノグリコシド類の抗生
物質の中で最も重要なものの1つである。それは
次の構造をもつている。
物質の中で最も重要なものの1つである。それは
次の構造をもつている。
ジエンタマイシン製剤は通常これらの成分の混
合物から成る。
合物から成る。
ジエンタマイシンは毒性があつて危険である
が、その最適治療レベルの2〜3倍の少量で循環
系に存在したときには特に耳に対して毒性(耳
毒)がある。さらにまたジエンタマイシンは血液
中からの排泄率が患者個個によつて大いに異なる
ものである。したがつてこれを臨床に適用するに
は、個個の場合についてジエンタマイシンの存在
量を知るため血液の監視を続けることが肝要であ
る。現在最も普通に使われているジエンタマイシ
ンの検定法は生物学的検定法であつて、これでは
血液試料のバクテリアの生長を阻止する能力を測
るものである。
が、その最適治療レベルの2〜3倍の少量で循環
系に存在したときには特に耳に対して毒性(耳
毒)がある。さらにまたジエンタマイシンは血液
中からの排泄率が患者個個によつて大いに異なる
ものである。したがつてこれを臨床に適用するに
は、個個の場合についてジエンタマイシンの存在
量を知るため血液の監視を続けることが肝要であ
る。現在最も普通に使われているジエンタマイシ
ンの検定法は生物学的検定法であつて、これでは
血液試料のバクテリアの生長を阻止する能力を測
るものである。
この方法は時間がかかり、不精確でそして試料
の出来高が非常に低いときに限り使うことができ
る。これらの問題が現在ジエンタマイシンの臨床
使用を制限ていることはほとんど確実である。
の出来高が非常に低いときに限り使うことができ
る。これらの問題が現在ジエンタマイシンの臨床
使用を制限ていることはほとんど確実である。
最近ジエンタマイシンに対する放射免疫検定
(RIA)が開発されて文献に報告されている。こ
れは生物学的検定法に比しより迅速で精度もよ
い。そしてそれに加えて免疫特異性の利点があ
る。このRIAの不利な点としては先ず通常の放射
能危険、標識の寿命が限られていること、それに
放射活性の計数設備の必要があることである。第
2には遊離のまたは抗体に結合した標識つけられ
た画分をその定量のために分離するための工程が
必要なことであり、そして第3にはジエンタマイ
シンの放射標識をつける問題である。三重水素化
(3H−)されたジエンタマイシン(これは注文す
れば市販品が入手できる)は不純なことが知られ
ているし、そして三重水素の標識を使うことは高
価な液体シンチレーシヨン計数法を必要とする。
放射性ヨードによる標識つけ(例えば簡単なガン
マ計数定量)は先ずジエンタマイシンを適当なキ
ヤリアーの類に結合し、その後そのキヤリアーを
放射性ヨード化するか、あるいはジエンタマイシ
ンをあらかじめヨード化されたキヤリアーと結合
または反応させることによつてのみ実現すること
ができる。これらは複雑な手続を要し、しかもし
ばしばその再現性は乏しい。
(RIA)が開発されて文献に報告されている。こ
れは生物学的検定法に比しより迅速で精度もよ
い。そしてそれに加えて免疫特異性の利点があ
る。このRIAの不利な点としては先ず通常の放射
能危険、標識の寿命が限られていること、それに
放射活性の計数設備の必要があることである。第
2には遊離のまたは抗体に結合した標識つけられ
た画分をその定量のために分離するための工程が
必要なことであり、そして第3にはジエンタマイ
シンの放射標識をつける問題である。三重水素化
(3H−)されたジエンタマイシン(これは注文す
れば市販品が入手できる)は不純なことが知られ
ているし、そして三重水素の標識を使うことは高
価な液体シンチレーシヨン計数法を必要とする。
放射性ヨードによる標識つけ(例えば簡単なガン
マ計数定量)は先ずジエンタマイシンを適当なキ
ヤリアーの類に結合し、その後そのキヤリアーを
放射性ヨード化するか、あるいはジエンタマイシ
ンをあらかじめヨード化されたキヤリアーと結合
または反応させることによつてのみ実現すること
ができる。これらは複雑な手続を要し、しかもし
ばしばその再現性は乏しい。
本発明者はジエンタマイシンおよび同様なアミ
ノグリコシド抗生物質に対して免疫検定法を考え
出した。その方法は放射活性物質の使用を含まな
いし、そして上記の抗生物質についての生物学的
定量法にまさる多くの利点をもつている。特に本
発明者は、これらアミノグリコシド抗生物質をフ
ルオレセインで標識すると、抗生物質が特定の抗
体で処理された場合に標識の螢光が減少すること
を発見した。その結果、生物学的液体試料からそ
の螢光を測定することによつてこれらの抗生物質
を検定することが可能となり、それは信頼できま
た有効である。
ノグリコシド抗生物質に対して免疫検定法を考え
出した。その方法は放射活性物質の使用を含まな
いし、そして上記の抗生物質についての生物学的
定量法にまさる多くの利点をもつている。特に本
発明者は、これらアミノグリコシド抗生物質をフ
ルオレセインで標識すると、抗生物質が特定の抗
体で処理された場合に標識の螢光が減少すること
を発見した。その結果、生物学的液体試料からそ
の螢光を測定することによつてこれらの抗生物質
を検定することが可能となり、それは信頼できま
た有効である。
本発明によつて生物学的液体試料からジエンタ
マイシンまたは同様なアミノグリコシド抗生物質
を検定する方法が提供されるのであるが、この方
法は試料とフルオレセイン標識された化合物とそ
して検定すべき抗生物質および上記化合物に対す
る抗体(例えば抗血清または抗血清からの免疫グ
ロブリン)との混合物を作り、この混合物の螢光
を測定し、それによつて試料中に存在するアミノ
グリコシド抗生物質を定量するものである。
マイシンまたは同様なアミノグリコシド抗生物質
を検定する方法が提供されるのであるが、この方
法は試料とフルオレセイン標識された化合物とそ
して検定すべき抗生物質および上記化合物に対す
る抗体(例えば抗血清または抗血清からの免疫グ
ロブリン)との混合物を作り、この混合物の螢光
を測定し、それによつて試料中に存在するアミノ
グリコシド抗生物質を定量するものである。
“フルオレセインで標識された化合物”という
のはフルオレセインによる螢光性基をもつた化合
物の意味であり、そしてこの螢光は該化合物〔以
下、フルオレセイン標識化合物とも呼ぶ〕が抗体
と結合すると減少するものである。このようにし
て混合物の螢光は、原試料中にあるアミノグリコ
シド抗生物質の量に応じた量だけフルオレセイン
標識化合物の螢光よりも少なくなる。混合物の螢
光を測り、それを例えば標識曲線(下記に詳述す
る)と比較することによつて、アミノグリコシド
抗生物質の量を定量することができるものであ
る。
のはフルオレセインによる螢光性基をもつた化合
物の意味であり、そしてこの螢光は該化合物〔以
下、フルオレセイン標識化合物とも呼ぶ〕が抗体
と結合すると減少するものである。このようにし
て混合物の螢光は、原試料中にあるアミノグリコ
シド抗生物質の量に応じた量だけフルオレセイン
標識化合物の螢光よりも少なくなる。混合物の螢
光を測り、それを例えば標識曲線(下記に詳述す
る)と比較することによつて、アミノグリコシド
抗生物質の量を定量することができるものであ
る。
フルオレセインで標識された化合物は、この方
法に用いる抗体と複合体を作ることができなけれ
ばならない。そして抗体もまた分析されるジエン
タマイシン(または他の類似の薬剤)と複合体を
作ることができなければならない。したがつてフ
ルオレセイン標識化合物は検定されるジエンタマ
イシンまたは他の薬剤と同じ構造をもつているか
あるいは非常に近似の構造をもつていなければな
らない。そうでないとそれは抗体と結合しないか
らである。すなわち薬剤Aの検定に用いるべきフ
ルオレセイン標識化合物はフルオレセイン標識を
もつたAそのものかあるいはAに非常に近い(そ
してフルオレセイン標識をもつている)化合物の
どちらかであろう。
法に用いる抗体と複合体を作ることができなけれ
ばならない。そして抗体もまた分析されるジエン
タマイシン(または他の類似の薬剤)と複合体を
作ることができなければならない。したがつてフ
ルオレセイン標識化合物は検定されるジエンタマ
イシンまたは他の薬剤と同じ構造をもつているか
あるいは非常に近似の構造をもつていなければな
らない。そうでないとそれは抗体と結合しないか
らである。すなわち薬剤Aの検定に用いるべきフ
ルオレセイン標識化合物はフルオレセイン標識を
もつたAそのものかあるいはAに非常に近い(そ
してフルオレセイン標識をもつている)化合物の
どちらかであろう。
検定される特殊な薬剤かあるいは(使えるなら
ば)密切な関係にある化合物(それはフルオレセ
イン標識をつけられるべきものである)のどちら
かを使うものとして述べた抗体を使うことは本発
明方法においては肝要なことではない。その代わ
りこの抗体は別の物質を使うことをすすめること
もできる。しかしこの物質は必ず検定すべき薬剤
および標識化合物に構造上近似のものである。そ
うでないと抗体がこれら2つの物質に結合しない
からである。
ば)密切な関係にある化合物(それはフルオレセ
イン標識をつけられるべきものである)のどちら
かを使うものとして述べた抗体を使うことは本発
明方法においては肝要なことではない。その代わ
りこの抗体は別の物質を使うことをすすめること
もできる。しかしこの物質は必ず検定すべき薬剤
および標識化合物に構造上近似のものである。そ
うでないと抗体がこれら2つの物質に結合しない
からである。
アミノグリコシド抗生物質のある物は非常に似
かよつた化学構造をもつたものがある。そして本
発明者は例えば家兎の抗ジエンタマイシン抗血清
がジエンタマイシンと結合するのみでなくサイソ
マイシンおよびSchering20569とも結合すること
を発見した。この型の交差反応はこのような抗生
物質を2つあるいはそれ以上含んだ試料の検定を
困難にする。しかし実際にはこのような検定が必
要になることはまれである。生物学的液体試料は
通常1種の抗生物質だけしか含まないだろう、そ
してこんな場合には交差反応の可能性は有利であ
る。すなわち例えば本発明方法によつてジエンタ
マイシン、サイソマイシンまたはSchering20569
を検定するためにはただ1つの抗血清が必要であ
り、例えば兎の抗−ジエンタマイシン抗血清だけ
が必要である。このことは臨床実験室ではストツ
クしておくことはほとんど必要がないことを意味
するのみならず特定の抗血清を作ることが困難な
薬剤が検定できることをも意味する。
かよつた化学構造をもつたものがある。そして本
発明者は例えば家兎の抗ジエンタマイシン抗血清
がジエンタマイシンと結合するのみでなくサイソ
マイシンおよびSchering20569とも結合すること
を発見した。この型の交差反応はこのような抗生
物質を2つあるいはそれ以上含んだ試料の検定を
困難にする。しかし実際にはこのような検定が必
要になることはまれである。生物学的液体試料は
通常1種の抗生物質だけしか含まないだろう、そ
してこんな場合には交差反応の可能性は有利であ
る。すなわち例えば本発明方法によつてジエンタ
マイシン、サイソマイシンまたはSchering20569
を検定するためにはただ1つの抗血清が必要であ
り、例えば兎の抗−ジエンタマイシン抗血清だけ
が必要である。このことは臨床実験室ではストツ
クしておくことはほとんど必要がないことを意味
するのみならず特定の抗血清を作ることが困難な
薬剤が検定できることをも意味する。
本発明の方法では被験試料にフルオレセイン化
合物を加えその次に抗体との混合物を作ることが
好ましい。この代わりに抗体を試料と混合し、次
でフルオレセイン標識化合物をそれに加えること
もできる。
合物を加えその次に抗体との混合物を作ることが
好ましい。この代わりに抗体を試料と混合し、次
でフルオレセイン標識化合物をそれに加えること
もできる。
螢光測定で試料中のアミノグリコシド抗生物質
を定量することは標識曲線を使つて便宜的に行な
うことができる。どんな特殊な系(すなわち抗生
物質/フルオレセインで標識された抗生物質また
は他の化合物/抗血清)に対する標準曲線は例え
ば次のようにして得ることができる。検定すべき
抗生物質の濃度既知の溶液を正常な血清または適
当な緩衝剤とプールして作り上げる。各溶液に、
一定の既知量のフルオレセインで標識された抗生
物質〔以下、フルオレセイン標識抗生物質とも呼
ぶ〕または他の化合物および充分な抗血清を加え
て、抗血清の予め定めた希釈度をもつた溶液を作
る。次に溶液の螢光強度を測定しそしてフルオレ
セイン標識されない抗生物質の濃度に対する螢光
強度の標準曲線がプロツトされる。
を定量することは標識曲線を使つて便宜的に行な
うことができる。どんな特殊な系(すなわち抗生
物質/フルオレセインで標識された抗生物質また
は他の化合物/抗血清)に対する標準曲線は例え
ば次のようにして得ることができる。検定すべき
抗生物質の濃度既知の溶液を正常な血清または適
当な緩衝剤とプールして作り上げる。各溶液に、
一定の既知量のフルオレセインで標識された抗生
物質〔以下、フルオレセイン標識抗生物質とも呼
ぶ〕または他の化合物および充分な抗血清を加え
て、抗血清の予め定めた希釈度をもつた溶液を作
る。次に溶液の螢光強度を測定しそしてフルオレ
セイン標識されない抗生物質の濃度に対する螢光
強度の標準曲線がプロツトされる。
このような曲線は本発明において例えば次のよ
うにして使うことができる。検定すべき抗生物質
を含み、そして緩衝剤を含んでいてもよい生物学
的液体試料の既知容量に対して、標準曲線作成用
に使われるフルオレセインで標識された抗生物質
または他の化合物の一定既知量が加えられる。次
いである量の抗血清が加えられて標準曲線決定に
使われる抗血清の希釈物が作られる。生成した混
合物の螢光強度が測定され、そして生物学的液体
試料中の抗生物質の量が標準曲線から定量され
る。
うにして使うことができる。検定すべき抗生物質
を含み、そして緩衝剤を含んでいてもよい生物学
的液体試料の既知容量に対して、標準曲線作成用
に使われるフルオレセインで標識された抗生物質
または他の化合物の一定既知量が加えられる。次
いである量の抗血清が加えられて標準曲線決定に
使われる抗血清の希釈物が作られる。生成した混
合物の螢光強度が測定され、そして生物学的液体
試料中の抗生物質の量が標準曲線から定量され
る。
本発明の方法は特にジエンタマイシンの定量に
有用であるが、例えばストレプトマイシン、トブ
ラマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、アミ
カシンおよびさらに最近発見された例えばサイソ
マイシンやSchering20569のような他のアミノグ
リコシド抗生物質にも使うことができる。サイソ
マイシンとSchering20569の化学構造は次の通り
である。
有用であるが、例えばストレプトマイシン、トブ
ラマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、アミ
カシンおよびさらに最近発見された例えばサイソ
マイシンやSchering20569のような他のアミノグ
リコシド抗生物質にも使うことができる。サイソ
マイシンとSchering20569の化学構造は次の通り
である。
本発明方法によるジエンタマイシンの検定にお
いて使用するフルオレセイン標識は例えばジエン
タマイシンをフルオレセインイソチオシアネート
と反応させることによつてジエンタマイシンに付
けることができそれによつてフルオレセインチオ
カルバミンジエンタマイシン(以後FTC−Gと
略称する)が得られる。
いて使用するフルオレセイン標識は例えばジエン
タマイシンをフルオレセインイソチオシアネート
と反応させることによつてジエンタマイシンに付
けることができそれによつてフルオレセインチオ
カルバミンジエンタマイシン(以後FTC−Gと
略称する)が得られる。
螢光を消すことは標識とそして使つたフルオレ
セインに依存するのみならず抗生物質と抗血清の
性質にも依存する。後者はまたその系全体におけ
るそれの適当性を顧慮して選ばれなければならな
い。再び言うが、通常の試行と実験で特殊な抗生
物質/フルオレセインで標識された抗生物質の系
において特殊な抗血清が適当であるか否かが明ら
かにされるであろう。カルボジイミド法によつて
牛の血清アルブミンに結合したジエンタマイシン
を注射することによつて作られた家兎の抗血清は
フルオレセイン標識ジエンタマイシンに対して満
足なものであることが本発明者によつて発見され
た。ジエンタマイシン/FTC−G/家兎抗血清
の特殊なケースではフルオレセイン標識と抗体分
子の基との間の相互作用によつて螢光の消去が起
ることを本発明者は信じている。
セインに依存するのみならず抗生物質と抗血清の
性質にも依存する。後者はまたその系全体におけ
るそれの適当性を顧慮して選ばれなければならな
い。再び言うが、通常の試行と実験で特殊な抗生
物質/フルオレセインで標識された抗生物質の系
において特殊な抗血清が適当であるか否かが明ら
かにされるであろう。カルボジイミド法によつて
牛の血清アルブミンに結合したジエンタマイシン
を注射することによつて作られた家兎の抗血清は
フルオレセイン標識ジエンタマイシンに対して満
足なものであることが本発明者によつて発見され
た。ジエンタマイシン/FTC−G/家兎抗血清
の特殊なケースではフルオレセイン標識と抗体分
子の基との間の相互作用によつて螢光の消去が起
ることを本発明者は信じている。
本発明の方法はいわゆる競合結合を含み、それ
には抗体(抗血清)の限られた量と結合する標識
されたまたはされていない抗原(抗生物質)の間
に競合が存在するということが認められるであろ
う。競合結合免疫検定は非常によく知られてい
る。そして通常それには必ず遊離抗原からの結合
体:抗原複合体の分離が含まれる。この分離工程
(それは例えばRIAでは必要である)は実際に不
便なものである。しかしながら本発明方法は何ら
かの分離工程も含まない、そしてこれが本発明方
法を連続流動型の分析に理想的に適したものにし
ているのである。したがつて本発明方法はここに
述べる連続流動式に行なわれる方法およびそれに
対する装置をも含むものである。
には抗体(抗血清)の限られた量と結合する標識
されたまたはされていない抗原(抗生物質)の間
に競合が存在するということが認められるであろ
う。競合結合免疫検定は非常によく知られてい
る。そして通常それには必ず遊離抗原からの結合
体:抗原複合体の分離が含まれる。この分離工程
(それは例えばRIAでは必要である)は実際に不
便なものである。しかしながら本発明方法は何ら
かの分離工程も含まない、そしてこれが本発明方
法を連続流動型の分析に理想的に適したものにし
ているのである。したがつて本発明方法はここに
述べる連続流動式に行なわれる方法およびそれに
対する装置をも含むものである。
本発明による連続流動分析においては、試料と
抗体とフルオレセインで標識された化合物との混
合物が導管を通されそして螢光が測定される。米
国特許第2797149号明細書に記載された好ましい
方法では混合物の個個のセグメントが次次と導管
を通され、不活性流体のセグメント(例えば空
気)そして所望ならば洗浄液体のセグメントで分
離される。この混合物を導管自体の中で作ること
ができる。すなわち混合物中にある成分、さらに
1つのあるはそれ以上の成分のセグメントを導管
に供給することによつて混合物の流れがそこを通
りながら導管中において各成分の混合が起こるの
である。
抗体とフルオレセインで標識された化合物との混
合物が導管を通されそして螢光が測定される。米
国特許第2797149号明細書に記載された好ましい
方法では混合物の個個のセグメントが次次と導管
を通され、不活性流体のセグメント(例えば空
気)そして所望ならば洗浄液体のセグメントで分
離される。この混合物を導管自体の中で作ること
ができる。すなわち混合物中にある成分、さらに
1つのあるはそれ以上の成分のセグメントを導管
に供給することによつて混合物の流れがそこを通
りながら導管中において各成分の混合が起こるの
である。
主として本発明方法では何らの分離工程も必要
ではないという事実の結果として、今問題として
いる薬剤の分析が比較的簡単にこの連続流動式で
行なわれるということは本発明の非常に有利な特
徴である。このようにして導管を流れる混合物は
直接に(あるいは通つて)螢光セルに達し直接測
定に供される。それゆえに本発明方法によつて、
従来の公知先行技術では困難ないし不可能であつ
た連続流動ベースによる特殊の薬剤の検定が可能
となる。
ではないという事実の結果として、今問題として
いる薬剤の分析が比較的簡単にこの連続流動式で
行なわれるということは本発明の非常に有利な特
徴である。このようにして導管を流れる混合物は
直接に(あるいは通つて)螢光セルに達し直接測
定に供される。それゆえに本発明方法によつて、
従来の公知先行技術では困難ないし不可能であつ
た連続流動ベースによる特殊の薬剤の検定が可能
となる。
本発明の利点の中には次のようなものがあ
る。: 1 容易に使用できそして廉価な出発物質から
FTC−Gがすぐれた収率で容易に作られる。
る。: 1 容易に使用できそして廉価な出発物質から
FTC−Gがすぐれた収率で容易に作られる。
2 FTC−Gは良好な貯蔵寿命をもつている。
3 放射線危害も放射活性計数装置の必要もな
い。
い。
4 何らの分離工程を必要としない。
5 測定は在来の螢光光度計による。
6 上記4および5のゆえに操作は容易に自動化
できる。
できる。
7 検定は非常に迅速である。抗体は、FTC−
Gそしてジエンタマイシンの間の免疫学的平衡
に到達するのは僅僅数分でよく、その後で螢光
測定だけで結果が得られる。
Gそしてジエンタマイシンの間の免疫学的平衡
に到達するのは僅僅数分でよく、その後で螢光
測定だけで結果が得られる。
8 交差反応に関して先になされた意見に従え
ば、この検定は特殊な抗生物質に対して免疫特
性を現わすことができる。
ば、この検定は特殊な抗生物質に対して免疫特
性を現わすことができる。
9 必要とされる血清試料のサイズは非常に小さ
い。それぞれ個個の検定には5μまたはそれ
以下で足りる。
い。それぞれ個個の検定には5μまたはそれ
以下で足りる。
本発明がより充分に理解されるように説明する
ために次の実施例を示す。
ために次の実施例を示す。
例 1
フルオレセインで標識つけられたジエンタマイ
シン(FTC−G)の調製 ジエンタマイシン(1mM)とフルオレセイン
イソチオシアネート(FITC)(1.25mM)とを
0.05M Na2CO3/NaHCO3(緩衝液)中でPH9.0、
室温で2時間反応させる。反応混合物2mlをG−
15級セフアデツクスのカラム(1×97cm)に仕込
み、そして上記のようなNa2CO3/NaHCO3緩衝
液で流速1.8ml/時で溶出させる。カラムの画分
(1.8ml)を使つて放射免疫検定でジエンタマイシ
ン含量を検定し、そして螢光光度計でフルオレセ
イン含量を検定した。添付の第1図はその結果を
示す。未反応のジエンタマイシンが先ずカラムを
出る。その次にFTC−G生成物が出て、ジエン
タマイシンのピークからよく分離した。未反応の
FITCは非常に強くG−15カラム上に保留されて
溶出しなかつた。
シン(FTC−G)の調製 ジエンタマイシン(1mM)とフルオレセイン
イソチオシアネート(FITC)(1.25mM)とを
0.05M Na2CO3/NaHCO3(緩衝液)中でPH9.0、
室温で2時間反応させる。反応混合物2mlをG−
15級セフアデツクスのカラム(1×97cm)に仕込
み、そして上記のようなNa2CO3/NaHCO3緩衝
液で流速1.8ml/時で溶出させる。カラムの画分
(1.8ml)を使つて放射免疫検定でジエンタマイシ
ン含量を検定し、そして螢光光度計でフルオレセ
イン含量を検定した。添付の第1図はその結果を
示す。未反応のジエンタマイシンが先ずカラムを
出る。その次にFTC−G生成物が出て、ジエン
タマイシンのピークからよく分離した。未反応の
FITCは非常に強くG−15カラム上に保留されて
溶出しなかつた。
FTC−G製品は凍結するかまたは4℃で溶液
中に貯えられた。電気泳動特性は1つの主バンド
(モノ−FTC−標識ジエンタマイシンと見られ
る)と2つの小バンド(ポリ−FTC−標識ジエ
ンタマイシンと見られる)を示した。
中に貯えられた。電気泳動特性は1つの主バンド
(モノ−FTC−標識ジエンタマイシンと見られ
る)と2つの小バンド(ポリ−FTC−標識ジエ
ンタマイシンと見られる)を示した。
下記引用のFTC−Gの濃度は放射免疫検定に
よつて評価されたジエンタマイシン含量に基づく
ものである。
よつて評価されたジエンタマイシン含量に基づく
ものである。
例 2
抗ジエンタマイシン血清の調製
カルボジイミド法によつて牛の血清アルブミン
に結合したジエンタマイシンで家兎を免疫した。
に結合したジエンタマイシンで家兎を免疫した。
例 3
ジエンタマイシンの螢光消去免疫検定
(i) 抗体希釈曲線
最適の検定条件を選ぶために、0.1Mりん醸
ナトリウム緩衝液PH7.5中のFTC−G16.4ng/
ml溶液0.5mlを同じ緩衝液中の抗血清2倍希釈
液(1ml)に加えた。平衡になるまで2〜3分
間おいた後螢光強度を測定した(第2図参
照)。この曲線から1.5ml中の最終抗体希釈度1/
240が標準曲線の構成のために選ばれた。
ナトリウム緩衝液PH7.5中のFTC−G16.4ng/
ml溶液0.5mlを同じ緩衝液中の抗血清2倍希釈
液(1ml)に加えた。平衡になるまで2〜3分
間おいた後螢光強度を測定した(第2図参
照)。この曲線から1.5ml中の最終抗体希釈度1/
240が標準曲線の構成のために選ばれた。
(ii) 標準曲線
ジエンタマイシンを既知量でプールされた正
常な人間の血清に加えた。これらの標準試料の
アリコートを0.1Mりん酸ナトリウム緩衝液PH
7.5中で1/50に希釈した。希釈された標準試料
の0.5mlに同じ緩衝液中FTC−Gの16.4ng/ml
溶液0.5mlを加え、次で同じ緩衝液中の1/80に
希釈された抗血清0.5mlを加えた。平衡に達す
るように2〜3分間おいた後検定する混合物の
螢光強度を測定した。プールされた正常な人間
の血清の固有螢光が検定する混合物の全螢光強
度にどれくらい寄与するかを算定するには、希
釈された標準試料0.5mlのりん酸塩緩衝液1ml
を加えて独立に螢光を測定して求めた。検定す
る混合物の全螢光強度から血清固有の螢光強度
を差引くことによつて第3図に示される標準曲
線が作られた。
常な人間の血清に加えた。これらの標準試料の
アリコートを0.1Mりん酸ナトリウム緩衝液PH
7.5中で1/50に希釈した。希釈された標準試料
の0.5mlに同じ緩衝液中FTC−Gの16.4ng/ml
溶液0.5mlを加え、次で同じ緩衝液中の1/80に
希釈された抗血清0.5mlを加えた。平衡に達す
るように2〜3分間おいた後検定する混合物の
螢光強度を測定した。プールされた正常な人間
の血清の固有螢光が検定する混合物の全螢光強
度にどれくらい寄与するかを算定するには、希
釈された標準試料0.5mlのりん酸塩緩衝液1ml
を加えて独立に螢光を測定して求めた。検定す
る混合物の全螢光強度から血清固有の螢光強度
を差引くことによつて第3図に示される標準曲
線が作られた。
例 4
患者試料中のジエンタマイシンの検定
ジエンタマイシンによる治療を受けている患者
からの血清試料を例3の(ii)に述べた方法によつて
検定した。各血清試料の独立に測られた固有の螢
光の寄与は相当する定量混合物の全螢光強度から
差引かれた。そしてその結果が血清試料中のジエ
ンタマイシンの量を適当な標準曲線から検定する
のに用いられた。
からの血清試料を例3の(ii)に述べた方法によつて
検定した。各血清試料の独立に測られた固有の螢
光の寄与は相当する定量混合物の全螢光強度から
差引かれた。そしてその結果が血清試料中のジエ
ンタマイシンの量を適当な標準曲線から検定する
のに用いられた。
第4図は螢光消去免疫検定で測つたジエンタマ
イシン水準と、別の無関係の研究室で今までに確
立された生物学的検定で測定した水準との間の相
関関係を示す。最もよく合つた計算された線が示
されている。生物学的検定に認められる不精確度
を考えるならば、この2つの方法の間の一致は、
受容できるものであり臨床目的には満足なもので
ある。
イシン水準と、別の無関係の研究室で今までに確
立された生物学的検定で測定した水準との間の相
関関係を示す。最もよく合つた計算された線が示
されている。生物学的検定に認められる不精確度
を考えるならば、この2つの方法の間の一致は、
受容できるものであり臨床目的には満足なもので
ある。
例 5
ジエンタマイシンの自動化された検定用連続流
動系 第5図は連続流動検定に適する流動系の1つの
型を示す。この系は試料流入ライン1、FTC−
G流入ライン2、空気流入ライン3および抗血清
流入ライン4から成る。ライン2と3はセグメン
ター(Segmenter)6で出会い、このセグメンタ
ーはライン1がライン2に合する接合部7に連結
している。接合部7の下降流ライン2には混合コ
イル8がついており、そしてライン4が接合する
接合部9に通じる。9の下降流は混合コイル10
にそして最後には排液出口12をもつ螢光光度計
11に連結する。螢光セルの排出口13の下降流
はライン5に連結し、それから排液として出る。
螢光光度計11は記録計14に結合する。
動系 第5図は連続流動検定に適する流動系の1つの
型を示す。この系は試料流入ライン1、FTC−
G流入ライン2、空気流入ライン3および抗血清
流入ライン4から成る。ライン2と3はセグメン
ター(Segmenter)6で出会い、このセグメンタ
ーはライン1がライン2に合する接合部7に連結
している。接合部7の下降流ライン2には混合コ
イル8がついており、そしてライン4が接合する
接合部9に通じる。9の下降流は混合コイル10
にそして最後には排液出口12をもつ螢光光度計
11に連結する。螢光セルの排出口13の下降流
はライン5に連結し、それから排液として出る。
螢光光度計11は記録計14に結合する。
操作に当つては、FTC−Gの制御された量が
ライン2に入り、そしてセグメンター6で空気で
区分けされる。被検試料(例えば血清)は必要程
度に希釈されて接合部7で区分けされた流れに導
入され、次にコイル8で混合される。次いで制御
された量の抗血清が接合部9導入され、さらに螢
光光度計11を通る前にコイル10で混合され
る。
ライン2に入り、そしてセグメンター6で空気で
区分けされる。被検試料(例えば血清)は必要程
度に希釈されて接合部7で区分けされた流れに導
入され、次にコイル8で混合される。次いで制御
された量の抗血清が接合部9導入され、さらに螢
光光度計11を通る前にコイル10で混合され
る。
例 6
ジエンタマイシンの自動化検定:標準曲線
プールされた正常な人間の血清にジエンタマイ
シンの既知量を加えた。これらの標準試料のアリ
コートはMgCl210mMを含む0.1Mトリス
(Tris)/HCl緩衝液PH7.5(“Tris/
MgCl2buffer”)中で1/100に希釈された。第5図
の流動系を使つて次の方法で標準曲線を作つた。
シンの既知量を加えた。これらの標準試料のアリ
コートはMgCl210mMを含む0.1Mトリス
(Tris)/HCl緩衝液PH7.5(“Tris/
MgCl2buffer”)中で1/100に希釈された。第5図
の流動系を使つて次の方法で標準曲線を作つた。
標準試料は流入ライン1へ0.16ml/分でポンプ
により送入した。各試料は1分間ポンプで送り、
次にトリス/MgCl2緩衝液を、次の試料をポンプ
で送る前1分間の洗浄期間にポンプで送つた。
0.1%V/VTriton X−100洗剤を含むトリス/
MgCl2緩衝液のFTC−G8.2ng/mlを流入ライン
2へ0.16ml/分でポンプで送つた。0.1%V/V
Triton X−100洗剤を含むトリス/MgCl2緩衝
液中に1/160に希釈された抗血清を流入ライン4
へ0.16ml/分でポンプで通した。混合した流れを
螢光計フローセル(flow cell)を通して0.42ml/
分でひいた。混合流の全螢光強度はチヤートレコ
ーダーに記録された。洗浄期間の間に記録された
強度(試料のないときのFTC−Gの抗血清への
最高結合に相当する)が検定する各混合物が螢光
計フローセルを通る間に記録された強度から差引
かれた。こんな方法で、各試料による螢光強度の
正味の増加が測定された。標準試料がこの系を通
つてしまつたときに、ライン2と4にポンプで送
られた溶液は0.1%V/V Triton X−100洗剤
を含むトリス/MgCl2緩衝液に変つた。標準試料
が次に再びこの系に通された。標準血清試料の固
有螢光強度はそれによつて測られた。各検定混合
物に対して測られた螢光強度の正味の増加から血
清の固有の螢光強度を差引くことによつて、第6
図に示される標準曲線が作られた。
により送入した。各試料は1分間ポンプで送り、
次にトリス/MgCl2緩衝液を、次の試料をポンプ
で送る前1分間の洗浄期間にポンプで送つた。
0.1%V/VTriton X−100洗剤を含むトリス/
MgCl2緩衝液のFTC−G8.2ng/mlを流入ライン
2へ0.16ml/分でポンプで送つた。0.1%V/V
Triton X−100洗剤を含むトリス/MgCl2緩衝
液中に1/160に希釈された抗血清を流入ライン4
へ0.16ml/分でポンプで通した。混合した流れを
螢光計フローセル(flow cell)を通して0.42ml/
分でひいた。混合流の全螢光強度はチヤートレコ
ーダーに記録された。洗浄期間の間に記録された
強度(試料のないときのFTC−Gの抗血清への
最高結合に相当する)が検定する各混合物が螢光
計フローセルを通る間に記録された強度から差引
かれた。こんな方法で、各試料による螢光強度の
正味の増加が測定された。標準試料がこの系を通
つてしまつたときに、ライン2と4にポンプで送
られた溶液は0.1%V/V Triton X−100洗剤
を含むトリス/MgCl2緩衝液に変つた。標準試料
が次に再びこの系に通された。標準血清試料の固
有螢光強度はそれによつて測られた。各検定混合
物に対して測られた螢光強度の正味の増加から血
清の固有の螢光強度を差引くことによつて、第6
図に示される標準曲線が作られた。
例 7
患者試料中のジエンタマイシンの自動化検定
ジエンタマイシン療法を受けている患者の血清
試料を例6に記載の方法によつて検定した。独立
に測られた各血清試料の固有螢光の寄与が、相当
する検定混合物に対して測られた螢光強度の正味
の増加から差引かれた。そしてその結果が血清試
料中のジエンタマイシンの量を検定するのに用い
られた。自動化された螢光消去免疫検定によつて
測つたジエンタマイシンの水準と、別の独立した
研究室で、確立した生物学的検定法を使つて測つ
た水準との間の相関関係は第7図に示される。最
もよく適合する計算されたラインが示されてい
る。生物学的検定技術に認められた不精確度を考
えれば、この2つの方法の間の一致は受容できる
ものであり、そして臨床目的には満足なものであ
る。
試料を例6に記載の方法によつて検定した。独立
に測られた各血清試料の固有螢光の寄与が、相当
する検定混合物に対して測られた螢光強度の正味
の増加から差引かれた。そしてその結果が血清試
料中のジエンタマイシンの量を検定するのに用い
られた。自動化された螢光消去免疫検定によつて
測つたジエンタマイシンの水準と、別の独立した
研究室で、確立した生物学的検定法を使つて測つ
た水準との間の相関関係は第7図に示される。最
もよく適合する計算されたラインが示されてい
る。生物学的検定技術に認められた不精確度を考
えれば、この2つの方法の間の一致は受容できる
ものであり、そして臨床目的には満足なものであ
る。
第1図はFTC−ジエンタマイシン(フルオレ
セインチオカルバミルジエンタマイシン)の調製
(カラムクロマトグラフイによる)を示す。第2
図は抗体希釈曲線を示す。第3図は標準曲線を示
す。第4図は患者の血清試料について螢光消去免
疫検定法と生物学的検定法との間の相関関係を示
す。第5図はジエンタマイシンの自動化検定用の
連続流動系を示す。第6図は自動化定量の標準曲
線を示す。第7図は患者の血清試料について自動
化された螢光消去免疫検定法と生物学的検定法と
の間の相関関係を示す。
セインチオカルバミルジエンタマイシン)の調製
(カラムクロマトグラフイによる)を示す。第2
図は抗体希釈曲線を示す。第3図は標準曲線を示
す。第4図は患者の血清試料について螢光消去免
疫検定法と生物学的検定法との間の相関関係を示
す。第5図はジエンタマイシンの自動化検定用の
連続流動系を示す。第6図は自動化定量の標準曲
線を示す。第7図は患者の血清試料について自動
化された螢光消去免疫検定法と生物学的検定法と
の間の相関関係を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 アミノグリコシド抗生物質に関して生物学的
液体試料を検定するにあたり、 (a) 試料と、後記抗体との結合により減少する螢
光性をもつフルオレセインで標識された化合物
と、検定する抗生物質および前記化合物に対す
る抗体と、から成る混合物を作り、 (b) 混合物の螢光を測定して前記化合物の螢光減
少量を定量し、それにより試料中に存在するア
ミノグリコシド抗生物質の量を定量することか
ら成る、 アミノグリコシド抗生物質に関する生物学的液体
試料の検定方法。 2 抗生物質としてジエンタマイシンを使う、前
項1に記載の方法。 3 フルオレセインで標識された化合物としてフ
ルオレセインで標識されたジエンタマイシンを使
う、前項1に記載の方法。 4 フルオレセインで標識されたジエンタマイシ
ンとして、フルオレセインチオカルバミルジエン
タマイシンを使う、前項3に記載の方法。 5 抗体として家兎の抗ジエンタマイシン抗血清
を使う、前項1に記載の方法。 6 連続流動方式で行う、前項1に記載の方法。 7 混合物のセグメントを導管に流し、それを不
活性流体のセグメントで分離し、そしてその混合
物から反応生成物を分離する工程を使わずに混合
物のセグメントの螢光を測定する、前項1に記載
の方法。 8 混合物のセグメントの螢光を標準結果と比較
して試料中のアミノグリコシド抗生物質を定量す
る、前項7に記載の方法。 9 混合物のセグメントを空気セグメントにより
分離する、前項7に記載の方法。 10 ジエンタマイシン、サイソマイシン、シエ
ーリンク20569、ストレプトマイシン、トブラマ
イシン、ネオマイシン、カナマイシンおよびアミ
カシンから成る群から選んだ抗生物質に関して生
物学的液体試料を検定するにあたり、 (a) 生物学的液体試料と (b) 後記抗体との結合により減少する螢光性を与
えるフルオレセインで標識される化合物と (c) 抗生物質およびフルオレセイン標識化合物に
対する抗体と の混合物を作り、この混合物の螢光を測定し、そ
の螢光を標準結果と比較し、そしてそれにより試
料中に存在する前記抗生物質の量を定量すること
から成る、 前記抗生物質に関する生物学的液体試料の検定方
法。 11 連続流動方式で行う、前項10に記載の方
法。 12 導管、 試料と、後記抗体との結合により減少する螢光
性をもつフルオレセインで標識された化合物と、
検定する抗生物質および前記化合物に対する抗体
と、から成る混合物を前記導管に通すための手
段、 混合物の螢光を測定するための手段、および 混合物の螢光を標準結果と比較して試料中の検
定すべき抗生物質の量を定量するための手段 から成る、螢光減少方法によるアミノグリコシド
抗生物質に関する生物学的液体試料の連続流動検
定を行うための装置。
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