JPH10501336A

JPH10501336A - 液体クロマトグラフィ樹脂の殺菌法

Info

Publication number: JPH10501336A
Application number: JP8501158A
Authority: JP
Inventors: ユングバウアー，アロイス; ピーターレットナー，ハンス
Original assignee: バイオセプラインコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 1998-02-03
Also published as: AU2658295A; EP0762919A1; CA2191351A1; AU685954B2; EP0762919A4; US5676837A; WO1995032783A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、強力な酸化剤による酸化に対して高い耐性を有する液体クロマトグラフィ樹脂の殺菌方法およびこの方法で使用するための殺菌溶液に関する。好適態様において、本発明は酸化耐性を有するクロマトグラフィ樹脂を過酢酸および４０％までのエタノールの水溶液と接触させることからなる。特に、この溶液を正に帯電したイオン交換樹脂の殺菌に使用する場合には、この溶液は好ましくは、この樹脂に対する過酢酸イオンの吸着を防止するために充分のイオン強度を有する酢酸塩緩衝液をさらに含有する。

Description

【発明の詳細な説明】液体クロマトグラフィ樹脂の殺菌法本発明は一般に、液体クロマトグラフィ樹脂の殺菌方法に関し、さらに特に強力な酸化剤による酸化に対して高い耐性を有する液体クロマトグラフィ樹脂の新規殺菌方法に関する。本発明はまた、強力な酸化剤による酸化に対して高い耐性を有する液体クロマトグラフィ樹脂の殺菌に使用するための殺菌溶液に関する。発明の背景液体クロマトグラフィは生体分子の溶液からの精製に関して現在利用することができる技術の中で最も強力で、かつまた慣用の技術の一つである。液体クロマトグラフィが考慮される用途の例には、医薬製剤からの微生物による毒素の除去、細胞培養フラクションからの組換えタンパク質の分離などが包含される。容易に認識できるように、かなりのこのような用途において、クロマトグラフィ樹脂が微生物により変色および（または）汚染されることは格別に望ましくないことである。この理由は、このような微生物が当該樹脂と接触する製剤の純度に有害に作用することがあることにある。従って、使用前および順次使用中の両方で、クロマトグラフィ樹脂に対して或る種の殺菌技術を適用することが慣用である。現在、クロマトグラフィ樹脂の殺菌に係わり数種の相違する殺菌技術が存在している。これらの技術の大部分は、樹脂をカラムに充填する前または後に、樹脂を殺菌性化学剤によって処理する操作を包含する。この特定の化学剤の選択は、殺菌される特定の樹脂にほとんど依存する。慣用の殺菌剤の一例には、中性またはより好ましくは酸性ｐＨのエタノール／水がある。この水性エタノールは、６０％〜７０％の濃度でその最高の殺菌効果を発揮する。しかしながら、濃度が高いほど容易に爆発することが証明されていることから、水性エタノールの最も慣用の濃度は約２０％である。残念なことに、エタノールは２０％の濃度で胞子殺滅効果を有しておらず、その効果は部分的に止どまり、発熱性物質は破壊されない。むしろ、２０％エタノールはリポ多糖分子の大型分子凝集体を不安定にする傾向を有するのみである。これらの理由で、２０％エタノールは静菌剤であると考えられるに過ぎない。エタノールと塩基または酸との混合物は若干さらに胞子殺滅性であるけれども、妥当な短いインキュベーション時間で、かつまた妥当な低温における殺菌を可能にするのに充分な胞子殺滅性は有していない。慣用の殺菌剤のもう一つの例は、水酸化ナトリウムである。水酸化ナトリウムは、クロマトグラフィ樹脂の再生および殺菌の両方で、バイオテクノロジイ工業界で広く使用されている。水酸化ナトリウムを殺菌剤として使用する場合の使用条件は、濃度（０．１Ｎ〜１Ｎ）、インキュベーション時間（数時間から数日）温度およびカラムに通すカラム容積（１から１０以上）の点で格別に変えることができる。０．１〜０．２Ｎの濃度で、室温において３０分間の条件で、水酸化ナトリウムはクロマトグラフィカラム内に存在する発熱性物質を幾分破壊することができる。この観点から見ると、発熱性物質がエタノールによっては実質的な影響を受けないが、アルカリ水酸化物に対しては感受性であることから、水酸化ナトリウムはエタノールよりも優れている。しかしながら、本明細書の図１（ａ）および１（ｂ）を参照することによって判るように、数時間のインキュベーション時間で０．５Ｎの濃度において、水酸化ナトリウムはビー．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子形成した微生物を完全に不活性化するには有効ではない［ファーマコペイアアンドザアメリカンミクロバイアルソサエティ（ＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａａｎｄｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｉｃｒｏｂｉａｌＳｏｃｉｅｔｙ）の推奨によりモデル微生物として、この場合にはビー．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が使用される］。実際に、明白なように、ビー．サブチリス胞子の微生物濃度をＮａＯＨを使用して有意に減少させるには、数十時間が必要である。（図１（ａ）および１（ｂ）に記載の結果を、図２（ａ）および２（ｂ）に記載の結果と比較することを希望する。この比較は４０％エタノール中で０．２ＮＮａＯＨの不活性化動態が、０．５ＮＮａＯＨの場合と比較して改善されることを示している。）クロマトグラフィカラムの殺菌に慣用のもう一種の化学剤には、酸（例えば、ＨＣｌ）、洗剤、例えばナトリウムＮ−ラウロイルサルコシネート（ＳＬＳ）および樹脂が充分の耐性を有する場合に、ＣＦ₃ＣＯＯＨ、ＣＨＣｌ₃およびＣＨＣｌ₃とエタノールとの混合物が包含される。残念なことに、これらの化学剤の胞子殺滅効果は、非常に高くはなく、かつまたこれらの化学剤の中の或る種の化学剤はヒトおよび材料の両方に有害である。前記のクロマトグラフィ樹脂に現在使用されている技術に対して、医薬品殺菌装置などの殺菌に慣用の多くの公知技術はクロマトグラフィ樹脂の殺菌には使用されていない。例えば、乾式または湿式加熱による微生物殺滅に格別に有効な技術は、大部分の樹脂が温度感受性であることから、その殺菌技術としては採用されていない。同様に、照射による殺菌は、照射による危険性、特にクロマトグラフィ樹脂が代表的に使用される工業環境に対する危険性のために、適当ではなかった。気体状殺菌剤、例えばベータ−プロピオラクトンおよびエチレンオキサイドは、これらの化学的反応性および爆発性によってクロマトグラフィ樹脂の殺菌に適当であるとは考えられなかった。同様に、ホルムアルデヒド溶液は、発癌性の疑い（または少なくとも強力なアレルゲン性）によってクロマトグラフィ樹脂の殺菌に適当であるとは考えられなかった。強力な酸化剤はまた、過去に、クロマトグラフィ樹脂殺菌剤として使用されたことはなかった。この理由は、大部分のクロマトグラフィ樹脂はこのような強力な酸化剤にさらされると、物理的および化学的の両方で容易に劣化することが当業者に認識されていたからである。過去に、医薬品装置などの殺菌に慣用されていた強力な酸化剤の一例に、次亜塩素酸ナトリウムがある。次亜塩素酸ナトリウムは優れた殺菌性を有するのに加えて、ヒトの皮膚および口に対して無害である。しかしながら残念なことに、殺菌剤としての次亜塩素酸ナトリウムの使用は、毒性の塩素化副生成物が発生するという事実によって制限される。過去に、医薬品装置などで殺菌に慣用されていた、もう一つの種類の強力な酸化剤は過カルボン酸、特に過酢酸である。例えば、米国特許第５，２７９，７３５号（この特許を引用してここに組み入れる）には、病院透析装置の中空繊維膜の殺菌用溶液が記載されており、この溶液は過酢酸などの過カルボン酸および酸化性消毒環境において有効期間にわたり安定である色を有する着色剤からなる。同様に、米国特許第４，９８６，９６３号および同第４，７４３，４４７号（これらの特許の両方を引用してここに組み入れる）には、コンタクトレンズ殺菌用の各種組成物が記載されている。これらの組成物の一つは過酸化水素および過酢酸の水溶液を包含する。別の組成物は約０．０００１重量％〜１０．０重量％の過酢酸を含有する。殺菌剤としての過酢酸または過酢酸含有溶液の使用を開示する追加の特許には、米国特許第５，２６８，１４４号、同第５，０７７，００８号、同第５，００８，０７９号および同第４，５８７，２６４号が包含される（これらの特許の全部を引用してここに組み入れる）。優れた殺微生物性を有することに加えて、過酢酸は無害な最終生成物（すなわち、水、酢酸および酸素）に分解することから、次亜塩素酸ナトリウムが付随する欠点を克服するものである。しかしながら、重ねて言うと、過酢酸は上記種類の殺菌装置で使用する場合に限り、上記理由から過去に、クロマトグラフィ樹脂の殺菌に使用されたことはなかった。米国特許第５，２６８，０９７号（この特許を引用してここに組み入れる）には、新規種類のクロマトグラフィ樹脂が記載されており、この樹脂は強力な酸化剤に対して高度の耐性を有する。この対象樹脂はその内部および外部表面を有し、かつまた生物学的分子との望ましくない非特異的相互反応に対して当該マトリックスを非感受性にする内生の（すなわち固有に存在する）基を有する有孔固形マトリックスおよび有効量の主要モノマー、この主要モノマーとは相違する不動態化性モノマー（ｐａｓｓｉｖａｔｉｎｇｍｏｎｏｍｅｒ）および架橋剤からなる不動態化混合物（ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅ）から誘導されるポリマーネットワークからなり、この混合物が重合されると、マトリックスの内生基が不活性化されて、上記の望ましくない非特異的相互反応が実質的に排除されるか、または減少されるのに充分な時間にわたり、この混合物がマトリックスの表面と密に接触するようにされている。発明の要旨本発明の目的は、強力な酸化剤に対して格別の耐性を有するクロマトグラフィ樹脂の新規殺菌方法を提供することにある。本発明のもう一つの目的は、酸化耐性クロマトグラフィ樹脂の現存の殺菌方法が付随する欠点の少なくとも一部分を克服する、上記方法を提供することにある。本発明のさらにもう一つの目的は、高い殺微生物効果を有するが、作用を受けるクロマトグラフィ樹脂の劣化をもたらさない、上記方法を提供することにある。本発明のさらにもう一つの目的は、流動床、充填床またはその他の操作手段に配置されたクロマトグラフィ樹脂に使用することができる、上記方法を提供することにある。本発明のさらにもう一つの目的は、酸化耐性クロマトグラフィ樹脂をカラムに充填する前または充填した後のどちらかの時点で、当該クロマトグラフィ樹脂の殺菌に使用することができ、そして（または）順次分離間で充填した樹脂を殺菌するために使用することができる、上記方法を提供することにある。本発明のさらにもう一つの目的は、上記方法の実施に使用するための殺菌溶液を提供することにある。以下で説明され、または明白にされる、これらのおよびその他の目的の観点から、ここに酸化に対して高度に耐性のクロマトグラフィ樹脂を殺菌する方法が提供される。この方法は当該樹脂を過カルボン酸の水溶液と接触させる工程を包含する。好ましくは、この過カルボン酸は過酢酸であり、さらに好ましくは４０％までのエタノールをさらに含有する水溶液である。この溶液を正に帯電したイオン交換樹脂に使用しようとする場合には、この溶液は好ましくは、樹脂に対する過酢酸イオンの吸着を防止するために充分のイオン強度を有する酢酸塩緩衝剤をさらに含有する。本発明の追加の目的、特徴および利点は、一部分が以下に記載されており、また一部分は以下の記載から明白になるか、または本発明の実施により学ぶことができる。本発明の態様は、当業者が本発明を実施することができるのに充分に詳細に説明されており、その他の態様を使用することもでき、かつまた本発明の範囲から逸脱することなく変更をなすことができるものと理解されるべきである。従って、以下の詳細な説明は制限するものと考えられるべきではなく、本発明の範囲は添付請求の範囲によって最良に定義されている。図面の簡単な説明添付図面は本明細書の一部に組み入れられ、本明細書の一部を構成するものである：図１（ａ）および１（ｂ）は、それぞれ４℃および２５℃において、バシルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子に対して施用された０．５ＮＮａＯＨの不活性化動態を示すグラフである；図２（ａ）および２（ｂ）は、それぞれ４℃および２５℃において、バシルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子に対して施用された４０％エタノール中の０．２ＮＮａＯＨの不活性化動態を示すグラフである；図３（ａ）および３（ｂ）は、それぞれ４℃および２５℃において、バシルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子に対して施用された各種殺菌剤のＤ₁₀値を示すグラフである（ここで、Ｐａａ１５００は、１５００ｐｐｍ過酢酸を表わし；Ｃｌ２１００／５００ｐｐｍは利用できる塩素が１００／５００ｐｐｍである次亜塩素酸塩を表わし；Ａｃ．５Ｍは０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を表わし；そしてＥｔＯＨ２０／３０％は、２０／３０（容積／容積）％エタノールを表わす）；そして図４（ａ）〜４（ｄ）は、バシルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子に対して施用された、（ａ）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）で緩衝された１５００ｐｐｍ過酢酸の２５℃における不活性化動態を；（ｂ）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）で緩衝された２０％エタノール中１５００ｐｐｍ過酢酸の２５℃における不活性化動態を；（ｃ）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）で緩衝された１５００ｐｐｍ過酢酸の４℃における不活性化動態を；そして（ｄ）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）で緩衝された２０％エタノール中１５００ｐｐｍ過酢酸の４℃における不活性化動態をそれぞれ示すグラフである。好適態様の詳細な説明本発明は、強力な酸化剤に対して格別の耐性を有するクロマトグラフィ樹脂の新規殺菌方法およびこの方法に使用するための殺菌溶液に関するものである。酸化耐性クロマトグラフィ樹脂の代表的種類は米国特許第５，２６８，０９７号に記載されており、バイオセプラ社（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｉｎｃ．）［マールボロー、マサチュウセッツ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）］から一群のハイパーＤ（ＨｙｐｅｒＤ）（登録商品名）クロマトグラフィ吸着剤として市販されている。本発明は、酸化に対して格別の耐性を有するクロマトグラフィ樹脂を過カルボン酸の水溶液と接触させることによって殺菌することができるという予想外の発見を用いるものである。好ましくは、この過カルボン酸は過酢酸であり、この過酢酸の濃度は、少なくとも５００ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは１５００ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌである。本発明はまた、特に低温における改良された殺微生物効果が、過カルボン酸含有溶液にアルコール、好ましくはエタノールを添加することによって得られるという予想外の発見を用いるものである。このエタノールの濃度は約４０％ほどの濃度であることができるが、その可燃性から、好ましくは約２０％である。この溶液を正に帯電したイオン交換樹脂に使用しようとする場合には、この溶液は好ましくは、樹脂に対する過酢酸イオンの吸着を防止するために充分の高レベルにまで当該溶液のイオン強度を高めるための成分をさらに含有する。（樹脂に対する過酢酸イオンの吸着は樹脂の殺菌には利用することはできず、これにより溶液の有効活性は低下される。）ＮａＣｌなどの成分はそれら自体が過酢酸により酸化される傾向を有することから、このような成分は当該溶液のイオン強度を高めるために使用するには適さない。しかしながら、本出願人は酢酸塩緩衝液、好ましくは約０．１〜２Ｍの酢酸塩緩衝液、さらに好ましくは約０．５Ｍの酢酸塩緩衝液は、過酢酸の酸化力に抵抗することができ、従って当該溶液のイオン強度を高めるための適当な成分であることを見出した。好ましくは、本発明の殺菌溶液は、約５．０のｐＨを有する。このｐＨは、（１）過酢酸の有効性（過酢酸のｐＨが低下するほど、その殺微生物効果は増大される）および（２）通常のクロマトグラフィ条件（約５．０〜９．０のｐＨ）の競合する問題間を調和させるｐＨとして選択されたｐＨである。本発明の殺菌溶液は重金属類を含有すべきではない。この理由は、重金属が過酢酸の分解を加速するからである。また、本発明の殺菌溶液の使用前の長期間にわたる保存は、推奨されない。むしろ、本発明の殺菌溶液は使用の直前に調製すべきである。本発明の殺菌溶液を使用して酸化耐性クロマトグラフィ樹脂を殺菌するには、樹脂の使用前に、この樹脂を当該溶液中で保存することができる；別法として、樹脂をクロマトグラフィカラムに充填し、次いでこのカラムを通して溶液を注ぎ入れることによって樹脂を洗浄することもできる。この溶液はまた、流動床、充填床、およびその他の操作方式に配置されている樹脂の殺菌に使用することもできる。以下に示す情報は、本発明の或る態様を単に説明するために示すものであって、本発明を如何なる方法でも制限しようとするものではない。従って、本発明は添付請求の範囲によって最良に定義されている。例Ｉ：０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中に過酢酸１５００ｍｇ／ｌを含有する殺菌溶液の製造最初に、約９００ｍｌの蒸留水に１６０ｍＭ酢酸（すなわち、９６％酢酸９．６１ｇ）および３４０ｍＭ酢酸ナトリウム（すなわち、ＣＨ₃ＣＯＯＮａ２７．９ｇ）を添加することによって、酢酸塩緩衝液を調製した。精製した緩衝溶液のｐＨは、５．０８であった。次いで、この緩衝液に１９．７ｍＭ過酢酸を添加した。（過酢酸は、３２〜４０％保存溶液として市販されている；従って１５００ｍｇ／ｌの濃度を得るためには、３２％保存溶液４．６９ｇを緩衝液に添加しなければならない）。最後に、この溶液に蒸留水を添加して、容積を１リットルにした。この溶液の最終ｐＨは、５．００±０．０３であった。例ＩＩ：０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の２０％エタノールおよび過酢酸１５００ｍｇ／ｌを含有する殺菌溶液の製造下記の点を除いて、例１に関して上記した方法を反復した：蒸留水の代わりに対応量のエタノールを使用して、２０％のエタノール最終濃度を得た。例ＩＩＩ：本発明の殺菌溶液を包含する各種殺微生物剤のＤ₁₀値の比較ここで図３（ａ）および３（ｂ）を参照すると、ここにはビー．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ６６３３）の胞子に対する殺微生物剤のＤ₁₀ 値が示されている。被験剤のかなりにおいては、濃度、ｐＨおよび温度の条件を変えてＤ₁₀値を得た。（ここで、Ｄ₁₀値の用語は、初期細菌濃度を１桁の大きさで、換言すれば９０％まで減少させるのに必要な時間であると定義することができる）。スペクトルの相対する限度は、ｐＨ５で、２５℃において過酢酸（１５００ｐｐｍ）溶液に３０％エタノールを補給した場合の０．４分のＤ₁₀値にあり、一方は４℃において０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を使用した場合の８６０分付近のＤ₁₀値にあることを見ることができる。例ＩＶ：本発明の殺菌溶液の不活性化動態に対する温度およびエタノールの効果ここで図４（ａ）〜図４（ｄ）を参照すると、ここには本発明の殺菌溶液の不活性化動態に対する温度およびエタノールの効果が示されている。例えば、図４（ａ）と図４（ｂ）とを比較することによって、または図４（ｃ）と図４（ｄ）とを比較することによって、２０％エタノールを含有する殺菌溶液が、２０％エタノールを含有していない殺菌溶液に比較して、良好な殺微生物作用性を有することを見ることができる。さらに、図４（ａ）と４（ｃ）とを比較することによって、または図４（ｂ）と４（ｄ）とを比較することによって、殺菌温度を４℃ から２５℃に高めることにより、殺菌溶液の殺微生物効果が格別に改良されることを明白に見ることができる。例Ｖ：本発明の殺菌溶液を使用するＱ−ハイパーＤ（登録商品名）およびＳ−ハイパーＤ（登録商品名）クロマトグラフィ樹脂の殺菌洗浄し、水切りしたイオン交換クロマトグラフィ用の四級アミンにより官能性にされたＱ−ハイパーＤ（登録商品名）シリカオキサイド／ポリスチレン複合体支持体１ｍｌ［これは、バイオセプラ社（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｉｎｃ．；マールボロー、マサチュウセッツ）から市販されている］を１５ｍｌ管中に移した。洗浄し、水切りしたイオン交換クロマトグラフィ用のスルホプロピルにより官能性にされてたＳ−ハイパーＤ（登録商品名）シリカオキサイド／ポリスチレン複合体支持体１ｍｌ［これは、バイオセプラ社（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｉｎｃ．；マールボロー、マサチュウセッツ）から市販されている］を第二の１５ｍｌ管中に移した。第三の１５ｍｌ管に蒸留水１ｍｌを添加して、ブランク試験を行った。各管に、酢酸塩緩衝液１０ｍｌ（０．５Ｍ、ｐＨ５）を添加し、次いで各管の内容物を混合した。樹脂を沈降させた後に、各管から上清を傾斜により除去した。各管にビー．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子１０ｍｌ（１．９×１０⁶ 微生物／ｍｌ）を添加し、次いで各管の内容物を混合した。樹脂を沈降させた後に、各管から上清を傾斜により再度除去した。次いで、各管に過酢酸１０ｍｌ（０．５Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５中の１５００ｐｐｍ）を添加し、次いで各管の内容物を混合した。３０分の後に、各管にＮａ₂ Ｓ₂Ｏ₃・５Ｈ₂Ｏ（５０重量／容量％）０．１ｍｌを添加し、次いで各管の内容物を混合した。樹脂を沈降させた後に、各管から上清を傾斜により除去し、代わりに無菌酢酸塩緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ５）１０ｍｌを添加した。この緩衝液を次いで、傾斜により除去し、代わりに無菌カソボイロン（ＣａｓｏＢｏｕｉｌｌｏｎ）１０ｍｌを添加した。これらの試料を次いで、３０℃で７日間インキュベートし、試料を殺菌性について毎日検査した。７日後に、これらの試料にビー．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子の二回目の接種を行い、当該殺菌溶液以外の因子を反映する増殖抑制効果が見られる可能性を除外した。これらの試料を次いで、二回目の接種の次の日から殺菌性について検査した。各試料に関する毎日の殺菌評価を次表に示す。上記表から見ることができるように、本発明の殺菌溶液は７日間にわたり各種媒質上における増殖を充分に阻止した。８日目の結果は、この増殖抑制効果が殺菌溶液の使用によるものであることを確証している。例ＶＩ：本発明の殺菌溶液を使用するフェニル−ハイパーＤ（登録商品名）クロマトグラフイ樹脂の殺菌Ｑ−およびＳ−ハイパーＤ樹脂１ｍｌの代わりに、フェニル−ハイパーＤ１ｍｌ（これは、疎水性相互作用性クロマトグラフィ樹脂を生成するために、フェニルにより官能性にされたハイパーＤ樹脂である）を使用した以外は、例Ｖについて上記した方法を反復した。７日間のインキュベーションの後に、無菌性が再度観察された。例ＶＩＩ：本発明の殺菌溶液を使用するハイパーＤ（登録商品名）クロマトグラフイ樹脂の殺菌官能性にされているヒドロゲル充填孔を有するハイパーＤ（登録商品名）シリカオキサイド／ポリスチレン複合体支持体１ｍｌ［これは、バイオセプラ社（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｉｎｃ．；マールボロー、マサチュウセッツ）から市販されている］に、ビー．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を挑戦させ、引き続いて例Ｖについて上記した方法と同一の方法を使用して、殺菌した。この殺菌操作の後に、殺菌溶液を過剰量の無菌１ＭＮａＣＯ₃溶液で置き換えた。樹脂を沈降させた後に、上清を傾斜により除去した。樹脂を含有する管中に１ＭＮａＣＯ₃に溶解したＢｒＣＮを無菌濾過して添加した。生成する懸濁液を室温で２０分間穏やかに振り混ぜた。樹脂を沈降させた後に、上清を傾斜により除去し、この樹脂を無菌アセトン１０ｍｌ容量の添加および傾斜による除去の反復によって洗浄した。この活性樹脂を無菌水で２回洗浄した後に、沈降した樹脂をカソボイロン（ＣａｓｏＢｏｕｉｌｌｏｎ）１０ｍｌ中に注ぎ入れ、次いで３０℃で７日間インキュベートした。７日間のインキュベーションの後に、増殖は検知できなかった。この活性樹脂およびこの活性化方法の副生成物の両方が微生物増殖の抑制に関与しなかったことを証明するために、カソボイロン中の対照ゲルにビー．サブチリスを挑戦させ、次いで同様にインキュベートした。増殖が見出された。ここで引用した本発明の態様は単に例示しようとするものであって、当業者は本発明の精神から逸脱することなくこれらの態様に対して多くの変更および修正をなすことができる。このような変更および修正は全部が、添付請求の範囲によって定義されているとおりの本発明の範囲内にあるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年５月１７日【補正内容】請求の範囲１．強力な酸化剤による酸化に対して高い耐性を有するクロマトグラフィ樹脂用の殺菌溶液であって、約０．１Ｍ〜２Ｍの濃度の酢酸塩緩衝液中に過カルボン酸を含有する殺菌溶液。２．上記過カルボン酸が過酢酸である、請求項１に記載の殺菌溶液。５．上記酢酸塩緩衝液が約０．５Ｍの濃度を有する、請求項１に記載の殺菌溶液。６．上記殺菌溶液が約５のｐＨを有する、請求項５に記載の殺菌溶液。７．上記殺菌溶液が約５のｐＨを有する、請求項１に記載の殺菌溶液。８．過酢酸の濃度が約５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌである、請求項２に記載の殺菌溶液。９．過酢酸の濃度が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌである、請求項８に記載の殺菌溶液。１０．過酢酸の濃度が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌである、請求項６に記載の殺菌溶液。１１．アルコールをさらに含有する、請求項１に記載の殺菌溶液。１２．上記アルコールがエタノールである、請求項１１に記載の殺菌溶液。１３．エタノールの濃度が約４０％よりも大きくない、請求項１２に記載の殺菌溶液。１４．エタノールの濃度が約２０％である、請求項１３に記載の殺菌溶液。１５．約２０％の濃度でエタノールをさらに含有する、請求項１０に記載の殺菌溶液。１６．強力な酸化剤による酸化に対して高い耐性を有するクロマトグラフィ樹脂の殺菌方法であって、クロマトグラフィ樹脂を過カルボン酸の水溶液により洗浄する工程を包含し、この水溶液が約０．１Ｍ〜２Ｍの濃度で酢酸塩緩衝剤を含有する殺菌方法。１７．上記過カルボン酸が過酢酸である、請求項１６に記載の方法。２１．上記酢酸塩緩衝剤が約０．５Ｍの濃度を有する、請求項１６に記載の方法。２２．上記水溶液が約５のｐＨを有する、請求項１６に記載の方法。２３．上記水溶液が約５のｐＨを有する、請求項２１に記載の方法。２４．上記過酢酸が約５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項１７に記載の方法。２５．上記過酢酸が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項２４に記載の方法。２６．上記過酢酸が約５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項２３に記載の方法。２７．上記過酢酸が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項２６に記載の方法。２８．上記過酢酸の水溶液がアルコールをさらに含有する、請求項１７に記載の方法。２９．上記アルコールがエタノールである、請求項２８に記載の方法。３０．上記水溶液中のエタノール濃度が約４０％よりも大きくない、請求項２９に記載の方法。３１．上記水溶液中のエタノールの濃度が約２０％である、請求項３０に記載の方法。３２．上記水溶液が約２０％の濃度でエタノールをさらに含有する、請求項２７に記載の方法。３３．上記洗浄工程を４℃で行う、請求項１７に記載の方法。３４．上記洗浄工程を２５℃で行う、請求項１７に記載の方法。３５．上記洗浄工程を４℃で行う、請求項３２に記載の方法。３６．上記洗浄工程を２５℃で行う、請求項３２に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．強力な酸化剤による酸化に対して高い耐性を有するクロマトグラフィ樹脂用の殺菌溶液であって、高いイオン強度を有する液体中に過カルボン酸を含有する殺菌溶液。２．上記過カルボン酸が過酢酸である、請求項１に記載の殺菌溶液。３．上記高いイオン強度を有する液体が酢酸塩緩衝液である、請求項２に記載の殺菌溶液。４．上記酢酸塩緩衝液が約０．１Ｍ〜２Ｍの濃度を有する、請求項３に記載の殺菌溶液。５．上記酢酸塩緩衝液が約０．５Ｍの濃度を有する、請求項３に記載の殺菌溶液。６．上記殺菌溶液が約５のｐＨを有する、請求項５に記載の殺菌溶液。７．上記殺菌溶液が約５のｐＨを有する、請求項３に記載の殺菌溶液。８．過酢酸の濃度が約５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌである、請求項２に記載の殺菌溶液。９．過酢酸の濃度が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌである、請求項８に記載の殺菌溶液。１０．過酢酸の濃度が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌである、請求項６に記載の殺菌溶液。１１．アルコールをさらに含有する、請求項１に記載の殺菌溶液。１２．上記アルコールがエタノールである、請求項１１に記載の殺菌溶液。１３．エタノールの濃度が約４０％よりも大きくない、請求項１２に記載の殺菌溶液。１４．エタノールの濃度が約２０％である、請求項１３に記載の殺菌溶液。１５．約２０％の濃度でエタノールをさらに含有する、請求項１０に記載の殺菌溶液。１６．強力な酸化剤による酸化に対して高い耐性を有するクロマトグラフィ樹脂の殺菌方法であって、クロマトグラフィ樹脂を過カルボン酸の水溶液により洗浄する工程を包含する殺菌方法。１７．上記過カルボン酸が過酢酸である、請求項１６に記載の方法。１８．上記水溶液が高いイオン強度を有する、請求項１７に記載の方法。１９．上記水溶液が酢酸塩緩衝剤を含有する、請求項１７に記載の方法。２０．上記酢酸塩緩衝液が約０．１〜２Ｍの濃度を有する、請求項１９に記載の方法。２１．上記酢酸塩緩衝液が約０．５Ｍの濃度を有する、請求項２０に記載の方法。２２．上記水溶液が約５のｐＨを有する、請求項１９に記載の方法。２３．上記水溶液が約５のｐＨを有する、請求項２１に記載の方法。２４．上記過酢酸が約５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項１７に記載の方法。２５．上記過酢酸が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項２４に記載の方法。２６．上記過酢酸が約５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項２３に記載の方法。２７．上記過酢酸が約１５００ｍｇ／ｌ〜約５０００ｍｇ／ｌの濃度を有する、請求項２６に記載の方法。２８．上記過酢酸の水溶液がアルコールをさらに含有する、請求項１７に記載の方法。２９．上記アルコールがエタノールである、請求項２８に記載の方法。３０．上記水溶液中のエタノール濃度が約４０％よりも大きくない、請求項２９に記載の方法。３１．上記水溶液中のエタノールの濃度が約２０％である、請求項３０に記載の方法。３２．上記水溶液が約２０％の濃度でエタノールをさらに含有する、請求項２７に記載の方法。３３．上記洗浄工程を４℃で行う、請求項１７に記載の方法。３４．上記洗浄工程を２５℃で行う、請求項１７に記載の方法。３５．上記洗浄工程を４℃で行う、請求項３２に記載の方法。３６．上記洗浄工程を２５℃で行う、請求項３２に記載の方法。