JPS61224997A - プロテインａの精製方法 - Google Patents
プロテインａの精製方法Info
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- JPS61224997A JPS61224997A JP6785085A JP6785085A JPS61224997A JP S61224997 A JPS61224997 A JP S61224997A JP 6785085 A JP6785085 A JP 6785085A JP 6785085 A JP6785085 A JP 6785085A JP S61224997 A JPS61224997 A JP S61224997A
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- protein
- strain
- solution
- buffer
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
亘亘盈！
本発明はプロティンＡ産生菌特に黄色ブドウ球菌、すな
ワチ、スタフイロコツ、ｌ’Ｊスフ’７ｖ ７ ス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）から
のプロティンＡの精製方法に関する。
ワチ、スタフイロコツ、ｌ’Ｊスフ’７ｖ ７ ス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）から
のプロティンＡの精製方法に関する。
プロティンＡは、周知の如く、各種動物の免疫グロブリ
ンＧ（工ｇＧ）特にそのＦＱフラグメントと特異的に結
合する特性を有し、かくしてこの性質を利用し、適当な
担体に結合せしめ抗体産生細胞の定量、工ｇＧの精製、
抗体を結合した細胞の分離等に用いられる有用な物質で
ある。
ンＧ（工ｇＧ）特にそのＦＱフラグメントと特異的に結
合する特性を有し、かくしてこの性質を利用し、適当な
担体に結合せしめ抗体産生細胞の定量、工ｇＧの精製、
抗体を結合した細胞の分離等に用いられる有用な物質で
ある。
従来技術
プロティンＡは、通常、黄色ブドウ球菌の菌体表面に結
合した形で存在するたん白質で、特ニコーワン１ （Ｃ
ｏｗａｎ、 Ｉ ）裸面体表面に多く含まれている。従
って、このプロティンＡを分離精製するに際しては、プ
ロティンＡ含有菌体を何らかの方法で消化あるいは破壊
してプロティンＡを可溶化し、しかる後アニオンイオン
交換クロマトグラフィーあるいはアフィニティクロマト
グラフィー法等でプロティンＡを分離している。
合した形で存在するたん白質で、特ニコーワン１ （Ｃ
ｏｗａｎ、 Ｉ ）裸面体表面に多く含まれている。従
って、このプロティンＡを分離精製するに際しては、プ
ロティンＡ含有菌体を何らかの方法で消化あるいは破壊
してプロティンＡを可溶化し、しかる後アニオンイオン
交換クロマトグラフィーあるいはアフィニティクロマト
グラフィー法等でプロティンＡを分離している。
例えば、Ｊｏｈｎ ５ｊ５ｑｕｉｓｔ等の〔ユーロビア
ン ジャーナルオプ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、
Ｊ、 Ｂ１０（！ｈｅｍｉ、５ｔｒｙ）、 ２９１５７
２−５７８（１９７２）’）には、リゾスタフィンのよ
うな酵素で黄色ブドウ状球菌４体を処理し、ついでアニ
オン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを行
ってプロティンＡを分離する方法を開示している。また
特開昭４９−１３３５９７号は、上記同様に酵素処理し
て調製したプロティンＡ含有液を、免疫グロブリンまた
はそのＦｃフヲグメントを結合しかつプロティンＡ含有
液に不溶である重合体物質からなる固相と接触せしめ、
との固相に結合したプロティンＡを任意の方法例えばｐ
Ｈ条件を変えることによシ分離することを開示している
。
ン ジャーナルオプ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、
Ｊ、 Ｂ１０（！ｈｅｍｉ、５ｔｒｙ）、 ２９１５７
２−５７８（１９７２）’）には、リゾスタフィンのよ
うな酵素で黄色ブドウ状球菌４体を処理し、ついでアニ
オン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを行
ってプロティンＡを分離する方法を開示している。また
特開昭４９−１３３５９７号は、上記同様に酵素処理し
て調製したプロティンＡ含有液を、免疫グロブリンまた
はそのＦｃフヲグメントを結合しかつプロティンＡ含有
液に不溶である重合体物質からなる固相と接触せしめ、
との固相に結合したプロティンＡを任意の方法例えばｐ
Ｈ条件を変えることによシ分離することを開示している
。
これらの方法で用いる酵素処理による消化方法は、比較
的均一な分子サイズのプロティンＡが得られると言われ
ているものの、一般に作業が繁雑であり、プロティンＡ
自体の分解あるいは、池の細胞壁成分の夾雑の可能性が
大であシ、その後のアニオンイオン交換クロマトグラフ
ィーあるいは上述のようなＦＱフラグメント結合重合体
物質使用による分離においても不純物の除去は十分でな
く満足できる高純度プロティンＡ標品を得ることは難し
い。特に後者の方法においては免疫グロブリン結合固相
から工ｇＧ等も一諸にはく離してその精製品中への混入
は避は難い。従って、より高純度の標品を得るにはさら
に追加の処理を必要とする。
的均一な分子サイズのプロティンＡが得られると言われ
ているものの、一般に作業が繁雑であり、プロティンＡ
自体の分解あるいは、池の細胞壁成分の夾雑の可能性が
大であシ、その後のアニオンイオン交換クロマトグラフ
ィーあるいは上述のようなＦＱフラグメント結合重合体
物質使用による分離においても不純物の除去は十分でな
く満足できる高純度プロティンＡ標品を得ることは難し
い。特に後者の方法においては免疫グロブリン結合固相
から工ｇＧ等も一諸にはく離してその精製品中への混入
は避は難い。従って、より高純度の標品を得るにはさら
に追加の処理を必要とする。
また、上記のような菌体結合性プロティンＡの代シに菌
体外にプロティンＡを放出してしまう黄色ブドウ球菌変
異株、即ち、コセデ４ メ：／ Ｔ −Ｖ ヨ７ （Ｑ
Ｏ８ｅｄ’１ｍｅｎｊａｔｉＯｎ ）法による黄色ブド
ウ球菌ＬＨ変異株（以下、ＬＨ変異株と略称する）を用
い、この培養液からプロティンＡを分離精製することが
報告されている（益田等、モダンメディアユマ。
体外にプロティンＡを放出してしまう黄色ブドウ球菌変
異株、即ち、コセデ４ メ：／ Ｔ −Ｖ ヨ７ （Ｑ
Ｏ８ｅｄ’１ｍｅｎｊａｔｉＯｎ ）法による黄色ブド
ウ球菌ＬＨ変異株（以下、ＬＨ変異株と略称する）を用
い、この培養液からプロティンＡを分離精製することが
報告されている（益田等、モダンメディアユマ。
５１４−５１８．（１９７８））。この益田等の論文に
よれば、コーワンＩ株由来のＬＨ変異株をｒ−グロブリ
ン結合ゲルを用いるアフィニティクロマトグラフィーに
よって分離しているが、これは単に研究室レベルの方法
であり、またその精製度がいかなる程度のものであるか
定かにしていない。コセディメンテーション法によるＬ
Ｈ変異株とは、上記論文５１６頁に定義する如く、感作
赤血球と菌浮遊液とを混合すると菌体結合（ｃｅｌｌ−
ｂｏｕｎｄ ）プロティンＡを保有する原理はただちに
赤血球に吸着し軽く遠心沈澱を行うと赤血球と共に沈澱
してしまうが、菌体結合プロティンＡを保有しない変異
株は上清中に残るという原理に基づいた非常に簡便なプ
ロティンＡ産生性変異株の選択分離法により分離された
プロティンＡを細胞外性（ｅｘｔｒａｃ′ｅｌｌｕｌａ
ｒ）の形で産生ずる変異体である。
よれば、コーワンＩ株由来のＬＨ変異株をｒ−グロブリ
ン結合ゲルを用いるアフィニティクロマトグラフィーに
よって分離しているが、これは単に研究室レベルの方法
であり、またその精製度がいかなる程度のものであるか
定かにしていない。コセディメンテーション法によるＬ
Ｈ変異株とは、上記論文５１６頁に定義する如く、感作
赤血球と菌浮遊液とを混合すると菌体結合（ｃｅｌｌ−
ｂｏｕｎｄ ）プロティンＡを保有する原理はただちに
赤血球に吸着し軽く遠心沈澱を行うと赤血球と共に沈澱
してしまうが、菌体結合プロティンＡを保有しない変異
株は上清中に残るという原理に基づいた非常に簡便なプ
ロティンＡ産生性変異株の選択分離法により分離された
プロティンＡを細胞外性（ｅｘｔｒａｃ′ｅｌｌｕｌａ
ｒ）の形で産生ずる変異体である。
発明の目的及び構成
本発明は、プロティンＡ含有液を従来とは異なるカチオ
ン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより
処理させることにより意外にも簡単な方法で高純度のプ
ロテ不１ンＡを高収率でかつ工業的規模で精製できるこ
とを見い出したことに基づく。特にり、Ｈ変異株を培養
し、その培養上清を用いたときは極めて効率的に高純度
のプロティンＡを分離取得することができる。
ン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより
処理させることにより意外にも簡単な方法で高純度のプ
ロテ不１ンＡを高収率でかつ工業的規模で精製できるこ
とを見い出したことに基づく。特にり、Ｈ変異株を培養
し、その培養上清を用いたときは極めて効率的に高純度
のプロティンＡを分離取得することができる。
本発明で使用するプロティンＡ含有液は、プロティンＡ
を菌体表面に結合した黄色ブドウ球菌を酵素等で消化あ
るいは破壊して得たプロティンＡ含有液でもよいが、上
述のＬＨ変異株由来のプロティンＡ含有液を使用するの
が有利であり、このプロティンＡ含有液は一般に次の如
くして得られる。
を菌体表面に結合した黄色ブドウ球菌を酵素等で消化あ
るいは破壊して得たプロティンＡ含有液でもよいが、上
述のＬＨ変異株由来のプロティンＡ含有液を使用するの
が有利であり、このプロティンＡ含有液は一般に次の如
くして得られる。
ＬＨ変異・株は、上述した如く、黄色ブドウ球菌浮遊液
をコセディメンテーション法ニよシ分離した上清中に含
まれるものである。コセディメンテーション法により効
果的にＬＨ変異株を得るには、通常、出発黄色ブドウ球
菌（好ましくは十分に増殖させた）を紫外線（、Ｕ’Ｖ
）照射等による変異株作成の手法を入れ菌を一旦減少さ
せ、さらに発育効率のよいＢＨ工（Ｂｒａｉ、ｎ Ｈｅ
ａｒｔ工ｎｆｕｓｉ−ｏｎ ）培地中で変異株と：Ｉ−
’７ン１株とを約１０’ Ｃ，Ｆ、Ｕｙ／ｍＪ−オーダ
ーの菌濃度としたのちコセディメンテーション処理に供
するのが好ましい。さらに好ましいのはこの操作を数回
（３〜５回）繰返すことである。
をコセディメンテーション法ニよシ分離した上清中に含
まれるものである。コセディメンテーション法により効
果的にＬＨ変異株を得るには、通常、出発黄色ブドウ球
菌（好ましくは十分に増殖させた）を紫外線（、Ｕ’Ｖ
）照射等による変異株作成の手法を入れ菌を一旦減少さ
せ、さらに発育効率のよいＢＨ工（Ｂｒａｉ、ｎ Ｈｅ
ａｒｔ工ｎｆｕｓｉ−ｏｎ ）培地中で変異株と：Ｉ−
’７ン１株とを約１０’ Ｃ，Ｆ、Ｕｙ／ｍＪ−オーダ
ーの菌濃度としたのちコセディメンテーション処理に供
するのが好ましい。さらに好ましいのはこの操作を数回
（３〜５回）繰返すことである。
かくして得られた上溝は通常ＬＨ変異株菌体の池にプロ
ティンＡを全く産生じないいわゆるＨ Ｌ （ｈａｌｏ
ｌｅｓｓ）型変異株モ含ンテイルので、このＨＬ変異株
を除去したのちＬＨ変異株のみを培養することが好まし
い。即ち、ＬＨ変異株は、例えば免疫グロブリンを含む
寒天培地、に上記上清を塗床し約３７°Ｃで培養したと
き、菌の生育コロニーの回りに菌によシ産生分泌された
プロティンＡと免疫グロブリンとの反応による凝集リン
グを生ずる菌であるので、この菌を単離例えば釣菌によ
り分離してＩ、Ｈ変異株のみを得る。かくして分離した
Ｉ、Ｈ変異株菌体は、通常の培養法例えば、ＨＩ培地、
ＢＨ工等の一般の細菌培養用の液培地で約３０〜４０’
Ｃ，約１０〜３０時間攪拌培養し、そうすることにより
培養上清中にプロティンＡを産生させる。
ティンＡを全く産生じないいわゆるＨ Ｌ （ｈａｌｏ
ｌｅｓｓ）型変異株モ含ンテイルので、このＨＬ変異株
を除去したのちＬＨ変異株のみを培養することが好まし
い。即ち、ＬＨ変異株は、例えば免疫グロブリンを含む
寒天培地、に上記上清を塗床し約３７°Ｃで培養したと
き、菌の生育コロニーの回りに菌によシ産生分泌された
プロティンＡと免疫グロブリンとの反応による凝集リン
グを生ずる菌であるので、この菌を単離例えば釣菌によ
り分離してＩ、Ｈ変異株のみを得る。かくして分離した
Ｉ、Ｈ変異株菌体は、通常の培養法例えば、ＨＩ培地、
ＢＨ工等の一般の細菌培養用の液培地で約３０〜４０’
Ｃ，約１０〜３０時間攪拌培養し、そうすることにより
培養上清中にプロティンＡを産生させる。
かくして培養増殖させたＬＨ変異株含有液は、好ましく
は任意の適当な方法、例えば、限外濾過等によシ約１０
〜２０倍に濃縮し、さらに透析により即ち、例えばｐＨ
４，０〜６．０の０．０５〜０．１ Ｍ酢酸緩衝液を用
いてバッファー交換を行ったのち、カチオン交換体充填
のカラムに通してプロティンＡをカチオン交換体に吸着
させる。千の後、溶出用緩＃液でもりて溶出を行うが浴
出液のｐＨを変化させるかあるいは塩濃度（即ち、電導
度）を変化させる等の方法によシブロチインＡのみを含
む両分を溶出させる。
は任意の適当な方法、例えば、限外濾過等によシ約１０
〜２０倍に濃縮し、さらに透析により即ち、例えばｐＨ
４，０〜６．０の０．０５〜０．１ Ｍ酢酸緩衝液を用
いてバッファー交換を行ったのち、カチオン交換体充填
のカラムに通してプロティンＡをカチオン交換体に吸着
させる。千の後、溶出用緩＃液でもりて溶出を行うが浴
出液のｐＨを変化させるかあるいは塩濃度（即ち、電導
度）を変化させる等の方法によシブロチインＡのみを含
む両分を溶出させる。
本発明で使用するカチオン交換体は、プロティンＡと結
合できるもの、好ましくはプロティンＡのみを特異的に
吸着し得るものが選択され、そのようなカチオン交換体
としては例えば、力μボキシ（メチｌｖ）系樹脂があシ
、ファルマシア社製のＣＭ−セルローズ（ＣＭ−Ｃｅｌ
ｌｕｌｏ日ｅ）・ミニ０Ｍニー１ｚ７７ｃｌ−ズ（ＣＭ
−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）、あるいはチッソ株式会社製
のＣＭ ＋ セｔｖ ｏ ｙ ７ イ：／ （ＱＭ−Ｏ
ｅｌｌｕｌＯｆｉ、ｎｅ ）等の市販のものを使用でき
る。その池に、使用できるカチオン交換体としては、ス
ルホン酸基を有しているＳＥ−セルローズ（ＳＥ−５３
）（ワットマン社）等を挙げることができ、これらは通
常カラム充填の形で使用される。カラム充填したカチオ
ン交換体は、プロティンＡを吸着させる前に適当な緩衝
液によりｐＨ４、０〜６．０好ましくは４．５〜５．５
さらに好ましくは４．８〜５，３の酸性側に平衡化させ
ておくことが必要である。
合できるもの、好ましくはプロティンＡのみを特異的に
吸着し得るものが選択され、そのようなカチオン交換体
としては例えば、力μボキシ（メチｌｖ）系樹脂があシ
、ファルマシア社製のＣＭ−セルローズ（ＣＭ−Ｃｅｌ
ｌｕｌｏ日ｅ）・ミニ０Ｍニー１ｚ７７ｃｌ−ズ（ＣＭ
−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）、あるいはチッソ株式会社製
のＣＭ ＋ セｔｖ ｏ ｙ ７ イ：／ （ＱＭ−Ｏ
ｅｌｌｕｌＯｆｉ、ｎｅ ）等の市販のものを使用でき
る。その池に、使用できるカチオン交換体としては、ス
ルホン酸基を有しているＳＥ−セルローズ（ＳＥ−５３
）（ワットマン社）等を挙げることができ、これらは通
常カラム充填の形で使用される。カラム充填したカチオ
ン交換体は、プロティンＡを吸着させる前に適当な緩衝
液によりｐＨ４、０〜６．０好ましくは４．５〜５．５
さらに好ましくは４．８〜５，３の酸性側に平衡化させ
ておくことが必要である。
本発明においては、プロティンＡ産生菌でおる任意の黄
色ブドウ球菌株を使用できるが好ましいのは前記のコー
ワン！株の池にファージタイプ（ｐｈａｇｅｔｙｐｅ）
５２株、５２／）２株、Ａ／７９／８０株等の比較的プ
ロティンＡを多く含む株である。
色ブドウ球菌株を使用できるが好ましいのは前記のコー
ワン！株の池にファージタイプ（ｐｈａｇｅｔｙｐｅ）
５２株、５２／）２株、Ａ／７９／８０株等の比較的プ
ロティンＡを多く含む株である。
実施例
以下、本発明を実施例等により具体的に説明する。
調製例（ＬＨ変異株菌体含有液の調製）黄色ブドウ球菌
コーワン１株をＢＨ工檀地で約３７°Ｃ１４〜５時間、
菌濃・度が約５Ｘ１０８ＣＦ、−になるまで培養した（
対数増殖期まで）。菌体を遠心処理により集め生理食塩
水で３回洗浄した。
コーワン１株をＢＨ工檀地で約３７°Ｃ１４〜５時間、
菌濃・度が約５Ｘ１０８ＣＦ、−になるまで培養した（
対数増殖期まで）。菌体を遠心処理により集め生理食塩
水で３回洗浄した。
洗浄した菌体を４ ｍＡの生理食塩水に懸濁して約５
Ｘ １０８Ｃ−Ｆ−Ｕ−／ＦＬＪ−としシャーレに入れ
攬拌しながら殺菌灯（紫外線照射１５Ｗ）で約１時間照
射した。このＵＶ照射した菌液（菌数・Ｉ ＸＩ ０３
Ｃ−Ｆ−ＩＪ−７−ｔ ＞を再びＢＨ工培地で上記と同
じ条件で培養し、菌数約６ Ｘ １０８ ｃ、 Ｆ、
ＴＪｙ’ｍＪ−の培養液を得た。この菌液２′Ｆｎ、１
に免疫グロブリンを感作した赤血球を加え室温にて約１
０分間放置し続いて１．５００ ｒｐｍ 、約３分間遠
心処理を行った（コセディメンティション処理）。
Ｘ １０８Ｃ−Ｆ−Ｕ−／ＦＬＪ−としシャーレに入れ
攬拌しながら殺菌灯（紫外線照射１５Ｗ）で約１時間照
射した。このＵＶ照射した菌液（菌数・Ｉ ＸＩ ０３
Ｃ−Ｆ−ＩＪ−７−ｔ ＞を再びＢＨ工培地で上記と同
じ条件で培養し、菌数約６ Ｘ １０８ ｃ、 Ｆ、
ＴＪｙ’ｍＪ−の培養液を得た。この菌液２′Ｆｎ、１
に免疫グロブリンを感作した赤血球を加え室温にて約１
０分間放置し続いて１．５００ ｒｐｍ 、約３分間遠
心処理を行った（コセディメンティション処理）。
上清中の菌（このときの菌数約７Ｘ１０５Ｃ−Ｆ−Ｕ。
／ｍＪＬ ）を再びＢＨ工培地に移植し、菌濃度５Ｘ１
０８Ｃ−Ｆ−ワ―となるまで培養した。
０８Ｃ−Ｆ−ワ―となるまで培養した。
以下、遠心処理によシ菌体を集め、生理食塩水で洗浄（
３回）し紫外線照射、コセテ゛イメンテーション処理、
その後の培養と続く上記一連の操作を３〜４回繰返した
後、得られた菌液を１％之イメ血清を含むＢＨ工寒天培
地上に塗床して生育したコロニーのまわシに菌により産
生分泌されたプロティンＡと、免疫グロブリンと反応し
て凝集リングの生じたもの（ＬＨ変異株菌）を釣菌した
。
３回）し紫外線照射、コセテ゛イメンテーション処理、
その後の培養と続く上記一連の操作を３〜４回繰返した
後、得られた菌液を１％之イメ血清を含むＢＨ工寒天培
地上に塗床して生育したコロニーのまわシに菌により産
生分泌されたプロティンＡと、免疫グロブリンと反応し
て凝集リングの生じたもの（ＬＨ変異株菌）を釣菌した
。
このようにして得たＬＨ変異株菌をＢＨより１００１中
で攪拌下（４００ｒｐｍ）、温度３４°Ｃ１空ｄＡｎ’
ｘｎで１６〜２０時間培養した。培養液を遠心処理（３
，ＯＯＯｒｐｍ）して培養上清を調製した。この上清は
工ｇＧを用いた凝集法で測定して約２００μシー程度の
プロティンＡを含んでいた。
で攪拌下（４００ｒｐｍ）、温度３４°Ｃ１空ｄＡｎ’
ｘｎで１６〜２０時間培養した。培養液を遠心処理（３
，ＯＯＯｒｐｍ）して培養上清を調製した。この上清は
工ｇＧを用いた凝集法で測定して約２００μシー程度の
プロティンＡを含んでいた。
実施例１
上記調製例で得たプロティンＡ含有上清２０１を限外濾
過により約２０倍に濃縮し、ｐ Ｅ（５，４，０，０５
Ｍ酢酸緩衝液約８〜１０１で透析しバッファー交換を行
った。次いでｐ Ｈ５，０−５，３の０．０５Ｍ酢酸緩
衝液で平衡化したカチオン交換体であるカルボキシメチ
ル系樹脂ＣＭ−セファローズ０Ｌ−６Ｂを充填した５、
０ ｃｍφ×４０ｃｒｎのカラムに通して、プロティ
ンＡを上記樹脂に吸着させた。その後、ｐＨ５，０，０
，０５Ｍ酢酸緩衝液とこれに０．３Ｍ Ｎａｃｌを添加
した液とを用いて電導度変化によるグラジェント溶出を
行った。その結果を第１図に示す。
過により約２０倍に濃縮し、ｐ Ｅ（５，４，０，０５
Ｍ酢酸緩衝液約８〜１０１で透析しバッファー交換を行
った。次いでｐ Ｈ５，０−５，３の０．０５Ｍ酢酸緩
衝液で平衡化したカチオン交換体であるカルボキシメチ
ル系樹脂ＣＭ−セファローズ０Ｌ−６Ｂを充填した５、
０ ｃｍφ×４０ｃｒｎのカラムに通して、プロティ
ンＡを上記樹脂に吸着させた。その後、ｐＨ５，０，０
，０５Ｍ酢酸緩衝液とこれに０．３Ｍ Ｎａｃｌを添加
した液とを用いて電導度変化によるグラジェント溶出を
行った。その結果を第１図に示す。
！＄ＩＩ図は、グラジェント溶出に際しての電導度変化
曲線（ｍｖ／、、）と各溶出フラクション（横軸黒で示
す）のＯＤ２７４ｎｍでの吸光度曲線を示す。即ち、電
導度１．５９ｍＶ／、の上記ｐＨ５，０，０，０５Ｍ酢
酸緩衝液とこれに０．３ Ｍ Ｎａｃｌを加えた電導度
２７．７ ｍｖ／、の緩衝液とを適宜混合して電導度勾
配を作成して溶出したとき、電導成約２０．０〜約２３
．０ ”ｖ／にｙｌ （７７’；’ ジョンｔｒａ １
４０〜１５０）で吸光度のピークが見られ、さらに免疫
電気向流法で行ったＩｇＧとの親和性（結合力）、試験
においても同じフラクションにおいて１最も強いＩｇＧ
親和性（図中十で示す）を示すことが判った。さらに、
ポリアクリルアミドディスク電気泳動にょシタンパク成
分を調べ、プロティンＡのみを含有する轟１４０〜１５
０のフラクションを精製プロティンＡ含有液としてプー
ルした。
曲線（ｍｖ／、、）と各溶出フラクション（横軸黒で示
す）のＯＤ２７４ｎｍでの吸光度曲線を示す。即ち、電
導度１．５９ｍＶ／、の上記ｐＨ５，０，０，０５Ｍ酢
酸緩衝液とこれに０．３ Ｍ Ｎａｃｌを加えた電導度
２７．７ ｍｖ／、の緩衝液とを適宜混合して電導度勾
配を作成して溶出したとき、電導成約２０．０〜約２３
．０ ”ｖ／にｙｌ （７７’；’ ジョンｔｒａ １
４０〜１５０）で吸光度のピークが見られ、さらに免疫
電気向流法で行ったＩｇＧとの親和性（結合力）、試験
においても同じフラクションにおいて１最も強いＩｇＧ
親和性（図中十で示す）を示すことが判った。さらに、
ポリアクリルアミドディスク電気泳動にょシタンパク成
分を調べ、プロティンＡのみを含有する轟１４０〜１５
０のフラクションを精製プロティンＡ含有液としてプー
ルした。
次に比較のため、上記ＣＭ−セファローズＣＩ、−６Ｂ
の代りにアニオン交換体であるＤＩＥＡＥ−セファロー
ズＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）を用いて同様の実験
を打い、第２図の結果を得た。この際２０倍濃縮後のプ
ロティンＡ含有上清は、０．０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８３）でバッファー交換を行い、交換体も上記の
リン酸緩衝液を用いて平衡した。電導度グラジェント溶
出に用いた緩衝液はｐＨ６，８３，０，０５Ｍ ！Ｊ
：／酸１１ＪｔｆｌＫ ２．２０ｍ′ｒｔ／、 ト、コ
レＫＯ，２Ｍ ＮａＣ１を加えた緩衝液１８．３０ｍυ
ムであった。第２図を見るに吸光度曲線は第１図におけ
る急激なピークは見られず、なだらかであり工ｇＧとの
親和性も分散している。
の代りにアニオン交換体であるＤＩＥＡＥ−セファロー
ズＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）を用いて同様の実験
を打い、第２図の結果を得た。この際２０倍濃縮後のプ
ロティンＡ含有上清は、０．０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８３）でバッファー交換を行い、交換体も上記の
リン酸緩衝液を用いて平衡した。電導度グラジェント溶
出に用いた緩衝液はｐＨ６，８３，０，０５Ｍ ！Ｊ
：／酸１１ＪｔｆｌＫ ２．２０ｍ′ｒｔ／、 ト、コ
レＫＯ，２Ｍ ＮａＣ１を加えた緩衝液１８．３０ｍυ
ムであった。第２図を見るに吸光度曲線は第１図におけ
る急激なピークは見られず、なだらかであり工ｇＧとの
親和性も分散している。
さらに、次の各試料についてディスク電気泳動法による
不純物の存在の有無を調べた。
不純物の存在の有無を調べた。
試料ＡＩ、 ＤＥＡＥセファロース０Ｌ−６Ｂ供試前
の液〃２．〃 の素通り液 ｔｔ ４ ＣＭ−セファローズＣＬ−６Ｂ供試前の
液〃 ５・ 〃 の素通り液結
果は第３図に示すとおりであるが、試料点１と＆４は明
らかにプロティンＡと不純物の混在を示しており、試料
＆２と＆５は不純物のみの存在を示している。このこと
から、アニオン交換体、カチオン交換体ともにプロティ
ンＡを十分吸着していることは分るが、溶出後の試料点
３と／Ｆｌ１６の比較で明らかなように、試料７１１１
３では不純物の混在が明確に見られるのに対し、／１Ｆ
Ｌ６では殆んど見られない。
の液〃２．〃 の素通り液 ｔｔ ４ ＣＭ−セファローズＣＬ−６Ｂ供試前の
液〃 ５・ 〃 の素通り液結
果は第３図に示すとおりであるが、試料点１と＆４は明
らかにプロティンＡと不純物の混在を示しており、試料
＆２と＆５は不純物のみの存在を示している。このこと
から、アニオン交換体、カチオン交換体ともにプロティ
ンＡを十分吸着していることは分るが、溶出後の試料点
３と／Ｆｌ１６の比較で明らかなように、試料７１１１
３では不純物の混在が明確に見られるのに対し、／１Ｆ
Ｌ６では殆んど見られない。
このことは本発明の方法によれば、カチオン交換体の使
用の１回のクロマトグラフィー処理で高度に精製したプ
ロティンＡが得られるのに対し、アニオン交換体の使用
はさらに追加の処理を行なわなければ高純度のプロティ
ンＡが得られないことを示している。
用の１回のクロマトグラフィー処理で高度に精製したプ
ロティンＡが得られるのに対し、アニオン交換体の使用
はさらに追加の処理を行なわなければ高純度のプロティ
ンＡが得られないことを示している。
さらに本発明方法により得られたプロティンＡの純度を
さらに確認するため、試料悪６のデンシトメトリースキ
ャ？ニングによる純度検定結果と紫外線スペクトμによ
るパターン図とをそれぞれ第４図及び第５図に示すが、
これらの結果はいずれも本発明による精製品は不純物が
殆んど見られず十分に精製されたプロティンＡであるこ
とを明瞭に示している。
さらに確認するため、試料悪６のデンシトメトリースキ
ャ？ニングによる純度検定結果と紫外線スペクトμによ
るパターン図とをそれぞれ第４図及び第５図に示すが、
これらの結果はいずれも本発明による精製品は不純物が
殆んど見られず十分に精製されたプロティンＡであるこ
とを明瞭に示している。
実施例２
次に、上記ＣＭ−セファローズ０Ｌ−６Ｂの各ｐＨ値で
のプロティンＡ吸着性を試験した。
のプロティンＡ吸着性を試験した。
ＫＣｊｌ含有リン酸クエン酸バッファー（総七ｐ数０．
０５Ｍ）を用い、下記の各ｐＨでのプロティンＡ吸着性
をヒトＩｇＧ感作ラテツクス凝集反応により測定した。
０５Ｍ）を用い、下記の各ｐＨでのプロティンＡ吸着性
をヒトＩｇＧ感作ラテツクス凝集反応により測定した。
結果は次のとおりである。
上清中のヒトエｇＧ・ラテックス凝集側実施例３
調製例で得た培養上清をｐＨ４，５〜５．０のマツキル
ペン（ＭｃＱｖａ：Ｌｎｅ’ｓ ）緩衝液にそれぞれ適
当量で懸濁させ、得られへ懸濁液にあらかじめ１）Ｉ（
４，７およびｐＨ７，０に平衡化した次の各カチオン交
換体を加えた。
ペン（ＭｃＱｖａ：Ｌｎｅ’ｓ ）緩衝液にそれぞれ適
当量で懸濁させ、得られへ懸濁液にあらかじめ１）Ｉ（
４，７およびｐＨ７，０に平衡化した次の各カチオン交
換体を加えた。
Ａ ＣＭ−セルロース ＣＭ−５２Ｂ
ＣＭ−セファロース ＣＬｉ−６ＢＣＣＭ−セルロ
ファイン ＣＨ 各混合物を室温にて十分攪拌後、上清中のプロティンＡ
の活性をイヌ血清を用いて免疫電気向流法により測定し
た。
ＣＭ−セファロース ＣＬｉ−６ＢＣＣＭ−セルロ
ファイン ＣＨ 各混合物を室温にて十分攪拌後、上清中のプロティンＡ
の活性をイヌ血清を用いて免疫電気向流法により測定し
た。
結果は第６図に示すとおりで、Ｄは対照のプロティンＡ
含有液の場合を示す。第６図′で明らかな如く、Ａ−Ｃ
樹脂のいずれにおいても１）Ｈ７，０に平衡化した場合
は、沈降線が見られプロティンＡを吸着していないのに
対し、ｐＨ４，７では沈降線が見られず、プロティンＡ
を十分に吸着していることが分る。
含有液の場合を示す。第６図′で明らかな如く、Ａ−Ｃ
樹脂のいずれにおいても１）Ｈ７，０に平衡化した場合
は、沈降線が見られプロティンＡを吸着していないのに
対し、ｐＨ４，７では沈降線が見られず、プロティンＡ
を十分に吸着していることが分る。
このことから、ＣＭ−セルロース、ＣＭ−セルロファイ
ン等の池のカチオン交換体４ＣＭ−セファロースＣＬ
−５Ｂ同様プロティンＡｔ−十分に吸着し、本発明にお
いて十分使用できることを意味する。
ン等の池のカチオン交換体４ＣＭ−セファロースＣＬ
−５Ｂ同様プロティンＡｔ−十分に吸着し、本発明にお
いて十分使用できることを意味する。
発明の効果
以上から明らかな如く、本発明の方法は、カチオン交換
体による一段階のクロマトグラフィーによって高純度の
プロティンＡを簡単に得ることができる。また、出発原
料として前記ＬＨ変異株のようなプロティンＡ菌体外産
生性菌を使用すれば従来の菌体結合性プロティンＡを用
いた酵素処理におけるはん雑さもない。
体による一段階のクロマトグラフィーによって高純度の
プロティンＡを簡単に得ることができる。また、出発原
料として前記ＬＨ変異株のようなプロティンＡ菌体外産
生性菌を使用すれば従来の菌体結合性プロティンＡを用
いた酵素処理におけるはん雑さもない。
第１図は、本発明方法によシカチオン交換体ｔｉ４ｐ−
を用いたプロティンＡの精製の際の溶出型導度勾配と溶
出液の吸光度曲線を示すグラフである。 第２図は、比較のためアニオン交換体を用いてプロティ
ンＡを精製したときの第１図と同様のグラフを示す。 第３図は、本発明方法による精製プロティンＡの純度を
明確にするための比較゛電気泳動写真図である。 第４図は、本発明方法によって得たプロティンＡのデン
シトメトリースキャンユング法による純度検定図である
。 第５図は、本発明方法によって得たプロティンＡの紫外
線スペクトルによる純度検定図である。 第６図は、本発明で用いる各カチオン交換体のプロティ
ンＡの吸′碧、特−性・を示す免疫電気向流法による検
討結果を示す写真図である。 ｔｌ曳（、、ｎｙ／（、、−ｍ５−） 図面の〜１、を−割こ変更なし） 第３図 Ｍ６図 ＢＣＤ ｏｏｏｏｏｏ○：○ｐＨ４，７ ０１００１００１００１０ｐ＋１゜ 官５０ 手続補正書（自発） 昭和６０年９月１２日 １、事件の表示 昭和６０年 特許Ｊ［第６７８５０
号２、発明の名称 プロティンＡのＷＩＩ＃方法３、
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 熊本系油本市清水町大１６６８番地５、補
正の内容 （り明細書第１９ページの記載を別紙のとおシ全文訂正
する ４、図面の簡単な説明 第１図は、本発明方法によシカチオン交換体を用いたプ
ロティン人の精製゛の際の溶出型導度勾配と溶出液の吸
光度曲線を示すグラフである◇ ８２図社、比較のためアニオン交換体を用いてプロティ
ンＪｌ精製し九ときの第１図と同様のグラフを示す。 第３図は、本発明方法による精製プロティンＡのＭ度を
明確にするための比較電気泳動図である。 第４図社、本発明方法によって得九プロティンＡのデン
シトメトリースキャンユング法による純度検定図である
Ｏ 第５図は、本発明方法によって得たプロティンＡの紫外
線スペクトルによる純度検定図である。 第６図は、本発明で用いる各カチオン交換体のプロティ
ンＡの吸着特性を示す免疫電気向流法による検討結果を
示す比較図である。
を用いたプロティンＡの精製の際の溶出型導度勾配と溶
出液の吸光度曲線を示すグラフである。 第２図は、比較のためアニオン交換体を用いてプロティ
ンＡを精製したときの第１図と同様のグラフを示す。 第３図は、本発明方法による精製プロティンＡの純度を
明確にするための比較゛電気泳動写真図である。 第４図は、本発明方法によって得たプロティンＡのデン
シトメトリースキャンユング法による純度検定図である
。 第５図は、本発明方法によって得たプロティンＡの紫外
線スペクトルによる純度検定図である。 第６図は、本発明で用いる各カチオン交換体のプロティ
ンＡの吸′碧、特−性・を示す免疫電気向流法による検
討結果を示す写真図である。 ｔｌ曳（、、ｎｙ／（、、−ｍ５−） 図面の〜１、を−割こ変更なし） 第３図 Ｍ６図 ＢＣＤ ｏｏｏｏｏｏ○：○ｐＨ４，７ ０１００１００１００１０ｐ＋１゜ 官５０ 手続補正書（自発） 昭和６０年９月１２日 １、事件の表示 昭和６０年 特許Ｊ［第６７８５０
号２、発明の名称 プロティンＡのＷＩＩ＃方法３、
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 熊本系油本市清水町大１６６８番地５、補
正の内容 （り明細書第１９ページの記載を別紙のとおシ全文訂正
する ４、図面の簡単な説明 第１図は、本発明方法によシカチオン交換体を用いたプ
ロティン人の精製゛の際の溶出型導度勾配と溶出液の吸
光度曲線を示すグラフである◇ ８２図社、比較のためアニオン交換体を用いてプロティ
ンＪｌ精製し九ときの第１図と同様のグラフを示す。 第３図は、本発明方法による精製プロティンＡのＭ度を
明確にするための比較電気泳動図である。 第４図社、本発明方法によって得九プロティンＡのデン
シトメトリースキャンユング法による純度検定図である
Ｏ 第５図は、本発明方法によって得たプロティンＡの紫外
線スペクトルによる純度検定図である。 第６図は、本発明で用いる各カチオン交換体のプロティ
ンＡの吸着特性を示す免疫電気向流法による検討結果を
示す比較図である。
Claims (6)
- （１）プロテインＡ含有液をカチオン交換体に吸着させ
次いで吸着したプロテインＡを溶出させることからなる
プロテインＡの精製方法。 - （２）プロテインＡ含有液がプロテインＡ細胞外産生菌
を液状培地に培養して得たものである特許請求の範囲第
（１）項記載の方法。 - （３）プロテインＡ細胞外産生菌がコセディメンテーシ
ョン法によって分離した黄色ブドウ球菌のＬＨ変異株で
ある特許請求の範囲第（２）項記載の方法。 - （４）黄色ブドウ球菌が、コーワン I 株、ファージタ
イプ５２株、５２／５２株またはＡ／７９／８０株であ
る特許請求の範囲第（３）項記載の方法。 - （５）プロテインＡの吸着をｐＨ４．０Ｎ６．０の酸性
条件下で行う特許請求の範囲第（１）項、第（２）項、
第（３）項または第（４）項のいずれか一項の記載の方
法。 - （６）ｐＨが４．５〜５．０の範囲である特許請求の範
囲第（５）項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6785085A JPS61224997A (ja) | 1985-03-29 | 1985-03-29 | プロテインａの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6785085A JPS61224997A (ja) | 1985-03-29 | 1985-03-29 | プロテインａの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61224997A true JPS61224997A (ja) | 1986-10-06 |
Family
ID=13356844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6785085A Pending JPS61224997A (ja) | 1985-03-29 | 1985-03-29 | プロテインａの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61224997A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7375188B2 (en) | 2005-07-29 | 2008-05-20 | Mallinckrodt Baker, Inc. | Vegetarian protein a preparation and methods thereof |
-
1985
- 1985-03-29 JP JP6785085A patent/JPS61224997A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7375188B2 (en) | 2005-07-29 | 2008-05-20 | Mallinckrodt Baker, Inc. | Vegetarian protein a preparation and methods thereof |
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