JPS61173798A - Ｂ−細胞新生物の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、デ・デパートメント・オプ・ヘルス、エデュ
ケーション・アンド・ウェル７エア（ｔＭＤｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　、　Ｅｄｕｃａｔｉｏ
ｎ　ａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ）からの助成金または奨学
金の下での研究の進行中に行なわれた。

癌の有利な予知は悪性細胞の初期の検出に依存する。Ｂ
−細胞新生物、例えばリンパ球性白血病、濾胞性リンパ
腫、その他は染色体転座を有する異常型細胞から発達す
る。新生物Ｂ−細胞の核学的分析は、それらが特定新生
物に特有の染色体転座をもつことを示している〔エリク
ソン（ｇｒｉｋｓｏｎ）等、プロシーデインダス・オデ
・ナショナル・アＳｃｉ、　ＵＳＡ　）　８０　；　４
８２２〜４８２６　（１９８３）、およびＰｒｏｃ、　
Ｎａｔ′ＩＡｃａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ　８１　：　
４１４４〜１４４８（１９８４）参照〕。例えば、染色
体１４と１８の間の転座はヒト濾胞性リンパ腫の特徴で
ある〔クロース（Ｃｒｏｃｅ　）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ’ＩＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ３Ａ３０　：　６９２
２〜６９２６（１９８３）およびユ＝　（Ｙｕｎｉ　）
等、Ｎ、　Ｅｎｇｌ。

Ｊ、　Ｍｏ２．３’０７　：　１２３１〜１２３６　（
１９８２）参照〕。

しかし、リンパ球の核学的分析は、これらＢ−細胞新生
物の染色体再配列を検出するために多数の個人をスクリ
ーニングする能率的技術ではない。

従って、疑われたＢ−細胞新生物の診断のための簡便な
試験法に対する要望がある。

発明の要約 本発明の一つの目的はＢ−細胞新生物における染色体転
座を検出し、同定する試験を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は転座により生じた雑種染色体
の存在を検出できるＤＮＡプローブを提供することにあ
る。

本発明によれば、標識したＤＮＡ　７’　０−デを制限
Ｂ−細胞ＤＮＡ　Ｋ雑種形成させ（前記ＤＮＡプローブ
は悪性Ｂ−細胞の雑種染色体の制限部位と前記染色体の
切断点との間にあるＤＮＡの領域に雑種形成し、前記制
限部位は前記領域に独特である）、前記ＤＮＡ！ロー少
が雑種形成する制限−包体ＤＮＡ断片ア゛パメ゛−ンを
同定し、そして試験パターンと制限された正常染色体Ｄ
ＮＡのパターンとの間の差異番検出することからなるＢ
−細胞新生物の診断法が提供される゛。

本発明で使用するＤＮＡプローブは、Ｂ−細胞の悪性変
換に含まれる転座染色体上に位置する遺伝子の場所を明
らかＫするものである。本発明は、病気の初期段階忙あ
る患者の濾胞性リンパ腫、分散Ｂ−細胞リンパ腫、その
他のようなり一細胞新生物の検出と同定を可能にする。

本発明は正確な診断のために明白な症状が現われる必要
がない。

発明の詳細な記述 本発明における使用が全回されたＤＮＡ　７’ロープは
、染色体転座をもつ試験管内に保たれたＢ−細胞系のＤ
ＮＡから、あるいはＢ−細胞新生物をもつ患者から直接
得られた新鮮試料から誘導できる。

完全なｒツムライブラリーがこれら細胞系のＤＮＡから
調製できる。ｒツムライブラリーを構成するための公知
の技術のいずれも使用できる。このような手順はデノム
ＤＮＡを制限酵素で部分消化し、ＤＮＡ断片（長さ１５
から２５　ｋｌ）　）を精製し、これら断片をラムダ−
ファージベクターのＤＮＡで結合し、そして試験管内で
パッケージすることを包含するが、これに制限されない
。

ＤＮＡの目的断片は、独立した組換え７アージを、Ｂ−
細胞系に、あるいは新しい腫瘍細胞に存在する雑種染色
体の切断点付近く位置する遺伝子配列に特異的なプルー
プでスクリーニングすることにより得ることができる。

例えば、染色体１４上の免疫グロブリンＨ鎖遺伝子は切
断点付近にある。

染色体２２上の免疫グロブリンラムダ−鎖遺伝子は切断
点近くにあり、カッパー鎖免疫グロブリン遺伝子は染色
体２の切断点の近くＫある。ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子は染色
体８の切断点の近くＫある。

切断点という用語はここで用いているように結合領域と
して引用しているが、これはまたＤＮＡ主鎖をなすヌク
レオチド間の共有結合が切れて異なる染色体から誘導さ
れたヌクレオチドと共に再形成する場所を指す。このよ
５Ｋして生じた染色体は１つ以上の染色体から誘導され
たＤＮＡからなる雑種染色体である。染色体１４および
１８ｔ−含む転座は大多数のリンパ腫に観察されている
。染色体８と２．８と１４．８と２２、および１１と１
４を含むＢ−細胞新生物に生する他の転座も知られてい
る。

転座をもつＢ−細胞は二つの雑種染色体：植字的分析に
よるとその相同染色体よりも長いと思われる雑種染色体
、および植字的分析によりその相同染色体より短いと思
われる雑種染色体を有する。

ここで用いた雑種染色体という用語は１つ以上の染色体
から生じたＤＮＡからなるど゛の染色体に対しても包括
的である。

雑種染色体の切断点にまたがる染色体領域から誘導され
たＤＮＡは胚系ＤＮＡとは異なる制限地図を有し、従っ
て制限地図分析によって同定できる。

例えば、切断点Ｋｌたかる正常染色体１４から誘導され
たＤＮＡクローンは制限酵素または酵素群で切ると特徴
的な制限地図を有する。切断点Ｋまたがり、従って染色
体１４から、および他の染色倣例えば染色体１８からの
ＤＮＡ配列を含む雑種染色体１４から誘導体されたＤＮ
Ａクローンは同じ制限酵素または酵素群で切ると異なる
制限地図をもつが、それはこのＤＮＡクローンのヌクレ
オチド配列が正常染色体１４から誘導されたクローンの
ヌクレオチド配列と異なるからである。制限地図は、Ｄ
ＮＡセグメントを制限酵素または幾つかの制限酵素群で
切るとき生ずる特別な寸法のＤＮＡ断片のパターンを表
わす。特定のＤＮＡ配列を識別し、切断する制限酵素は
この分野で公知であり、微生物から精製されるＥａｏＲ
Ｉ、Ｈｉｎｄ　ｌ　、および８ａｕ３ａといった酵素を
包含するが、これらに限定されない。

切断点にまたがるＤＮＡはサブクローンとして発生させ
ることができ、そして切断点の一方の側だけに雑種形成
するＤＮＡデローデを選択するよう処理できる。即ち、
それを精製し、望む制限酵素で切ってＤＮＡ断片をつく
り、次にこのものをグラスミドベクターの中にクローン
を発生させ、微生物中で増殖させる。サブクローンから
単離されたＤＮＡは唯一つのヒト染色体、例えば染色体
１４を含む雑種細胞（例えば、葺歯動物×ヒト細胞）か
ら誘導されたＤＮＡ　Ｋ雑種形成させることができ、そ
してまた異なるヒト染色体、例えば染色体１８を含む雑
種細胞に雑種形成させることができる。

ヒト染色体１８を含む細胞からのＤＮＡに雑種形成する
が、ヒト染色体１４を含む細胞からのＤＮＡ　Ｋ対して
は雑種形成しないサブクローンを選ぶことができる。別
法として、染色体１４に対して雑種形成するが１８に対
しては形成しないサブクローンも選ばれる。切断点の唯
一の側に染色体ＤＮＡに対して相同のＤＮＡを含むサブ
クローンが本発明における使用に企図されたＤＮＡ　ｆ
ロープである。明らかなように５本発明は切断点のいず
れの側にあるＤＮＡ　Ｋ対しても雑種形成するＤＮＡプ
ローデの使用を企図するものである。ＤＮＡ　ｆロープ
の寸法は約２０個のヌクレオチドからおよそ数百または
数予測のヌクレオチドまで変化しうる。

本発明への使用に企図された細胞系は染色体転座をもつ
悪性Ｂ−細胞から誘導される。このような細胞系は慢性
リンパ球白血病、濾胞性リンパ腫、分散Ｂ−細胞リンパ
腫、および他の白血病またはリンパ腫を包含するが、こ
れらの限定はされない。

このような細胞は当業者にとって周知の標準技術を用い
ることにより培養できる。

上記は本発明に係るＤＮＡプローデを得る代表的手順で
ある。この分野で公知の他の手順も使用できる。

Ｂ−細胞の如何なる給源も本発明に係る診断試験に使用
するのに適している。例えば、診断試験は、Ｂ−ｍ胞腫
瘍の存在に対してスクリーニングされている個人から得
た末梢血液試料を使用できる。ＤＮＡは当業者にとって
よく知られた標準技術を用いてリンパ球から精製される
。リンパ球ＤＮＡの幾つかの部分をそれぞれ制限酵素ま
たは酵素群と共にインキエイーションする。制限酵素は
、染色体のＤＮＡをこの制限酵素で切るとき、プローブ
が染色体の切断点と選ばれた制限酵素が切るＤＮＡ配列
との間にあるＤＮＡの領域に雑種形成するように選ばれ
る。このＤＮＡ領域はこのようＫしてこの制限酵素に対
して独特の部位を含む。プローブはまた制限部位を越え
てＤＮＡ配列に雑種形成しうる。

適当な制限酵素の選択は当業者のよくするところである
。

制限ＤＮＡ試料はアガロースデル電気泳動により分離で
き、サデーン（８ｏｕｔｈｅｒｎ　）　（エリクソン７
５８５（１９８３）］により本質的に記述されている通
り、ニトロセルロースフィルターに吸い取らせることが
できる。制限されたＤＮＡ断片を分離しそれらを更に処
理するための適当な基質に移す他の手順も用いることが
できる。

ニトロセルロースフィルター上または他の適当な基質上
の分離されたＤＮＡ区域は、腫瘍から誘導されたＢ−細
胞系における転座染色体の切断点近くのＤＮＡ領域と相
同である標識ＤＮＡ　プローブに雑種形成される。この
雑種形成反応は当業者にとって公知の標準条件下で実施
できる。その後、分離されたＤＮＡ区域を雑種形成が起
きたかどうかを決定するように調べる。腫瘍性であるリ
ンパ球試料からのＤＮＡは対照ＤＮＡとは異なった雑種
形成パターンを示すが、それは雑種形成パターンが寸法
に変化を起こすか、あるいは再配列した雑種染色体から
誘導された断片によるプローブの雑種形成を表わす追加
の雑種形成パターンが現われるからである。

関連領域における多形を探索したが、見出されたことが
ない。従って、個々の正常細胞の正常なりＮＡパターン
を本発明の試験に対する標準化された対照として使用で
゛きる。必要ならば、試験されている個人からの正常細
胞（例えば、Ｔ−細胞またはＢ−細胞でない他の細胞）
からのＤＮＡを、もしこのような追跡試験を遂行するな
ら追跡試験に用いることができる。

本発明の試験に対する一つの典聾的手順において、ＤＮ
Ａプローブは、例えば放射性リンで標識できそして固体
基質に移されたデルからのＤＮＡをそれで雑種形成する
。基質を洗浄し、乾燥し、そして試験の結果を目に見え
るようにするために％Ｘ−線フイルムに乾燥基質をさら
すととくより雑種形成を検出する。腫瘍をもたない制限
リンパ球ＤＮλ試料に相当するデルのレーンは雑種形成
の特徴的パターンを示し、そして試験ＤＮＡを比較する
対照レーンとして役立つ。ＤＮＡプローブを標識し雑種
形成を検出するための他の手段は当業者にとって公知で
あり、これらもまた使用できる。

本発明の一つの具体例においては、試験細胞ＤＮＡを、
異なる転座を有する細胞系から誘導されるＤＮＡプロー
ブ混合物に雑種形成する。もし最初のスクリーニングが
明確な結果を与えたならば、別僅のＤＮＡプローブを用
いるそれ以上のスクリーニングを行なうことができる。

下記の例は説明の目的のためであって、本発明の範囲を
制限しよ５とする意図はない。

例　　１ 末梢血液および骨髄塗抹の形態学的検査に基づき、急性
リンパ母細胞白血病型Ｌ２（ｐＡＢ分類）を有すると診
断された１５才の少年から末梢血液を採った。診断の根
拠となるデータを表ＩＫ：ｌ）約する。

表１ 過ヨウ素酸シック　　　　　　００ ペルオキシダーゼ　　　　　　００ アルカリ性ホスフアターゼ　　　　　１０　　　　　０
−ナフチルーアセテートー二大門→ぜ　　１２　　　　
　０表面マーカー 多価免疫グロブリン　　　　　２０ ＳＲＢＣ２０ Ｆｃレセプター　　　　　　　イ、 ｃ３ｂレセプター　　　　　　　５０ Ｂ３３．１　　　　　　　　　　　８１　　　　９５Ｊ
−５８０８９ ０ＫＴ−３１００ ０ＫＴ−イ、０ ０ＫＴ−６１０ ｏｘＴ−８２０ ０ＫＴ−１１１１０ Ｌ５−１　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　　
　　　　７２細胞内マーカー 核’Ｉ”ｃＬＴ　　　　　　　　　９２’　　　９０細
胞質免疫グロビン　　　　００ Ｉｉ８ＢＮＡ　　　　　　　　　　　０　　　　０１　
再発時の患者からの未分離末梢血液細胞（９月、１９８
３）。

２　同じ血液標品から確定した細胞系 ３　陽性細胞の百分率 血液を６．４Ｍクエン酸ナトリウムと９／ＩＫ混合し、
リンホゾｖ　７′″（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ　）　（比
重１．０７０、メイガード社（ｌ（ａ７ｇｇａｒａ　ａ
ｎｄ　Ｃｏ、　）、オスロー、ノルウェイ〕上忙重層し
、赤血球および顆粒球を除去するため遠心した。界面か
ら集められた細胞を洗浄し、１５％の胎児子牛血清を含
むＲＰＭ１１６イ、培地に１ｘ１０’／ｄで接種し、５
％ＣＯＲ中６７℃でインキエイーションした。コノ細胞
は浮遊培養中で無限に発育する能力を保持した。

少年の再発中に採った血液試料から誘導された細胞系を
細胞系３８０と称する。

表１に示したように１この３８０細胞は膜固定免疫グロ
ブリンを表出しない。しかし、１様抗原（Ｂ　３３．１
　）指向、また普通の急性リンパ球白血病抗原（Ｊ５）
であるＣＡＬＬＡ指向の抗体との強い陽性反応が観察さ
れた。これら細胞は！−細胞マーカーに％異的な抗体と
反応しなかった（表１）。

ニブシュタイン　パール（ｇｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　
）ウィルス核抗原（ｇＢＮＡ　）の表出は３８０細胞に
おいて検出されなかった。その上、これら細胞は免疫螢
光法により測定されるように、細胞質免疫グロブリンの
表出には陰性であるが、Ｔｄ′ｒＦ／ｃ対しては陽性で
あった。

３８０細胞の植字的分析は二つの相互細胞質転座の存在
を示した。

・β８０細胞は二つの異常染色体１・４（１４ｑ＋入一
つは再配列した染色体８　（８ｑ−）そして一つは異常
染色体１８（１８ｑ−）をもつ。１４ｑ＋染色体の一つ
は染色体８の長い腕の末端が染色体１４の帯ｑ３２上の
ヘビーチェインの場所に転座した結果であるが、他の１
４ｑ＋染色体はヒト染色体１８のｑｔａｒよりｑ２１大
きいセグメントがヘビーチェインの場所に転座すること
から生じた。

染色体形態学における他の異常性は植字で検出されなか
った。

例　　２ 例１と同様に％Ｂ−細胞屋、ｔ（１１；１４）（ｑ１３
；ｑ３２）、染色体転座、の慢性リンパ球白血病（ＣＬ
Ｌ　）をもつ６５オ男子から誘導されＣＬＬ　２７１と
呼ぶヒト白血病細胞を得、それらのＤＮＡを抽出した。

これら細胞はまたマウス骨髄細胞腫の細胞で雑種形成さ
せ、転座した染色体を含む雑ｓを得たｒ−ｘリクソン等
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ。

８ｃｉ、　Ｕ３Ａ３１　：　４１４４〜４１４８（１９
８４）］。

例　　３ 例１の３８０細胞のＤＮＡから完全ｒツムライブラリー
を調製した。デノムＤＮＡを制限酵素８ａｕ　３Ａで部
分消化し、長さ１４から２３　ｋｌ）のＤＮＡ断片をシ
ョ糖勾配遠心により精製した。次に、断片を９５１ｍ　
ＨＩで切ったラムダ−７アージベクター腸８Ｌ３＊　ｌ
：ツジモト等、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）２２４
：１イ、３（１９８４）］のＤＮＡで結合した。大腸菌
中試験管内でパッケージした後、４２０．０００独立組
換えファージをＪＢ　（Ｈ鎖結合領域）　ＤＮＡ断片に
％異的なグループ（・ｐＨ，ｌ　）でスクリーニングし
た（第１図、Ｈ，Ｈｌｎ（ｌ　ｌ　ｓ　Ｒ−ＢＱＯＲＩ
　；　８．８Ｂｍ、　３１　）　ａ九つの組換えクロー
ンを得、それらの制限地図分析は二つの１４ｑ＋染色体
から誘導された配列を表わす群への分類を許した。各群
の制限地図および代表的重なりクローンを第１図に示す
。

例　　４ 例３の方法と同様にして、例２のＣＬＩ、　２７１新鮮
白血球細胞のＤＮＡから完全ｒツムライブラリーを調製
した。試験管内でパッケージ後％　３７５，０００独立
組換え７アージをｐｃｕ　０．９　ＣＤ、９　ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ断片を含むＣ（一定）領域の免疫グロビンｒ鎖
に相同のグループ〕およびｐＨｊプローデでスクリーニ
ングした。１０個のクローンを選び制限地図分析を行な
ったところ関連のない染色体１４からおよび１４ｑ＋雑
種染色体から誘導された連続を表わす二つのグループへ
の分類が可能となった。制限地図および各グループの代
表的重なり組換えクローンを２Ｂ図Ｃ図に示す（Ｈ、Ｈ
ｌｎｄ　Ｉ　；　Ｒ，ｇｃ。

ＲＩ　；　Ｂ、　ＢａＩ！１．　ＩＩ　）。第２Ｂ図に
示した組換えクローンはｐＣｕ　０．９またはｐＨ：Ｊ
　グループで雑種形成したより短かいＢａｎ　ＨＩ断片
を含み、関連のない染色体１４上に生産的に配列された
Ｕ遺伝子を表わす。図の３０に説明された他のグループ
は１４ｑ＋染色体上の除外されたμ相互遺伝質を表わす
。第２図に示したよ５に、二つのグループ、ＪＨ断片の
５′の制限地図は相互に％また胚系ＤＮＡのそれとも完
全に異なる。

例　　５ ３８０細胞系から誘導された組換えクローンの二つのグ
ループのうちどちらが染色体８および１４　ＤＮＡ断片
（ｐ３８０ｊ−２ＲＲおよびｐ５８０ｊ−９８８）の間
の切断点を含むかを確定するために１繰返し配列を含ま
ないクローンを発生させた両ＪＨ断片の５′（第２図）
を大腸菌宿主中ｐＢＲ３２２誘導体を用いてサブクロー
ンをつくった。次にこれらサデクｐ−ンをヒト細胞から
誘導されたＤＮＡおよびヒト染色体８または１４いずれ
かを含む薔歯動物×ヒト雑株細胞からのＨｌｎｄ　ｌ消
化ＤＮＡのサウデーン雑種形成１ｆｃｆロープとして使
用した。ＤＮＡ試料を０．７チアガロースデルで分画し
た。すず−ン・プロット・フィルターを５０チホルムア
ミドおよび４　Ｘ　８ＳＣ中３７℃において３２ｐで標
識したＰ３８０ｊ−９８８１０−デで雑種形成させ、最
後ＫＯ０２×８８Ｃで６５℃において洗浄した。

この雑種形成の結果を第３図に示す：レーン１、ＣＨＯ
（チャイニーズノ１ムスター卵巣細胞〕からのＤＮＡ　
；レーン２，７０６Ｂ６−イ、０１　１７（ヒト染色体
８のみ含むＣＨＯＸヒト雑種細胞）からのＤＮＡ　；レ
ーン３．２８０ＡＧ８Ｃｅ４（ヒト染色体８を含むがヒ
ト染色体１４を含まないマウスｘ′ヒト雑種）からのＤ
ＮＡ　クローン４．５４５Ｔヒト細胞系からのＤＮＡ　
、この図に示したように、プローブｐ３８０ｊ−９ｓｓ
はヒトＤＮＡで、そしてヒト染色体８のみを含み他のヒ
ト染色体を含まないＣＨＯＸヒト雑種のＤＮＡで雑種形
成した。同じプローブはヒト染色体１４だけを含む誓書
動物Ｘヒト雑種で雑種形成しなかった。それ故に、ｐ　
３８０　ｊ　−９ｓｓ　ＤＮＡセグメントを含む組換え
屋の部類は１４ｑ十染色体上の染色体８と１４との間に
結合領域をもつ（第１図）。

対照としてｐ３８０ｊ−９８Ｂｆロープは白血病３８０
細胞系を得た同じ患者から誘導されるＴ−細胞系（５４
５Ｔ）のＤＮＡにおける、そしてまた檻々な他のヒト細
胞から誘導されるＤＮＡにおける単−胚系雑種形成断片
だけを検出することが確立された。しかしこのプローブ
は６８０白血病細胞系ＤＮＡにおける胚系および再配列
したＤＮＡ断片を検出し、８と１４との間の転座が患者
の白血病の展開中に身体の出来事として起ったことを示
す。

ｐ３８０ｊ−９８８プローデは染色体１４からのＤＮＡ
で雑種形成しなかったので、またＪＨ断片に特異的なｐ
Ｈｊプローデは、クローンラムダ−３８０ｊ〜９の大抵
のｓ　　Ｈｌｎｄ　１部位の左のＤＮＡ断片で雑種形成
しなかったので（第１図）、ｔ（８：１４）転座に含ま
れる染色体１４の切断点は第１Ｃ図に示したように大抵
の５’　Ｓａｔ　ｘ部位と第二のＢｉｎｄ　１部位との
間にあった。

Ｐ３８０ｊ−２ＲＲｆロープ（第１Ｂ図〕をヒト染色体
１４および１８を含むそれぞれマウスＸヒトおよびＣＨ
ＯＸヒト雑種細胞から単離されたＤＮＡに雑種形成させ
た。このプローブはヒトＤＮＡと、そしてヒト染色体１
８を含む雑種から誘導されたＤＮＡと雑種形成するが、
しかしヒト染色体１４を含む雑種からのＤＮＡとは形成
しなかった。

このように、クローン３８０ｊ２および３８０ｊ３は染
色体１４と１８との間に結合領域を含む。

例　　６ 第２ｃ図に示した新しい白血病細胞ＣＬＬ　２７１から
誘導された組換えクローンがｔ（１１；１４）切断点を
含むかどうかを試験するために、ラムダ−Ｒａ９および
ラムダ−Ｒａ５クローン発生ＤＮＡ内の染色体１１から
誘導された単一コピーＤＮＡ配列を単離した。第２Ｄ図
に描かれたＳａＩ　Ｉ　−Ｓａｔ　Ｉ断片およびＳｍａ
　Ｉ　−ｇｃｏ　ＲＩ断片をグラスミドベクターｐＵＣ
１９（６）およびｐＹＴ　１３　（７）と呼ぶｐＢＲ３
２２の誘導体にサブクローン発生させ。大腸菌で複製し
た。これらサブクローンはそれぞれｐＲｃ８８ｓおよび
ＰＲＯ８ＳｍＲと呼んだ（第３Ｄ図）。

これら二つのプローブをヒト染色体１４またはヒト染色
体１１いずれかを保有する薔歯動物細胞とヒト細胞との
間の身体細胞雑種からのＤＮＡのサデーンプロットとの
雑種形成に用いた。この手順の結果を第４図に示す。

（ＡＪＫ対するＤＮＡ　５マイクログラムおよび（Ｂと
Ｉｃ）Ｋ対する１０マイクログラムの試料をデル上に載
せる。Ｊ工細胞はヒト染色体１１のみ含むヒトチャイニ
ーズハムスター卵巣雌株であり、Ｈ１１細胞はヒト染色
体１１およびＸｑのみ含むヒト×マウス雑種であり、　
Ｐ３ＨＲ−１細胞はパーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ　）リ
ンパ腫から誘導される。雑種Ｍ４４（Ｃ１２Ｓ５）はＰ
３ＨＲ−１バーキツトリンパ腫からのヒト染色体１４ｃ
１＋のみ含むヒト×マウス細胞系であり、ＮＰ３細胞は
マウス骨髄細胞腫細胞系から誘導される。

ＤＮＡ試料をＢａａ　ＲＩで消化し、サデーン・デロッ
ト−フイｋｌｌ−をｆｌ：Ｉ−プｐＲｃ８８ｓ　（レ−
７ＡとＢ〕で、またｐＲｃ８８ＭＲ（レーンＣ）で雑種
形成させた。フィルターの最終的洗浄を（ＡＪＫ対して
は２　Ｘ　ＳＳｃで６５℃において行ない、（靭および
（Ｃ）　Ｋ対しては０．２　Ｘ　Ｓｅｃで６５℃で行な
った。Ｊｌ、Ｈｌｌ、およびＣＬＬ　２７１細胞のＤＮ
Ａは二つのプローブと雑種をつくる同じ寸法の断片（約
６　ｋｂ）を示したが、一方マウスおよびチャイニーズ
ハムスターＤＮＡはこれらプローブと雑種形成しなかっ
た。　ｐＲｃ３８ｓプローゾはヒト染色体１４を含む雑
檻細胞からのＤＮＡと雑種形成しなかった（第５Ａ図、
レーン４）。このようにして、組換えクローンラムダ−
Ｒａ８およびラムダ−Ｒａ５はＣ’ＬＬ　２７１細胞の
１４ｑ＋染色体上の染色体１１と１４との間に結合部位
を含む。

ＣＬＬ　２７１　ＤＮＡのｇｃｏ　ＲＩ消化物が染色体
１１　ＤＮＡと雑種形成する単一制限断片を示したので
〔このものは、ｔ（８；１４）転座をもっＰ３ＨＲ−１
バーキツトリンパ腫細胞で観察されたそれと同じもので
ある（第４Ａ図、レーン５］〕、１４ｑ＋上の切断点は
ラムダ−Ｒａ８およびラムダ−Ｒａ５クローンの３′か
ら大抵の５’　Ｅｃｏ　ＲＩ部位の領域に生じたと推論
できる（第３図）。

例　　７ 染色体１４および（または）１８を含むマウスＸヒトお
よびチャイニーズハムスター×ヒト雑種細胞のＤＮＡを
Ｐ３８０ｊ−２ＲＲプローデで雑種形成させた（第１図
）。ＤＮＡ試料をＢａｎ　Ｈ１１で消化し、０．７　％
アガロースデル上で分画した。すゾーン・プロット・フ
ィルターを３２ｐで標識したｐ３８０ｊ−２ＲＲで雑種
形成させ、前記のように洗浄した。ｐ３８０ｊ−２ＲＲ
ｆロープはヒトＤＮＡとそしてヒト染色体１８を含む雑
種から誘導されたＤＮＡと雑種形成したが、ヒト染色体
１４を含む雑種からのＤＮＡとは雑種形成しなかった。

これらデータはクローン３８０ｊ２および３８０ｊ３が
染色体１４と１８との間に結合領域を含むことを示す。

例　　８ ｐ３８０ｊ−２ＲＲ染色体１８特異性プローブを各種起
源のヒト細胞からのまた６８０細胞からのＤＮＡで雑種
形成させた。ヒ）　ＤＮＡを８ｓｔ、１で切り、０．７
１アガロースデル上に流した。サデーン・プロット・フ
ィルターを前述したようＫ”Ｐで標識したｐ３８０ｊ−
２ＲＲで雑種形成させ、洗浄した。この手順の結果を第
５図に示す：レーン１、ｇＢｖ変換したヒトリンパ母Ｍ
ｉ肥様の細胞からのＤＮＡ　；レーン２、ヒトＴ−細胞
リンパ腫からのＤＮＡ　；レーン３、ＣＩ、Ｌ　２７１
　［ｔ　（１１；　１４　）染色体転座をもつ〕の細胞
からのＤＮＡ　；レーン４、ｔ（８；１４）転座をもつ
バーキットリンパ腫細胞系（ＤＡＵＤＩ　）からのＤＮ
Ａ　；レーン５．５４５Ｔ−細胞系からのＤＮＡ　；レ
ーン６．３８０白血病細胞系からのＤＮＡ　ｐおよびレ
ーン７、ＬＮ１２８細胞（ｔ（１４；１８）染色体転座
をもつヒト濾胞性リンパ腫〕からのＤＮＡ　。

第５図に示したように、３８０およびＬＮ１２８新生物
Ｂ細胞からのＤＮＡ　（追加の雑種形成断片をもった）
を除き試験した全ヒ）　ＤＮＡは胚系配列を表わす単一
雑種形成断片を示した。５４５Ｔ−細胞系からのＤＮＡ
　（レーン５）Ｋおける単一杯系帯も検出された。それ
故に、第５図、レーン６で観察されたｔ　（１４，；　
１　Ｂ　）転座およびＤＮＡ再配列はこの白血病の進展
中に身体的出来事として起こった。

例　　９ 標準法により濾胞性リンパ腫（ＬＮ　１２８　）をもつ
と診断された３５才男子の腫瘍細胞から誘導されたＤＮ
Ａは、Ｉ）３８０ｊ−２ＲＲＤＮＡｆロープ（第５図、
レーン７）で雑種形成させたとき胚系および再配列した
ＤＮＡ断片の両方を示した。対照レーン（レーン１〕と
比較して雑種形成の追加帯は濾胞性リンパ腫の存在を示
す。この患者の染色体の植字的分析は相互ｔ（１４；１
８）（ｑ３２；ｑ２１）転座を示した。

例１０ 雑種染色体から誘導された再配列断片を検出するため、
染色体１１に対して特異的なプローブｐＲｃ８８ｍＲを
種々な給源から単離されたＤＮＡに雑種形成させた。種
々な給源からの細胞ＤＮＡ　（５μｇ）ヲＨ１ｎｄ　ｌ
またはＢｃＩＩで消化し、アガロースデル電気泳動によ
り分画した。そのサデーン・プロット・フィルターをｐ
Ｒ０８ｓｍＲ７’ロープで雑種形成させ、最後に０．２
　Ｘ　Ｓａｃで６５℃において洗浄した。

ＤＮＡ給源には次のものが含まれる：　Ｍｏ１ｔ；　４
（ヒトＴ−細胞系）　ＤＮＡ再配列　６０７　（ヒトリ
ンパ母細胞様細胞系ＤＮＡ　）、Ｃｏ１ｏ　３２０　Ｄ
Ｍ　（１：　）類癌腫）　ＤＮＡ％ＰＡＦ　（ｅＶ　イ
、転換ヒト繊維母細胞）　ＤＮＡ、　Ｈ８Ｂ２　（ヒト
’ｒ−細胞系）　ＤＮＡ％ＣＬＬ２７１（ヒトＢ−細胞
白血病）　ＤＮＡ再配列　８７（ヒトＢ−細胞リンパ腫
）ＤＮＡ。

ＣＬＬ　２７１　ＤＮＡを除き、試験したすべてのヒト
ＤＮＡ試料は二つのＨｌｒｉｄ　ｌ断片への雑種形成を
示し、ＣＬＬ　２７１　ＤＮＡは更に一つの再配列した
断片を示した。およそ２．５　ｋｔ＋のＨｉｎｄ　ｌ断
片の一つは正常な染色体１１配列に相当する。このこと
は１４ｑ＋上の染色体切断がラムダＲｃ８　ＤＮＡの２
．１ｋｌ１１３’から大抵の５’　ＥｃｏＲＩ部位の領
域内で起こることを示す（第２Ｄ図）。

Ｂｃｌ　工消化はＬＮ　８７細胞ＤＮＡおよびＣＬＬ２
７１細胞ＤＮＡ　Ｋ再配列断片を示した。この結果はＬ
Ｌ８７における切断点がＣＬＬ　２７１細胞に観察され
た切断点に近いことを示す。ＣＬＬ　２７１　、慢性リ
ンパ球性白血病、およびＬＮ　８７、分散大細胞リンパ
腫〔両者ともｔ（１１；１４）転座をもつ〕の場合の切
断点の一貫した場所は、この染色体転座を示す種々なり
一細胞悪性度において推定的に　　　′ｂｃｌ−１（Ｂ
−細胞リンパ腫／白血病−１）と呼ばれる同じ遺伝子の
関与を示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は制限地図および代表的重なりクローンを示し、
第２図は制限地図および代表的重なり組換えクローンを
示し、第５図はレーン１から４に示したＤＮＡを用いる
雑樵形成の結果を説明するものであり、第４図は新しい
白血病細胞から誘導された組換えクローンの切断点試験
の結果を示し、第５図はｐ３８０ｊ−２ＲＲ染色体１８
％異性プローブを各＠　ＤＮＡで雌株形成させる手順の
結果を示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｂ−細胞新生物の診断法において、 イ、標識したＤＮＡプローブを制限Ｂ−細胞ＤＮＡに雑
   種形成し、前記ＤＮＡプローブは悪性Ｂ−細胞の雑種染
   色体の制限部位とこの染色体の切断点との間にあるＤＮ
   Ａの領域に雑種形成し、制限部位は前記領域に独特であ
   り、 ロ、ＤＮＡプローブが雑種形成する制限染色体ＤＮＡ断
   片のパターンを同定し、 ハ、試験パターンと制限正常染色体ＤＮＡに対するパタ
   ーンとの間の差異を検出することを特徴とする、上記方
   法。
2. （２）悪性細胞を検出するためのＤＮＡプローブを構築
   する方法において、 イ、悪性Ｂ−細胞由来のＤＮＡのゲノムライブラリーを
   作成し、 ロ、この悪性Ｂ−細胞の雑種染色体の切断点にまたがる
   染色体ＤＮＡの領域と相同のＤＮＡを含むクローンを選
   び、そして ハ、前記切断点の唯一つの側上の染色体ＤＮＡと相同の
   ＤＮＡを含むＤＮＡ断片をサブクローンさせることを特
   徴とする、上記方法。
3. （３）リンパ球ＤＮＡをＤＮＡプローブにより同定され
   た染色体転座の存在について試験する、Ｂ−細胞新生物
   の検出用検定法において、 イ、個人からリンパ球を取り出し、それから染色体ＤＮ
   Ａを抽出し、 ロ、リンパ球ＤＮＡを制限し、 ハ、制限ＤＮＡを、染色体の制限部位と雑種染色体の切
   断点との間にある染色体のＤＮＡの領域、（前記制限部
   位は前記領域に独特である）に雑種形成する標識ＤＮＡ
   プローブと接触させ ニ、ＤＮＡプローブが雑種形成する制限染色体ＤＮＡ断
   片のパターンを同定し、そして ホ、試験パターンと制限された正常染色体ＤＮＡに対す
   るパターンとの間の差異を検出する工程を包含する、上
   記検定法。
4. （４）プローブはヒト染色体８から誘導する、特許請求
   の範囲第３項記載の検定法。
5. （５）プローブはヒト染色体１８から誘導する、特許請
   求の範囲第３項記載の検定法。
6. （６）プローブはヒト染色体１１から誘導する、特許請
   求の範囲第５項記載の検定法。
7. （７）プローブはヒト染色体１４から誘導する、特許請
   求の範囲第３項記載の検定法。
8. （８）悪性Ｂ−細胞系は濾胞性リンパ腫患者から誘導す
   る、特許請求の範囲第２項記載の方法。
9. （９）悪性細胞系を慢性リンパ球性白血病、または分散
   Ｂ−細胞リンパ腫から誘導する特許請求の範囲第２項記
   載の方法。