JPS61212286A - 溶液中のペルオキシダーゼの活性を安定化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、浴液中のペルオキシダーゼの活性上安定化イ
る方法に関する。

従来の技術 ペルオキシダーゼは、殊に酵素的検出反応の範囲内で多
く使用される酵素である。種々の実施態様の酵素免役試
験（Ｅ工Ａ）の範囲内でも、ペルオキシダーゼは標Ｒ酵
素として広く普及されている。種々の出所のペルオキシ
ダーゼ、特に西洋ワサビのペルオキシダーゼは、多数の
方法を用いて迅速かつ定量的に検出できる。

検出酵素または標識酵素としてのペルオキシダーゼの極
めて良好な適性はこ４に基づく。しかしながら他面で、
ペルオキシダーゼ（’ＰＯＤ　）は、殊に高い希釈液お
よび溶液では、全く不十分な活性安定性を有するという
欠点を有する。

従って、殊に酵素的試験試薬または他の酵素製剤の範囲
内のペルオキシダーゼ結合物の寿命は制限されていて、
目指す貯蔵性を得るためには、安定化が必要である。

西ドイツ国特許出願公開第３１０００７６号明細書から
、血清タンパク質を含有する媒体中でペルオキシダーゼ
七８−アニリノ−１−ナフタリンース＼フオンｉ！Ｉ！
　（ＡＮ８　）の番加忙工って安定化することは既に公
知である。欧州公開特許第１７０９９２号から、血清ま
たは血清タン定 バク質を含有する媒体中でＰＯＩ）′ｆｔ安χ化するた
めに４−アミノアンチピリンを使用することも公知であ
る。最後に、米国特許第４１６９０１２号から、ＰＯＩ
）ｊ−、たとえばＡｔ、ＺｎＸＭｇ、　Ｆθお工びＣｕ
のような周期律の第３族及び第４族からの多価イオンに
よつ１安定化することが公知である。これら公知の活性
安定剤は、通常の組合せ試柴の他の株加物とあまシ相溶
性がないか、または活性安定化に関して相変らず所望の
ものとは程遠い。さらに、この活性安定剤は、ＰＯＤが
免疫学的に有効物質との結合物として存在する場合、部
分的に免疫反応に不利な影響を及はし、これは平坦な較
正曲線上止じる。

発明が解決しようとする問題点 匠って、本発明の根底ｔなす課題は、溶液でのペルオキ
シダーゼまたはペルオキシダーゼ結合物の活性上、上述
の欠点なしにかつ本来の免役反応に不利な影響を及は１
ことなしに安定することである。

問題点を解決するための手段 この課題は本発明によれば溶液でのペルオキシダーゼの
活性ｔ−％殊な活性安定剤の添加によって安定化する方
法によって解決され、この方法は、固形または溶解した
形で存在する酵素に活性安定剤として、場合により低級
アルキル基、塩素原子または／および臭素原子であって
よい１つまたは若干の置換基を有するフェノールを、ｌ
＠液に対してｏ、ｏ　ｏ　ｏ　ｓ〜２重量％の量で添加
すること１％徴とイる。

本発明によれば、遊離かまたは場合によっては結合物中
に共有結合して存在するペルオキシダーゼの酵素活性は
、特に希釈された溶液中で非常に顕者な、温度、異物質
等の不活性化作用に対して安定化される。このことは、
溶液中で生じる酵素活性の急激な減少が除去ないしは者
しく弱められることを意味し、これによって結合物中の
ペルオキシダーゼに結合している免疫学的有効物質の免
疫学的有効性は損なわれることもない。

本発明の範囲内では、活性安定剤としてフェノールそれ
自体かまたは１つまたは多数の低級アルキル基、塩素原
子、または／および臭素原子で置換されているフェノー
ル誘導体が使用される。好ましい安定剤は、フェノール
それ自体の他に、　ブロムフェノール、クロルフェノー
ル、ジクロルフェノール、ジブロムフェノールおよびク
レゾールである。この場合、置換基はベンゼン環の全て
の位置に存在しうる。置換フェノールのうち、環に１つ
または２つの置換基を有するものが有利となる。低級ア
ル４ａル基とは、本発明の範囲内では１〜３個の炭素原
子を有するものを表わす。

本発明による活性安定剤は、上記に既述したように、Ｐ
ＯＤが含有されている溶液の容積に対して０゜００５〜
２重量％の量で添加されろ。２％の上限を上廻る場合、
実際に熱作用に対する負荷能力は依然として保持された
ままであるが、ＰＯＤ活性それ自体は再び減少する。下
限を下廻った場合、満足な安定化はもはや得られない。

本発明によれば、活性安定剤は有利には０．０１〜０．
５重量％の量で添加される。

活性安定剤は、固形または溶解した形で存在する酵素ま
たは酵素結合物に、任意の時点で添加することができる
。溶液に添加するのが有利であり、その理由はそれによ
つ１安定剤の均一な分配が得られ、それとともにこの分
配によって、有効範囲の下限で添加した場合でも、良好
な作用が得られるからである。殊に、フェノールを酵素
溶液ないしは結合物溶液に１親液性化の前または水性浴
剤で親液性物質を再構成した後に添加することができ、
その際、後者の場合にもちろん溶剤をまず活性安定剤と
混合し、その後親液性物質に添加してそれを溶解するこ
とができる。

結合物中の免疫学的に有効物質としては、有利に抗体ま
たは抗体フラグメント、抗原またをゴハテテンが使用さ
れる。

抗原ないしはハプテンとじてをｊまたとえばタンパク質
、業物、ステロイド、およびホルモンが挙げられる。こ
れの例は、ＴＢＧ、コルチンル、♂クミンＢ１２、ジブ
キシン、ジブキシゲニン、トリヨードチロニンおよびチ
ロキシンである。

抗体としては、ポリクロナール抗体およびモ　　　”ノ
クロナール抗体、およびそれらのフラグメントがこれに
該当する。同様に、その化学的に変えられた誘導体、た
とえばグルタルジアルデヒドで架橋された抗体が結合物
の成分であってもよい。その例は、’Ｌ’８）１　、　
ｈＣＧ　、　ＡＩＦＰ　、　ＬＨ、７８Ｈ、プロラクチ
ン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ　）、フェリチン（Ｆａｒｒｉ
ｔｉｎ　）、ＣＩＬＡおよびインシュリンに対する抗体
である。

ＰＯＤとしては、かかる酵素の全ての変種がとれに該当
する。その良好な入手性に基づき、西洋ワサビのＰＯＤ
が望まれる。

有利に、本発明による方法の場合、上述の活性安定剤の
他に、なお保存剤が添加される。過当な保存剤は、たと
えばメチルオレート（Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔ　）、ゲル
マ−ル（Ｇｅｒｍａｌｌ　）、ドビシＡ／　（Ｄ□ｗｉ
ｃｉｌ　）およびカートｙ　（Ｋａｔｈｏｎ）ＣＧであ
る。

また、ペルオキシダーゼまたはベルオキシダービ結合物
を含有し、０．０００５〜２重蓋チのフェノールを含有
し、このフェノールは場合に工つ′Ｃは低級アルキル亮
、塩素原子または／および臭素原子であってもよい１つ
または幾つかの置換基を有するフェノールｏ、ｏ　ｏ　
ｏ　ｓ〜２重量％を含有する。安定化された酵素製剤も
本発明の範囲内である。

結合物の成分、活性安定剤の量および場合による付加的
な保存剤の含量に関しては、方法に対する上述の記載が
、安定化された酵素製剤についても同様にあてはまる。

さらに酵素製剤は、有利になお緩衝物質、たとえばリン
酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝物液等ま
たは／および牛血清アルブミンまたは／およびペルオキ
シダーゼ活性の検出系を含有する。

本発明は、浴液中で通常化じる迅速な活性減少に対する
ＰＯＤまた１２Ｉ’ＯＤ−結合物の酵素活性の安定化が
、結合物における免疫反応の不利な影響なしに可能であ
る。その際、本発明により活性安定化は高い温度でも長
時間達成されるので、すぐに使用できるＰＯＤまたはＰ
ＯＩ）−結合物の溶除の使用性は者しく改善される。

次の例は本発明の詳細な説明する。

実施例 例１（抗体−ＰＯＤ結合物の安定化） 溶ｏ１ 恒温保持した緩衝港 リ　ン酸塩緩伽液　　　　　　　　１５ミリモル／λ、
ｐｉ−１６，９牛血清アルブミン（Ｒ８Ａ）　　０．２
重１ｉ％メルチオラート　　　　　　０．０１重量％溶
液２ 溶ｏ１に溶解された抗−ＴＳ　Ｈ−ＰＯＤ七合物約４０
０／１ 溶液３ 基質緩衝液 リン酸塩クエン酸塩緩衝液　　　　　　９５　ミリモル
／ｌ、ｐ）１４−４過ホウ酸ナトリウム　　　　　　　
　３．１ミリモル／１２．２′−アジノージ−〔３−エ
チル　１．６ミリモル７１ズ ーイノＸチアゾリン−スルホン酸 （６）〕−ジアンモニウム塩 （ＡＢＴ８■） 使用される溶液、核種された。Ｊ４および標準液は、エ
ンチーム・テストＴ８Ｆ！　’ｂ　Ｃペーリンガー・マ
ンハイム社（Ｂｏａｈｒｉｎｇａｒ　Ｍａｎｎｈａｉｍ
　ＧｍｂＨ）。

測定番号７３　６０　８３号〕に由来する。測定の実施
は製造業者の社内規定と同様に行なう。

抗−７８Ｈ−抗体で被橿された小管内に、溶液１　１ｄ
およびＴ８Ｈ−標準液（約５０即／１）０．２−を添加
し、６０分間、２０〜２５℃で恒温保持する。吸引およ
び洗浄した後、溶液２１−を添加する。このために使用
される溶液２は、新しく配合されたか（比較測定）ｔた
は添加前に、８時間、１８時間ないしは２４時間、３０
℃で恒温保持されておシ、その除場合によってはフェノ
ール０．０１重１％が添加された。

６０分間２０〜２５℃で恒温保持した後、小管を吸引し
、洗浄する。引き続き、溶液３１１ＩＬｔを添加し、再
び６０分間２０〜２５℃で恒温保持する。その後、溶液
３に対して、空試験値としてλ−４０５ｎｍで光度測定
を実施する。

次のｆｉｌに記載された値は、それぞれ、新しく配合さ
れた溶液２（フェノールなし）ｔ−用いた試鹸で得られ
た相対値１００％に対するものである。

同様の測定を次のもの使用いて実施した：酵素試験０フ
ェリチン　　　測定番号６７　７３　３７酵素試−τＢ
Ｋ　　　　　　　測定番号２４　９４　１６酵素試験０
ジ♂キシン　　　　測定番号１９　９６　５６酵素試験
ＯＡ？Ｐ　　　　　　　測定番号７１　１４　１１（ｌ
ｌｌ造業者二（ヘ−リンガーマンハイム社）〕によって
実施される。

ｆ１２（フェノール／フェノール誘導体ヲ用いる遊離ペ
ルオ牟シダーゼの安定化） 恒温保持した緩衝液： Ｋｎ　２ＰＯ、緩衝液　　　　　　１０ミリ七ル／１１
ＰＨ７，５Ｎａ　ＣＪ　　　　　　　　　　　　　　　
１００　　ミ！７　モルｉ　１Ｒ８Ａ　　　　　　　　
　　　Ｏ，５重量係フェノールないしはフェノール　０
．０２ｉ１ｔチ誘　導体 ＰＯＤ　ｔ−恒温保持した緩衝液中で２４時間ないし４
８時間３０℃で保持し、引き続きＰＯＤ−活性に測定し
かつ無添加溶液の活性と比較する（無添加溶液は、２４
時間ないし４８時間、４℃で保存する溶液である）。

ＰＯＤ　ｒｔＩ性を測定するために１恒温保持した緩衝
ｆｌｔｔ　０．１　ｍオヨヒｐｏＤＩｍ２．９ｔＩＬｔ
ｔ２５℃テ混合しλ＝４０５　ｎｍでの光度測定によ９
５分間吸光変化を追跡しｚ／ｍｉｎ’ｉ測定した。ＰＯ
Ｄ活性は次式によって計算される： ［１，ｌＸ３６．ＩＸ１ 結果として表■お工び表Ｉが得られた。

表　　２ 表　　■ 例　　３ 例２による実験実施におい１、異なる濃度のフェノール
を用いて表■による結果が得られム表　　■ Ｏ，ＯＳ　＊　：緩衝液４２２　、４−シ１０””７エ
／−／ｌ／　　’で飽和さ七ていた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特殊な活性安定剤の添加によつて、溶液中のペルオ
   キシダーゼの活性を安定化する方法において、固形また
   は溶解した形で存在する酵素に、活性安定剤として、場
   合により低級アルキル基、塩素原子、または／および臭
   素原子であつてもよい１つまたは幾つかの置換基を有す
   るフェノールを、溶液に対して ０．０００５〜２重量％の量で添加することを特徴とす
   る溶液中のペルオキシダーゼの活性を安定化する方法。 ２、フェノール０．０１〜０．５重量％を添加する、特
   許請求の範囲１項記載の方法。 ５、フェノールを、親液性化するための結合物溶液に添
   加する、特許請求の範囲第１項から第２項までのいずれ
   か１項に記載の方法。 ４、フェノールを水性溶剤を用いて再構成された親液性
   物質に添加する、特許請求の範囲第１項から第２項まで
   のいずれか１項に記載の方法 ５、ペルオキシダーゼを結合物として、免疫学的に有効
   な物質との結合物として使用する、特許請求の範囲１項
   から第４項までのいず れか１項に記載の方法。 ６、免疫学的に有効な物質が抗体または抗体フラグメン
   ト、抗原またはパプテンである、特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ７、免疫学的に有効な物質がジゴキシン、ジゴキシゲニ
   ン、トリヨードチロニンまたはチロキシン、またはＴＳ
   Ｈ、フエリチンまたはＡＦＰに対する抗体である、特許
   請求の範囲第６項記載の方法。 ８、付加的に保存剤を添加する、特許請求の範囲第１項
   から第７項までのいずれか１項に記載の方法。