JPS61251604A - 土壌細菌を用いる線虫類の防除 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は生化学の分野であり、線虫の防除をするための
土壌細菌と遺伝子工学の利用に関する。

線虫 多くの種類の寄生性の小さな虫は「線虫」と呼ばれてい
る。根瘤線虫（メロイドシネ種）及び包のう線虫（ヘテ
ロデラ種）のような多くの型の線虫は植物寄生虫−で、
世界中で作物やその他の植物に本質的な損害を引きおこ
す。十二指腸虫や心糸状虫のような他の型の線虫は人や
動物の寄生虫である。

線虫の生理学、生活環および行動は、り一（１９７；１
年）及びドロプキン（１９８０年）のように、いくつか
の参考文献に記述されている（注：完全な引用をした全
ての参考文献の完全なリストを例の後につけた）。簡単
に言うと、植物線虫の卵があるとき、卵の中のエンブリ
オはＬ１幼虫と呼ばれる。群化前、エンブリオは変態し
、Ｌ２幼虫となる。ある条件下では、線虫の卵の何種類
かは生きたままで、数年間の後に釘化するのだが、通常
Ｌ２幼虫は約２週間以内に生まれる。

卵から出てまたＬ２幼虫はしばしば前寄生性幼虫と呼ば
れる。その硬化した管状突起を用いて、Ｌ２幼虫は根の
表面を溶解する。はとんどのＬ２幼虫は、約２週間餌を
食べ、それから餌なしで一連の３種の変態をおこなう。

未成熟の成虫は、最後の変態から生まれ、成熟し、卵を
産む。本発明でいう、「線虫」は生活環のどの段階の線
虫を意味する。

短剣状又は環状の線虫のような「外部寄生」線虫は、根
の外側にとどまり、根の細胞から栄養を吸い取るために
突起を使う。また、ウィルス感染を植物に伝染でき、ブ
ドウの木や果樹に特に深刻な問題を引き起こす。

「内部寄生」線虫は根に入り込み、根の内部で摂餌領域
を移動する。病変線虫やランス線虫のような移動性内部
寄生虫は植物の１ケ所にとどまらない。通常根の組織の
中に卵を産みつける。根瘤線虫や包のう線虫のような定
住性の内部寄生虫は単一の場所で根に感染し、通常根組
織の外側に卵を産みつける。

はとんどの線虫が、食物源を捜しあてる助けとなる「ア
ンビド」と呼ばれる走化性の感覚器官をもっている。セ
ノルハプデイチス・エレガンス（細菌を食べる土壌線虫
）の頭部は、グルコース、ガラクトース、マンノース及
びシアル酸の残基でグリコジル化されていることが報告
されている（例えば、マクルール、１９８１年及び１９
８２年参照）。しかし、シュビーグル（１９８２年Ａ及
びＢ）により報告された研究は、■、２ヱ１＜＝互（植
物線虫）はガラクトース部分をもたないことを指摘した
。

植物線虫は、作物に厳しい経済的損害を引き起こすので
、線虫を抑制゛するための各種の努力がなされてきた。

本発明で用いる、「抑制」は植物のような他の生物に及
ぼす線虫の影響を妨げるか、あるいは弱める、又は、対
象の領域の線虫あるいはその卵の数を減らすような活性
を意味するように広く用いられる。例えば、線虫の抑制
は、線虫の幼虫又は卵の絶滅、あるいは、線虫に生理的
損傷を加えることにより、その動きあるいは感染性を減
することに関する。抑制は卵から幼虫がかえれなくなっ
たり、生存あるいは生殖できない未成熟の幼虫をかえし
たりするような効果を含む。

フィールド試験あるいは温室試論では、線虫と抗線虫剤
の評価は、通常、（１）土壌又は根の与えられた量から
集められる線虫又はその卵の数、あるいは、（２）フィ
ールドの植物に加えられた損害の母をモニターする。試
験管内の研究で、（１）走化性反応（例えば化学薬品の
拡散点源からの近遠方向への線虫の移動）　、（２）幼
虫の運動性の変化（はとんどの種のほとんどの生きてい
る幼虫はある条件下でほとん゛ど一定に動く、それで、
そのような条件で運動性のないものは通常、非生存の信
頼できるインディケータ−である）　、（３）土壌又は
根から集められる瘤、包のうあるいは卵の数によりはか
られる感染性の変化、又は（４）生細胞染色のような他
のいろいろな測定が用いられる。

各種のカビ（メリア・コニオスボラ、２去乙二土ヱ之ヱ
（５，及びり、オビパラシチカを含む）及び少なくとも
２種類の細菌（バチルス・±主Σ乏之）及びＺ主二丘旦
去スニヱ三上ＩＪ７（Ｌ之））は、線虫を殺し、消化で
きる。さらに、（シュードモナス属細菌を含む）他の天
然に存在する細菌がキチナーゼ（ナガハタ（１９７９年
）及びワーネス（１９８４年）参照）、コラゲナーゼ（
例えばラオ（１９７７年）及びキャリツク（１９７３年
）参照）及び他の蛋白分解酵素（例えば池田（１９７８
年）参照）を含み／又は放出することが報告されている
。

しかし、天然に存在するカビ及び細菌は、線虫を抑制す
ることにより、植物を保護する効果を限定してしまう。

カビ又は細菌を用いて植物線虫を抑制する多くの努力か
ら得られたのは、最良のもので、狭い範囲の種の線虫に
だけ短期間（例えば１シーズン）保護するものであった
。より大きな成果がなかった４つの理由が明らかにされ
た。

第１に、植物の根に侵入し線虫を抑制するのに本当に効
果のある細菌に関して、測子という他の微生物のかなり
の競合があるにもかかわらず、細菌は、植物の根の表面
にコロニーを形成し、高度に増殖せねばならない。ある
抗線虫性細菌は土壌に存在し、あるものは、根の表面に
存在することができるが、はとんどは効果があるような
十分に多い状態では存在できない。

第２に、抗線虫性の微生物を接種した領域で線虫の個体
数が減少したら、旌線虫性細菌の個体数は本質的に、他
の細菌の競合で、次第に少なくなる。抗線虫性の個体数
が減少した後、線虫は再出現し、ついには、線虫と抗線
虫性輯菌の平衡がつくられる。均衡した個体数の中の線
虫が常に、影響を受けやすい作物に本質的な損害を引き
起こす。

第３に、はとんどの杭線虫性細菌は、宿主域がほんのわ
ずかである。例えば根瘤線虫に対して効果的なパ　ルス
・ペ　　ランスは、包のう線虫に対しては効果がない。

生物防除剤として用いられるが、バチルス・ベネトラン
スは線虫宿生がいないと培養や生存が非常に困難な偏性
寄生虫であると考えられている。それ故、かなり大きな
領域を接種するのに十分な凶のバチルス・ペネトランス
の細胞あるいは胞子を用意するのは非常に困難で、任意
の接種物は生きている、感染性の線虫を含んでいるよう
である。

第４に、ある細菌は、ある条件下でのみ線虫を殺す。例
えば、はとんどの線虫を殺すカビは、食物不足という条
件下でのみ、線虫の罠をつくる。

キチンとキチナーゼ 線虫の卵は、Ｎ−アセチル・グルコサミン（ＮＡＧ）の
重合体であるキチンを含有する。ある研究者は、幼生の
線虫も又（特に、その茎状突起に）キチンを含有すると
信じているが、他の研究者は意見を異にしている。即ち
、キチンが幼生あるいは成虫の線虫に存在しているとい
う確実な報告はない。キチンは、°昆虫及びカビに存在
していることが知られている。

本発明でいう、「キチン質の有害生物」とは、植物ある
いは動物に対して、病原性、寄生、あるいは他の有害効
果を及ぼｂ、そして、その生活環の全ての段階にもキチ
ンを含む全ての生物又は細菌を含む。キチン質の有害生
物は、線虫、カビ、及び昆虫を含む。

（小麦胚芽リパーゼ、パパイン、キチナーゼ及びコラゲ
ナーゼを含む）いくつかの物質が線虫の１種であるチレ
ンコリンカスΦズビウス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃ
ｈｕｓ　ｄｕｂｉｕｓ）の運動性を減少できることが、
ミラー（１９７７年）により報告された。この報告は、
用いたキチナーゼあるいは他の物質の型、供給源、又は
純度を示り、ていなかった。

出願人は、市販のキチナーゼが線虫を制御できる非特異
的な加水分解及び蛋白分解酵素を含有することを測定し
た。

セラチア・マルセセンス及び乞ｌ二五工ｌノ・ステユツ
エリを含む数種の細菌はキチナーゼ酵素を発現し、放出
することが知られている。本発明で用いる、細胞による
酵素の「放出」は、死細胞による酵素の放出同様、生細
胞による酵素の活性分泌を含む。

ある種のキチナーゼ遺伝子は、誘導しないと低レベルし
か発現しないと信じられている。キチンが放出キチナー
ゼに遭遇し分解されると、その最終産物は、ＮＡＧの単
量体、２量体、及びオリゴマーを含有する。これらのキ
チンの分解産物は可溶性である、そして、これらが細菌
内に拡散し、そこでキチナーゼ遺伝子のより以上の発現
を誘導するという仮説が出された（例えば、モンリール
（１９６９年）参照）。

この誘導効果は、キチンが土壌に添加されると、線虫の
個体数と感染が減少するという報告に関するとある研究
者は信じている。例えば、マンカラ（１９６９年）参照
。

本発明で用いる、「構成的」プロモーターは、当業者に
より「インデューサー」として！！！識される状態ある
いは物質がない場合に、相当量のポリペプチドの発現を
促進する遺伝子プロモーターである。これは、細胞の生
活の全ての段階に遺伝子の連続的な発現を必要としない
（例えば、はとんどの遺伝子は、ある複製段階では発現
されない）。

このプロモーターは、望む環境あるいは、形質転換した
宿主細胞に抑制物質が含まれていないとすると、ある型
の宿主の中のある物質により抑制されるプロモーターを
含む。天然のキチナーゼのプロモーターは、構成的とい
うよりはむしろ、ここでは、「誘導的」であるとみなさ
れる。（モンリール（１９６９年）及びマンカラ（１９
６９年）参照）。

各種の異型のキチナーゼが報告された。しばしば「エキ
ソキチナーゼ」と呼ばれるカテゴリーの酵素は、重合し
たキチン分子の端からＮＡＧの単量体あるいは可能なオ
リゴマーを通常除去する。

比較すると、「エンドキチナーゼ」は、キチン重合体を
、２つのＮＡＧ残基の間の結合部分で切断する。「キト
ビアーぜ」と呼ばれる異なるが、関連した酵素は、ＮＡ
Ｇの２量体と可能ならオリゴマーを単量体のＮＡＧに切
断する。それぞれのカテゴリーは、異なった型及び供給
源のキチンに対し、異なったレベルの活性を有する各種
の異なったキチナーゼを含む。例えば、セラチア・マル
セセンス遺伝子により発現するキチナーゼは、他の微生
物が発現するキチナーゼとは異なる。本発明で用いる「
キチナーゼ」は、エキソキチナーゼとエンドキチナーゼ
を含むが、キトビアーゼは含まない。

グリコシダーゼ酵素と蛍光性シュードモナス菌 サツカライド（糖）部分を付着している蛋白、細胞及び
動物組織は、「グリコジル化されているＪといねれる。

「グリコシダーゼ」酵素（「糖分解」酵素とも呼ばれる
）は、二部、多糖あるいは糖蛋白のような分子から１つ
又は、それ以上のサツカリド部分を切断することができ
る酵素である。

（ラクトースの結合部位のような）β−ガラクトース結
合を切断できるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ　）
を含む、各種のグリコシダーゼ酵素が知られている。大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のβ−ｇａｌ　５量素はＩａＣＺ
遺伝子によりコードされる。ｌａｃ　Ｚ遺伝子は、誘導
的プロモーター／オペレーター領域、Ｉａｃ　Ｚコード
配列、ラクトース透過酵素をコードするｌａｃ　Ｙコー
ド配列及びチオガラクトシダーゼ・トランスアセチラー
ぜをコードするｌａｃ　Ａコード配列から成るｌａｃオ
ペロンの部分である。誘導的プロモーター系であること
、及び、色素産生マーカー遺伝子として利用されること
から、ｌａｃオペロンとβ−ｇａｌ酵素は広く研究され
かつ利用されている（例えばミラー（１９８０年）参照
）。

シュードモナス属細菌は、いくつかの理由から、植物科
学者にとって興味深いものである。シュートモナス属細
菌は土壌中に比較的多く、選択された植物の特定の品質
の根にコロニーを形成する菌株は、その品質の根から細
胞を集めることにより、簡単に得られる。さらに、ある
土壌シュードモナス属細菌は、病原性のカビを含むいく
種かの有害微生物に対して、生育を抑制する効果をあら
れすと信じられている。有害微生物を妨げることにより
、あるシュードモナス属細菌が、種子及び苗の保護を示
した（カナダ特許１，１７２，５８５号（シュロス、カ
リフォルニア大学）参照）。シュードモナス属細菌は又
、農業及び工業廃棄物の生物的分解を含む各種のＶＬ術
分野において化学的に、かつ工業的に興味深い、そして
各種の大Ｉ＆菌−シュードモナス属細菌のシャトル・ベ
クターは、研究室における比較的簡単な遺伝子操作を考
慮すると、役立つ。

シュードモナス・フルオレセンスを含む何種類かのシュ
ードモナス属ｉｉｔｔｍは、ある種の栄養培地に生育さ
せると蛍光性である。蛍光性シュードモナス属細菌は、
蛍光性の「シデロフオア」と呼ばれる分子をつくる。こ
れらの分子（及びそれらを含む細菌）は、約２９０〜３
９０ｎｌｌの波長の光で（紫外部領域で）励起されると
、異なった波長、通常的３９８〜４９８　ｎｍ（黄−縁
領域）で、光を放出する。蛍光性シュードモナス属細菌
は、それ故、紫外線下での観察により、研究室で容易に
非蛍光性シュードモナス属細菌と区別することができる
（例えば、メイヤー（１９７８年）、シェリー（１９８
０年）及びシュ０ス＜１９８１年）参照）。

出願第５９２．１５８号には、天然に存在する蛍光性シ
ュードモナス属細菌はβ−ｇａｌ活性を含まないことを
開示している。この発見に基づき、温室及び野外及び野
外のような環境において、接種し、遺伝的に形質転換し
た蛍光性シュードモナス属細菌の増殖を追跡するために
、β−ｇａｌ遺伝子をマーカー遺伝子として用いる方法
が創り出される。

１貝Ｕ狗 本発明の１つの目的は、細菌を用いて、効果的に線虫類
を抑制する方法を創造することである。

他方の目的は、線虫類に対して効果的な防護力をもつ特
別な型の植物を供給するため、選択された植物の根にコ
ロニーを形成する１種又はそれ以上の土壌細菌に、外来
遺伝子を挿入する方法を供することである。別の目的は
、土壌に適用することができ、そして、線虫類を抑制す
る細菌を含有する組成物を創造することである。

１監立１１ 不発明畔、微生物の競合条件下、（植物の根の表面にコ
ロニーを形成するシュードモナス属のような）線虫類が
群集する環境で増殖可能で、かつ、線虫類を抑制する細
菌に関する。本発明は、又、線虫類及びその他のキチン
質の有害生物を抑制する細菌を用いる方法に関する。

本発明は又、１種又はそれ以上の線虫類を抑制できる、
（β−ガラクトシダーぜのような）グリコシダーゼ酵素
、あるいは、キチナーゼを発現する外来遺伝子を有する
細菌の形質転換を含む。

（１）特定の植物の根の表面のような、標的環境にコロ
ニーを形成できる適当な細菌を選択すること、（２）望
ましくは、強力なプロモーターの支配下で、キチナーゼ
及び（もしくは）グリコシダーゼ酵素をコードする外来
遺伝子を有する選択された細菌を形質転換すること、及
び（３）細菌が標的環境で、選択された型の線虫類を効
果的に抑制するかどうかを決定する方法が開示されてい
る。

１艶立ｌ！皇ａｍ　　　　。

本発明は、蛍光性シュードモナス属細菌のように、植物
の根で、共生関係あるいは、非有害関係で、天然に非常
に多く存在し、線虫類を抑制する細菌の利用に関する。

本発明以前は、未修飾のシュードモナス属細菌が、植物
の根に接種されると、本質的に線虫類を抑制するという
予想はなかった。形質転換していないシュードモナス属
細菌は、コントロールとして、β−ガラクトシダーゼ（
β−ｇａｌ）遺伝子とキチナーゼ遺伝子を含む遺伝子工
学実験に使用した。

これらの実験は外来のβ−ｇａｌ及び／又はキチナーゼ
遺伝子をもったシュードモナス属細菌を、（１）外来遺
伝子をもたないシュードモナス属細菌、又は（り細菌無
接種の土壌と比較した。これらの実験は、（１）各種の
天然に存在する細菌の混合物をもつ非滅菌土壌、（２１
大豆又はトマト、（３）トウモロコシあるいは大豆の根
から分離されたシュードモナス・フルオレセンスの菌株
、及び（４）種メロイドシネ−（λユｌ又は、メロイド
シネ・ジャポニカからの根瘤線虫類を含む。

表１の結果は、線虫の瘤がほとんどできないような外来
遺伝子をもたないシュードモナス属細菌を接種した植物
の根を、細菌を接種していない根と、２８日後に比較し
たことを示す。

統計値は、ジョンソン（１９８０年）が述べた方法で計
算された、平均値上「平均の標準誤差」（ｓ、ｅ、ｍ、
）として表わす。一般に、平均値はデータ点の平均を示
し、Ｓ、ｅ、１．値は、平均値に対するデータの分布を
示す。

表１ 線虫に及ぼす非形質転換シュードモナス属細菌の影響 細菌無接種　　　　　　　　５３±２．８７０１Ｅ１　
　　　　　　　３２．６±３．５試験ＮＯ１２ 細菌無接種　　　　　　　１０４．９±１０．７１１２
−１２　　　　　　　５８．６±６．３これは、シュー
ドモナス属細菌が、遺伝的形質転換なしに、線虫類を抑
制するのに、植物の根に接種されうることを証明する。

特定の環境で、線虫類を抑制するのに、シュードモナス
属１１１ｉ（あるいは、以下に述べる別の形質転換した
細菌）を使用する際、天然に存在する微生物との競合が
あるにもかかわらず、その環境で増殖可能な細菌の菌株
を選択することが重要である。（ある型の土壌で、特定
の型の植物の根というような）特異的な環境適所で、自
然に増殖するほとんど全ての型の細菌は、その適所で生
存することに十分適応せねばならない。そのような細菌
が、各種の他の細菌がすでにコロニーを形成している。

環境に接種されると、接種された細菌の子孫は、その環
境でコロニーを形成し、長時間後、比較的多数存在する
可能性がある。

特異的な環境で増殖できる微生物は、その環境中の物質
（土壌、根の組織等）を採取し、その物質に含まれる微
生物を回収し、培養することにより簡単に得られる。次
々と出る科学文献は、本発明に関して興味あるほとんど
の型の環境に天然に存在する型の微生物を示した参考文
献に富んでいる。例えば、ア　ロバクテリウム、リゾビ
ウム、イセス、７ランキ７、ノカルジアあるいは、バチ
ｋｌ属の土壌細菌は、各種の根にコロニーを形成するか
、高頻度である型の土壌に存在することが知られている
。

シュードモナスＲＩｌ１ｍ及び他の土壌細菌のがなりの
菌株が、各地に生育する植物の根から簡単に分離できる
。さらに、他のかなりの菌株が、公然と、アメリカン・
タイプΦカルチャー・コレクション（メリーランド州ロ
ックビル）やノザン・リージョナル・リサーチ・ラボ（
イリノイ州ペオリア）の寄託機闇から得られる。寄託さ
れていた細菌の菌株あるいは分離された菌株は（形質転
換したものも、していないものも）以下の処置を用いて
、特異的な型の土壌中で、特定の型の植物の根の上で１
種又は、それ以上の線虫類を抑制する効果が試験される
。ＩＩｌ菌は、線虫（又は他の有害虫）が群がる範囲の
一部又はそれ以上の部分に、あるいは、そのような範囲
の非滅菌土壌を含む容器に接種される。細菌は、植物の
根又は種子に接種される。処理を施した領域あるいは容
器と、未処理の領域あるいは容器は定期的に、ここに述
べられている方法又は当業者に知られている別の方法で
、線虫の幼虫、卵又は被覆のうの数が、そして接種した
細菌の存在が測定される。細菌がコロニーを形成してい
る領域の線虫の数がコロニーを形成していない領域と比
較して減少していることは、未処理の領域あるいは容器
に発見された型の線虫を細菌が抑制することを示唆する
。

本発明の別の面は、形質転換細胞とその子孫にグリコシ
ダーゼ酵素を発現し放出させる外来遺伝子を挿入するこ
とによる細菌の形質転換を含む。

そのような形質転換Ｉｌｌは、以下に述べるように、線
虫の抑制を示した。

菌株７０１Ｅ１及び１１４１の２主二五工丈ス・フルオ
レセンスの２種の培養は、その染色体の中に、（強力な
構成的プロモーターであるβ−ラクタマーゼ又は、Ｐｂ
１ａプロモーターの支配下にある）キメラの１ａｃＺＹ
遺伝子を挿入することにより形質転換された。得られた
７０１　Ｌ５及び１１４１Ｌ１と命名された菌株は、Ａ
ＴＣＣに寄託され、それぞれ寄託番号５３１７５及び５
３１７６が割り当てられた。

元来、β−ｇａｌ遺伝子は、米国特許出願第５９２．１
５８＠に述べられているように単独で、接種された細菌
を計測するのにマーカー遺伝子として使用されるもので
あった。β−ａａｌ　Ｎ素は、線虫を抑制するとは予想
されなかった、そして、β−ｏａｔ遺伝子を含む細胞は
、キチナーゼ遺伝子を含む線虫の抑制実膿のコントロー
ルとして使用された。しかしながら、表２に示したよう
に、β−ｇａｌ遺伝子は、実質上、線虫を抑制するシュ
ードモナス属細菌の能力を増加すること発見された。

表２ 線虫に対するβ−ｇａｌ酵素の効果 瘤の数 □　　　士の なし　　　　　　　　　　　５３　　上２゜８１　１４
１１１（ｗｉｔｈ　　Ｉａｃ２Ｙ）　　　３１．　８　
　±　６　、９７０１Ｅ１　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３２．　６　　±　３　、５７０１Ｌ１（ｗ
ｉｔｈｌａｃＺＹ）　　　１４．８±３．７β−ｇａｌ
酵素による条虫の抑制の理由はまだ完全には理解されて
いないが、β−ｇａｌのよ−うなあるグリコシダーゼ酵
素は、アンワイズ上のあるいは近傍の糖部分にアタック
することにより、線虫を傷つけることができると信じら
れている。線虫に対する他のグリコシダーゼの効果を評
価する計画が始められた。そのような酵素の１つ、マン
ノシダーゼが、例１Ｃに述べた試験管内テストで、Ｍ、
ジャバニカ線虫を抑制することを示した。マンノシダー
ゼをコードする細菌の遺伝子は、組換えＤＮＡ技術を利
用して分離され、形質転換した細菌が線虫を抑制できる
かどうかを決定するために土壌細菌に挿入された。同様
に、試験管内で線虫を抑制する他の酵素をフードする遺
伝子は、分離されて、細菌を形質転換・するのに使用さ
れ、それから、線虫に対して試験がおこなわ°れた。

さらに、含有される酵素活性のために、形質転換した細
菌による線虫の抑制は宿主細胞が（１）挿入遺伝子の活
性グリコシダーゼ酵素を発現、放出し、（り標的環境に
コロニーを形成できない限り、宿主細胞の属に依存しな
いと信じられている。

本発明の第３点は、線虫を抑制するキチナーゼの使用を
含む。例１、Ｂに述べた実験において、セー　　・マル
セセンスの精製キチナーゼは、１μｇ／−程度の濃度で
、線虫卵の幼虫への瞬化を抑制することが分った。この
遺伝子がシュードモナス属細菌を形質転換するのに使用
でき、それが線虫を抑制するかを決定するために、例に
述べ、以下に簡単に要約したように、セラチア・マルセ
センスのキチナーゼ遺伝子を分離し、発現ベクターに挿
入して、シュードモナスＲ１［菌を形質転換するのに使
用した。

セラ　アφマルセセンスの染色体ＤＮＡは、でたらめに
断片化され、そして、ＤＮＡ断片はコスミド・りＯ−ニ
ング・ベクターに挿入された。挿入をもったコスミドＤ
ＮＡは、ラムダファージの殻にパッケージされた。得ら
れたファージは、大島菌細胞へコスミドＤＮＡを挿入す
るのに使用された。細胞内に入ると、完全なセットのフ
ァージ遺伝子を含んでいないので、コスミドＤＮＡは、
ファージとしてよりもむしろプラスミドとして機能する
。

形質転換した大腸菌細胞は、コロシト状キチンの重層を
含む栄養寒天平板にスポットされた。コロイド状キチン
層は半透明で不溶性である。コロイド状キチンを分解で
きるキチナーゼが形質転換細胞から放出されているとす
ると、キチナーゼは、コロイド状キチンを可溶性産物に
分解し、その結果、コロイド状キチンの背景に対して目
に見える透明帯をつくる。

キチンの透明帯に囲まれた６個のコロニーが選択されて
、次の分析に使用された。選択されたコロニーの中のそ
れぞれのコスミドは、１つ又はそれ以上のキチナーぜ遺
伝子を含む約２２から２６ｋｂの長さのセラチア・マル
セセンスのＤＮＡ断片を含んでいた。

トリーバレンタル交配を用いて、６個の選択された大腸
菌クローンの修飾されたコスミドは、シュードモナス・
フルオレセンス７０１Ｅ１株に移された。キチン重層平
板を用いた別のスクリーニング段階が利用されて、大き
なキチンの透明帯をもったシュードモナス属細菌のコロ
ニーが選択された。ＣＩＨＯＮ５０３１と命名したコス
ミドを含んでいた、そしてこの株は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託番号３
９７６５号として寄託された。

大腸菌及びシュードモナス属の細胞中のキチナーゼ遺伝
子の発現を増加し、発現がキチンによる可能な誘導に依
存することを軽減するために、２４ｋｂの挿入が、コス
ミドｐＨ０Ｎ５０３１から削除され、例２０）Ｆに述べ
たように、各種エンドヌクレアーゼを用いてより小さな
断片に消化された。

得られたＤＮＡ断片は、個々のプラスミドに挿入され、
得られたプラスミドは、犬馬菌細胞に形質転換された。

キチン重層平板を用いて、コロニーが選択され、キチナ
ーゼの放出がスクリーニングされた。２１１の陽性コロ
ニーが同定され、それらが含んでいたプラスミドは、ｐ
Ｈ０Ｎ５０３５とｐＨ０Ｎ５０３６と命名された。これ
らのプラスミドはどちらも、ＥｃｏＲＩ切断部位に結合
し、内部に２ケ所Ｂｏｌ　Ｉｆ部位をもち、ＥｃｏＲＩ
部位のない９．５ｋｂ断片に少なくとも１個のキチナー
ゼ遺伝子を含む。

ｐＨ０Ｉ４５０３５よりも大きなキチンの透明帯をつく
るプラスミドｐＨ０Ｎ５０３６では、キチナーゼ遺伝子
は明らかに図２に示したようにＰｂ１ａプロモーターの
支配下にある。ｐＨ０Ｈ５０３６を含む大１１ｉ１細胞
の培養はＡＴＣＣに寄託され、寄託番号３９７６４を割
り当てられた。

例２０）Ｇに述べるように、プラスミドｐＨ０Ｎ５０３
６は大腸菌から取り出され、ＥｃｏＲＩとＢｏｌ　ＩＦ
の両者で消化された。得られた断片は、Ｐｂ１ａプロモ
ーターの支配下で９，５ｋｂのキチナーゼ部分の副断片
をもつプラスミドを創るために再結合された。結合混合
物は、大腸菌細胞に形質転換され、キチン重層平板にま
かれ、キチン透明化のスクリーニングがおこなわれた。

試験した２００個のうち５個が、異常に大きなキチン透
明領域をもっていた。これらのクローンのそれぞれは、
２．４ｋｂの挿入を含んでいた。１個はｐＨ０Ｎ５０４
０と命名された。これらのクローンが各種のエンドヌク
レアーゼで分析されて、２．４ｋｂ部分が、明らかに、
非ＥｃｏＲＩ部位テ、ＥＣ０ＲＩ”　　（２り）切断に
より創られたことが発明された（　ＥｃｏＲＩ”につい
ては１９８３／８４ニユー・イングランド・バイオラボ
のカタログ７７ページ、及びフックス（１９８３年）に
議論されている）。予想されなかったスター切断は明ら
かに、２．４ｋｂ断片上めキチナーゼ遺伝子からある形
の転写レプレッサーを切り出し、以前のベクター以上に
ｐＨ０Ｎ５０４０のキチナーゼ遺伝子の発現レベルを高
めた。ＥＩＨＯＮ５０４０をもつ大腸菌ＬＥ、３９２細
胞の培養液は、ＡＴＣＣに寄託され、寄託番号３９７７
４を受けた。

例３に述べた一連の実験で、（１）外来遺伝子をもたな
い、（りβ−ｇａｌ遺伝子をもつ、又は（３）β−ｇａ
ｌ遺伝子とキチナーゼ遺伝子をもつそれぞれの蛍光性シ
ュードモナス属細菌が、大豆種子と根瘤線虫を含む土壌
に接種された。この研究は２８日間（線虫の約１世代）
継続した。表３の結果は以下のことを示唆する： （１）　　非滅菌土壌を使用した場合、未接種コントロ
ールに比較して、接種した、非形質転化細菌（７０１Ｅ
１株）は線虫を抑制した。

（り　β−ｇａｌ遺伝子を含む細菌は、β−ｇａｌ遺伝
子を含まない比較菌株より大きな程度で線虫を抑制した
。そして、 （３）　　キチナーゼ遺伝子をもつ細菌は、キチナーゼ
遺伝子をもたない比較菌株より大きな程度で線虫を抑制
した。

瘤の数 （平均上平均の １１立１１１釆盈旦ｌ　　　　　標準誤差）　゛なしく
コン トロール）５３±２．８ １１４１ＬＩ　　　　　　　ＬａｃＺＹ　　　　　　　
　　　　　　　　　３１．８±　６．９１４１Ｌ１ （ＤＨＯＮ５０４Ｇ）　　ＬａｃＺＹ、キチナーゼ　　
２０．８±２．６７０１Ｅ１　　　　　　　　　　　　
　３２．ｅ±３．５７０１Ｌ５　　　　ＬａＣＺＹ　　
　　　　　　　１４．８±３．７０１Ｌ５ （ｐＨＯＮ５０４Ｇ）　　ＬａｃＺＹ、キチナーゼ　　
１１．８±　１．９微生物の競合があるにもかかわらず
、多数で標的環境にコロニーを形成できる細菌の菌株は
、特に形質転換前にある程度、自然に線虫を抑制できる
とすると、ここに述べたベクターや遺伝子を用いた遺伝
的形質転換には良い候補である。本発明のグリコシダー
ゼ及び／又はキチナーゼ遺伝子は、ここに述べた、ある
いは、当業者に既知の他の方法やベクターを用いて、細
菌を形質転換するのに用いられる。選択環境で最も効果
的に線虫を抑制する適当な細菌の菌株の選択は、日常の
実験を用いて決定される。

・　さらに、キチナーゼ及び／又は、グリコシダーゼ遺
伝子は、ある反すう動物の餌の補足として用いられる（
ある種の１見ヱ文２あるいはセラチアの菌株のような）
ＩＩ内細菌の菌株を形質転換するのに用いられる。その
ように形質転換した細菌は、動物に病原性の害を引き起
こすアスカリス種のようなある型の線虫を抑制するよう
に、そのような動物の消化系に接種される。

本発明は、セラ　ア・マルセセンスのキチナーゼ遺伝子
に限定されない。セラチア・リカファシェンス及びパ　
ルス・ボ１″：キサのような他の細菌は、セー　　・マ
ルセセンスで発現されるキチナーゼとは異なった基質活
性と割合をもつ各種のキチナーゼを発現する。そのよう
な微生物のキチナーゼ遺伝子は、分離され、発現ベクタ
ーにのせられ、選択された細菌を形質転換するのに用い
られる。望むならば、各型の精製したキチナーゼは、１
種あるいはそれ以上の線虫を抑制するかを決定するため
に試験管内で試験される。試験管内で、線虫を抑制する
キチナーぜをコードする遺伝子はここに述べたような分
離と使用に良い候補である。

望むならば、本発明の細菌は、又、キトビアーゼ遺伝子
で形質転換される。これは、多くの型の細菌が栄養とし
て利用できる単量体のＮＡＧに（キチナーゼによるキチ
ンの消化によりつくられる）２量″休あるいはオリゴマ
ーのＮＡＧを細菌に切断させる。キトビアーゼ遺伝子の
分離とクローニングはホロウイツツ（１９８４年）によ
り報告された。

ここに用いられているように、「接種」とは、選択され
た環境に生きた細菌を導入する全ての方法である。例え
ば、根の表面は、細菌の懸濁液と植物の種子を接触する
こと、種子を乾燥すること、そして、種子を植えること
により、細菌が接種される。種子が発芽すると、根は細
菌と接触することになる。

望むならば、線虫を抑制する細菌は、ビートモス、蛭石
、土壌、種子又は他の植物組織、メチルセルロース、キ
サンタンガム等のような各種の担体物質と混合される。

混合物は、線虫のいる土壌へ、広げられるか、すきこむ
か、他の方法で混合される。望むならば、細菌は、生物
学的に分解可能なあるいは水溶性の物質に包まれた、又
は、生存を延長するように、あるいは、取り扱い中その
代謝活性レベルが減少するように処理された凍結乾燥の
状態で、物質と混合される。望むならば、担体物質は、
細菌の増殖を助けるために同化されつる栄養源を含む。

腸内接種の為の細菌は、目的の動物が摂取するのに適し
ている担体物質と混合される。

望むならば、本発明の遺伝子は、その適当な遺伝形質を
確実にするために、細菌の染色体に挿入されうる。特異
的な環境で他の微生物と競合する特定の型の細胞中でプ
ラスミドが不安定であるとすると、これは有効である。

ＥＰＯ ０９１，７２３号（グリンター）に述べられた方法のよ
うに、細菌の染色体に遺伝子を挿入する各種の方法が知
られている。

望むならば、選択した酵素をコードするＤＮＡ配列を、
β−ラクタマーゼ・プロモーター（Ｐｂｌａ）「ｔａｃ
Ｊプロモーターあるいは、バクテリオファージのプロモ
ーターのような強力な構成的プロモーターの支配下に置
くことができる。得られたキメラ遺伝子は、自然の遺伝
子よりも大量に望む酵素を発現させる。（キチナーゼ遺
伝子をもつ）プラスミドｐＨ０Ｎ５０３１　、ＥＩＨＯ
Ｎ５０３６又はｐＨ０Ｎ５０４０を含む細胞の培養液は
ＡＴＣＣに寄託され、それぞれ寄託番号３９７６５．３
９７６４及び３９７７４を割り当てられた。さらに、３
つのシュードモナス・フルオレセンスの菌株（リファン
ピシン耐性ではあるが、形質転換していない７０１Ｅ１
、染色体１ａｃＺＹ遺伝子をもった７０１Ｅ１株である
７０１　Ｌ５、及び染色体１ａｃＺＹ遺伝子をもつ異な
ったりファンビシン耐性株である１１４１１１株）の培
養液は、寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号３９７７３．５３
１７５及び５３１７６をそれぞれ当゛てられた。

非常に多くの型のこれらの株のバリアントやミュータン
ト又、それに含まれるプラスミドや遺伝子を当業者に既
知の方法でつくった。例えば、細胞は、Ｘ線、紫外線あ
るいは、ランダム・ミューチージョンを引きおこす各種
化学薬品のような突然変異誘°発剤で処理する。別法で
は、コントロールされた様式で、プラスミド又は遺伝子
の１つのあるいは、多くの塩基を換えることは可能であ
る。

処理を施した細胞、あるいは、処理を施したプラスミド
又は遺伝子をもつ宿主細胞は、上述の方法で、線虫抑制
活性が測定される。

ここに用いられているように、寄託培養「由来の遺伝子
をもつ細菌」は、寄託菌のＤＮＡから複製されたＤＮＡ
を受け継いでいるか、形質転換された細菌を含む。１つ
の例として、プラスミドｐＨ０Ｎ５０４０は、培養＃３
９７７４　（又はその子孫）から取り出され、異なる微
生物宿主に挿入さ°　　れた。別の例として、キチナー
ゼ遺伝子は、ｐＨ０Ｎ５０４０から切り出され、異なる
マーカー遺伝子をもつベクターに組み込まれ、そして、
選択された宿主細胞に挿入される。どちらの型の形質転
換細胞も、特許請求の範囲にカバーされる。

ここに用いられている「遺伝的に形質転換した細菌」は
、形質転換した細菌の全ての子孫又は、他の末えいを含
む。「外来」遺伝子は、形質転換、交配等により存在す
る細胞に挿入された遺伝子、及び、形質転換細胞の子孫
に受け継がれたような遺伝子をいう。外来遺伝子は、文
献では、しばしば「異種の」遺伝子と見なされる。

「キメラ」遺伝子は、２種又はそれ以上の遺伝子断片を
連結してつくった機能的遺伝子である。

例えば、キチナーゼを暗号化する（コーティング配列と
も呼ばれる）゛構造配列に適当な関係で連結された構成
的プロモーターは、キメラ遺伝子の１つの型である。キ
メラ遺伝子は又、例えば、１つの遺伝子を３つの断片に
消化し、遺伝子の発現を阻害する１つの断片を削除し、
高レベルの発現力をもった修飾遺伝子を再構築するため
に残りの断片を再連結することによりつくられる。

法例は、本発明の特異的具体例をさらに述べている。当
業者は普通の実験を用いて、ここに明らかにしている発
明の特異的な具体例とかなり同様のことをｉ！識し、確
認できる。そのように同義のことも特許請求の範囲にカ
バーされる。

健 （比活性１４８ネファロメトリック単位／Ｍｇ蛋白、の
ＵＳＢＣＩｏｔ＃２６１０２）のセラチア・マルセセン
ス由来のキチナーゼの粗標品は、米国バイオケミカル・
コーポレーション（オハイオ州りリーヴランド）から入
手した。（ロング（１９８１年）が述べた測定に類似し
た）基質としてアゾカゼインを用いるプロテアーゼの測
定は、この粗標品には、線虫にとっては毒性のある氷解
及び他の蛋白分解酵素が、実質量混在していることを示
唆した。線虫に対するキチナーゼの効果の正確な評価を
する前に、非特異的な氷解又は蛋白分解酵素を除去する
ために、粗標品をＩＩｆＪする必要があった。

第１の精製手順は、精製したコロイド状キチンへの親和
力結合を含んだ（ロバーツ（１９８２年）に類似）。簡
単に言えば、この手順は、不溶性のコロイド状キチンへ
のキチナーゼの親和力結合を含む。最初の結合は、キチ
ナーゼによるキチンの分解を阻害する４℃で生ずる。未
結合の酵素と他の可溶性物質は、ベレット中のコロイド
状キチンと結合したキチナーぜを遠心し、上清液を捨て
、ベレットを再懸濁することにより除去された。懸濁し
たベレットキチナーゼにキチンを分解し、可溶化するた
めに３０℃でインキュベートすると、かなり精製された
キチナーゼが出て可溶化する。

この手順は以下に詳細に述べる。

・マ　　　゛　のキチナーゼ１ｇを ２００ｍの５０−Ｈリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，３
）に懸濁し、４℃で同じ緩衝液４１に透析した。最初の
１２時間の透析後、新しい４１の緩衝液に交換し、さら
に３時間透析した。牛血清アルブミンを標準に用いたブ
ラッドフォード（１９７６年）の方法により測定した蛋
白濃度は、コロイド状キチンへのキチナーゼの結合と溶
出に最適の濃度である、０．６７Ｊ１９蛋白／ｍｅの所
定濃度に稀釈された。モラノ（１９７７年）が述べたよ
うに合成された等量の精製されたコロイド状キチンのス
ラリー（７＊（乾燥重量）キチン／ＩＩ１５ＱｍＨリン
酸カリウム（ｐＨ６，３））を４℃で、透析し、稀釈し
たキチナーゼ標品に添加した。コロイド状キチンへのキ
チナーゼの均一な結合を確実にするために、１５分間隔
で３０秒間手で振盪することによりスラリーを懸濁した
。定期的に採取した試料をエツベンドルフの微量遠心で
２分間遠心し、上清中の未結合のままのキチナーゼ活性
の量を示す放射性キチンの可溶化の測定（モラノ（１９
７７年））に・よりキチナーゼの結合を測定した。結合
は速く、１５分以内に完全であった。

キチンに結合したキチナーゼは、複合体を沈降させるた
め、２０分間、２０，０００ｇで遠心した。ベレットを
９００ｄｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＥＩＨ６
，３）で洗浄じ、同ＭＩｊ液に懸濁し、キチナーゼにキ
チンを分解させるために３０℃でインキュベートし、キ
チナーゼを放出、可溶化した。結合したキチナーゼ活性
の約３０％が３０℃での２４時間のインキュベートでキ
チンから溶出する。キチナーゼを上記のように粒子を除
去するために遠心し、５０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ６，３＞４１に対し、キチンの分解産物を除去する
ために４時間、さらに・１８時間透析した。透析したキ
チンをアミコンの濃縮器で２０倍に濃縮した。得られた
混合物は、５種の異なるキチナーゼを含むと信じられる
。

プロテア−ぜ活性が５０ｍ１４リン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ６，３で測定されたことを除いて、ロング（１９８１
年）により述べられたように基質としてアゾカゼイン（
シグマ・ケミカルＣＯ，ミズーリ州セント・ルイス）を
用いて非特異的プロテアーゼ活性を測定した。非特異的
ブ０テアーゼ活性は、キチンの７フイニテイ一精製段階
で入手したキチナーゼ°標品に比較して約１５０分の１
にそし　　゛て、分子ふるいのクロマトグラフィーで検
出できない程度まで減少した。それ故、ＩＩキチナーゼ
を用いた抗線虫性試験から得られた結果（例１、Ｂ）は
、非特異的プロテアーゼ又は、他の加水分解酵素につい
ての制限なしにキチナーゼによるものである。

濃縮キチナーゼ的４〜９■を１．５１：ＩＩＸ９５Ｑｍ
（１６８ｍ１！ベツド容量）カラム（１ジルトロゲルＡ
ｃＡ５４、ＬＫＢインストルメンツ、メリーランド州ロ
ックビル）にのせ、約１０ｄ／ｈｒで溶出した。１．５
ａｄずつ画分を集め、キチナーゼ活性を測定し、ＳＯＳ
　−　ＰＡＧＥ分析により決定した独特の単量体の分子
量をもつ３つの異なるピークに分離した（図４）。キチ
ナーぜ活性と総蛋白の大部分が、異なる単量体の分子量
の２つの独特の蛋白として最後のピークに溶出した。未
変性条件下でのこれらの蛋白の電気泳動から、キチナー
ゼ活性を有する分子量約５７ｋｄと２　１　ｋｄの２種
の蛋白のバニドが得られた。これらの２種のキチナーゼ
は、クマジー・ブルーで染色したＳＯＳ−ＰＡＧＥゲル
を見る限りで９５％以上の純度で精製された。

Ｂ．Ｍ．ジャバニカ卵のキチナーゼ処理根瘤線虫、メロ
イドシネ・ジャバニカの卵は、し２段階の幼虫を温室栽
培植物に接種して６週間後、感染させたトマトの根を水
でホモジネートすることにより得られた。

根のホモジネートは、次いで、６０メツシユ、２００メ
ツシユ、及び５００メツシユのスクリーン（Ｗ．Ｓ．タ
イラーＣＯ．，オハイオ州メニトール）を用いてふるい
にかけられる。メツシュの大きさは、平方インチあたり
の穴の数を示す。卵は最後のふるいに残される（例えば
、５００メツシユ卵は、２００メツシユのスクリーンは
通過するが、５００メツシユのスクリーンは通過しない
）そして、遠心するために５０−の円錐状のチューブに
移される。卵の水懸濁液４０Ｉｄはダイナツク・テーブ
ル・トップ・遠心機（ベクトン・デイキンソン＆カンパ
ニー、ニューシャーシー州バーシバニー）の設定数を６
にして４分後に沈澱をつくる。上清液は除去されて、卵
を５０％（　Ｗ／Ｖ）蔗糖水溶液に再懸濁した。先の設
定条件でこの懸濁液を遠心し、蔗糖溶液に浮かんだ卵を
回収した。

卵は、予め短波長のＵ■光で滅菌したエタノールで洗浄
した５００メツシユのふるいの上で、ゆるやかに振盪回
収した。卵は、５０μｇ／ａｄの硫酸ストレプトマイシ
ン（シグマ・ケミカルＣＯ．）に懸濁させ、室温で４時
間インキュベーションして、表面の滅菌をおこなった。

表面の滅菌後、抗生物質を除去するために、卵を滅菌ふ
るいに置き、滅菌水で３回洗浄した。

卵は滅菌した培養チューブに分配した。リン酸カリウム
（ｐＨ６．３）を５０ｍＨの濃度で添加し．た。

それぞれ１１７！の溶液には約９２００個の卵が含まれ
た。

異なるバッチの卵をリン酸カリウム緩衝液（コントロー
ル）又は、例１，Ａで述べたように精製した５種類のセ
ーチア・マルセセンスのキチナーゼの混合物１μｇ／Ｍ
１、１０μｔ／ｄ又は１００μ９７ｄを含む緩衝液に浸
した。蛋白濃度の可能な効果のコントロールとして、同
一濃度で牛血清アルブミンを準備し、試験したが、明ら
かな効果は観察されなかった。それぞれの処理を４パツ
チの卵についておこない、それぞれの処理から３′ｉｎ
の試料（各２５′ｕ１容量）で１２試料となった。

群化した幼虫（運動性及び非運動性）を２４時間間隔で
１０日以上、立体顕微１（４０ｘ）下で計測した。２５
μオ試料あたりの負型的な初期の卵の数は２３１±３１
（’ｎー３６処理チューブ）であった。

図５及び表４にある結果は、１μｇ／Ｉ１１はどの低濃
度でキチナーゼが線虫の卵からの群化を抑制することを
示唆する。

表４ 線虫類に対するキチナーゼの効果 １０日後に 処　　理　　　　　　　　　群化した卵（平均上標準偏
差） 緩衝液のみ（コントロール）　　　８２．２±１０．１
５１μ９／ｄｌキチナーゼ　　　　　５３．１±１５．
７１０μｇ／１１１キチナーゼ　　　　４９．９±１３
．８１００μ９／ｍｅキチナーゼ　　　２６．０±４．
６Ｃ，−ａｌ　　マンソン″　−ゼによる幼虫の処理群
化したばかりのＭ、ジャバニカの幼牛を２４時間、３０
０ｕｎｉｔｓ　／ｄβ−０ａ１（大腸菌由来）、１η／
−マンノシダーゼ（ジャック豆由来）もしくはＩＱ／ｄ
牛血清アルブミン（ＢＳＡ、コントロール）に浸した。

幼虫を２週齢のトマトの根に接種し、・１４日後に瘤を
計測した。表５の結果は、β−ｇａｌ処理はコントロー
ルに比較して、幼虫にそれ程効果を与えないが、マンノ
シダーゼ処理は約４４％まで瘤を減少させたことを示す
。

表５ β−ｇａｌ又はマンノシダーゼによるＭ・ジャバ＝ｎ幼
虫の２４時間処理効果 １４日１の瘤の数 処理　　　　　　　　　　（平均上標準偏差）ＢＳＡ　
（コントロール）　　　４０．４±　９．５β−ｇａｌ
　　　　　　　　　　　３７　　　±１１．９マンノシ
ダーゼ　　　　　　２２．８±　６．３例２：セラチア
・マルセセンスのキチナーゼ　−子の操作 Ａ、　セラチア・マルセセンス染色体ＤＮＡの分離セン
スの菌株は、Ｅ、キャビア（国立健康研究所、ＮＩＨ）
から得た。この菌株は元来、モン′リール（１９６９年
）により特徴が調べられており、そして、キチナーゼを
分泌することが報告されている。セラチア・マルセセン
スＱＭＢ１４６６　１１をルリア・ブロース（ＬＢ）中
、３０℃でＡ６００−２．０まで生育し、細胞を０．１
５Ｍ生理的食塩水−１−ＨＥＤＴＡで洗浄し、−７０℃
で凍結した。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ標品に対して、Ｒ
ＨａＳＩＢ処理の後、フェノール抽出と、続いてクロロ
フォルム地山をおこなったことを除いてマーマー（１９
６１年）が述べたように分離した。

約１ｑの染色体ＤＮＡを分離した。このＤＮＡ２０μグ
を業者が述べたようなＥｃｏＲＩ緩衝液を含む１５０μ
ｌの反応溶液中で、８ユニツトのＥｃｏＲＩを用いて、
３７℃で１５分間部分消化した（全てのエンドヌクレア
ーゼは、ニューイングランド・バイオラボ（マサチュー
セッツ州パーバリー）又は、ＢＲＬ（メリーランド州ゲ
イサース・バーブ）から入手した）。これらの条件は、
染色体ＤＮＡの１８〜２８ｋｂ断片を最大限回収するよ
うになっていた。ＥｃｏＲ１消化は、６５℃、５分間の
熱処理で停止させた。部分消化されたＤＮＡを０．２５
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）存在下、２容のエタノ
ールで沈澱させ、０．５μｇ／μｌｔ’ＴＥ！１ｌｌｉ
液（ｉ　ＱＩＨＴｒｉＳ　ＨＣｌ、１ｎ＋ＨＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０＞に懸濁した。

コスミドｐＲＭＳＬ２６　（ロング（１９８１年））は
バーバード大学のＦ、アウスベルから得た。火父亘ｌ込
種の約２０ｋｂのＤＮＡを含むこのコミストは、Ｅｃｏ
Ｒ工で消化されて、ＤＬＡＦＲｌ（フリートマン（１９
８２年））に匹敵すると信じられている２１．６ｋｂコ
スミドを再構築するために再連結された。　　− ２１，６ｋｂ＋スミドを、ｃａｃｚ２で処理した大腸菌
ＨＢ１０１細［１（ＡＴＣＣ＃３３，６９４）に形質転
換した。１２．５μｇ／ｌ１ｌｅのテトラサイクリン（
Ｔｃ）を含む１１のＬＢ培地で細胞を１晩、飽和まで生
育した。これらの細胞培養液１６０ａｔを遠心で集菌し
、冷却したＴＥＩｉｉ液で洗浄し、凍結ベレットとして
保存した。コスミドＤＮＡは以下に述べるように「手順
Ａ」を用いて調製した。

ベレットを融解し、６ＩＩＮのＴＥＧ緩衝液（２５ｉＨ
Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ　（ＤＨ８）　−５０１１８ＥＤＴ
Ａ及び１％（１４／Ｖ）グルコース）に懸濁し、１２ｍ
のアルカリ−８Ｏ８（１０，５ｓｅ蒸溜水、３．０ｄｌ
Ｎ−ＮａＯＨ，１，５ｍ１０％ドデシル硫酸ナトリウム
）を添加し、逆さにして混合し、水中に２０分間静置し
た。９Ｉｄの氷冷したＫＯＡＣ（６０４５Ｍ酢酸カリウ
ム、１１．５ｍ氷酢酸、２８．５ａｄ蒸溜水）を添加し
、逆さにして混合し、１０分間水中でインキュベートし
て、１０分間１２．００（ｌで遠心した。約２０ａｔの
上清を２つの新しいチューブに移した（各１０ｍ＞。等
量のフェノール：クロロフォルム（１：１、ＴＥＩ衝液
で飽和したフェノール）を添加し、撹拌し、１０分間１
２．０００９で遠心した。

約１０ａｅの上層を２本の新しいチューブのそれぞれに
移した。２０ｙｄのエタノール（２容）を各チューブに
添加し、水中で２０分間沈澱させて、１０分間１０．０
００ｇで遠心した。ベレットをエタノールで洗浄し、真
空で５分間乾燥した。１ｄのＴＥ緩衝液を各チューブに
添加し、ＤＮＡを再懸濁して、１本のチューブにまとめ
た（合計２−）。

ＲＮａｓｅＡ　（シグマ・ケミカル・Ｃｏ、、ミズーリ
州セントルイス）を１５ｍＨＮａＣｆを含む１ＱＩＨＴ
ｒｉｓ−ＨＣｊ　（ＤＨ７，５）で１０ＭＩ／ｍｌにな
るように調製した。混在するＤＮａＳｅを不活化するた
めＲ１４ａＳｅ＾を１０〜１５分間煮沸し、ゆっくりと
室温で冷却した。溶液は一２０℃で保存した。

１００μｍのＲＮａｓｅＡ（１０ａｙ／ｄ）と１〜２μ
１７）ＲＮａｓｅ　Ｔｌ　　（約３００μ／μｍ、ＢＲ
Ｌ）をｍ加し、３７℃で１５分間インキュベートした。

５００μｌの２ＭＮａ（，４１／ＴＥ！ＩＩ液を添加し
た。混合液は、以下に述べるように調製した平衡化した
ＮＡＣ３−５２ミニカラムに直接のせられた。

ＮＡＣ３−５２樹脂を業者の説明！（ＢＲＬ）に従い水
和して、マグネチックスターラで撹拌した。２２ゲージ
針を１０ｍのエコノーカラム（バイオ・ランド、カリフ
ォルニア州すッチモンド）につなげ、Ｐ９０イントラメ
ゾイック・チューブを針につなげた。６＋ｄの樹脂（約
０．４ｇ）を各カラムにピペットで入れ、はとんどの樹
脂緩衝液（２Ｍ　　ＮａＣ１／ＴＥ）をカラムに通した
。試料を添加する前に、１０−の０．４Ｍ　　ＮａＣ１
／ＴＥを加え、流した。

ＤＮＡ試料（合計２．６Ｍりをカラムにのせた。

はとんどのＤＮＡがこの段階で、ＮＡＣ３−５２樹脂に
吸着した。収量を上げるため、溶出液を集め、３度カラ
ムにかけた。結合していない蛋白やＲＮＡを除去するた
めに、３０ｍの０．４ＭＮａＣｊ／ＴＥでカラムを洗浄
した。ＤＮＡは、１１Ｉｌの０．６５Ｍ’　ＮａＣ１／
ＴＥ２回で溶出した。

２−のエタノールをそれぞれの溶液に加え、１０分間ド
ライアイス中で沈澱させ、マイクロ遠心機で５分間遠心
し、上清を捨て、エタノールで洗浄し、５分間真空で乾
燥して、２００μオのＴＥＩＩｉ液に再懸濁した。

ＤＮＡの収量及び確実性は、吸光度（ＯＤ　　　）６Ｇ を読み取り、０．８％アガロース・ゲル上でＥｃｏＲ工
とＢＱＩ　■の制限断片を分析することにより測定した
。

１．５１１９の精製ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　テ３７℃、６
０分間制限し、子牛腸のアルカリ・ホスフェイト（ＣＡ
Ｐ）で処理した。得られた断片は、例１で述べたように
ＥｃｏＲ工で部分消化したセラチア・マルセセンスの精
製ＤＮＡ０．５μグと結合させた。１ｍＭＡＴＰを緩衝
液中のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、混合液を２３℃で
４０分間、さらに１６℃で４０分間インキュベートした
。

Ｃ１セー　　・マルセセンス　ＮＡのクローニンバクテ
リオファージのパッケージング、エキスはプロメガ・バ
イオチック（ウィスコンシン州マデイソン）から入手し
た。しかし、ここで述べた実験では、それは、基本的に
は、マニアナイス（１９８２年）が述べたようにＩＩ製
した。簡単に言えば、この手順は、１つの遺伝子を欠落
しているλ（ラムダ）のプロファージ配列をそれぞれが
含むような２種の相補的な大腸菌の細胞系の使用を含む
。細胞系ＢＨ３２６８８は、ファージの殻のＥ蛋白を生
産できないｒＥＪ遺伝子欠落のプロファージを含む。ａ
ｍ系ＢＨＢ２６９０は、ｒＤＪ遺伝子を欠落したプロフ
ァージを含む。両細胞系のプロファージは、ファージ蛋
白を発現誘導し、蛋白は、完全なファージの殻を集合さ
せるため混合させた。セラチア・マルセセンスの挿入を
もつコスミドは、ファージの殻と混合させた。ファージ
のパッケージングの性質のため、約２２〜２６ｋｂの挿
入をもつコスミドのみが、大腸菌細胞に感染できるファ
ージをつくるためその殻の中に取り込んだ。挿入された
コスミドＤＮＡは、大腸菌細胞で複製するが、完全なセ
ットのファージ蛋白をコードしないために、大腸菌細胞
内では、ファージというよりはむしろプラスミドの様に
機能する。

凍結／融解ライセードをＩＩ製するため、大腸菌ＢＨ３
２６８８細胞が３０℃で１晩ＬＢ培地中で飽和まで培養
した。細胞を２１フラスコ中、５００ｄのＬＢ培地でサ
ブカルチャーし、３０℃で、培養濃度が７５クレット単
位に達するまで振盪した。プロファージの複製は、４５
℃以上１５分間さらに３９℃２．５時間のインキュベー
ションで誘導した。

細胞を４℃１０分ｔｌ１１０．０ＯＯ５Ｆで延伸した。

ペレットを２０％（１１Ｉ／Ｖ）蔗糖を含む冷却した蒸
溜水１１Ｉ＆に再懸濁し、これを５００μｌ画分に分注
した。２５０■Ｈトリス・ＨＣｊ（ｐＨ８）に溶解した
２■／Ｍｌリゾチーム２５μｌをそれぞれの画分に加え
、ゆるやかに混合した。チューブにキャップをし、２〜
３分間液体窒素に浸し、それから水中に静置し、１時間
融解した。２５μｌのパッケージング緩衝液（６１８Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣＪ！　（ｐＨ８）、５０ｍＭスペルミジ
ン、５０ｓＨプトレシン、２０−ＨＭＱＣ！　　　　、
　３０ｇ＋ＨＡＴＰ、　　３０ｅＨ２−メルカプトエタ
ノール）を各チューブに加え、注出液を混合した。混合
液を４℃で２５分間 ３０、ｏｏｏｇで遠心した。上清を５０μｌずっに分配
し一８０℃で保存した。

音波処理抽出液は、ＢＨ３２６８８１１胞と同じ手順で
大腸菌ＢＨＢ２６９０細胞を培養して調製した。遠心後
、ペレットを３．６ａｅの冷却した音波処理用緩衝液（
２０１８Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｔ）Ｈ８）、１−１４
　　ＥＤＴＡ、５ｓＭ　　２−メルカプトエタノール）
に再懸濁し、音波処理により溶菌した。ライセードを４
℃で１０分間微量遠心し、ペレットを除去した。等量の
音波処理用緩衝液と１７６容の新しいパッケージング緩
衝液を上清に加え、混合した。混合液は５０１１１ずつ
に分配し、−８０℃で保存した。

連結したコスミド・セラチア・マルセセンスＤＮＡ　　
５μオを１０μｌの音波処理抽出液及び２５μｌの凍結
−融解う゛イセートと混合し、２３℃で６０分間インキ
ュベートし、それから、２１０ｕｔのファージ緩衝液（
５０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、０．ＩＭ
ＮａＣｊ、８−ＨｔｖｌｏｓＯ４）をさらに加え混合し
た。１５０μｌの稀釈したパッケージしたコスミドＤＮ
Ａを、０．４％、マルトースを含むＬＢ培地中、３０℃
で２００クレット単位の濃度まで生育した大腸菌５Ｒ１
９３細胞（ＳＲ１２５７Ｃ６００ＳｔｒＡｒ−ｍ　”　
Ｉｅｕ　−ｐｒｏ　−５ｕｉＩ　［λ　ｃＩ８５７ｎｉ
ｎ＋ΔＢａｍＨＩ　　５８−７１　ｐｒａｃｌ　）に感
染させるのに使用した。細胞とファージを３０℃で２０
分間インキュベーション後、１ｄＬＢ培地を加え、混合
液を３０℃で７０分間振盪培養した。細胞をその後簡単
に遠心して濃縮し、１４μｇ／ｄＴｃを含むＬＢプレー
トにまき、３０℃で４８時間培養した。

０、　大腸菌５Ｒ１９３株のキチナーゼのスクリ一二Ｕ 例２０）Ｃの形質転換株を半透明のコロイド状キチンを
含む寒天平板を用いてキチナーゼ活性のスクリーニング
をおこなった。セラチア・マルセセ＞１の細胞を含む試
験は、市販のキチンには低感度であった、そこで、次の
ような、キチン平板をつくる改良方法が開発された。

モラノ（１９７７年）の方法を用いて、キチンをキトサ
ン（シグマ・ケミカルＣｏ）を利用して合成した。キチ
ナーゼを−かなり洗浄することが必須であった。蒸溜し
た脱イオン水で数回洗浄し、それからＩ）Ｈを７．０に
調整し、混合液をさらに数回洗浄した。合成キチンをオ
ートクレーブ前にポリトロン・ブリンク−（ブリンクマ
ン・インストルメンツ：ニューヨーク州ウェストバリー
）で均一にした。この段階、によって、キチンは、市販
標品よりも少なくとも１０倍キチナーゼ分解に感受性が
高くなった。

（キチンが寒天を通して分散したというよりはむしろ）
キチンの重層を含む平板を使用した。

２５Ｍ１の寒天層（各々０．１　％　（１４／Ｖ　）　
＋７）栄ｌｌ天と寒天（ディフコ、ミシガン州デトロイ
ト）と、１２．５μｇ／ＩｄのＴＣ）をペトリ皿に流し
込んだ。寒天が固化したら、５η／Ｉ１１のコロイド状
キチン（乾燥重量）を含む同一の寒天培地１０ｄを各々
のベトリ皿に加えた。これは、透明帯試験の感度を約３
〜５倍増加した。

約２８００個のテトラサイクリン耐性のコロニー（ＴＣ
Ｒ遺伝子をもつｐＬＡＦＲｌ）を楊子を用いてキチン重
層平板に移した。平板を目視分析の前少なくとも３日ｆ
ｌＥ１３０℃で培養した。コロイド状キチンの半透明の
背景に対して目で見えるコロニー周辺部の透明帯の存在
により、６個のキチナーゼ陽性コロニーを同定した。２
個のクローンは、ＥｃｏＲＩとＢＱＩ　ｉによる消化で
決定される同一の２４　ｋｂ挿入を含むと思われるｐＭ
ＯＮ５０３１及びｐＭＯＮ５０３２というコミストを含
んでいた。第３のりＯ−ン（ｐＭＯＮ５０３３）は、１
．７ｋｂのＥｃｏＲ工断片を抜いた同一挿入を含んでい
る。４つのクローン（ｐＭＯＮ５０２７．５０３０．５
０３１、及び５０３４）は、大Ｉ＆菌５Ｒ１９３でキチ
ナーぜ活性を発現する。

大腸菌のクローンを１４μｇ／ｄＴｃを含むＬＢ培地中
、３０℃で１晩培養し、プラスミドＤＮＡを次の方法（
「手順ＢＪ）で調製した。

細胞をエツペンドルフのマイクロ遠心機で２分間遠心し
、上清を捨て、ＴＥＧＩ［液１００μｌに再懸濁し、懸
濁液が均一になるまで撹拌した。

２００μオのアルカリ−３ＤＳ　（０，２ＮＮａＯＨ，
１％５ＤＳ）を加え、逆さにして混合し、５分間水中に
静置した。１５０μｌの酢酸カリウム（ＫＯＡＣ）混合
液（３Ｍ　　ＫＯＡＣ＋２Ｍ酢酸）を加え、逆さにして
混合し、５分間水中に静置したのち、マイクロ遠心機で
５分間遠心した。４５０μｍ（又はそれ以下）をエツペ
ンドルフチューブに入れた。４５０μｌのフ、エノール
／クロロフォルム（１：ｌＴＥ１１１液飽和のフェノー
ル＋クロロフォルム）を加え、撹拌し、２分間微量遠心
した。上層（約３５０μｉ）を別のエツベンドルフチュ
ーブに移した。等量又はそれ以上の無水エーテルを加え
、下層が比較的透明になるまで撹拌した。上層をデカン
トして除去した。エーテル処理をその後繰り返した。

７００μｌのエタノールを加え、１５分間氷に静置し、
５分間の微量遠心後、上清を除いた。

２５０μｌのＴＥ１１１液を加え、混合液をペレットが
溶解するように撹拌した。２５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，８）を加え、混合した。

６００μｌのエタノールを加え混合した。混合液を１０
分間ドライアイス中でインキュベートし、５分間の微量
遠心後、上積を除いた。５００μオのエタノールを加え
、混合液を１分間微量遠心した。上清をデカントして除
去した。下層を５分間真空で乾燥させ、１７μｌの蒸溜
水に再懸濁した。

２μオの１０Ｘ制限緩衝液と１０〜１５単位の制限エン
ドヌクレアーピを加えて、３７℃で３０分間インキュベ
ートした。１μオのＲＮａｓｅＡ　（１０ｑ／ｄ）を各
試料に加えた。混合液を５分間室温でインキュベートし
、２μｌの１０Ｘブロモフエノール緩衝液（５０％グリ
セロール及び０．００２％（ＩＩ／Ｖ）色素）を加えた
。試料を大きさのマーカーを含むアガロースゲルにのせ
た。ブロモフェノール色素の最前部がゲルの末端に達す
るまで泳動した。アガロースゲルを１μｇ／ｄ臭化エチ
ジウム（ＥｔＢｒ）で２０分間染色し、蒸溜水で３０分
間脱色して、写真撮影した。

プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＢｇＩ　［、Ｈｐａ　
工、ＢａｍＨＩ　、Ｓｅａ　Ｉ、あるいはＳｐｈ　Ｉで
消化し、ゲルのバンド・パターンを比較した。この結果
は、全ての陽性クローンが、そ、れぞれの末端にＥｃｏ
Ｒ工部位をもち、内部にはＥｃｏＲＩ部位のない共通の
９．５ｋｂ配列を含むことを示唆した。

ｐＭＯＮ５０３０又は５０２７をもつ大腸菌ＬＥ３９２
１１胞をＬＢ培地中、３０℃で１０日間培養した。細胞
を音波処理で溶菌し、微粒子物質を除去するために遠心
し、５０−Ｈリン酸カリウム緩衝液で１晩透析した。こ
れにより、例１Ａ−に述ぺた方法でＩＩ製された蛋白の
粗標品が得られた。

５Ｏ８−ＰＡＧＥゲルによる分析は、形質転換した大腸
菌が、発現するキチナーゼが約５７ｋｄの大きさをもつ
単量体の蛋白であることを示唆した。

５７ｋｄの蛋白は約１．６ｋｂの長さのコーディング配
列を必要とする。

分解したコロイド状キチンの透明帯の生成は、培地中へ
の形質転換した大腸菌細胞によるキチナーゼの放出に依
存する。大腸菌５Ｒ１９３株は、不完全な温度感受性の
λプロファージを含んでいる。ファージの清涼性による
細胞破壊が、必要ならば、培養を４２℃に上げることに
より誘導されるので、この菌株が選択された。あるコロ
ニー周辺にキチンの透明帯を生成するのに十分のキチナ
ーゼが非誘導培養により放出されるので、誘導による細
胞破壊は不必要ということが明らかとなった。

大腸菌細胞が放出するキチナーゼを分析するため、３種
のベクター（ｐＭＯＮ５０２７．５０３２及び５０３４
）が例２０）Ｂの「手順Ａ」により分離し、標準のＣａ
Ｃｌ２法を用いて、大腸菌の異なる菌株、ＬＥ３９２　
（マニアナイス、（１９８２年））に形質転換した。大
腸菌［Ｅ３９２株はλの清涼を含まない。

ＬＥ３９２株の３種の形質転換コロニーすべてが、５Ｒ
１９３株の細胞で測定された透明帯に匹敵するキチンの
透明帯を生成した。生存する非形質転換のセラチア・マ
ルセセンス細胞にキチナーゼを分泌させる天然の分泌過
程を利用して、大腸菌が、セーチア・マルセセンスのキ
チナーゼを分泌したことをこれは示唆した。しかし、次
の実験は、例２０）Ｈに述べるように、生細胞によりキ
チナーゼが活性をもって分泌されることは殆んどないこ
とを示唆した。

６個のキチナーゼ産生陽性クローンのコスミドが、プラ
スミドｐＲＫ２０１３　（フィブルスキー、（１９７９
）参照）をもつ大腸菌細胞を用いたトリーバレンタル交
配による大豆の根にコロニーを形成するシュードモナス
・フルオレセンス７０１Ｅ１株（ＡＴＣＣ＃３９７７３
）の形質転換に用いた。コスミドを含むコロニーは、（
例２０）Ｄに述べられた「手順Ｂ」を用いた）制限酵素
によるパターンの解析により確認し、例２０）Ｄに述べ
られたように、キチン重層平板にストリークした。平板
は３〜１０日ｆｌ１３０℃で培養し、キチンの背景の透
明化を観察した。大腸菌５Ｒ１９３の中にあるときにキ
チンを透明化するクローンのいくつかは、又、ρＭＯＮ
５０３１、ｐＭＯＮ５０３２０）ｐＭＯＮ５０３４及び
ＤＭＯＮ５０２７を含む区主二五土丈２７０１Ｅ１株で
も、キチンを透明化することは注目すべきことであった
。しかしながら、シュードモナス７０１　Ｅ１株のコロ
ニー周辺の領域の大きさ及び、それが出現する速度は、
一般に、大腸菌のそれよりも低かった。コスミドｐＭＯ
Ｎ５０３１をもつｚｌ二上ｊス・フルオレセンス７０１
Ｅ１株は、ＡＴＣＣに寄託され、寄託番号３９７６５を
当てられた。

コスミドｐＭＯＮ５０３１をもつ大腸菌５Ｒ１９３株を
、飽和まで、３０℃で、１４μ９／ｄテトラサイクリン
を含む４００ｄのＬＢ培地で培養した。細胞を遠心で集
め、プラスミドＤＮＡを手順Ａ（例２０）Ｂ）により精
製した。このＤＮＡの確実性は、上述のように、Ｅｃｏ
ＲＩ　、　Ｈｐａ　Ｉ。

Ｓｅａ　Ｉ　、Ｓｐｈ　Ｉ及び／又はＢｏｌ　［を用い
た制限酵素によるパターンの解析により確認した。

ｐＭＯＮ５０３１のＥｃｏＲＩによる完全消化で、３つ
の小さな断片と大きなコスミドの断片が生じる。

同様に、７ラスミｔ’ｌ）ＭＯＮ５０１２ＤＮＡを大腸
菌Ｍ２Ｂ５株（ｌａｃ−）に形質転換し精製した。ＤＭ
ＯＮ５０１２ＤＮＡ１．２μり及びｐＭＯＮ５０３１Ｄ
ＮＡ２．４μグをそれぞれＥＣＯＲＩで完全消化し、エ
タノール沈澱により濃縮した。ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼとインキュベートして、ＣａＣｌ２処
理をした大腸菌ＭＯ１００９株（ｌａｃ　−、ｒｅｃＡ
−）　ヲ形質転換するのに使用した。形質転換株は、５
０μｇ／ｄカナマイシン及び６４１１ｇ／ｄＸ−Ｑａ＋
を含むＬＢ平板上で、３７℃で１晩生育させた後に選択
した。白色コロニーをキチン重層平板に移し、３日１１
１３７℃で生育させた。透明帯が２５％以上のコロニー
の周辺に見られ、これは、３つのＥｃｏＲＩ断片の１個
が少なくとも１つキチナーぜ遺伝子を含み、この遺伝子
の強力な発現が、（Ｐｂ１ａ又はＰｏｒｉプロモーター
からの）方向づけで得られることを示唆する。

プラスミドＤＮＡを手順Ｂ（例２０）を用いて１１個の
陽性の候補から精製し、ＥｃｏＲＩ消化によるバター、
ンを分析した。全てが９，５ｋｂのＥＣＯＲＩ断片をも
っていた。さらに、Ｂａｔ　ＩＩによる消化が、透明帯
がわずかに大きいと思われる１１個のうちの２個及び、
より小さいと思われる２１Ｍについておこなった。得ら
れたパターンから、キチンの透明化がより大きい２１１
は（ＤＭＯＮ５０３６と呼ばれる）プラスミドのＢ（ｌ
１１［特有の部位に関して順方向にひろがっていること
が示唆された。キチンの透明帯がより小さい２１の別の
ものは、逆方向にひろがっている゛、、Ｐｂ１ａプロモ
ーターは一般的に、Ｐｏｒｉよりも強力なので、図２に
示したように、ＤＭＯＮ５０３６のキチナーゼ遺伝子の
方向性は、Ｐｂ１ａプロモーターの支配下にあると推察
された。

逆方向にキチナーゼ遺伝子をもったクローンの１つがｐ
ＭＯＮ５０３５と命名された。ＤＭＯＮ５０３６をもつ
大腸菌ＭＣＩ　００９株をＡＴＣＣに寄託し、寄託番号
３９７６４を得た。

Ｇ、ｐＭＯＮ５０４０の　製 例１Ｆに述べたようにＩＦ製したブ、ラスミドｐＭＯＮ
　５０３６を、例２０）Ｂで述べた、手順Ａを用いて、
大腸菌ＭＣ１００９株の細胞から取り出した。ＤＮＡ５
μ９をＥｃｏＲＩ　２０単位を含むＥｃｏＲＩｌ１ｍ液
３０μｌに懸濁し、３７℃で３０分間消化した。ＥＣＱ
ＲＩは７０℃で１５分間熱処理することにより不活性化
した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＢｏｌＩ［２４
単位を含むＢｌ）ｌ　ＩＩ緩衝液３０μｌに再懸濁した
。混合液を３０分間消化し、エタノールで沈澱さ、せ、
そして、蒸溜した脱イオン水１５μｌに懸濁した。１０
ｘリガ一ゼ！ｌ衝液２μｍ１１０ａ１４　　ＡＴＰ２μ
オ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを混合し、ＤＮＡＩ濁
液に加え、１６℃で１晩インキユベートした。連結した
ＤＮＡは、Ｃｒａｗ１２処理した大腸菌ＭＣ１００９株
ｌｌＡｌ１ｌ！を形質転換するのに用いた。細胞を３７
℃で１時間ＬＢ中で培養し、５０Ｍｇ／ｄカナマイシン
を含むＬＢ平板にまいて、３７℃で１晩培養した。

２００コロニーを選択し、キチン重層平板にまいた。２
日後、３２個のコロニーが透明帯に囲まれており、１２
個のコロニーを選択した。これらのコロニーのうち５Ｉ
ｌは、比較的大きな透明帯に囲まれていた、そして残り
の７個は、小さな透明帯に囲まれていた。プラスミドを
各コロニーから手順Ｂ（例２０）Ｄ）により取り出した
。ＤＮＡの半分はＢａｔ　ＩＩのみで消化し、残り半分
のＤＮＡは、同時にＥＣＯＲＩとＢＱＩ　ｌ）で消化し
た。ＤＮＡ断片を０．８％アガロース・ゲルで解析した
。この解析から、弱いキチナーゼの発現をする７個のク
ローンは３．８ｋｂの挿入をもつことが分った。これら
のプラスミドの１個はｐＭＯＮ５０３９と命名された。

キチナーゼが強く発現する５個のクローンは、２．４ｋ
ｂの挿入をもっていた。これらのクローンの１１１の中
のプラスミドはｐＭＯＮ　５０４０と命名され、エンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、Ｂｇ＋　、ＩＦ、ＰＳｔ　Ｉ
及びＳｅａ　Ｉを用いて解析した。消化パターンは、Ｅ
）ＭＯＮ５０３９の３．８ｋｂ挿入の消化パターンと比
較した。その結果は、２．４ｋｂ挿入が完全に３’、８
ｋｔｌ挿入の中に含まれることを示唆した。これは、Ｅ
ＣＯＲＩ又はＢｏｌ　ＩＩの切断部位が３．８ｋｂの挿
入の中に存在しないことから予想されなかった。これは
「スター」切断が起きたこと、即ち、通常の切断配列と
は別のＤＮＡ配列のエンドヌクアーぜによる切断を示唆
した（例えば、フックス（１９Ｂ３年）参照）。

スター切断は、エンドヌクレアーゼの消化条件（主とし
て温度、塩及びグリセロール濃度、そしてｐ旧の操作に
より誘導されるがスター切断は、しばしば予測できない
し、再現できないものである、そして、ｐＭＯＮ５０３
６のスター切断を誘導する努力はなされなかった。Ｅ）
ＭＯＮ５０３６の消化中にそれが起きることは、予想さ
れなかったし、偶然のことであった。そしてｐＭＯＮ５
０４０（７）２．４ｋＭ）ｌ１人＋７）ＭＧＭｌｋ：完
全すＥｃｏＲＩ切断部位（ＧＡＡＴＴＣ）ができたこと
も又、予想できなかったし、偶然のことであった。

ｐＭＯＮ５０４０は、トリバレンタル交配により、シュ
ードモナス・フルオレセンス７０１Ｅ１株に挿入された
、そして細菌は、キチン重層平板上にまいた。本来のキ
チンの透明帯は、シュードモナス属細菌の他の形質転換
株によりひきおこされるキチンの透明化よりも速く、４
８時間以内に観察した。Ｉ）ＭＯＮ５０４０をもつ大ｌ
！菌ＬＥ３９２細胞の培養はＡＴＣＣに寄託されて、寄
託番号３９７７４を受けた。

２．４ｋｂの挿入がＦ；ｃｏＲＩ消化によりｐＭＯＮ５
０４０から取り出し、Ｉ　ＰＴＧで誘導できる＋ａＣプ
ロモーター支配下のプラスミドｐｔＪｃ８に挿入した。

ｐＭＯＮ５０４２と命名された、この得られたプラスミ
ドは、大１１１ｉＪＭ１０１細胞に形質転換され、これ
は、Ｉ　ＰＴＧを上部にひろげたキチン重層平板に植え
た。これらの細胞は８時間以内にキチンの透明帯を生成
した。

Ｈｌ　キチナーぜの　泌の試験 ｐＭＯＮ　５０４０をもつ大腸菌細胞を、５０μ９７ｄ
のカナマイシンを含むルリア・ブロースで、３０℃、１
晩生育した。培養液からの細胞は、濃度が５〜１０クレ
ット単位になるように、１００−の新鮮な培地に接種し
た。これらの培養液は、１００クレツト単位まで（約５
時＠）培養された。試料を採取し、２００００ＳＦで２
０分間遠心した。

上清をデカントし、ミニコン濃縮器（アミコン、マサチ
ューセッツ州ダンバース）で１０倍に濃縮し、以下に述
べるように分泌キチナーゼを算定する試験をおこなった
。

それぞれの細胞ベレットを２ｍの５０−Ｈリン酸カリウ
ムに懸濁し、２００００ｐｓ　ｉで２回フレンチプレス
（アミンコ、メリーランド州シルバー・スプリングス）
を通して溶菌した。粗細胞抽出液を微粒子除去のために
４℃で３０分間２０．０００ｇで遠心し、得られた上滑
を細胞内キチナーゼ算定のために使用した。

細胞内及び分泌キチナーぜ濃度は、モラノ１９７７年）
が述べているように、３日で標識したキチンを用いて、
もしも結果が直線範囲を越えたら１０：１に稀釈して決
定した（遠心ベレットから抽出される）１１ｇ！！内キ
チナーゼは、１分あた’００．８５℃１ｍｏｌｅのＮＡ
Ｇをつくるが、一方、（Ｉ初の上清から得られる）分泌
キチナーゼは、対等の条件下で０．０８μＭのＮＡＧを
つくった。

２回目の実験では、結果は、１．２μＭ（細胞内）及び
０．０８μＭ（分泌）のＮＡＧであった。これらの結果
は、全体のキチナーゼの約６〜８％（又はそれ以下）だ
けが２００００ｇで２０分間細胞を遠心した後の上清に
存在することを示唆した。この数字は、最も活発に分泌
される蛋白にあるものよりも実質上低い値で、培養や遠
心の段階での細胞破壊によりおこされるものと同様であ
る。

にもかかわらず、例３に示したように、形質転換したシ
ュードモナス属細菌による維持期間（例えば、２８日）
以上の、おそらくは破壊された細胞によるセラチア・マ
ルセセンスのキチナーゼの放出は、線虫を抑制するのに
十分であった。

３：　　転換ＷＩＡ胞による線虫の抑制菌株を用いた。

１１４１株は、ウィスコンシン州サン・プレーリー近く
の大豆の根から分離した菌株の自然発生的リファンピシ
ン耐性ミュータント（５０μｇ／ｄリファンピシンで分
離される）である。１１２−１２株は、ミズーリ州セン
ト・チャールズ郡のトウモロコシの根から分離した菌株
のりファンピシン耐性ミュータントである。

７０１Ｅ１株は、イリノイ州ホープストン近くの大豆の
根から分離したりファンビシン耐性ミュータントである
。リファンピシン耐性は区主二亙孟ナス・フルオレセン
ス中に天然に存在し、外来遺伝子を挿入しないでも、リ
ファンピシンと細胞を接触することで選択される。線虫
の抑制に対する効果は信じられていない。

これらの３種の菌株の修飾株が、染色体中にキメラの１
ａｃＺ’ｌｌ遺伝子を挿入することにより作製した。こ
れは、ＥＰＯ９１，７２３号（グリンタ一二インペリア
ル中ケミカル・インダストリー）に述べられている系に
類似の２つの組成物の転換系によりおこなった。簡単に
言えば、この系は、以下を含む： １、Ｔｎ７のトランスボゼース酵素の遺伝子、ｔｎｐＡ
、Ｂ及びＣとカナマイシン耐性遺伝子を含むヘルパーφ
プラスミド及び ２０）　ゲンタマイシン耐性遺伝子とＴ０７トランスボ
ゾンの末端に存在する１ａＣＺＹ遺伝子をもつがトラン
スボゼース遺伝子をもたない運搬プラスミド ヘルパー・プラスミドが発現するトランスボゼース酵素
は、修飾トランスボゾンを運搬プラスミドから染色体に
動かす。ヘルパー・プラスミドはそれから取り除き、そ
して、子孫の細胞にトランスボゼース遺伝子が欠如して
いることは、挿入した１ａｃＺＹ遺伝子が染色体の外に
転移できないことを確実にしている。

キメラの１ａｃＺＹ遺伝子は、β−ラクタマーゼ遺伝子
由来の強力な構造的プロモーター、ｐｂｔａプロモータ
ーにより調節される（β−ｏａｌを暗号化する）　Ｉａ
ｃ　Ｚ　（ラクトース道通酵素を暗号化する）ｌａｃ　
Ｙのコーディング配列を含んでいる。

キメラのＩａｃＺＹ遺伝子で形質転換する際、次の試験
に用いて１１２−１２．１１４１及び７０１Ｅ１株は、
それぞれ１１２Ｌ１．１１４１Ｌ１及び７０１　Ｌ５と
あられした。

全ての細菌の培養をグルコースを含むＭ９培地（１１蒸
溜脱イオン水あたり３９　　ＫＨ２ＰＯ４，７ｇＮａ　
　ＨＰｏ　　、１９Ｎ８４Ｃ１，０，５ｇＮａＣ！、１
０９グルコース、２５μ第１ＭＣａＣｚ　　、１．２ａ
ｆＩＭＭＱＳＯ４−７Ｈ２０）で２４時ｆ１３００クレ
ットまでおこなった。グルコース、ＣａＣ１、及びＭＱ
ＳＯ４はオートクレーブ後に添加した。選択のための抗
生物質は、次の濃度で添加した：リファンピシン（５０
μ９／Ｍ１）及びカナマイシン（５０μｇ／ｌ１１）。

（８表に示した）処理に用いた３０Ｈ１の培養液を１０
分間５０００９で速心し、抗生物質を除いたＭ９グルコ
ースに再懸゛濁した。再懸濁細菌１Ｍ１を各種子にピペ
ットで添加した。表６は、各試験の初めの種子に接種さ
れた細菌数を示す。これらのデータは、０．５ｇＮａＣ
１のかわりに０．５９クエン酸ナトリウムを用いた修ｉ
！ｉ！Ｍ９寒天（ＭＭ９）上での２枚のレプリカに対す
る３種の稀釈（１，０，１０，１０）に基づく。

Ｌ−」」［匹ｉ璽 Ｍ、インコグニタの卵を４００及び５００メツシユのふ
るいを用いて集めた。約１２００個の卵、あるいは、し
１及びし２幼虫の混合を１００ｃｃの土壌混合物（Ｗ８
丁０砂、ＷＢ２０砂及びミズーリ州セント・チャーシス
群の非滅菌土壌をそれぞれ等量）に混合した。線虫の接
種原（１２００卵／１０ｄ水）をガラス・ビーカーの土
壌に加え、軽く混合し、２分間自動ミキサーで１０試料
を混合した。１００ＣＣの土壌−線虫混合物をそれから
１０ａｅの目の粗い蛭石のはいった円錐形のプラスチッ
ク容器に加えた。

１個の大豆の種子（ウィリアムス８２品種）をそれぞれ
の容器に加えた。１１ｄの細菌接種原を各種子に添加し
、３αの目の細かい蛭石でカバーした。注記しない限り
植物には１日２回水を与えた。

第１葉が開いた後、肥料溶液（ビータ−・プロフェッシ
ョナル水溶性肥料Ｎ＝２０、Ｐ−１９、Ｋ＝１８：Ｗ、
Ｒ，グレースＧｏ、ペンシルバニア州フォーゲルスピル
；ガロン当たり１さじ）を１日１回（水をやるときに）
与えた。容器は２８℃に維持した。

Ｃ１量測のだめの　の回 すべての植物はポットから引き扱き、根から混合土壌の
ほとんどを除くためにゆるやかに撮った。

それぞれの根は土壌表面で切断し、３０ｄの滅菌　　　
　　水を入れた５０ｒｄの遠心チューブに置いた。これ
らは１５分間２０　Ｏｒａｍで振盪し、そして根を取り
出して、再洗浄のために第２のチューブに入れた。第１
洗浄の水について、土壌含量を計測した。

表７に示したように、土壌の「根圏個体数」を測定する
ために、第１の洗浄の２つの液（各５０μｍ）を１０　
及び１０−７に稀釈した。全ての稀釈液は、１％ラクト
ース（グルコースなし）、５０　μ９７ｄシクＯへキシ
ミド、４０μ９／ｄ！Ｘ−ｇａ　Ｉ、及び５０μｇ／Ｉ
１１リファンピシンを含むＭＭＱ上にまいた。ｐＭＯＮ
５０４０をもつ菌株用の培地は又、５０μｇ／ｊｌ！１
！カナマイシンを含んでいた。唯一の例外は、ラクトー
スのかわりにグルコースを用いたＭＭ９で選択される１
１２−１２株であった。

根を３０１ｄの滅菌水に入れ、１５分間２００ｒｐＩｌ
で振盪した。その後、最後の洗浄のために、根を第３の
チューブに入れた。３０ｍの滅菌水での第３の洗浄は又
、１５分間振盪され、表８に示したように、「根圏個体
数」計測を測定するため２つの液（各５０μｌ）を１０
　及び１０”’に稀釈した。

線虫により引き起こされる根瘤は、照明付きの拡大鏡の
もとで、手動計測した。瘤は、大豆のりゾビウム属細菌
がつくる根粒とは容易に区別された。

０、試験Ｎ０７１ ふるい分けした５００メツシユの卵を土壌と混合し、根
の容器に置いた。大豆を容器に植えて、表９に示した細
菌の菌株の１つを接種した。容器に、１日に水を２回、
肥料を１回施した。２８日後、線虫能の数と、細菌数を
決定するために、上述のように、根を引き扱いて処理し
た。

表９に示した１１４１及び７０１株の試験の結果は、２
８日後以下のことを示唆する：１．１ａｃＺＹ遺伝子を
も１１４１１１株は線虫を抑制した、そして、キチナー
ゼ遺伝子をもつプラスミドＤＭＯＮ５０４０を１１４１
ＬＩ株に添加すると、形質転換株も線虫を抑制した。

そして、 ２．２８日後、その株の菌数（表７及び８）は低いにも
かかわらず、β−ｇａｌ及びキチナーゼ遺伝子をもつ７
０１株によるコントロールは高程度（５０％以上）に達
した。

１ａｃＺＹ遺伝子をもつ場合ともたない場合の（通常、
トウモーロコシにコロニーを形成する）１１２−１２株
についての試験の結果を表１０に示す。ＩａｃＺＹ遺伝
子をもたない１１２−１２株が２８日後には、１ａｃＺ
Ｙ遺伝子をもつ１１２Ｌ１株よりも効果的に線虫を抑制
することから、これらのデータは十分には理解されてい
ない。それらの結果は変則的なもので、実験がくり返さ
れたら再現しないかもしれない。にもかがねうｂ、１１
２−１２株は、ＩａｃＺＹ遺伝子があってもなくても、
本質的に、無接種コントロールに比較して線虫を抑制す
ることは明らかである。

Ｅ、試験Ｎ０９２ の段階で豊かにするためふるい分けをする。

「４００メツシユ」卵は、直径０．０３８順（０，００
１５インチ）の穴のあいた、平方センチあたり６２穴（
平方インチあたり４００穴）のスクリーンを通り抜けな
い。これらの卵は、５００メツシユ卵よりも古くて大き
り、蝮虫状の形状をした卵を約６５％含む（Ｌｌ又はＬ
２）。

５００メツシユ卵は４００メツシユスクリーンを通り抜
けるが、直径０．２５厘（０，００１０インチ）の穴を
もつ平方インチあたり５００穴のスクリーンは通り抜け
ない。これらの卵は、若い発育段階にある。１３％だけ
が嬬虫状の形状をしている。

根の容器に約１２００（１の４００メツシユ又は５００
メツシユの卵を接種した。大豆をそれぞれの容器に植え
、細菌を試験Ｎｏ、　１に述べたように接種した。２２
日後、根を引き扱いて、遊離土壌を洗浄し、そして、線
虫の瘤を計数した。

表１１に示した結果は、キチナーゼが４００メツシユ卵
から生まれた線虫を抑制しないことを示唆する。キチナ
・−ゼは、群化しようとする幼虫を包み込んでいる卵殻
を弱くすることによって、４００メツシユ卵の群化を促
進さえすると信じられている。この要因は、試験Ｎ０９
１で得られたデータの可変性のいくつかを説明すると信
じられる。

しかしながら、表９及び１２に示したように、本来キチ
ナーゼは、５００メツシユ卵からの線虫の群化を抑υ１
する。フィールドでの線虫の細菌による抑制は、線虫の
多くの世代を含んでかなりの期間にわたって作用するの
で、若い卵に損傷を与えるキチナーゼの能力は、効果的
な線虫の抑制を、群化しようとしている卵への効果とは
無関係にさせている。

例１、已に述べた手順は、！１に用いられた同一のＵＳ
ＢＣ１ｏｔ（＃２６１０２）のセラチア・マルセセンス
のキチナーゼを用いて異なる種であるＭ、ジャバニカの
４００メツシユ卵を処理するのに利用された。（ｔＪｓ
Ｂｃにより供給されるバイアルの）凍結乾燥した未精製
キチナーゼは、この実験がおこなわれたときまで４℃で
１ｏｔ月間保存した。５種のキチナーゼ混合物を得るた
めに例１、Ａに述べたように精製がおこなった。例１、
八で述べた精製キチナーゼ混合物の一部も又、−８０℃
で１０ケ月間の保存の後に使用した。再混合物を５０１
８ＫＰＯ４ではなく２５ｍＨＫＰＯ４を使用することを
除いて、例１、Ｂで述べたように４００メツシユの線虫
の卵を処理するのに使用した。保存しておいたキチナー
ぜ混合物は両者とも試験管内でキチンに対して同一の活
性を示したが、それらは、線虫をほとんど抑制しなかっ
た。

さらに、５７ｋｄのキチナーゼをｐＭＯＮ５０４０をも
つシュードモナス・フルオレセンス７０１Ｅ１細胞から
精製した；これは４００メツシユ卵を抑制しなかった。

これらの結果は、表１１に示した結果を確実なものとす
る。

Ｆ、　試験Ｎ０１３ 根の容器を土壌、５００メツシユの線虫の卵、大豆及び
細菌と共に、試験Ｎｏ、　　’ｌで述べたように準備し
、２８日間生育した。偶然に、生育期間中、１日に１度
だけ（肥料を含む）水を施した。

表１２に示した結果４よ、（現に、線虫の１世代である
）２８日間以上で、次のことを示唆する：１、外来遺伝
子をもたないシュードモナスの選択株は現に線虫を抑制
する。

２０）β−ｇａｔを発現する土壌ｌ菌は現に線虫を抑制
できる。そして、 ３、キチナーゼを発現する土壌細菌は線虫を抑制できる
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オロジー、＃Ｎ２０ ツイカキス、Ｊ、Ｔ、（編）１９８４年、キチン、キト
サン　び関連酵素、アカデミツク・プレス・オルランド
・フロツグ

【図面の簡単な説明】

図１は、部分消化したセラチア・マルセセンス（Ｓ、＋
＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａのクローニング・
ベクターへのショットガン・クローニングを示す。 図２は、９．５ｋｂ断片をつくるためのＥｃｏＲＩによ
るロスミドｐＭＯＮ５０’３１の消化と、プラスミドＩ
）ＭＯＮ５０３５とｐＭＯＮ５０３６をつくるためのｐ
ＭＯＮ５０１２へのその断片の挿入を示す。 図３は、３，８ｋｂのキチナーゼ遺伝子断片をもつＤＭ
ＯＮ５０３９及び２，４ｋｂのキチナーゼ遺伝子断片を
もつｐＭＯＮ５０４０の作製を示す。 図４は、セラチア・マルセセンス（ｓ、ｍａｒｃｅ−ｓ
ｃｅｎｓ）のキチナーゼのクロマトグラフィーによる精
製と分離を示す。 図５は、精製キチナーゼの１〜１００μｇ／Ｉｄの濃度
範囲での線虫の卵の畔化の阻害活性を示す。

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ、微生物の競合条件下、１種又はそれ以上の土
   壌中の植物の根に増殖可能であり、かつｂ、植物の根が
   存在すると、１種又はそれ以上の線虫類を抑制すること
   ができる土壌細菌の選択株の細胞を植物の根に接種する
   ことを特徴とする、線虫類の抑制方法。
2. （２）土壌細菌はシュードモナス・フルオレセンス７０
   １Ｌ５（ＡＴＣＣ５３１７５番）及びシュードモナス・
   フルオレセンス１１３１Ｌ１（ＡＴＣＣ５３１７６番）
   から成る群から選択される、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
3. （３）細菌はキチナーゼをコードする外来遺伝子を発現
   する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）外来遺伝子は構成的プロモーターにより調節され
   るキメラ遺伝子である、特許請求の範囲第３項記載の方
   法。
5. （５）細菌はグリコシダーゼ酵素をコードする外来遺伝
   子を発現する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）細胞は蛍光性のシュードモナス属であり、グリコ
   シダーゼ酵素はβ−ガラクトシダーゼである、特許請求
   の範囲第５項記載の方法。
7. （７）ａ、線虫類が存在するか、又は、線虫類に感染し
   易い環境で、微生物の競合条件下、増殖可能であり、か
   つ ｂ、１種又はそれ以上の線虫類を抑制する外来遺伝子に
   より発現される少なくとも１種類の酵素を放出する、 遺伝的に形質転換された細菌。
8. （８）酵素はキチナーゼから成る、特許請求の範囲第７
   項記載の遺伝的に形質転換された細菌。
9. （９）酵素はグリコシダーゼ酵素から成る、特許請求の
   範囲第７項記載の遺伝的に形質転換された細菌。
10. （１０）キチナーゼとグリコシダーゼ酵素を出す、特許
    請求の範囲第７項記載の遺伝的に形質転換された細菌。
11. （１１）構成的プロモーターにより調節されるキメラ外
    来遺伝子を発現する、特許請求の範囲第７項記載の遺伝
    的に形質転換された細菌。
12. （１２）環境が１種又はそれ以上の植物の根の表面であ
    る、特許請求の範囲第７項記載の遺伝的に形質転換され
    た細菌。
13. （１３）酵素はキチナーゼである、特許請求の範囲第１
    ２項記載の遺伝的に形質転換された細菌。
14. （１４）酵素はグリコシダーゼ酵素である、特許請求の
    範囲第１２項記載の遺伝的に形質転換された細菌。
15. （１５）シュードモナス科に属する、特許請求の範囲第
    １２項記載の遺伝的に形質転換された細菌。
16. （１６）アグロバクテリウム、リゾビウム、アゾトバク
    ター、アゾスピリルム、フラボバクテリウム、アセトバ
    クター、エルウイニア、エンテロバクター、クレブジラ
    、セラチア、サイトロバクター、クロモバクテリウム、
    プロテウス、グルコノバクター、コリネバクテリウム、
    ストレプトマイセス、フランキア、ノカルジア及びバチ
    ルスから成る群から選択された属に属する、特許請求の
    範囲第１２項記載の遺伝的に形質転換された細菌。
17. （１７）外来遺伝子は、構成的プロモーターにより調節
    されるキメラ遺伝子である、特許請求の範囲第１２項記
    載の遺伝的に形質転換された細菌。
18. （１８）１種又はそれ以上の植物の根の表面にコロニー
    を形成し、そして、線虫類を抑制する、少なくとも１種
    の外来遺伝子を発現する蛍光性シュードモナス属細菌で
    あつて、外来遺伝子は構成的プロモーターにより調節さ
    れ、かつ、外来遺伝子はキチナーゼとグリコシダーゼか
    ら成る群から選択された酵素をコードすることを特徴と
    する、上記細菌。
19. （１９）菌株７０１Ｌ５（ＡＴＣＣ５３１７５番）及び
    １１４１Ｌ１（ＡＴＣＣ５３１７０番）から成る群から
    選択される、特許請求の範囲第１８項記載の蛍光性シュ
    ードモナス属細菌。
20. （２０）特許請求の範囲第７項記載の細菌を接種した植
    物組織。
21. （２１）特許請求の範囲第１２項記載の細菌を接種した
    植物組織。
22. （２２）特許請求の範囲第１８項記載の細菌を接種した
    植物組織。
23. （２３）ｐＭＯＮ５０３１、ＰＭＯＮ５０３６及びｐＭ
    ＯＮ５０４０及びその突然変異体と変種から成る群から
    選択したプラスミド。
24. （２４）３９７６４、３９７６５、３９７７４、５３１
    ７５及び５３１７６、及びその突然変異体と変種から成
    る群から選択したＡＴＣＣ寄託番号を有する細菌。
25. （２５）特許請求の範囲第２４項記載の細菌を接種した
    植物組織。
26. （２６）３９７６４、３９７６５、３９７７４、５３１
    ７５及び５３１７６から成る群から選択したＡＴＣＣ寄
    託番号を有する細胞の培養から受け継がれた１つ又はそ
    れ以上の遺伝子を有する細菌。
27. （２７）特許請求の範囲第２６項記載の細菌を接種した
    植物組織。
28. （２８）線虫類が存在するか又は、線虫類に感染し易い
    環境に、特許請求の範囲第７項記載の遺伝的に形質転換
    された細菌を接種することを特徴とする、線虫類の抑制
    方法。
29. （２９）線虫類が生じる環境に、特許請求の範囲第１２
    項記載の遺伝的に形質転換された細菌を接種することを
    特徴とする、線虫類の抑制方法。
30. （３０）線虫類が生じる環境に、特許請求の範囲第１８
    項記載の遺伝的に形質転換された細菌を接種することを
    特徴とする、線虫類の抑制方法。
31. （３１）線虫類が存在するか、又は、線虫類に感染し易
    い環境に接種するための組成物であつて、選択された担
    体物質と特許請求の範囲第１項記載の細菌を包含する、
    上記組成物。
32. （３２）線虫類が存在するか、又は、線虫類に感染し易
    い環境に接種するための組成物であつて、選択された担
    体物質及び特許請求の範囲第１０項記載の遺伝的に形質
    転換された細菌を包含する、上記組成物。
33. （３３）担体物質は、ビートモス、土壌、砂、蛭石、植
    物組織、メチルセルロース及びキサンタンガムから成る
    群から選択された物質である、特許請求の範囲第３２項
    記載の組成物。
34. （３４）細菌を処理して、その生育を引き延ばすか、又
    は、取扱い中、その代謝活性レベルを減少する、特許請
    求の範囲第３２項記載の組成物。
35. （３５）担体物質は、細菌により同化しうる栄養源を含
    有する、特許請求の範囲第３２項記載の組成物。
36. （３６）３９７６４、３９７６５、３９７７４、５３１
    ７５及び５３１７６から成る群から選択されたＡＴＣＣ
    寄託番号をもつ細胞の培養物から細菌を受け継ぐ、特許
    請求の範囲第３２項記載の組成物。