JPS61260878A - 組換え微生物の殺菌法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、組換え微生物の殺菌法に関する。さらに詳し
くは、生理活性物質を産生ずる組換え微生物の培養細胞
を、該物質の物理化学的性質および生理学的性質を損う
ことなく、該微生物を殺菌する方法に関する。

同、ここで言う岨換え微生物は、組換えＤＮＡ技術或い
は遺伝子操作技術を用いて造成されたプラスミドもしく
はファージベクターによって形質転換された生理活性ポ
リペプチド産生能を有する微生物を言う。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 組換え微生物の培養物から該微生物の産生ずる有用物質
を得ようとする場合、培養ならびに該物質の抽出・精製
工程において、用いた組換え微生物の再増殖防止ならび
に組換えＤＮＡ実験指針から、培養微生物の殺菌が必要
とされる。組換え微生物が外部にもれないようにするに
は、培養から精製までのすべての工程を密閉して行うこ
とも考えられるが、現実には容易でなく、組換え微生物
の培養後、抽出・精製に移る前に、培養微生物を何らか
の方法で完全に殺菌することが上記指針から強く求めら
れている。

微生物の殺菌法としては加熱や菌体破壊などの物理学的
方法や塩素系薬剤、キシレン系薬剤、過酸化水素などを
用いる化学的な方法が用いられているが、これらの殺菌
法は微生物を殺菌できても微生物自身からあるいは微生
物培養物から目的とする物質を抽出・精製して得ようと
する場合、該目的物の本来の性質を損なう場合がある。

また、塩素系薬剤や過酸化水素を使用すると培養容器ま
たはタンクさらには培養システムにおけるパイプやパル
プなどを腐蝕したり、キシレン系薬剤では爆発等の不安
があり、特に大量の培養組換え微生物の殺菌には好まし
いものではない。

本発明者らは、上記の問題点を解決すべく、前にクロロ
へキシジンの塩を含む水溶液、またはベンザルコニウム
の塩を含む水溶液を培養組換え微生物用の殺菌剤として
用いる方法を見出したが（特願昭５９−２８１３７７お
よび同５９−２８１３７８参照）、更に有効な殺菌剤に
ついて鋭意研究を続けた結果、パラヒドロキシ安息香酸
エステル類が培養組換え微生物を殺菌するのに非常に有
効であることを見出し、本願発明を完成した。

（問題点を解決するための手段） 本発明の目的は低濃度のパラヒドロキシ安息香酸を組換
え微生物の培養液に加えることにより、菌体内に産生さ
れた有用物質の物理化学的および生理学的性質を損うこ
となく、該微生物を完全に死滅させることにある。

パラヒドロキシ安息香酸エステル類は、防腐、防カビ作
用を有することから、従来より保存料として用いられて
いる。特にパラヒドロキシ安息香酸のエチル、プロピル
、イソプロピル、ブチル、イソブチルの各エステルは食
品添加物と認められており、又メチル、エチル、プロピ
ル、ブチルの各エステルは各々パラオキシ安息香酸メチ
ル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プ
ロピル、パラオキシ安息香酸ブチルの名称で医薬品添加
物として日本薬局法に収載されている（日本薬局法、第
１０改正、Ｄ−７０２，６９５。

７０１．６９９）。しかしながら、培養微生物（特に有
用物質産生組換え微生物）の殺菌剤として、これらパラ
ヒドロキシ安息香酸エステル類が用いられた例はこれま
で知られていない。これらエステル類は殺菌作用に優れ
ているばかりでなく、ヒトに対する毒性が低いため使用
者に危険を及ぼすこともなく、また水に難溶性であるこ
とから殺菌処理後の培養液からの分離も非常に容易であ
る。

従って、特に大量培養された微生物（特に有用物質産生
組換え微生物）１に殺菌する場合には極めて有用である
。

本発明において、各種のパラヒドロキシ安息香酸エステ
ル類を用いることができるが、特に炭素数２〜５、好し
くは３〜４の直鎖または分岐鎖アルキルのエステル類が
望ましい。また、組換え微生物の産生ずる有用物質の諸
性質を損うことなく該微生物を殺菌し得るパラヒドロキ
シ安息香酸エステル類の使用濃度は用いる組換え微生物
の糧類（菌株）、培養濃度、培養に用いる培地の糧類に
よって異なるが、最終濃度として０．１〜５％、好しく
け０．５〜３．０％である。

本発明の殺菌方法はパラヒドロキシ安息香酸のエステル
を上記の濃度となるように、微生物培養液に加えて適当
な時間、例えば３０分から６時間、掻破または撹拌すれ
ば良い。処理温度は特に制限されないが、有用物質の性
質が損われないように配慮することが望まれる。

殺菌剤として添加された上記エステル類は水に難溶性の
ため、上記のようにして殺菌された組換え微生物培養菌
体（死菌体）を遠心分離することによって容易に除去す
ることができる。また、培養液中に溶解した微量の上記
エステル類は、この後の目的物質の精製過程で完全に除
去可能である本発明の殺菌法によれば、殺菌された組換
え微生物から、目的とする有用生理活性ポリペプチドを
その物理化学的および生理学的性質を損うことなく抽出
・精製することができる。

以下の実施例により本発明を更に詳しく説明する。実施
例では組換え微生物としてヒト・インターフェロン活性
を有するポリペプチド産生能を有する大腸菌形質転換体
の殺菌例について述べるが本発明の殺菌法は大腸菌に限
定されるものでなくまた組換え微生物の産生ずる有用物
質もヒト・インターフェロン活性を有するポリペプチド
に限定されるものではない。

実施例１゜ ヒト・インターフェロン活性を有するポリペプチドの生
産能を有する組換え微生物（大腸菌）Ｗ３１１０／ｐＩ
Ｎ５Ｔ４（特開昭６０−２４１８７に開示のプラスミド
ルｌＮ５ＧＩＦ５４上のアンピシリン耐性遺伝子をテト
ラサイクリン耐性遺伝子に置き換えられたプラスミドｐ
ｌＮ５Ｔ４によって。　　形質転換された大腸菌ｗａｌ
ｌｏ）ｔ−、ポリ４ブト７３％、酵母エキス２％、ＫＭ
ｔＰＯ，０，５％、ＭｆＳ：０．・７Ｈ，００，０１％
およびテトラサイクリン２０μＩ／−を含む培地２０１
中で３６時間、３０℃で通気撹拌培養した。この時の培
養液中の該大腸菌の生菌数は１ｄ当り約１．０　Ｘ　１
０”ＣＦＵ　（コロニー形成単位）であった。この培養
液３０１をチューブに分注し、第１表に示したバラヒド
ロキ、　　シ安息香酸またはそのエステル類を０．１％
または、１．０％になる様に加え、３０℃で１時間振盪
後、培養液中の大腸菌の生菌数およびインターフェロン
活性（抗ウィルス活性：ＡＶＡ）を調べた。

第１表に示した結果によれば、パラヒドロキシ安息香酸
のイソプロピル、ブチル、イソブチル、セックブチルの
各エステルでは１％濃度で組換え微生物（大腸菌）を充
分殺菌できること（但し、ブチルエステルでは若干の生
菌数が認められた）、またセックブチルエステルでは０
．１％の濃度でも充分な殺菌ができ、またイソプロピル
エステルも０．１％濃度で若干の生菌数を示すまで殺菌
することができ細胞破砕抽出と組み合せれば実用可能で
ある。

一万、インターフェロン活性（抗ウィルス活性）は、エ
ステルが低濃度（０，１％）の時は対照（殺菌剤無添加
）と変らないが、濃度が高くなると活性が損われる場合
（イソプロピルエステル、セックブチルエステル）と濃
度が高くなっても活性が損われない場合（ブチルエステ
ル、イソブチルエステル）とがみられた。インターフェ
ロン活性が保持され、しかも殺菌が充分できることが望
まれるので、この結果からは１％のイソブチルエステル
、０，１％のセックブチルが好しいことが判明した。し
かしながら、適当な濃度を用いることにより他のエステ
ル類、例えばブチルエステル、イソプロピルエステルも
使用可能である。

尚、組換え微生物（大腸菌）の生菌数は培養液１ゴから
遠心（１２，０００ｒｐｙｒＬ、５分）して得られる沈
澱物を、無菌の生理食塩水で３回洗浄後、同食塩水１ゴ
を加え、その懸濁液または食塩水で適当に希釈した懸濁
液０．１１を、培養に用いた同じ培地（但し２％寒天を
含む）上に塗布し、３７℃で２４時間培養後生じるコロ
ニー数を計数することにより行った。生菌の測定は同じ
サンプルについて最低２回行い、その平均値を第１表に
示した。

また、インターフェロン活性は、培養液から遠心分離し
て得られる菌体を、１　ｍＡ！　ＺｎＣ＆を含む２０　
ｍＷ　）リス塩酸バッファー（ｐＨ７，４）に懸濁した
後、フレンチプレスホモジナイザーによって細胞を破砕
し、遠心（１２，０００ｒｐｒｎ、　５分間）して得ら
れた上清について常法に従い測定した。

アスパラギン酸ナトリウム１％、酵母エキス０．２％、
ＫＨ２ＰＯ４０，５％、グルコース２％およびテトラサ
イクリア２０μｇ〜の組成を持つ培地を用いて、実施例
１と同様に培養して得られたＷＢ２１０／ｐｌＮ５Ｔ４
の培養液について、第２表に示したパラヒドロキシ安息
香酸の各エステルを、０．１％、１．０％、３．０％の
各濃度となるように添加し、更に実施例１と同様な方法
で生菌数およびインターフェロン活性（抗ウィルス活性
）を調べた。結果は第２表に示す。

第２表の結果によれば、ブチルエステルは帆１％、１．
０％および３．０％のいずれの濃度においても完全に組
換え大腸菌を殺菌し、しかもこの組換え大腸菌の産生ず
るインターフェロン活性には全く影響を及ぼさなかった
。また、イソブチルエステルも１．０％および３．０％
の濃度で同様な効果を示した。プロピルエステルまたは
イソプロピルエステルは前記の２つのエステルに比較し
て効果が若干低いが、適当な濃度を選択することによっ
て実用の可能性がある。

実施例３゜ 実施例１および実施例２で用いた培地台２０１中での、
パラヒドロキシ安息香酸ブチル０．１％、０．５％濃度
における殺菌効果と抗ウィルス活性に及ぼす影響を調べ
た。培養条件は３０℃での３６時間通気撹拌培養とし、
パラヒドロキシ安息香酸ブチルを培養器に上記濃度とな
るように直接投入し、３０℃、１時間、４５０　ｒｐｍ
で撹拌した。実施例１と同様に殺菌効果およびインター
フェロン活性（抗ウィルス活性）を調べた。

結果を第３表に示す。

Ａ培地：アスパラギン酸ナトリウム１％、酵母エキス０
．２％、グルコース２％、ＫＨ２ＰＯ４０，５％、テト
ラサイクリア２０μｇ７ＦＩＬＥＢ培地：ポリイブトン
３％、酵母エキス２％、ＫＨ，ＰＯ，０，５％、ＭｆＳ
Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０１％、テトラサイクリン２０μｇ
／ＦＩＬＥ第３表に示された結果によれば、パラヒドロ
キシ安息香酸ブチル０．５％濃度の場合、両培地共生菌
が全く認められず、生産されたインターフェロン活性に
もほとんど影響が無かった。

この０．５％濃度の前記ブチルエステル殺菌処理後の培
養菌体または殺菌処理を行わない培養菌体からの抽出液
を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて得
た蛋白バンドのパターンは、両者質らなかった。即ち、
前記ブチルエステル０．５％濃度による殺菌処理によっ
ても、目的とするインターフェロン活性を有する蛋白は
何ら損われることなく抽出されることが確認された。

特許出願人　サントリー株式会社 （外５名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）組換え微生物の培養物から生理活性物質を抽出、精
   製する前の工程において、該微生物の培養液にパラヒド
   ロキシ安息香酸のエステルを加えて該培養微生物を殺菌
   することを特徴とする組換え微生物の殺菌法。 ２）パラヒドロキシ安息香酸のエステルが３または４個
   の炭素原子を持つアルキルのエステルである特許請求の
   範囲第１項記載の殺菌法。 ３）パラヒドロキシ安息香酸のエステルが４個の炭素原
   子を持つアルキルのエステルである特許請求の範囲第２
   項記載の殺菌法。 ４）パラヒドロキシ安息香酸のエステルを０．１％から
   ３％になるように培養液に加えることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の殺菌法。 ５）組換え微生物が生理活性物質を産生する微生物であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の殺菌法
   。 ６）前記生理活性物質がガンマ型インターフエロン活性
   を有するポリペプチドである特許請求の範囲第５項記載
   の殺菌法。 ７）生理活性物質を産生する組換え微生物が大腸菌であ
   る特許請求の範囲第５項または第６項記載の殺菌法。