JPS6135988B2

JPS6135988B2 -

Info

Publication number: JPS6135988B2
Application number: JP52113205A
Authority: JP
Inventors: Hideo Ooishi; Takao Nofuji; Yoshiharu Nawata; Hiroshi Okazaki; Hiroshi Sasaki; Kunio Ando; Haruki Ogawa
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-09-22
Filing date: 1977-09-22
Publication date: 1986-08-15
Also published as: EP0001287B1; DE2861670D1; JPS5446774A; US4214091A; EP0001287A1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な広範囲抗生物質No.2−200物
質およびその製造方法に関する。本発明者らは、微生物の産生する新規抗生物質
のスクリーニングを目的として研究を行なつたと
ころ、ある種の放線菌がβ−ラクタム系抗生物質
に感受性を有する緑膿菌変異株Ｇ−75、Ｍ−
57740の生育を強く阻止する抗生物質を産生蓄積
することを見出した。更に種々の検討の結果、そ
の培養物から有効物質を結晶として単離し、該有
効物質の構造をＸ線回析法により決定した。本物
質は新規抗生物質と認め、これをNo.2−200と称
した。本発明は、これらの知見に基づきさらに研
究の結果完成されたものである。すなわち本発明は、ノカルデイア属に属する
No.2−200生産菌を培地に培養し、培養物中に蓄
積せしめたNo.2−200を分離採取することを特徴
とする抗生物質No.2−200物質およびその製造方
法である。本発明において用いられる微生物は、ノカルデ
イア属に属し、かつNo.2−200を産生する能力を
有するものであればいずれでもよい。その一例と
しては埼玉県の土壤から分離されたノカルデイア
sp.No.2−200株（Nocardia sp.No.2−200）が挙
げられる。この菌株はATCCNo.31319および微工
研菌専第4171号として寄託されている。その菌学的性状は次のとおりである。 (1) 形態的特徴基生菌糸は分岐し、短かい気菌糸が着生す
る。気菌糸が着生しない状態のコロニーは黄茶
色を呈し、着生とともに白色となる。培養時間の経過とともに気菌糸は短稈菌状に
分断し、例えばシエークロース硝酸塩培地上で
21日間28℃培養を行なつた菌体の気菌糸は、大
部分Bacillus状の細胞に分断される。
Streptomycesにおいてみられるような胞子柄
は存在しない。基中菌糸は、ほとんどが稈菌状
に分断し多形性（Pleomorphic）である。以上の形態的諸性質から、本菌株はソフトタ
イプのノカルデイア属に属するものと判定され
る。 (2) 各種培地上の性状（28℃、18日後の性状）

【表】

【表】 (3) 生理的性質

【表】本発明の新規抗生物質No.2−200物質は後述
のような好気性、好ましくは液内条件の下で液
体栄養培地において生産菌ノカルデイアsp.
No.2−200を培養した際に産出される。 (4) 各種糖類の資化性（IPS−９培地）

【表】本発明の新規抗生物質No.2−200物質は、Ｘ
線回析の結果次のような化学構造を有する有機
化合物で従来全く知られていない新規物質であ
る。 No.2−200の平面構造は次のとおりである。理化学的性質は次のとおりである。 (1) 元素分析ＣＨＳ理論値（％） 62.86 6.67 15.23 実測値（％） 62.57 6.78 14.93 (2) 分子式 C₁₁H₁₄O₂S質量分析により測定した分子量
210 (3) 融点 124〜126℃ (4) 赤外部吸収スペクトル第１図に示すような赤外部吸収スペクトルを
持つている。なお、重要な吸収帯は次の表に示
す。表中の記号は次の意味を示す。 VS：大変強いＳ：強いＭ：中程度Ｗ：弱い VW：大変弱い brd：幅広い

【表】 (5) 核磁気共鳴スペクトル第２図に示すとおりである。なお、本図は重
メタノールに本物質を10％となるよう溶解し、
TMSを内部標準として60MHzで測定したもの
である。 (6) 紫外部吸収スペクトル第３図に示す通りである。メタノールに溶解し測定したもので、本物質
は中性条件で237mmおよび300mmに吸収極大を示
す。 (7) マススペクトル第４図に示すとおりである。 m/eは質量対荷電数を示し、各々のバーの長
さはピークm/e111を100とした際の相対強度を
表わす。 (8) 呈色反応 KMnO₄の脱色陽性Ｓの定性反応陽性モリツシユ反応陰性 (9) 溶剤に対する溶解性溶剤溶解度中性ないし酸性の水僅かに溶ける。アルカリ性の水よく溶けるメタノールよく溶けるアセトンよく溶ける酢酸エチルよく溶ける (10) 薄膜クロマトグラフイーにおけるＲ値（Kieselgel 60 F254、Art5729、E.Merck社製
使用）溶媒系Ｒベンゼン：アセトン（３：１） 0.3 アセトン 0.8 酢酸エチル 0.5 抗生物質No.2−200物質は酸性物質であり有機
塩基および無機塩基、例えばエタノールアミン、
トリエチルアミン、苛性ソーダ、苛性カリ、アン
モニア等と無毒の塩を容易に形成する。このよう
な塩は水溶性であり、本物質を注射薬として用い
る際は好ましい。ノカルデイアsp.No.2−200株はノカルデイア属
菌の場合と同様にその性状が変化し易く、例えば
紫外線、エツクス線、放射線、変異誘発剤等を用
いる人工的変異手段で容易に変異しうるものであ
り、このような手段で得た変異株であつても
No.2−200を産生、蓄積する能力を有するものは
すべて本発明の方法に使用できる。本発明の方法において、ノカルデイアsp.No.2
−200株を培養してNo.2−200を培地中に産生蓄
積させる方法としては固体培養と液体培養のいず
れでもよく、また液体培養の場合は静置培養、撹
拌培養、振盪培養、通気培養などいずれを実施し
てもよいが、大量生産には通気撹拌培養を行うの
が好適である。本発明の目的に用いられる培地の組成物として
は、通常の放線菌の培養に用いられるものが適用
される。例えば、炭素源として澱粉、ぶどう糖な
どの糖類、グリセリン、メタノール、エタノール
などのアルコール類、酢酸、リノール酸、パルミ
チン酸などの脂肪酸類、大豆油、綿実油、魚油な
どの油脂類をそれぞれ単独もしくは混合して用い
られる。窒素源としてはペプトン、大豆粉、綿実
粉；コーン・ステイープ・リカー（以下C.S.L.と
略す）、酵母、肉エキスなどの有機窒素源のほか
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、燐酸アンモニウムなどの無機アンモニ
ウム塩などの無機窒素源も用いることができる。
また、無機塩として炭酸カルシウム、塩化ナトリ
ウム、硝酸ナトリウム、塩化カリウム、燐酸一カ
リウム、燐酸二カリウムなどの通常放線菌の培養
に必要な無機塩類を単独もしくは適宜組合せて使
用することができる。さらに必要に応じて重金属
塩類、ビタミン類などのほか、シリコンオイル、
ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤
や界面活性剤などを添加してもよい。本発明の方
法においては、これらの栄養源を含む培地にノカ
ルデイアsp.No.2−200株を接種して培養が行なわ
れる。培養の温度は本菌の生育する温度範囲で適
宜選ばれるが、通常15〜35℃、好ましくは24〜32
℃で培養される。培養の時間は抗生物質No.2−
200物質の蓄積量が最大に達するまで培養すれば
よく12〜168時間、好しくは24〜144時間培養すれ
ばその目的を達成することができる。かくして培養物中に産生された抗生物質No.2
−200物質を分離採取するには、微生物の生産す
る代謝産物を採取するのに通常用いられる手段が
適宜利用される。本物質は酸性物質で液のPHによ
つて水および水と相互に混り合わない有機溶剤、
例えば酢酸エチル、エーテルの間の分酸系数が変
化するのを利用して採取することができる。すな
わち培養物中の抗生物質No.2−200物質は主とし
て培養液中に含まれるので、培養物から菌体を
分離して得られる培養液を鉱酸、例えば塩酸で
PH３に調整し、培養液と等量の酢酸エチルで抽
出すると１回の抽出操作でNo.2−200は酢酸エチ
ル層に転移される。酢酸エチル層を減圧濃縮する
とNo.2−200を含むシロツプが得られる。このよ
うにして得られたシロツプをシリカゲルＧ（エ・
メルク社製）およびセフアデツクスLH−20（フ
アルマシア社製）によるカラムクロマトグラフイ
ーで緑膿菌Ｇ−75、M57740株を検定菌として精
製するとNo.2−200は淡黄色針状結晶として得ら
れる。抗生物質No.2−200物質は、第１表に示すよう
に主としてグラム陰性細菌に対して抗菌活性を有
するが哺乳動物に対してはほとんどうるべき毒性
を示さない。本物質の各種病原性細菌の生育を微
量で阻止するが、とりわけサルモネラ属およびセ
ラチア属細菌に強い抗菌活性を発揮するとが大き
な特徴の一つである。また、毒性は極めて弱く遅
延性の毒性は認められない。したがつて、抗生物
質No.2−200物質はヒトおよび動物の微生物感染
症に対する治療および予防剤として極めて有用で
ある。

【表】

【表】実施例１グルコース３％、乾燥ブイヨン（栄研化学社
製）１％、酵母エキス0.2％、炭酸カルシウム0.2
％からなる培地100mlを500ml容三角フラスコに分
注し滅菌する。これにノカルデイアsp.No.2−200
株（微工研寄託受理番号第4171号）胞子を接種し
た。これをロータリー式振盪機上で28℃、４日間
振盪培養した。この400mlの培養液を種としグル
コース１％、澱粉２％、C.S.L.2％、乾燥酵母0.1
％、炭酸カルシウム0.2％（PH6.5滅菌前）よりな
る滅菌培地20を注入した30ステンレス小型発
酵槽に移植し、通気10／分、撹拌400回転／
分、28℃、72時間培養した。実施例２実施例１のようにして培養したノカルデイア
sp.No.2−200株の培養液をラジオライト−800
（昭和化学社製）をプレコートした押心脱水器に
より菌体を分離して得られた液（約18）に希
塩酸を加えてPH3.0に調整する。PHを調製した液
に等量の酢酸エチルを加えてよく混和し抗生物質
No.2−200物質を抽出する。乳濁した液にラジオ
ライト−800を加えて過し、液を放置して２
層に分離するまで待つ。下層の水層を捨てて、上
層の酢酸エチル層をあつめ芒硝で脱水したのち減
圧濃縮すると抗生物質No.2−200物質を含む油状
物が得られる。実施例３実施例２のようにして得られた油状物をシリカ
ゲルG200ｇをベンゼンに懸濁して作製したカラ
ムの上端に加え、カラムをベンゼン：アセトン
（95：５）の組成を有する混合溶媒２で溶出し
て不純物を除去する。カラムをさらにベンゼン：
アセトン（９：１）よりなる混合溶媒２で溶出
し、溶出物を15mlづつ分画採取する。緑膿菌Ｇ−
75、M57740に抗菌活性を示す画分を集めて濃縮
すると油状の粗抗生物質No.2−200物質を７ｇ得
られた。実施例４実施例３のようにして得られた抗生物質No.2
−200物質含有油状物をセフアデツクスLH−20
75ｇをベンゼン：アセトン（９：１）に懸濁して
作製したカラムの上端に加え、ベンゼン：アセト
ン（９：１）よりなる混合溶媒４で溶出する。
溶出液を15mlづつ分画採取し、緑膿菌Ｇ−75、
M57740に抗菌活性を示す画分を集めて減圧濃縮
する。得られた淡黄色油状物をデシケーター内で
真空乾燥すると全体が固化して結晶化する。この
粗結晶をベンゼン：アセトン（９：１）よりなる
混合溶媒に加熱溶解したのち冷所において再結晶
する。収量２ｇ実施例５実施例４で得られた抗生物質No.2−200結晶は
第２表に示すごとき抗菌スペクトラムを有する。
被検菌は寒天平板希釈法により37℃で24時間培養
した後の生育を判定した。被検菌はNB培地（栄
研化学社製）に37℃で一夜培養した培養液を10³
〜10⁴倍希釈したものを１エーゼ寒天平板上にス
タンプした。なお、使用した寒天平板培地は、 NA：栄養寒天（Nutrient Ager、栄研化学社
製） NA＋G6P：グルコース−６−燐酸（50μｇ/ml）
添加栄養寒天 Anti−3A：アンチビオテイクメデイウムNo.3
寒天（Antibiotic medium No.3 Agar，Difco
社製） MHA：ミユラーヒントン寒天（Mueller
Hinton Agar、栄研化学社製）である。

【表】

【表】実施例６実施例４で得た抗生物質No.2−200結晶を滅菌
蒸留水に浮遊させ、５％苛性ソーダを加えてPH
7.0に調整し溶解する。この溶液を５週令のddY
系雄性マウスに投与して急性毒性を調べた。投与
後10日間飼育し、その間体重、摂食および飲水量
を測定し遅延性に起る毒性も併せ調べた。その結
果、１回に投与における半数致死量LD₅₀は静脈
注射で705mg/Kg、腹腔内注射で810mg/Kgで遅延性
の毒性は全く認められなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はNo.2−200物質の赤外部吸収スペクト
ル図、第２図は同物質の核磁気共鳴スペクトル
図、第３図は同物質の紫外部吸収スペクトル図、
第４図は同物質のマススペクトル図である。

Claims

【特許請求の範囲】１式で表わされる抗生物質No.2−200物質。２ノカルデイア属に属するNo.2−200生産菌を
培地に培養し、培養物中に蓄積せしめたNo.2−
200を分離採取することを特徴とする抗生物質
No.2−200物質の製造方法。