JPS61126030A - ヒトコロニ−形成刺激因子産生細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 虚呈上至剋里分立 本発明は、新規なヒト腎臓癌組織の細胞から株化された
ヒトコロニー形成刺激因子（ＨｕｍａｎＣｏｌｏｎｙ−
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　：以・下車に
、ｈ−Ｃ３Ｆと略す）産生細胞株ＴＲＣ−２９Ｒに関す
る。

従来の技術 骨髄系幹細胞に由来する白血球に分類される顆粒球、単
球、マクロファージ系幹細胞に作用し、ごれを成熟白血
球、すなわち顆粒球及び／又はマクロファージに分化誘
導させる刺激性因子としてＣ３Ｆが知られている〔ジャ
ーナルオブイムノロジカルメソッド（Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）
４２．２５３−２８４　（１９８１））。

またＣ３Ｆは、骨髄系幹細胞を顆粒球やマクロファージ
に分化誘導せしめる作用を有することから、例えば癌患
者等の白血球減少症に対する治療薬または種々の感染の
予防薬として有用な生理活性物質である。さらにｈ−Ｃ
３Ｆのインヒドロ生成用に起因するｈ　−Ｃ，Ｓ　Ｆ増
多症および減少症の診断用試藁としても有用なものであ
る。

このようなｈ−Ｃ３Ｆ産生細胞としてヒト由来のものは
肺癌細胞（ＫＯＮＴ、ＫＳＮＹ）　、甲状間癌細胞（Ｔ
３Ｍ−５＞　、ｔ−」肺癌細胞（Ｔ３Ｍ−１）、白血病
細胞（ＭＯ）などが株化されているか、腎臓癌由来のｈ
−Ｃ３Ｆ産生細胞は未だない。

魚屑）く解決しようとする間　点 癌の化学療法や放射線治療の際の重篤な副作用の１つと
して顆粒球減少症があり、そのために免疫系の生体防御
機構が働かなくなり１．感染症をひきおこす場合が多い
。従って、顆粒球減少を抑えるために骨髄幹細胞、顆粒
球、マクロファージの分化を促進させるｈ−Ｃ３Ｆが必
要となる。

そのため、従来ではヒトの尿またはヒト胎盤の培養上清
を原料として採取していたが原料に制限があり、現在ま
で、常に一定のｈ−Ｃ３Ｆ活性を有する標品を安定的に
大量製造する方法がなかった。

ｌ［直Ｕ癌金−解−μ旨片る）ζやμヨ臘本発明者等は
、ｈ−Ｃ３Ｆの持続産生能を有する細胞株の検索につき
種々研究を重ねた結果、ヒト腎臓癌Ｍｉ織由来の細胞か
らｈ−Ｃ８Ｆ産注能を有する細胞を新たに単離して継代
培養を′ｍ続し、ついに、無限に継代培養し得る株化細
胞の樹立に成功した。この株化細胞はＴＲＣ−２９Ｒと
命名され、現在までに８４回の継代培養を行なったが、
細胞形態、細胞増殖性、ｈ−Ｃ３Ｆ生産性、ボピュレエ
イション・ダブリング・タイム（Ｐｏｐｕ　Ｉａ　ｔ　
ｉｏｎＤｏｕｂｌｉｎｇ　Ｔｉｍｅ　）等継代培養間に
おいて変動か少なく、かなり安定したＴＲ（、−２９Ｒ
の特徴的性質を維持する細胞株であることを認めた。こ
れによって該細胞株を培養することにより、ｈ−Ｃ５Ｆ
を均質な状態で大量生産することが可能となることを見
出した。

本発明はこれらの新しい知見にもとついて完成されたも
のである。

すなわち、本発明は下記の特性を有するヒト腎臓癌組繊
由来のヒト株化細胞ＴＲＣ−２９Ｒである。

ａ）　由来：ヒト腎臓癌組織より分離。

１））　　形Ｂ＝上皮細胞様。

Ｃ）　染色体数：高３倍体域である染色体数子４本のモ
ーダル・ナンバー（Ｍｏｄａｌ　Ｎｏ、　）を示すこと
を特徴とする染色体数の分布モード。

ｄ）　　ｍ代培養：無限な継代培養。

（・）　機能的特１々：　ｈ−Ｃ３Ｆ産生。

［）細胞増殖性：細胞の増殖が進み、飽和状態になると
重層状に増殖する傾向が見られる。特に、５〜２０％生
胎児血清（Ｆ　ＣＳ）含有ＲＰ　Ｍ　１−１６４０培地
にて増殖性良く、ボピュレエイ７・、ｆン・ダブリンク
・タイムは２９±６時間である。

８）　保存条件：−１９０℃で凍結保存。

本発明の細胞株はヒト腎臓癌組織由来の樹立されたコロ
ニー形成刺激因子（Ｃ５Ｆ）産生細胞株であり、ヒ１−
Ｃ３Ｆ産生に有用であり、これを大量に製造することが
できる。更に、Ｃ３Ｆ産生能は長明にわたり安定であり
、低下が認められない。

ま−４゛　本発明のｈ　−ＣＳ　Ｆ産生細胞株ＴＲＣ−
２９Ｒを得るに当って、人体から外科的に摘出された腎
臓癌組織の１〜２ｇを細切し、これを１０〜１００ｍ１
のトリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ　ＢｕｆｆｅｒＳａ
ｌｉｎｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　；以下、ＴＢＳと略す）
にて洗浄する。次いでこれを細胞分散用酵素の溶液１０
〜５０ｍ１に加えて、３７℃にて６０〜１２０分間魔？
’Ｐ　ＬでＭ１￥＠を分散せしめる。その後該乃￥素活
性を停止せしめ、細胞を回収する。このようにして分離
した細胞は、通常培養用培地１ｍｌ当り１０４〜１０６
個の細胞数になるように調製して初代培養する。この培
養においては、籠便にはソヤーレまたはプラスチックボ
トルの培養容器を用いてｌ＠養湯温度３７℃５％ＣＯ２
混合気相、湿度１００％の条件下にて静置培養する。次
いでこれを継代培養するに当って、まず初期培養におい
て細胞が増殖して飽和に達したごとを確認後、洗浄して
細胞を剥離し、回収する。

この際、洗浄液としてはカルシウム、マグネシウムを含
まないリン酸緩衝生理食塩水ｃ以下、ＰＳＢ（−）と略
す〕を用いればよく、また細胞？１１＾１ｆの際は、ト
リプンンやナガーゼ酵素液を用いｎ、（よ′よい。この
ようにして得られた細胞は、さらに細胞数を調製して培
ｌ用培地に加え、これを簡便には、３７゛Ｃ１５％ＣＯ
２混合気相、湿度１００％の条件下培養容器内で飽和増
殖せしめる。次いてこの飽和増殖時の３分の１量の細胞
数を、新たな培地に接種し、同一条件下にてくり返しく
継代培養回数５０回以上）培養した。

このようにして継代培養を行なった結果、限界７〜く継
代培養が可能な株化細胞が得られ、さらにこの細胞はｈ
−Ｃ３Ｆを産生する機能的特徴を有するもので、この細
胞をｈ−Ｃ３Ｆ産生細胞株ＴＲ（、−２９Ｒと命名した
ものである。

以下に本発明に用いられる培養用培地、血清、細胞分散
用酵素および緩衝液（塩類溶液）について説明する。

■）　培養用培地にはイーグルＭＥＭ　（Ｅ−ＭＥＭ）
、アルファーＭＥＭ　（α・ＭＥＭ）（第２表）、ダル
ヘノニＩＭＥＭ（ＤＭ［！、）、イスコブ培地（ＩＭＤ
Ｍ）　。

フイノノヤー培地、ブレース培地、マノコイ・５Ａ培地
、１９９培地、ハム・Ｆ−１０培地、ハム・Ｆ−１２培
地、ＲＰＭＩ−１６４０培地（第１表）、ウェイマウス
培地、ウィリアム培地がある。

代表的な培地としてＲＰＭ［−１６４０培地の組成は例
えばペニシリンＧ１００μｇ／ｍｌ、硫酸ジヒドロスト
レプトマイシン１００μｇ／ｍ１などの抗菌性物質およ
び血清、好ましくは牛胎児血清ｌＯ〜１５％を添加する
。

２）　またＴＲＣ−２９Ｒの増殖の際の血清には、牛胎
児血清が好適であるが、その他ヒト血清、子牛血清、成
牛血清、馬血清、ニワトリ血清を用いてもよい。培養液
中の血清比率は１−２５％（容量）で、好ましくは５〜
２０％であり、抗生物質（ペニシリンＧ１００μｇ／…
１、硫酸ジヒドロストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ
）を含む。

３）細胞用分散用酵素は次のものが使用、例示される。

トリプシン（１：２５０）０．１〜０．２５％コラゲナ
ーゼ　　　　　　０．０５％ ディスパーゼ　　　　　５００〜１００ＯＵ／ｍｌナガ
ーゼ　　　　　　　　２５Ｕ／…ｌこれらの蛋白分解酵
素の溶液は、ＴＢＳに溶解（なお０．０２％のＥＤＴＡ
・２ナトリウム塩を含をする）し、滅菌後、いずれも０
．４５μｍミリポアーフィルタ濾過を行なった。

・１）　　塩類溶液としては、ＰＢＳ、ハンクス液、ア
ール？ｆｋおよび′Ｔ’　＋１５が（重用される。

５）　細胞の増殖 湿度１００％、５％ＣＯ□混合気相中で培養温度３７°
Ｃで１音養し、限界なく継代培養が可能である。

６）　保存条件。

ＩＲＣ−２９Ｒ株の培養物より酵素的に細胞を？す＾１
１させた後１０％０％ジメチルスルホオキシドｌＶＩｓ
ｏ）又は１０％グリセリン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地
（１０％ＦＣ３を含む）に懸濁して−８０〜−１９０°
Ｃにて凍結保存する。

７）細胞の特徴： 上皮様の形態を有する。染色体数の分布は７４本にモー
ドをもつ高３倍数体である。

＋；＞ｃｓＦ産生の確認 マウス骨髄細胞を用いたコロニー形成法仁保の方法（「
免疫実験操作法」、日本免疫学会編、１９７４年、第９
２７頁）に従いメチルセルローズを用いる下記の方法で
行った。

２．２％メチルセルローズ／α−Ｍ　Ｅ　Ｍ　　１．６
ｍｌウマ血清　　　　　　　　　　　　　　０．８１マ
ウス骨髄細胞懸濁液／α−Ｍ　Ｅ　Ｍｏ、８ｍｌ被験サ
ンプルまたはＣ３Ｆ標準液　　　０．８ｍｌメチルセル
ローズはダウ社製（Ｄｏｗ　）　、α−Ｍ　Ｅ　Ｍはフ
ロー社製（Ｆｌｏｗ）　、ウマ血清はギブコ社製（ＧＩ
ＢＣＯ）（＃２８に８０２４）Ｃ３Ｆ標準液はギブコ社
製（ＧＩ　ＢＣＯ）ＧＣ”ｆ”−ＣＭを使用した。また
マウス骨髄細胞は静岡実験動物農業開開組合より購入し
た雄性７週令のＩＣＲを使用し、大腿骨骨髄の単核球を
分離し２、α−ＭＥＭに懸濁して５　Ｘ　１０５／ｍｌ
に調整した。

上記混合液を３枚の３５■■の口径からなるブラ′スチ
ソクデノシュに１ｍｌずつ分注し３７°Ｃ１５％ＣＣｈ
？ｉ合気相下で７日間培養した後、２０個以上の細胞か
らなる細胞集団を１コロニーとみなして算出し、上記条
件で１コロニーを形成させるｈ−Ｃ５Ｆ活性を１単位（
［１）とした。

ｂ　−ＣＳ　Ｆの活性はいずれも３枚のデフシュの平均
値で算出した。

大麹孕Ｉ 次に実施例を掲げて本発明を説明するが、これζこ限定
されるものではない。

実施例 …）ノ［体試料 外科的に摘出された腎臓癌の腫瘍組織の一部２１Ｋをあ
らかじめ冷却しておいた組織培養用培地（イーグルーミ
ニマムエセンシアル４叱、１　（］％ＦＣ３含有培地（
［’、−Ｍ［’ｔＭ＋ｌＯ％１・’　（ｉ　Ｓ　）に無
菌的に入れ可及的速かに実験室に運び細胞の初代培養実
験に供した。

（１１）　　四代培養 鋭利な手術メスで前記組ｍ１ｇを細切し、２０ｍ１のＴ
ＢＳで三回洗浄した後２０ｍ、１の０．２５％トＵ　７
’シフ　（Ｄ　Ｉ　Ｆ　Ｃｏ社Ｗ）ＴＢＳ溶液ヲ加えて
３７℃のちとに９０分間攪拌して組織を充分に分散させ
た。次いで牛胎児血清を含む培地で希釈することにより
酵素活性を停止させ１５０メツシユの篩を通して濾過し
、その濾液、ａ　ｌ　０００ｒｐｍ　５分間遠心分離し
て細胞成分を集めた。次いで、分離した細胞をＲＰＩＩ
／ｊｌ−１６４０培地＋１５％ＦＣ５添加培地に懸濁さ
せ単細胞浮遊液とした後、細胞数を計数し、培地１ｍｌ
当り細胞数が２Ｘ１０５個になる様に調整しこの懸濁液
５ｍｌを径６ｃＩＩ＋のシャーレで３７℃、５％ＣＯ□
混合気相、湿度１００％下に静置培養した。

細胞数の計測は、改良型ノイハウエルＧ（Ｎｅｕｂａｕ
ｅｒ）血球計算板を用いて０．１％トリパンブルー染色
による生細胞数を５１数した（なお、継代培養およびＴ
ＲＣ−２９Ｒの増殖においても同一計測に基づいて行な
った）。

（Ｃ１液代墳ｉ 細胞が増殖し飽和状態に達したことを検鏡により確認し
た後、培養液を除去してＰＢＳ（’−）で洗浄し、次い
で２５［Ｊ／ｍｌのナガーゼ（長瀬産業社製１００Ｕ／
■）のＴＢＳ溶液（０，２５％のＥＤＴＡ・２ナトリウ
ム塩含有）５ｍｌを加えて３７℃、１５分間処理して細
胞を剥離させ、酵素液を遠心除去し、ＲＰＭｒ−１６４
０培地」−１５％ＦＣ３添加の培養用培地１５ｍ１を加
えて充分に細胞を分散させ、その５ｍｌを新たな培養容
器に入れて３７℃、５％ＣＯｚ混合気相、湿度１００％
の条件下培養した。培養後、同様に、飽和増殖時の３分
の１量の細胞数を新たな培地に接種し、これを３７°Ｃ
１５％ＣＯｚ？Ｒ合気相、湿度１００％にて８４回繰り
返し培養をおこなった。

ｔｄ＋　　Ｗ胞の糸〔川 このように継代培養して得られたヒト腎臓癌組織より株
化樹立したＣ３Ｆ産生機能を有するＴＲＣ−２９Ｒ株（
命名）の培養は、５〜２０％、好ましくは１０％ＦＣ５
含有ＲＰＭｒ−１６４０培地を用い、Ｉ　Ｘ　１０５／
ｍｌの細胞密度でコーニング社製ｔｌｈ２５１００組織
培養用フラスコに５ｍｌ量播種して３７℃、５％ＣＯ２
混合気相、１００％湿度の培養条件で培養し４〜５日毎
に継代を行った。

猪釆 （１）　　俳Ｔ一旦Ｓ〜　２し座の喝１ｌ−Ｃ３Ｆ産生
細胞として樹立したＴ　ＲＣ−２９Ｒ株の細胞生物学的
性質を検討し、以下のような特性を明らかにした。

形態：培養細胞は密に接した多角形の細胞が単層シート
状に増殖して敷石状を呈し、典型的な上皮細胞様配列を
示した。

細胞の増殖が進み飽和状態になると重層状に増殖する傾
向が見られた。

増殖能：ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣ３培地を用い
、３５關径組織培養用プラスチックディツシュ（コーニ
ング社製）へ５　ｘ　ｌ　Ｏ”ＪＥ、細胞／ｍｌの細胞
浮遊液を２ｍｌ播種し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２混合気相
、１００％湿度下で培養を行い増殖曲線を作成し、この
増殖曲線より求めたポビュレエイション・ダブリング・
タイムは２９±６時間であった。

水沫は、公知のいずれの培地でも培養可能であるが、Ｒ
ＰＭ［１６４０培地＋５〜２０％ＦＣＳ含有培地におい
ては、特に良好に増殖する。

染色体分析：染色体数の分布モートは第１図に示す通り
であって、染色体数子４本をモーダルナンバーとして高
３倍体域にあり、比較的安定した細胞株と判断された。

機能的特徴：Ｃ３Ｆ産生機能を有する。細胞株１’　Ｉ
＜　Ｃ−２９Ｒは公知のどの培地に培養するもｈ−ＣＳ
Ｆを産生ずるが、５〜４０％、例えば１０％１・’Ｃｓ
添加１ンＰＭＩ−１６４０培地を用いて培養した場合に
おいては、細胞の増殖とｈ−ＣＳＦとの産生が良好であ
った。

（２）梃賂（７）　ｆｌ　９ｉへとｈ−Ｃ３Ｆ産圭ｐ経
時的変化ＴＲＣ−２９Ｒ株の増殖とｈ−Ｃ３Ｆ産生との
相関をしらべるために１０％ＦＣ５添加ＲＰ　Ｍ　［−
１６４０培地を用いて３５龍φの口径からなるプラスチ
ノクディンシェに１．１Ｘ１０’個の細胞をＦ通挿し、
３７℃、５％ＣＯ２混合気相、湿度１００％のもとで培
養し、経時的に３枚のディツシュをサンプリングして細
胞数と培養液のｈ−Ｃ５Ｆ活性を測定した。その結果、
細胞は１日の遅滞時間の後に増殖し４日後にほぼ飽和に
近づき８０後には５．３×ＩＯ’個に達した（第２図）
。

培養液のｈ−Ｃ３Ｆ活性は細胞数の増大とともに上昇し
く第３図）、飽和増殖時に最大となり１ｍｌ当りの活性
が約３００単位に達することが明らかになった。

２１坏杉丸果 本発明により新規樹立株であるｈ−ＣＳ　Ｆ産生細胞株
ＴＩ’？Ｃ−２９Ｒを得たもので、この新規樹立株ＴＲ
Ｃ−２９Ｒ細胞の人聞培養による［１−Ｃ３Ｆの工業的
生産法を確立し、それによって得られたｈ−ＣＳＦを医
薬ならびに疾病の診断に有用な物質を提供し得るもので
ある。特にこのｈ−Ｃ３Ｆは該細胞の培養によって本発
明の大量製造が可能になれば、原料の安定供給ができる
ようになり、生体防御機構の崩壊に起因する疾病治療、
診断への利用が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴＲＣ−２９Ｒ株の染色体数の分布モードを示
す図、 第２図はＴＲＣ−２９Ｒ株の培養経過を示す増殖グラフ
、 第３図はＴＲＣ−２９Ｒ株のＣＦＳ生産の経時的変化を
示すグラフである。 将許出願人　二粟玖慣曵を 図 法 第２図 日存藺（ｅ） 第３図 瞳督（Ｓ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の特性を有するヒト腎臓癌組織由来のヒト株
   化細胞ＴＲＣ−２９Ｒ。 ａ）由来：ヒト腎臓癌組織より分離。 ｂ）形態：上皮細胞様。 ｃ）染色体数：高３倍体域である染色体数子４本のモー
   ダル・ナンバーを示すことを特徴とする染色体数の分布
   モード。 ｄ）継代培養：無限な継代培養。 ｅ）機能的特徴：コロニー形成刺激因子産生。 ｆ）細胞増殖性：細胞の増殖が進み、飽和状態になると
   重層状に増殖する傾向が見られる。 特に、５〜２０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０
   培地において増殖性良く、ポピュレエイション・タブリ
   ング・タイムは２９±６時間である。 ｇ）保存条件：−８０〜−１９０℃で凍結保存。