JPS61152275A - 組換え微生物の殺菌法 - Google Patents
組換え微生物の殺菌法Info
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- JPS61152275A JPS61152275A JP59281377A JP28137784A JPS61152275A JP S61152275 A JPS61152275 A JP S61152275A JP 59281377 A JP59281377 A JP 59281377A JP 28137784 A JP28137784 A JP 28137784A JP S61152275 A JPS61152275 A JP S61152275A
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- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、組換え微生物の殺菌法に関する。さらに詳し
くは、生理活性物質を産生ずる組換え微生物の培養細胞
を、該物質の物理化学的性質および生理学的性質を損う
ことなく、該微生物を殺菌する方法に関する。
くは、生理活性物質を産生ずる組換え微生物の培養細胞
を、該物質の物理化学的性質および生理学的性質を損う
ことなく、該微生物を殺菌する方法に関する。
閘、ここで言う組換え微生物は、組換えＤＮＡ技術或い
は遺伝子操作技術を用いて造成されたプラスミドもしく
はファージベクターによって形質転換された生理活性ポ
リペプチド産生能を有する微生物を言う。
は遺伝子操作技術を用いて造成されたプラスミドもしく
はファージベクターによって形質転換された生理活性ポ
リペプチド産生能を有する微生物を言う。
（従来の技術および発明が解決しようとする問題点）
組換え微生物の培養物から該微生物の産生ずる有用物質
を得ようとする場合、培養ならびに該物質の抽出・精製
工程において、用いた組換え微生物の再増殖防止ならび
に組換えＤＮＡ実験指針から必要とされる。組換え微生
物が外部にもれないようにするには、培養から精製丑で
のすべての工程を密閉して行うことも考えられるか、現
実には容易でなく、組換え微生物の培養後、抽出・精製
に移る前に、培養微生物を何らかの方法で完全に殺菌す
ることが上記指針から強く求められている。
を得ようとする場合、培養ならびに該物質の抽出・精製
工程において、用いた組換え微生物の再増殖防止ならび
に組換えＤＮＡ実験指針から必要とされる。組換え微生
物が外部にもれないようにするには、培養から精製丑で
のすべての工程を密閉して行うことも考えられるか、現
実には容易でなく、組換え微生物の培養後、抽出・精製
に移る前に、培養微生物を何らかの方法で完全に殺菌す
ることが上記指針から強く求められている。
微生物の殺菌法としては加熱や菌体破壊などの物理学的
方法や塩素系薬剤、キシレン系薬剤、過酸化水素などを
用いる化学的な方法が用いられているが、これらの殺菌
法は微生物を殺菌できても微生物自身からあるいは微生
物培養物から目的とする物質を抽出・精製して得ようと
する場合、該目的物の本来の性質を損々う場合がある。
方法や塩素系薬剤、キシレン系薬剤、過酸化水素などを
用いる化学的な方法が用いられているが、これらの殺菌
法は微生物を殺菌できても微生物自身からあるいは微生
物培養物から目的とする物質を抽出・精製して得ようと
する場合、該目的物の本来の性質を損々う場合がある。
また、塩素系薬剤や過酸化水素を使用すると培養容器ま
たはタンクさらには培養システムにおけるパイプやパル
プなどを腐蝕したり、キシレン系薬剤では爆発等の不安
があり、特に大量の培養組換え微生物の殺菌には好まし
いものではない。
たはタンクさらには培養システムにおけるパイプやパル
プなどを腐蝕したり、キシレン系薬剤では爆発等の不安
があり、特に大量の培養組換え微生物の殺菌には好まし
いものではない。
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく、種々の殺菌
法について鋭意研究の結果、クロルヘキシジンの塩を含
む水溶液、さらに好ましくはグルコン酸クロルヘキシジ
ン水溶液を殺菌剤として用いることにより上記の問題点
を解決することを見出し本発明を完成するに至った。
法について鋭意研究の結果、クロルヘキシジンの塩を含
む水溶液、さらに好ましくはグルコン酸クロルヘキシジ
ン水溶液を殺菌剤として用いることにより上記の問題点
を解決することを見出し本発明を完成するに至った。
尚、以下の説明では、グルコン酸クロルヘキシジン水溶
液を殺菌剤として用いた例について述べるが、クロルヘ
キシジンの塩を主成分とする溶液（例えばエタノール溶
液）であれば水溶液に限るものではない。また、該溶液
に界面活性剤（例えばエマルゲル界面活性剤）が含まれ
ていてもよい。
液を殺菌剤として用いた例について述べるが、クロルヘ
キシジンの塩を主成分とする溶液（例えばエタノール溶
液）であれば水溶液に限るものではない。また、該溶液
に界面活性剤（例えばエマルゲル界面活性剤）が含まれ
ていてもよい。
（問題点解決のための具体的手段）
クロルヘキシジン（１、６−ｃｌｉ−（４′−ｃｈｌｏ
−ｒｏｐｈｅｎｇｌｄｉｇｕａｎｉｄｏ）ｈｅｘａｎｅ
）は下記の構造＝を有し、広範囲の微生物（特に細菌
類）に対し、低濃度で迅速な殺菌作用を示す。特に、そ
のグルコン酸塩は外用ならびに医療器具等の殺菌消毒剤
として広く使用されている。
−ｒｏｐｈｅｎｇｌｄｉｇｕａｎｉｄｏ）ｈｅｘａｎｅ
）は下記の構造＝を有し、広範囲の微生物（特に細菌
類）に対し、低濃度で迅速な殺菌作用を示す。特に、そ
のグルコン酸塩は外用ならびに医療器具等の殺菌消毒剤
として広く使用されている。
本発明は、低濃度のクロルヘキシジンの塩を組換え微生
物の培養液に加えることにより、菌体内に産生された有
用物質の物理化学的および生理学的性質を損うことなく
、該微生物を完全に死滅させることにある。クロルヘキ
シジンの塩は外用や医療器具等の殺菌消毒に用いられて
いるバ 培養微生物（特に有用物質産生組換え微生物）
の殺菌剤として用いられた例はこれまで知られていない
。
物の培養液に加えることにより、菌体内に産生された有
用物質の物理化学的および生理学的性質を損うことなく
、該微生物を完全に死滅させることにある。クロルヘキ
シジンの塩は外用や医療器具等の殺菌消毒に用いられて
いるバ 培養微生物（特に有用物質産生組換え微生物）
の殺菌剤として用いられた例はこれまで知られていない
。
クロルヘキシジンの塩には種々のものが知られているが
、グルコン酸塩は水溶性も高く使用法も簡便で、ヒトに
対する毒性も低く使用者に危険を及ぼすこともない。従
って、特に大量に培養された微生物（特に有用物質産生
組換え微生物）を殺菌する必要がある場合有用である。
、グルコン酸塩は水溶性も高く使用法も簡便で、ヒトに
対する毒性も低く使用者に危険を及ぼすこともない。従
って、特に大量に培養された微生物（特に有用物質産生
組換え微生物）を殺菌する必要がある場合有用である。
グルコン酸クロルヘキシジンは水溶液として用いること
が好ましい。また、殺菌と同時に微生物が産生する菌体
内目的物質を菌体外へ漏出させる場合は界面活性剤例え
ば（エマルゲル界面活性剤）が含有きれている水溶液を
用いるとよい。
が好ましい。また、殺菌と同時に微生物が産生する菌体
内目的物質を菌体外へ漏出させる場合は界面活性剤例え
ば（エマルゲル界面活性剤）が含有きれている水溶液を
用いるとよい。
組換え微生物の産生ずる有用物質の諸性質を損うことな
く該微生物を殺菌しうるグルコン酸クロルヘキシジンの
濃度は、用いる組換え微生物の種類（菌株）や培養濃度
または培養に用いる培地の種類によって異なるが、最終
０．０３％から０．５％であるのが好ましい。具体的に
はグルコン酸クロルヘキシジン２０％水溶液（例えばヒ
ビテン：住友化学工業社製）を、グルコン酸クロルヘキ
シジンが上記の濃度になるように、組換え微生物培養液
に加えて適当な時間（３０がら６時間）撹拌するだけで
よい。処理温度は、特に制限されないが、有用物質の性
質か損われないよう配慮することが望まれる。
く該微生物を殺菌しうるグルコン酸クロルヘキシジンの
濃度は、用いる組換え微生物の種類（菌株）や培養濃度
または培養に用いる培地の種類によって異なるが、最終
０．０３％から０．５％であるのが好ましい。具体的に
はグルコン酸クロルヘキシジン２０％水溶液（例えばヒ
ビテン：住友化学工業社製）を、グルコン酸クロルヘキ
シジンが上記の濃度になるように、組換え微生物培養液
に加えて適当な時間（３０がら６時間）撹拌するだけで
よい。処理温度は、特に制限されないが、有用物質の性
質か損われないよう配慮することが望まれる。
上記のようにして殺菌された組換え微生物培養液から菌
体（死菌体）を遠心分離により集め、適当に菌体を破砕
後、目的とする有用物質を抽出・精製する適当な工程へ
移る。殺菌剤として添加されたグルコン酸クロルヘキシ
ジンは、精製過程で容易に除くことが可能である。また
、具体的には以下の実施例および参考例で述べるが、本
発明の殺菌法によって殺菌された組換え微生物（大腸菌
）から、目的とする有用生理活性ポリにプチド（ヒト・
インターフェロン活性を有するポリ被プテド）を、その
物理化学的および生理学的性質を損うことなく抽出・精
製することができる。
体（死菌体）を遠心分離により集め、適当に菌体を破砕
後、目的とする有用物質を抽出・精製する適当な工程へ
移る。殺菌剤として添加されたグルコン酸クロルヘキシ
ジンは、精製過程で容易に除くことが可能である。また
、具体的には以下の実施例および参考例で述べるが、本
発明の殺菌法によって殺菌された組換え微生物（大腸菌
）から、目的とする有用生理活性ポリにプチド（ヒト・
インターフェロン活性を有するポリ被プテド）を、その
物理化学的および生理学的性質を損うことなく抽出・精
製することができる。
以下の実施例および参考例では、組換え微生物としてヒ
ト・インターフェロン活性を有するポリペプチド産生能
を有する大腸菌形質転換体について述べるが、本発明の
殺菌法は大腸菌以外の微生物にも適用できる。捷だ、有
用物質は、ヒト・インターフェロン活性を有するポリ４
プチドに限るものでもない。
ト・インターフェロン活性を有するポリペプチド産生能
を有する大腸菌形質転換体について述べるが、本発明の
殺菌法は大腸菌以外の微生物にも適用できる。捷だ、有
用物質は、ヒト・インターフェロン活性を有するポリ４
プチドに限るものでもない。
グルコン酸クロルヘキシジンの濃度と殺菌効果ヒト・イ
ンターフェロン活性を有するポリ被プチドの生産能を有
する組換え微生物（大腸菌）Ｗ（′７） ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４．（特願昭５８−１３２５２４
に開示）を、ポリ被プトン３％、酵母エキス２％、グル
コース２％、ＫＰＩ２Ｐ Ｑ４０．５％、Ｍｙ ＳＯ４
・７Ｈ，，００，０１％およびテトラサイクリン２０μ
ｇ／ｍｌを含む培地で３６時間、３０℃で通気撹拌培養
した。
ンターフェロン活性を有するポリ被プチドの生産能を有
する組換え微生物（大腸菌）Ｗ（′７） ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４．（特願昭５８−１３２５２４
に開示）を、ポリ被プトン３％、酵母エキス２％、グル
コース２％、ＫＰＩ２Ｐ Ｑ４０．５％、Ｍｙ ＳＯ４
・７Ｈ，，００，０１％およびテトラサイクリン２０μ
ｇ／ｍｌを含む培地で３６時間、３０℃で通気撹拌培養
した。
この時の培養液中の該大腸菌の生菌数は１ｍｌ当り３、
２ Ｘ １０７ＣＦＵ （ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇ
ｖｎｉｔ ）であった。この培養液に、２０％グルコ
ン酸クロルヘキシジン水溶液（住友化学工業社製）を、
グルコン酸クロルヘキシジンとして０．０３％から０．
１８％になるように加え、３０℃で１時間撹拌後、培養
液中の大腸菌の生菌数を調べた。その結果、第１表に示
すように、グルコン酸クロルヘキシジンは低濃度で充分
組換え微生物（大腸菌）を殺菌することが認められた。
２ Ｘ １０７ＣＦＵ （ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇ
ｖｎｉｔ ）であった。この培養液に、２０％グルコ
ン酸クロルヘキシジン水溶液（住友化学工業社製）を、
グルコン酸クロルヘキシジンとして０．０３％から０．
１８％になるように加え、３０℃で１時間撹拌後、培養
液中の大腸菌の生菌数を調べた。その結果、第１表に示
すように、グルコン酸クロルヘキシジンは低濃度で充分
組換え微生物（大腸菌）を殺菌することが認められた。
生菌数は培養液ｌ ｍｌから遠心（１２，０００γｐｍ
、５分）して得られる沈澱物を、無菌の生理食塩水で３
回洗浄後、同食塩水ｌ ｍｌを加え、その懸濁液または
食塩水で適当に希釈した懸濁液０．１ｒｎｌを、培養に
用いた同じ培地（但し２％寒天を含む）上に塗布し、３
７℃で２４時間培養後生じるコロニーを計数することに
より行った。生菌数の測定は同じサンプルについて最低
２回行った。第１表はその平均値を示している。
、５分）して得られる沈澱物を、無菌の生理食塩水で３
回洗浄後、同食塩水ｌ ｍｌを加え、その懸濁液または
食塩水で適当に希釈した懸濁液０．１ｒｎｌを、培養に
用いた同じ培地（但し２％寒天を含む）上に塗布し、３
７℃で２４時間培養後生じるコロニーを計数することに
より行った。生菌数の測定は同じサンプルについて最低
２回行った。第１表はその平均値を示している。
一方、グルコン酸クロルヘキシジン処理および未処理に
よる目的生産物（この場合ヒト・インターフェロン活性
を有するポリ４プチド）の活性（抗ウィルス活性）に及
ぼす影響を調べた結果、第１表に示すように、グルコン
酸クロルヘキシジンは用いた濃度範囲においては、はと
んど影響がなかった（若干の値のバラツキは希釈率にも
とすく活性測定の誤差によるものと考えられる）。なお
、抗ウィルス活性は、培養液から遠心分離して得られる
菌体を、凍結・融合によって破砕後、上清について常法
に従い測定された。
よる目的生産物（この場合ヒト・インターフェロン活性
を有するポリ４プチド）の活性（抗ウィルス活性）に及
ぼす影響を調べた結果、第１表に示すように、グルコン
酸クロルヘキシジンは用いた濃度範囲においては、はと
んど影響がなかった（若干の値のバラツキは希釈率にも
とすく活性測定の誤差によるものと考えられる）。なお
、抗ウィルス活性は、培養液から遠心分離して得られる
菌体を、凍結・融合によって破砕後、上清について常法
に従い測定された。
第 １ 表
グルコン酸クロルヘキシンの殺菌効果と０
３．２Ｘ１０７ ３．８Ｘ１０’０．０３ ４．
３Ｘ１０’ ３．８ｘｌＯ’０．０６ 、 １
．６Ｘ１０’ ３，８ｘｌＯ’０．０９ １
．０ｘ１０３ １．９ｘｌＯ’０．１２ ０
３．８ｘｌＯ’０．１８ ０
１．９ｘｌＯ’さらに、上述と同じ菌株を用い同様の
培養条件によって得られた最終生菌数の異なる培養液に
ついて、グルコン酸クロルヘキシジンを０．０６％から
０．３６％になるよう添加し、先述と同様な方法で生菌
数および抗ウィルス活性を調べた。その結果°、第２表
に示すごとく、グルコン酸クロルヘキシジンが０．１８
％から０．３６％では、完全に組換え大腸菌を殺菌し、
しかも該組換え菌の産生ずるインターフェロン活性には
ほとんど影響しないことが認められた。
３．２Ｘ１０７ ３．８Ｘ１０’０．０３ ４．
３Ｘ１０’ ３．８ｘｌＯ’０．０６ 、 １
．６Ｘ１０’ ３，８ｘｌＯ’０．０９ １
．０ｘ１０３ １．９ｘｌＯ’０．１２ ０
３．８ｘｌＯ’０．１８ ０
１．９ｘｌＯ’さらに、上述と同じ菌株を用い同様の
培養条件によって得られた最終生菌数の異なる培養液に
ついて、グルコン酸クロルヘキシジンを０．０６％から
０．３６％になるよう添加し、先述と同様な方法で生菌
数および抗ウィルス活性を調べた。その結果°、第２表
に示すごとく、グルコン酸クロルヘキシジンが０．１８
％から０．３６％では、完全に組換え大腸菌を殺菌し、
しかも該組換え菌の産生ずるインターフェロン活性には
ほとんど影響しないことが認められた。
第 ２ 表
ｆ＃−１７酸クロルヘキシジンの殺菌効果ト活性に及ぼ
す影響（２） ０ ７．５Ｘ１０７ ３．８Ｘ１０’０．０
６ ２．３ｘｌＯ７１，，９Ｘ１０’０．１２
４．５ｘｌＯ” ２．９Ｘ］、０５０．１８
０ ３．８Ｘ１０’０．２４’
Ｑ ３．８Ｘ１０’０．３６
０ ３．８ｘｌＯ’犬量培養における組換え
微生物の殺菌 ヒト・インターフェロン活性を有するポリペプチドの生
産能を有する大腸菌Ｗ３１１０ｉｐＩＮ５Ｔ４（特願昭
５８−１３２５２４に開示）を、ポリ被フトン３％、酵
母エキス２％、グルコース２２％ＫＩＩ２Ｐ（ｈ ０．
５％、Ｍｙ Ｓ Ｏ４・７Ｈ２００，０１％およびテト
ラサイクリン２０μ９７ｍ１含む培地７００１で３６時
間、３０℃で通気撹拌培養した（なお、上記７００１の
培地には同組成の培地で培養された約Ｉ Ｘ １０９ｃ
ｅｌｌｓ／ｒｎｌの該大腸菌培養液０．５１を種菌とし
て接種して培養された）。
す影響（２） ０ ７．５Ｘ１０７ ３．８Ｘ１０’０．０
６ ２．３ｘｌＯ７１，，９Ｘ１０’０．１２
４．５ｘｌＯ” ２．９Ｘ］、０５０．１８
０ ３．８Ｘ１０’０．２４’
Ｑ ３．８Ｘ１０’０．３６
０ ３．８ｘｌＯ’犬量培養における組換え
微生物の殺菌 ヒト・インターフェロン活性を有するポリペプチドの生
産能を有する大腸菌Ｗ３１１０ｉｐＩＮ５Ｔ４（特願昭
５８−１３２５２４に開示）を、ポリ被フトン３％、酵
母エキス２％、グルコース２２％ＫＩＩ２Ｐ（ｈ ０．
５％、Ｍｙ Ｓ Ｏ４・７Ｈ２００，０１％およびテト
ラサイクリン２０μ９７ｍ１含む培地７００１で３６時
間、３０℃で通気撹拌培養した（なお、上記７００１の
培地には同組成の培地で培養された約Ｉ Ｘ １０９ｃ
ｅｌｌｓ／ｒｎｌの該大腸菌培養液０．５１を種菌とし
て接種して培養された）。
上記の如く培養された大腸菌培養液７００１に、２０％
のグルコン酸クロルヘキシジン水溶液（住友化学工業社
製）をグルコン酸クロルヘキシジンとして０．１５％に
なるように添加し、３０℃で１時間撹拌後培養液中の生
菌数を、実施例１に記した方法に従って測定した（なお
、殺菌剤添加前の培養液中の生菌数は５Ｘ １０８ＣＦ
Ｕ／ｒｎｌであった）。
のグルコン酸クロルヘキシジン水溶液（住友化学工業社
製）をグルコン酸クロルヘキシジンとして０．１５％に
なるように添加し、３０℃で１時間撹拌後培養液中の生
菌数を、実施例１に記した方法に従って測定した（なお
、殺菌剤添加前の培養液中の生菌数は５Ｘ １０８ＣＦ
Ｕ／ｒｎｌであった）。
その結果、生菌は全く認められなかった。
次に、殺菌処理前の培養液および上記のように殺菌処理
された培養液から１０ｍ１を採取し菌体を遠心分離後、
凍結・融解の繰り返しによって菌体を破砕し、そのうち
遠心上清液中のインターフェロン活性（抗ウィルス活性
）を常法に従って測定した。その結果、両者（殺菌処理
前と後）のインターフェロン（抗ウィルス活性）の比活
性は変らなかった。丑だ、両者の培養菌体からの抽出液
を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけてみられ
る蛋白のバンドのパターンも両者変らなかった。
された培養液から１０ｍ１を採取し菌体を遠心分離後、
凍結・融解の繰り返しによって菌体を破砕し、そのうち
遠心上清液中のインターフェロン活性（抗ウィルス活性
）を常法に従って測定した。その結果、両者（殺菌処理
前と後）のインターフェロン（抗ウィルス活性）の比活
性は変らなかった。丑だ、両者の培養菌体からの抽出液
を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけてみられ
る蛋白のバンドのパターンも両者変らなかった。
即チ、大量培養においてもグルコン酸クロルヘキシジン
による殺菌処理によっても目的とするインターフェロン
活性を有する蛋白が、何ら損なわれることなく抽出され
ることが確認できた。
による殺菌処理によっても目的とするインターフェロン
活性を有する蛋白が、何ら損なわれることなく抽出され
ることが確認できた。
また、参考例に記すように、上記のように殺菌処理され
た培養菌体から純粋なヒトインターフェロン活性を有す
るポＩＪ ｄプチド（蛋白）を精製することができた。
た培養菌体から純粋なヒトインターフェロン活性を有す
るポＩＪ ｄプチド（蛋白）を精製することができた。
１だ、精製標品中には、殺菌剤として添加したグルコン
酸クロルヘキシジンはラジアルパックＣＩ８カラム（ウ
ォーターズ製）を用いたガスクロマトグラフィーによっ
ても検出されなかった。
酸クロルヘキシジンはラジアルパックＣＩ８カラム（ウ
ォーターズ製）を用いたガスクロマトグラフィーによっ
ても検出されなかった。
参考例
実施例の（２）に記したように殺菌処理された培養液か
ら湿菌体として８００ｇを得、以下のようにヒト・イン
ターフェロン活性を有するポリペプチドの精製を行った
。
ら湿菌体として８００ｇを得、以下のようにヒト・イン
ターフェロン活性を有するポリペプチドの精製を行った
。
まず、上記の菌体を、１ ｍＭ ＺｎＣｌ２ を含む冷
却した２ ０ ｍＭ ）リス塩酸バッファー（以下ＴＨ
Ｅ）ｐＨ７，４５，１１３に懸濁し、氷冷したＭａ ｎ
ｔ ｏ ｎＧａｒｂｌｉｎ社製ホモジナイザーＭ１５
にてホモジナイズした後、遠心分離しく７，０００γｐ
ｍ、２０分間）上清を得た。これに１５％ポリエチレン
イミン（以下ＰＥＩ ）水溶液（ｐＨ８，０、ｌ１Ｃ１
で調整）を最終濃度０．７５％となる様に加え１０分間
撹拌後、４℃で２時間放置した。生じた沈殿を遠心分離
（７，００Ｏｒｐｍ、 ２０分間）で除去し、上清４．
７１を得た。この上清を、２０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフオン酸
バッファー（ＥＰＰＳＰバッファー）ｐＨ８，６で平衡
化した。ＱＡＥセファデックスＡ−２５（ファルマジア
社製）カラムにかけ、士通り画分を得た。次に０．１％
の２−メルカプトエタノール（以下２−ＭＥ ）を含む
２０ｍＭ ＴＨＢｐＨ７，４で平衡化したＣＭセファロ
ースＣＬ６Ｂ（ファルマシア社製）カラムに、この素通
り画分をかけ吸着した活性画分をＯ〜０．５ＭのＮａ
Ｃ１２直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン活性の
高い区分を集めた。なお、インターフェロン活性は特開
昭５８−２０１９９５９号公報に記載した方法に準じて
測定した。続いてこの画分に５０％飽和となる様に硫酸
アンモニウムを添加し、塩析を行い、７０００ｒｐｍ１
２０分間遠心分離して沈澱を得た。沈澱部を０，３Ｍ
ＮａＣｌ 及び０，１％２ＭＥを含む２０ ｍＭリン
酸ナトリウムバッファー（以下、２０ ｒｎ、Ｍ ＰＳ
Ｂ ） ｐＨ７，４に溶解し、同バッファーで平衡化し
た十フアクリル、Ｓ’−２００（ファルマシア社製）カ
ラムにかけ、最終精製品として２９８ｍ９０ＧＩＦ１４
６に対応するポリペプチドを得た（インターフェロンの
比活性１．６〜１、．７ Ｘ １０６Ｕ／ｍ’；／蛋白
）。このポリペプチドの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる純度検
定では純度９９％以上であり、また同５ＤＳ−ＰＡＧＥ
のバンドの位置は目的とするポリペプチドのバンドの位
置と一致した。
却した２ ０ ｍＭ ）リス塩酸バッファー（以下ＴＨ
Ｅ）ｐＨ７，４５，１１３に懸濁し、氷冷したＭａ ｎ
ｔ ｏ ｎＧａｒｂｌｉｎ社製ホモジナイザーＭ１５
にてホモジナイズした後、遠心分離しく７，０００γｐ
ｍ、２０分間）上清を得た。これに１５％ポリエチレン
イミン（以下ＰＥＩ ）水溶液（ｐＨ８，０、ｌ１Ｃ１
で調整）を最終濃度０．７５％となる様に加え１０分間
撹拌後、４℃で２時間放置した。生じた沈殿を遠心分離
（７，００Ｏｒｐｍ、 ２０分間）で除去し、上清４．
７１を得た。この上清を、２０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフオン酸
バッファー（ＥＰＰＳＰバッファー）ｐＨ８，６で平衡
化した。ＱＡＥセファデックスＡ−２５（ファルマジア
社製）カラムにかけ、士通り画分を得た。次に０．１％
の２−メルカプトエタノール（以下２−ＭＥ ）を含む
２０ｍＭ ＴＨＢｐＨ７，４で平衡化したＣＭセファロ
ースＣＬ６Ｂ（ファルマシア社製）カラムに、この素通
り画分をかけ吸着した活性画分をＯ〜０．５ＭのＮａ
Ｃ１２直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン活性の
高い区分を集めた。なお、インターフェロン活性は特開
昭５８−２０１９９５９号公報に記載した方法に準じて
測定した。続いてこの画分に５０％飽和となる様に硫酸
アンモニウムを添加し、塩析を行い、７０００ｒｐｍ１
２０分間遠心分離して沈澱を得た。沈澱部を０，３Ｍ
ＮａＣｌ 及び０，１％２ＭＥを含む２０ ｍＭリン
酸ナトリウムバッファー（以下、２０ ｒｎ、Ｍ ＰＳ
Ｂ ） ｐＨ７，４に溶解し、同バッファーで平衡化し
た十フアクリル、Ｓ’−２００（ファルマシア社製）カ
ラムにかけ、最終精製品として２９８ｍ９０ＧＩＦ１４
６に対応するポリペプチドを得た（インターフェロンの
比活性１．６〜１、．７ Ｘ １０６Ｕ／ｍ’；／蛋白
）。このポリペプチドの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる純度検
定では純度９９％以上であり、また同５ＤＳ−ＰＡＧＥ
のバンドの位置は目的とするポリペプチドのバンドの位
置と一致した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、組換え微生物の培養物から生理活性物質を抽出・精
製する前の工程において、該微生物の培養液にクロルヘ
キシジンの塩を加えて該培養物を殺菌することを特徴と
する組換え微生物の殺菌法。 ２、クロルヘキシジンの塩がグルコン酸クロルヘキシジ
ンである特許請求の範囲第１項記載の殺菌法。 ３、グルコン酸クロルヘキシジンを０．０３％から０．
５％になるように培養液に加えることを特徴とする特許
請求の範囲第２項記載の殺菌法。 ４、組換え微生物が生理活性物質を産生する微生物であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の殺菌法
。 ５、上記生理活性物質がガンマ型インターフエロン活性
を有するポリペプチドである特許請求の範囲第４項記載
の殺菌法。 ６、生理活性物質を産生する組換え微生物が大腸菌であ
る特許請求の範囲第４項または第５項に記載の殺菌法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281377A JPS61152275A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 組換え微生物の殺菌法 |
| EP85116457A EP0189587B1 (en) | 1984-12-27 | 1985-12-23 | Method of sterilizing recombinant microorganism |
| DE8585116457T DE3574675D1 (de) | 1984-12-27 | 1985-12-23 | Verfahren zum sterilisieren von rekombinantem mikroorganismus. |
| AT85116457T ATE48531T1 (de) | 1984-12-27 | 1985-12-23 | Verfahren zum sterilisieren von rekombinantem mikroorganismus. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281377A JPS61152275A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 組換え微生物の殺菌法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61152275A true JPS61152275A (ja) | 1986-07-10 |
| JPH0575392B2 JPH0575392B2 (ja) | 1993-10-20 |
Family
ID=17638282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59281377A Granted JPS61152275A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 組換え微生物の殺菌法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0189587B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61152275A (ja) |
| AT (1) | ATE48531T1 (ja) |
| DE (1) | DE3574675D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5242931A (en) * | 1988-06-09 | 1993-09-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Tricyclic compounds as TXA2 antagonists |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3733921A1 (de) * | 1987-10-07 | 1989-04-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur inaktivierung rekombinanter dna |
| DE102004006320C5 (de) * | 2004-02-10 | 2012-10-18 | Autoliv Development Ab | Baugruppe bestehend aus einer Sitzlehne und einem Gassack-Modul |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP59281377A patent/JPS61152275A/ja active Granted
-
1985
- 1985-12-23 EP EP85116457A patent/EP0189587B1/en not_active Expired
- 1985-12-23 DE DE8585116457T patent/DE3574675D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-23 AT AT85116457T patent/ATE48531T1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5242931A (en) * | 1988-06-09 | 1993-09-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Tricyclic compounds as TXA2 antagonists |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0189587B1 (en) | 1989-12-13 |
| ATE48531T1 (de) | 1989-12-15 |
| JPH0575392B2 (ja) | 1993-10-20 |
| EP0189587A2 (en) | 1986-08-06 |
| DE3574675D1 (de) | 1990-01-18 |
| EP0189587A3 (en) | 1986-10-22 |
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Legal Events
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