JPS60501570A - 迅速プランジヤ−免疫学的検定法及び装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 迅速プランジャー免疫学的検定法及び装置技術分野 本発明は免疫学的方法及び装置に関する。さらに詳しくいえば、本発明は、被検 出免疫成分を運ぶ体液、すなわち、キャリヤ流体、などの流体について免疫学的 検定方法を実施する特定の技術と装置に関するものである。

発明の背景 免疫化学の進歩に伴い、免疫学的検定を実施するための今までより効率的で低価 格の方法及び技術の必要性が大きくなり、最近はそれが加速されてきた。分子生 物学、生化学、生物学及び遺伝学におけろ多くの分野の努力においては、ただ一 つの結果を得るために数百、数千という免疫学的検定処理を実施することが必要 である。

免疫性疾病及び障害の臨床治療において、長く手間取ったり、何度も繰返し来院 して患者及び医者の時間全浪費しないためにすべての必要な免疫学的検定を迅速 に、安価に、かつ効率的に実施することが非常に望ましい。従って、医院または 臨床試験所において用いるためのもつと正確で、もつと安く、もつと簡単で、も つと効率的な免疫学的検定処理及び装置が長い間必要とされている。過去１０年 にわたって非常に多くの免疫検出器の機構、技術及び材料が開発されてきた。現 在昔ながらの放射線免疫分析技術が今でも非常に広く用いられているが、それは 非放射性反応指示薬を用いる他の技術で置換えられつつある。例えば、酵素と結 ひついた免疫学的検定技術並びに他の測光法、螢光」１１光法及び比色法もまた 特定の種類の免疫成分に適用できる。これらの進歩は、抗原及び抗体の比較的速 くて正確な検定を完全に実行できるようにしたが、なおもつと正確で同時に安く て効率的な装置及び方法に対する必要性が研究所および臨床実験室の両方でいつ も満たされない状態にあった。

既存の免疫学的検定技術は、非常に複雑であるか、または時間のかかることが多 いので、技術員が１日当り非常に限られた数の検定しか行えない。一方、臨床実 験室においては、１例として、特定の１日の間に実行されるべき分析の数は、検 定を実施する装置を組立てて動かすに値するまでに達しないことがある。ときに は、そのような情況では、技術員は、患者の試料を検・足金実行する労力を正当 化するのに十分な試料の舟になるまでためてしまうことがある。心臓麻痺の疑い のある場合などのような、多くの臨床的事情においては、検定技術につきものの 遅延または不都合があれば、患者に明らかに不利益である。そのような場合に、 迅速かつ正確に検定するこ、とか、患者の健康に肝要である。

本発明の諸特徴の中には、従来技術の前述の欠点を完全にまたけ大幅に克服する 方法と装置がある。

発明の要約 本発明の方法によれば５関心のある免疫成分、例えば抗原、を含む流体を、普通 は必ずしもフィルタを通さないが、プランジャー・フィルタに導入してプランジ ャー・フィルタ内にある免疫学的に結合するビードと接触させ玉。これらの免疫 学的に結合するビードは、対象とする免疫成分、例えば抗原または抗体５に結合 して、それを保有している溶液からその成分を抽出する。次にこの溶液全フィル タを通してプランジャー・フィルタから強制的に流し出して、ビードをグランジ ャー・フィルタに残す。ビードを洗滌して余分の流体を除去して、ビードに結合 している対象とする免疫成分だけがビードに残るようにする。次に対象とする免 疫成分、例えば、抗原または抗体、に結合する顕色剤をプランジャー・フィルタ に入れる。余分の顕色剤を洗浄、ろ過な、どによって除去する。最後に、対象と する免疫成分は、顕色剤の特色を表わす指示薬によって顕色剤を測定して決定さ れる。

装置としては、本発明は、被試験液の選択された免疫的に活性な成分に結合する ビードの入っている新規な改良されたプランジャ・フィルタ・アセンブリト容器 管とを備え、その容器管の中に前記プランジャ・フィルタが可動で液密な関係に は１つて、フィルタの中をどちらの方へも液体を押し通すことができる。また、 この装置によって意図されているのは、技術員が本発明に従って免疫学的検定を 実行するのに完全で十分な装置を提供するに適描な容器構造で、相互に関連した 多数の上記のような要素を含むキシドである。

さらに明確でしかも制限的でない意味では、本発明を、開放端及び閉鎖端を有す る円筒形容器管及び前記容器管の開放端内に受け入れられ、前記容器管内で滑動 できるグランジャ・フィルタ　アセンブリを備える免疫学的検定装置として記載 でき、前記プランジャ・フィルタ・アセンブリは、両端が開いている円筒形管と 、前記円筒形管の基部の端にしつかり固着され、前記容器管の開放端の方を向い て外方に伸びており、前記容器管の内壁に対して可動で、プランジャ・フィルタ の基部端と前記容器管との間に事実上液密な可動シールを形成する可動ノールと 、普通は内側がドーム形のフィルタで、フィルタを通過できる液体または粒子以 外は、プランジャ・フィルタの円筒の基部端を内外に物質が通り抜けないように している高い表面の領域と、使用時に、被検定液の選択された免疫的に活性な成 分に結合するとともに免疫的に活性な成分で処理された多孔性表面を有し、フィ ルタを通過するには大きすぎる免疫的な活性なビードとからなっている。

好ましい形では、フィルタは、検定液及びその成分、例えば血球が自由に二方向 に通れるように、できるだけ大きいが、なおビードをフィルタの片側に目詰りす ることなく保持するに十分なだけ小さい孔を備、え、フィルタ・シールはプラン ジャ・フィルタ管の円周上の周シに伸びて容器管の内壁と可動シール接触をする ヌカートと、プランジャ・フィルタ管の内側にしつかり受けられるスリーブから なり、そのスリーブの一番上は、プランジャ・フィルタ管の内壁と９０°未満の 角度で交差する大体平らな環状頂面を形成するように構成されて配置されている 。

また、好ましい形態においては、免疫的に活性なビードは、フィルタを通過しな い、すなわち、フィルタ全目詰りさせるのに十分な大きさであるが、ほかの点で は、ビードの沈降速度を遅くするようにできるだけ小さいので、検定反応の速度 を早くする。なお、ビードは、抗体または顕色剤がビードの内部に全く入らない だけの小さな細孔をもつべきでアリ、こうして、すべての結合段階及び反応段階 がビードの外表面に生じるので、反応時間の速さを早め、かつバックグランドの 妨害を減らす。この細孔寸法の制約の範囲内で、ビードの細孔寸法は、なお、ビ ードの比重を減らし、従ってビードの沈降速度を遅くし、さらに検定反応時間の 速さを早めるように最大限のものにすべきである。

もう一つの定義では本発明は、所定の物理的形態になっだ液体検定試料を含む段 階と、フィルタを前記形態を介して押しつけ、それによって液体試料を前記フィ ルタを通して第２の形態にして免疫学的に反応性部位をもつ多数のビードと強制 的に接触させる段階と。

試料内の免疫学的成分の反応が前記ビード上の前記免疫学的に反応性の部位と反 応できるようにするために液体を所定の時間前記ビードと接触した丑まにする段 階と；フィルタをその形態から引出して、第２の形態からフィルタを通して液体 試料をビーズとの接触を無理に離す段階と：ビーズから残りの液を洗い流す段階 と：試料からの免疫学的成分のビーズ上の免疫学的反応部位との反応を判定する 段階とを含む免疫検定方法である。

好ましい形式では、判定段階は、免疫学的成分をビーズから前記第２の形態の中 の液体の中１／ｉ：取り除くこと、前記成分を反応指示薬と反応させること、第 ２の形態内の前記液体内に反応指示薬のあることケ試料内の免疫学的成分の量の 尺度として判定することを含む。

最良モードの説明 以下の説明に訃いて、抗原判定免疫検定試験のための装置と方法を、代表例とし てのみ説明する。しかし、この説明は、装置の構造と使用法並びに方法の技術と 段階を単に例示することだけである。この装置の並列段階及び使用法が特定の免 疫学的検定に対して選んだ特定の顕色剤を甲いるとの免疫学的成分判定にも含１ れるであろう。例えば、結合酵素の検出技術を説明する。明らかに、免疫螢光、 Ｔ（ＩＡ及び他の技術をＥＬ工ＳＡ技術と同様に用いることができる。後述の最 良モードは、従って、典型例として考えられるへきで、本発明の範囲と概念に関 して制限するものではない。

本装置の概略図に対する第１図をまず参照するとこの発明的装置は、普通は、丸 底のよくある円筒管（試験管ということが多い）の形である容器管１０からなっ ている。不可欠の反応容器は、プラスチックの円筒管２０であり、それには円筒 管２０と容器管１０との間の空間を、前者が後者に挿入されるとき密封する取外 し可能なシール２２かつけられている。反応容器はまた、フィルタ２１Ｉ及びビ ード２６を含み、後者は、第う、）１図によく示されている。円筒管２０、シー ル２２及びフィルタ２１↓の組合せをプランジャ・フィルタと称し、フィルタ２ ヰはビード２６を含んでいろ。

シール２２及びフィルタ２１Ｉの構成は、や＼重要である。この構成の詳細につ いて第２Ａ図を参照する。

ノール２２［、インサート・ヌ’）　−フ２２　ａ　、！１スカート２２ｂを備 え、インサート・スリーブ２２ａは、円筒管２０の内部に液密な関係でついてお り、スカート２２Ｆ）は、円筒管２０の円周の１わりに外方に伸ひて容器管１０ の内壁と接触し、その結果円筒管２０と容器管１０との間に可動で液密なシール 會形成する。スカートは、弾性のあるもので、好ましいのは、弾性のあるゴムま たはポリマーで作られることである。スリーブ２２ａも捷だ、普通は、同じ弾性 桐材で作られ、スリーブ２２ａとスカート２２ｂは、普通は、一体であるが、こ れは不可欠なことではない。例えば、スリーブ２２ａは、比較的堅くて、接着に よるかまたは他の方法で、円筒管２０の中に密封捷たは固着されてもよい。Ｍｅ なのは、シール２２の上部がどんな粒子をも捕獲したり、保持したりしないよう に構成きれていることである。図示の特定の実施例においては、スカ−）２２ｂ の最上部が直角またはほぼ直角に円筒管２０の壁から伸びるとき、粒子の著しい 捕獲はないことが分った。

別形の実施例が第２Ｂ図に示されており、そこでは、スカート２２ｃは、フィル タ２’ｌｌに向って内側へ下がる方向に傾斜している」−線をもっているＣ、同 様に、この構成において粒子の捕獲はない。従って、特に第２Ｂ図に関しては、 円筒管２０の内壁とシール２２の肩の最上部表面との間の単一角度は、９０°以 下−〇ある。

なお、重要なことは、シール２２の上縁がフィルタと物理的にしつかり接触する ことである。これによって、プランジャ・フィルタ内のすへての液体を定量的に 除去できろ下向き吸引をフィルタ全通して行うことカ可能になる。シール２２の フィルタ２１Ｉへのこのしつか′りした接触がなり゛れば、とんなに努力して吸 引をしても、液体の溜り場所がシール２２に残って、洗浄段階の効果が十分でな くなる。

実際には、円筒管２０の内壁とシール２２のスＩＪ　−ブの最上部との間の関係 は、９０未満の角度をもつことにある程度理論的利点はあるけれども、直角であ ることが最も都合よいことが分った。実際に、９０の角度は、強い密封関係を与 え、組立てに便利であって、しかも粒子の捕獲を適当に防止する。

ビード２６に共有結合した抗体がプランジャ・フイルタに入れられ、フィルタを 通して下向きに吸引を行っても、粒子の大きさがフィルタを通過できないような ものになっているから、抗体はプランジャ・フィルタ内に保持される。一つの重 要なフィルタ特性は、フィルタがその上にビード全ぴったりと引き下ろしても吸 引効率を最大にするように、普通、ドーム形の表面にして、高い表面積をもって いることである。

キットの形になった装置は、同じ不可欠構成要素のほかに、免疫検定を実行する のに便利な構成要素ヲ備えている。キットは、あとで説明する。

例示的な形での基本免疫学的反応の説明は次の通りである。「テスト抗原」に対 して特異性をもつ抗体がビードに共有結合はせられる。抗体が結合したビードは 、グランジャ・フィルタ内に保持される。これらの「抗体−ビード」は、使用中 、「テスト抗原」に対して検定される予定の生物学的液体または他の液体のある ところで、プランジャ・フィルタ内に再び浮遊させられる。同時に、寸たは引続 いて、抗体−ビードを「第２の抗体−酵素Ｊの入っている溶液内で培養する。

この第２の抗体−酵素もテスト抗原に対して特異性をもっており、そのほかに、 酵素に共有結合している。

テスト抗原が検定された生物学的またはその他の液体中にあれば、それは、両方 の抗体に結合する。テスト抗原の中には、抗体−ビードと第２の抗体−酵素とに 同時に結合されるものもあろう。こうして、第２の抗体−酵素は、ビードに結合 され、非常に特定の免疫学的反Ｇｋ介してビードに保持されろ。抗原及び抗体− 酵素が結合した抗体−ビードは、次に、フィルタの底に加えられる真空吸引を用 いて、プランジャ・フィルタ内に洗浄溶液を取り入れ１円筒形容器管１０の中で 、各図に示されているように、プランジャー・フィルタを引上げて、洗浄溶液に 強制的にフィルタを通らせることによって洗浄される。最後に、ピッ゛ドは、「 顕色基質溶液」中に再び浮遊はせられる。第２の抗体に結合した酵素は、その基 質を変化させて、色の変化、捷たけ何らかの他の検出可能な現象を生じさせる。

比色法においては、顕色溶液は、可視的に、またけ紫外もしくは赤外範囲で、色 を変え、この色の変化を目視または適椙な紫外藍たは赤外の測光器を用いること によるいずれかで検出できる。その変化は、それ自体、テスト抗原の存在の一つ の定量的指示を構成する。顕色溶液における、例えば、色の濃さ、光の強さなど の変化量は、被検定液体内のテスト抗原の量の一つの定量的示度であるＰ 上述の説明は、公知の抗体・酵素に結びついた免疫検定を本発明のプランジャ・ フィルタ装置に採用したものであって、単に例としてのみ与えられていることに 注意されたい。

平らな表面にではなく、浮遊できる小さなビードの上に「第１の抗体」をつける ことによって、非常に大きな無秩序な界面が抗体とテスト抗原との間に迅速に得 られる。抗体のテスト抗原に「会う」頻度が多くなるので、反応時間は、ずっと 早く、反応の完成度がさらに高まる。培養の間ビードを浮遊状態に保てば、１５ 分以下の培養時間で少なくともナノグラム／ミリリットルの感度で免疫検定を行 えることが示された。これは、第１の抗体を平らな表面にだけ付着させた場合、 数時間を要する免疫検定に匹敵する。

もう一つの重要な利点は、遠心分離処理を全くなくすことである。抗体−ビード をプランジャ・フィルタ内に保持しながら、液体をプランジャから吸引によって 排除できる。

グランジャ・フィルタは、現在、単一の臨床的用途、すなわち患者の血液から血 清または血漿を収集するために製作されている。血液を遠心分離機にかけると、 血球は、管の底へぐるぐる回りながら降下し、上部に血漿−血清が残る。プラン ジャ・フィルタが血球のなくなった状態で止った管に挿入されて、血漿−血清が プランジャ内に入ることができるようになる。フィルタは、血の固まりやその他 の微粒子のぐずがプランジャに入らないようにする。しかし、現在製作されてい るプランジャ・フィルタの中には、本発明による検定に適当なものは一つもない 。高感度、短い反応時間及び低い色バンクグランドの検定を達成するためには、 ビードの大きさとビードの気孔率、フィルタの細孔の大きさ、プランジャの幾何 学的形状及び抗体−抗原の反応の間の液体の密度が非常に重要である。なお、本 発明は通常のや９方で検定された血清または血漿と反応に、全血の直接免疫検定 を可能にする。本発明のこれらの種々の面を次に検討する。

注意深く定められたフィルタとビードの寸法を用いて、凝固防止処理された全血 を検定することが可能である。これによって血液から血漿または血清を調製する 時間のかかるいやな仕事をしないですむ。全血を検定するためには、プランジャ に実効孔寸法１５〜１７ミクロンのフィルタをはめる。正常な血球は、すべて、 直径７５Ｅ１５ミクロンより小さいので、それらはフィルタを自由に通過して反 応室を形作るグランジャ・フィルタに入って抗体−抗原反応を始め、次に反応の 終りでフィルタを自由に通り抜けて、あとに抗体ビードを残す。溶血反応は、最 小限である。抗体ビードは、それらがフィルタによって保持されてフィルタを詰 まらせないようにフィルタの孔より十分に大きくなるように選ばれる。うＱ、　 ＯＯＯ〜７０，０００ドルトンより大きい蛋白質全排除する膨潤ビード孔寸法を もった２０〜５０ミクロンの膨潤直径の交差結合デキシトラン・ビードがこの目 的に全く適していることを見出した。

このようなビードは、３５ミクロン以上のビードと違って、反応段階の間機械的 手段なしで大部分が浮遊状態の１′ｉでいるのに十分なだけ小さくて多孔性であ る。

ポリアクリルアミドの同様な大きさのビードもこの種の検定に適している。こ＼ で限定したビードの種類は、例示としてだけであり、他のビード源も適当である 。

全血についての反応を最適に行わせるためには、血球を自由に通過させるに丁度 足りるだけ太きいが、フィルタを詰１らせるほど小さくなく、しかもそれ自体は 培養の間浮遊状態によく留することができるほどに小さいビードを保持するに足 りるだけ小ざい孔寸法をもったフィルタが必要である。もちろＡ、ある程度の限 られた詰りか生ずる可能性があってもより小きいピッドを用いるか、またけ沈降 する傾向のあるより大きいビードを用いて、これらの欠点をなくすために時間調 整、かき１ぜ、振どうまたは他の調整を行えば、最適より劣る結果を達成する可 能がある。

ビードは、ビードの沈降を遅くして検定反応を促進するのに十分に細孔が多いこ とが必要であるが、抗体および顕色剤分子がビードに入らないだけに小さな孔が おいている必要がある。３０．　ＯＯＯ〜７０，０００ドルトンより大きい蛋白 質全排除する膨潤孔寸法をもった交差結合デキントランビードがこれらの目的に 適して分り、それらの内部に抗体などのよ粉大きな蛋白質が入らないようにＬな がら、なお良好な浮力を示す。

類似の大きさのポリアクリルアミドのビードも適しており、これらのビードの種 類は、例としてのみである。

こめ直径と孔寸法に関して注意深く形作られたビードの幾何学的形状は、この検 定の迅速度と感度に対して重要である。ビードの７１１…孔は、そのビードに結 合されたすべての免疫学的試薬がビー　ドの外面にあることを確実にするに十分 なたけ小さい。これは、テスト抗原がビードに結合された抗体と相互作用するの にビードの中へ移動する必要をなくすので、検定反Ｔ；１≧、全促進する。同時 に、本発明の限定されたビードの幾何学的形状は、大きな直径のビードまたは小 さな孔のあいたビードよりずっと少ないビード沈降完了時間を示し、この特命が 検定速度全非常に大きくする。最後に、この細孔寸法は、第２の抗体−酵素また は他の顕色剤がビードに入らないものになっている。セファローズ（商標）など のより大きい細孔のあいたビードは、第２の抗体−酵素がビードに入り、洗浄段 階のりとれ杢これもトラップされたままであり、最後には、顕色の間室１しくな い高いバックグランド妨害を生ずることができるようにする。本発明の限定きれ たビードの幾何学的形状は、この検定バンクグランド妨害の＃を除去する０ 現在製作されているプランジャ・フィルタでは、フィルタは、ゴム環をはめられ て所定の位置に保持される。ゴム環がプランジャの内側についているフィルタの １わりにふくれれば、それは排出吸引を行った後でさえ不必要な液体の停滞音生 ずる。フィルタがゴムの十分上方で自由にプランジャ・フィルタの中に突き出ろ ようにゴム環を新しい形にすることによって、抗体ビードまたは他の免疫学的試 薬に結合したビードを洗浄段階の間完全に乾燥する１で吸引できることが分った 。ビードに特異的に結合されない酵素の定量的洗い落しを達成する必要があれば 、ビードを毎回の洗浄の間完全に乾燥するまで吸引することが不可欠である。

本発明によれば、プランジャがこの効果を達成するように設語されろ。これはプ ランジャの設計におけろ重要な変更である。なお、プランジャ・フィルタ・アセ ンブリの内側のフィルタの露出表面積を大きくすることによって、非常に有効度 の大きい吸引を適用できる。

この設剖変更なしには、すべての実用的目的に対して、小さなメッシュ・ビード を効果的に洗浄することは事実上不可能である。

ゴム環は、プランジャ・フィルタの円筒の内側と９０以下（第２Ａ及び２Ｂ図に 角φと称している）で接触することが重要であることも分った。接触角が９０よ り大きければ、割れ目が生じて、その中に血球がトラップされた状態になる。こ れらの血球を洗浄中に死金に除去できないので、溶血が検定の最後の顕色段階に おいてバンクグランド全非常に大きくすることがある。

円筒管２０の内部とゴムが直角に接触するようにゴムの形を新しく変えろと血球 のトラップとキャリオーバをなくす。代替の、しかし、いくらか好１しさの劣る 方法は、９０より小さい接触をさせることである。

抗体ビードがテスト抗原と反応はぜられる期間である第１段階培養は、ビードが 培養液の中に均等に分散されろと、より早く進行する。従って、ビードが沈降し ないようにすることが非常に望ましい。これは、反応中プランジャ・フィルタ・ アセンブリを揺り動かし、またはかきまぜて達成できる。これは、手で行っても よいし、捷たは適当に振動装置で自動的に行ってもよい。しかし、本発明によれ ば、この不都合でさえ注意深く予め選択したピッドの大きさと気孔率によって避 けてフィルタによろビード保持をな訃可能にしながら、沈降を最小限にする。な お、ある種の担体物質が十分な密度のものであって、抗体ビートの沈降を一層防 止するために適当な電荷特性をもっている。カゼインやアルブミンなどの担体が 冬〈の検定に適している。他の濃密化担体をも用いることができろ。全血の検定 においては、血液そのものの密度が、通常、ビードの沈降を妨げるか、または少 くとも沈降全非常に遅くするのに十分なだけ高いので、追加の担体ｆ＆’６とん どまたは全く必要としないことに注意されたい。

本発明のもう一つの重要な特徴は、第２の抗体全酵素に結合するための切り取り できる交差結合剤の使用である。これによって、顕色の間還元剤を導入して酵素 をビードから迅速に遊離きせて酵素を抗体から切り取り、酵素を溶解状態にして 、酵素が色または他の指水薬の結果を与えるために顕色溶液と反応できるように する。酵素の液相への遊離は、色反応を非常に早めて、酵素がプランジャ・フィ ルタを通過して新鮮な読取り管に入れるようにする。従って、この方法によれば 、プランジャ・フィルタ管内の顕色した溶液は、フィルタを通して真空吸引を行 うだけで、プランジャ・フィルタ管から容器管の中へ定量的に移され、顕色した 溶液を容器管の中へ引き入れる。

さらに本発明の他の重要な特徴がある。非イオン洗剤がプランジャ・フィルタ管 から未結合の酵素ｉＪらに完全に洗い落としてバックグランドを下げることが示 された。非イオン洗剤は、洗浄段階中に存在する酵素力または抗原−抗体反応を 損なわない。なお、それらはプランジャ内に保たれた血球の溶解と除去を促進す る。時には、非イオン洗剤を用いると泡立ちを生ずることがある。泡立ち過ぎは 、微量の泡立ち防止剤を加えることによって防止できる。泡立ち防止剤は、洗浄 段階中に酵素力を損なわないことがわかった。

被覆プランジャ・フィルタ表面も好都合であることがわかった。表面全ポリテト ラフルオロエチレン（テフロン：デュポンの商標）、シリコーン潤滑剤、アクリ ル潤滑剤、または他の種々の塗料で被覆すると、プランジャ・フィルタの内部表 面の性質を変え、ビードがプランジャ・フィルタの内壁へ固着しにくくなること がある。このような処理もまた第２の抗体−酵素の特表咀０−５０１５７０　（ ７） 不必要な固着を少なくして、その結果バックグランドを下げる。

前述の技術は、事実上どのタイプの生物学的液体へも広く適用できる。この技術 はまた、他の流体及び他のタイプの生物検定にも適用できることは極めて明らか である。例えば、滲出物、分泌物、排泄物質などを検定することが望まれる場合 、この技術は非常に容易かつ有効にそのような方法に採用される。柔らかく、不 活性で、容易に圧縮できる物質、例えばシリコーンフオームまたは可溶性力ルシ ュウム・アルギン酸消毒綿などを、分離できるプラスチックまたは厚紙の綿棒に 取付けて咽頭、直腸などの被試験領域にこすりつけて、次にその棒をスポンジ玉 からはずし、スポンジ玉を適当な寸法の容器管の中に落とす。抗体ピードの入っ ているグランジャを、次にできるだけ試験管に押付けて、カ一杯スポンジ玉を圧 迫する。液体がスポ・ンジ玉を覆うので、スポンジ玉を何度も「ポンプ汲み」し てもよい。ポンピング法で１回または繰返して強く圧縮されると、生物学的液は 、ボールがらしぼ９出されて、フィルタを通して溶液と一緒にプランジャ・フィ ルタアセンブリに運ばれる。検定が全血でなくこれらのタイプの物質に行われる とき、フィルタの気孔率は、２０ミクロンより非常に小さくでき、ビードの大き さは同じ程度に小さくてもよく、従ってビードの沈降がゆっくりになる。

前に指摘したように、本発明の技術を事実上すべてのタイプの免疫検定に適用し てもよい。例えば、それを免疫競争検定を実行するのに用いてもよい。

一時、抗体ビードが免疫学的検定に用いられたことがあるが（例えば、リッチマ ン（Ｒｉ　Ｃｈｍａｎ　）、ダグラヌ（ＤｏｕｇＬａｓ）・Ｄらの１異なる動物 種の血清による葡萄状球菌蛋白質Ａの結合」、ジャーナル・オプ・イミュノロジ （ＪａｕｒｎａＬ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　、第１２８巻、第５号、［ １９８２年］参照）、前述のプランジャ・フィルタ構成及び技術は、全く新規で あり、すべての周知の従来技術及び装置より遥かに勝っていると考えられる。本 発明のプランジャ・フィルタ装置は、全く新しく、そして放射能を含まないか、 またはより多くの段階を簡単になくす検定のための装置としてそれを用いること は新規でろる０特に、数時間も反応時間を少なくするその有用さはこの技術にお ける新しい概念とアプローチである。上述のように、試薬と試料の取扱いと共に 既存のグランジャ技術は、高感度、急速深窓時間１便利さ、低価格、及び低バツ クグランド顕色という特定の目的を達成するのに非常に改良された。

前述のように本発明は、多数の有益な特徴ヲ備えてイル。１ず第１に、プランジ ャ・フィルタ装置内に酵素連結検定を用いることであり、その検定は、低価格、 高効率、短時間遅延と結び付いて極めて高い感度を与える。反応表面積を犬きく するために平らな面にある抗体ではなく、抗体−ビードの慎重な使用が反応時間 を加速する。このビードの使用とプランジャ・フィルタ装置とを組合せることに よって検定の実行時間をさらに短縮する。この検定の培養期間中、ビードの沈降 を少なくするのに必要なフィルタとビードとの性質の釣合いをとることによって 、従来技術にまさる非常にそして予期されないほど有効に培養時間を非常に短縮 する。例えば、第２の抗体−酵素などの顕色剤の入ることを防止し、抗原と顕色 剤との出合いを促進するのに十分な程度の小さな孔のあいた沈降の遅いビードを 慎重に選択することは、また非常に大きな進歩であって、検定の時間を短縮し、 感度を増大することがわかった。液体と細胞の滞留をなくすためのグランジャ・ フィルタの設計はまた、本発明の非常に重要な特徴であるとみなされる。従来の 装ｋｋもったプランジャ・フィルタには、有効な洗浄サクションを適用できな′ い。

諸特徴の中にはビードを浮遊状態に保つために、アルブミンなどの比重増加担体 全選択的に用いることが入っている。第２の抗体−酵素結合物質の上につげた還 元性交、差結合酵素は、酵素をビードから遊離できる点で非常に都合がよく、そ して発色、または他の顕色反応を清浄な管の中で進めることができることも重要 である。非イオン洗浄及び泡立ち防止剤の使用は、ビードがプランジャ・フィル タの内壁に固着するのを防止するために被膜を用いるときにさらに利点を与えろ 。

本発明の非常に明らかで重要な利点は、それを未凝結全面と担体溶液ならびに生 物学的物質を検定するのに使用できろことである。もう一つの利点は、本発明の 技術と装置を事実上すべての種類の免疫学的検定を行うのに使用できることであ る。

咽の中にある種のバクテリヤ抗原が存在する場合に試験するようなある種の検定 の場合には、医師は定量的測定にはまる１で興味がなく、定性的結果だけが意味 がある。例えば、心臓まひの場合のように、指示蛋白質が心臓外ひの重さのめや すとして血液の中で発見されるというような他の状況において、医師は、蛋白質 の存在と量の両方に関・し・がらり、従って定量的結果が重要である。例えば後 者の場合には、時間も１だ極めて重要であって、医師は処置を始めろ前に何時間 もまたは何日も何もしないで待つことはできない。

第５図に示されたキットは、医師または臨床試験所に低価格で非常に短時間の遅 延で少数の検査を行う非常に迅速で有効な装置を提供することで特に有益である 。台３０は、このキットの発明の便利な形では、一つの台が任意の設計のもので あってよいホールダ５２を受け、そのホールダが多数の容器管１０とプランジャ ・フィルタ・アセンブリ２０を保持しているキットを保持するように設けられて ｂる。特定の実施例においては、ホールダ３２には、ヰ本の容器管があって。

２本は、標準または基準として用いるものであり、あとの２本は、生物学的液に ついての検定を行うたり〕のものである。キットは１だ、普通、二つのプランジ ャフィルタを備え、一つは、標準捷た（ｄ基準のためのものであり、もう一つば 、検定のためのものである。好ましい実施例においては、基準の容器とプランジ ャ・フィルタ・アセンブリは、１２ａ、１２ｂ及び１２０において、例えば、緑 で示されているように色わけ金付けられ、一方抗原試験成分は第５図の１１１ａ 、１１１ｂ、及び１ｌｌｃに示されているように赤で色わけ全つけられている。

通常、二つ以上の多数の試薬分与器５１１．　ａと３１１１−１（普通は、試薬 ポンプ３６ａおよび３６ｂ’ｉ備えている）、も設げられている。これらは、１ ２ｄにおいて緑の色わけ全一そして１ｌｌｄ及び１ｌｌｅでは、赤全同様に色わ けとして付けろ才１ている。

使用時に真空供給源に取付けられる１対の真空カップ３８ａ及び３８ｂが連通導 管を介して管４ｏに接続されて、プランジャ・フィルタ・アセンブリから液体を 洗い落としたり除いたりするのに便利なように設けられている。

台う０は、恒久的でもまたは一時的でもよい。例えば、それは木または金属で作 ってもよいし、またはそれを厚紙またはスチロフォームで一時的に作ってもよい 。台は個々の容器管及びプランジャ・フィルタ装置を挿入できるか、または容器 管及びプランジャ・フィルタ・アセンブリの入っている３２のようなキット成分 を挿入できる多数の管受けを備えて因る。普通は、台はまた多数の試薬分与器を 備え、もちろん真空カップも備えている。この台は、例えば、その台が望むなら ば２．５またはそれより多くのキットを備えるための多数の管受は全備えてもよ いように多数のキラ）１備えるように設計してもよい。

狛に例としてだけ、そして全く制限的意味なしに、１５のテスト・ランを含むキ ラトラ用因る場合、各キットは多数のホールグを備え、各キットは第５図に示す ように適当な関係にある、例えば、６本の管をＩＭｉとしている。ボールダ３２ は、−人の患者の検定を行うのに必要な管すべてを含む。

第５図を参照すると、キット５２は、管及びプランジャ・フィルタを含み、１本 の管１０ａは、例えば緑に色わげを付けられ、標準対照全検定する清浄な試験管 である。別の色、例えば、赤に色わけされた第２の管１０ｂは、患者の血液また は他の液体を検定することになっている清浄な試験管である、全面の場合には、 管１０　ｂは真空容器形血液採集管であってもよく、このタイプは、普通血液試 料の採集に用いられる。

２０ａは適当な防腐剤のついた緩衝液の中に抗体ビードを入れたプランジャ・フ ィルタである。それは−重上１で満だされて、しっかりと蓋ヲサれている。

管２０ｂは、管２０ａが１２ｃのところに示したように緑で色わけされており、 管２０ｂが１ｌｌｃのところに示きれているように赤で色わけきれていることを 除けば、管２０ａと同一である。容器管１０ｃは、標準対照を最後に読取る清浄 な、緑色に色わけされた試験管である。管１０ｄは、それが液体検定を読取るた めに赤に色わけされていることを除けば、管１０ｃと同一である。キットの前述 の部分のほかに、このキットは、試薬分与器を備えるであろう。これらの分与器 は第２の抗体−酵素または対照僕準などの必要な貯蔵溶液が入っている。それら は、その中の溶液が赤い管もしくは緑の管、またはその両方に分与されるべきか どうかを示すための色わげをもっている。単に例示としてあげられる特定の実施 例においては、試薬分与器３１１ａは、緑と赤の両方の管に分与するように設計 され、一方試薬分与器３　ＩＩ　ｂは、赤い管にのみ分与する。

特定の検定の特定の必要を満たすために任意の数の色わけをしてもよいことは、 全く明らかである。

このキットはまた停止溶液の入っている点眼びんのような他の分与器全備えてい てもよい。例えば洗浄びんなどの余分のびん全キットの中に入れてもよい。

単に拶１１としてだけであるある特定の免疫学的検定を実行するときに、キット ホルダ５２の中の６本の管を台３０の中にある穴に挿入する。この台が一つ以上 のキラトラ受けるように作られていれば、その台の中に受けることのできる任意 の数のキットをそこに挿入してもよい。

患者の試料または検定ばれるべき他の生物学的液は、あらかじめ決められている レベル丑で管１ｏに加えられる。その代りに、管１０ｂが真空容器形血液採集管 であれば、その中の真空は、その検定に用いられろ血液の正確な量を収集するよ うなものであシ、その管にＥＤＴＡまたはヘパリンなどの凝固防止剤の適量を加 えるか、適量が存在している。

試薬は、色わけによって指示されるように、色わけによって指示された管１０ａ 及び１０ｂに吹き出される。管１０１）は、第２の抗体−酵素及び標準の両方を 受ける。管１０ｃは、第２の抗体−酵素だけを受ける。

二つのプランジャ・フィルタ２０ａ及び２０ｂが蓋をとられて、真空管受けにお かれ、ビードが乾燥するまで吸引される。次にプランジャを適当に色わけでれた 管ＩＱａ及びｌＯｂに挿入する。そうするときに、一方の管の中に血液または他 の生物学的溶成、そして他方の管に標準溶液がフィルタを通してプランジャ・フ ィルタの中に押上げられて、抗体ビードを再び浮遊させて反応を開始する。ビー ドは、アルブミンのような高密度担体物質を用いることを含む多数の異なる手段 のどれかによって、寸たは単に機械的に振動させることによって浮遊状態に保た れる。

通常、はんの１５または２０分である反応時間の終りに、プランジャは、管から 引抜かれて、任意の真空の源と流体を連通ずる関係に取付けられている真空受げ ３０ａ及び３０ｂの中におかれる。次に、管１０ａ及び１０ｂ（ｚ捨ててもよい 。次にプランジャ２０ａ及び２０ｂの中のビードを適当な洗浄溶液で洗浄するが 、その洗浄液は、キットの一部分として供給してもよく。

または単に実験室で入手できる標準貯蔵溶液であってもよい。この洗浄は、ビー ドに特に結合していない血球及び酵素を取除く。真空は、ビードとフィルタとを 通して洗浄溶液を吸引する。次に゛、プランジャ・フィルタを適当に色のついた 管１０ｃ及び１０ｄに挿入して、プランジャを所定の位置まで下ける。普通、所 定：　の量になっているが、必ずしもそうする必要はない顕色溶液が、次になさ れなければならない特定の免疫検定に従ってプランジャフィルタ内に導入される 。還元剤を用いれば、溶液の中の還元剤は、ビードから酵素を遊離して酵素がプ ランジャ・フィルタのフィルタを通過できるようにする。適当な時間ののちに、 プランジャは、これらの管から引出されて、それぞれの管１０ｃ及び１（ｌｄに 酵素金運んでいる顕色溶液を吸引する異字ヲ作る０次にプランジャを捨ててもよ い。次に管１０ｃ及び１０’ｄを目視色変化または分光測光的に捷たけ任意の他 の所望の検出手段によろいずれかで測定する。比色法における定性的相違を目ま たは比色計によって評価してもよい。通常、定量的差を光度計、ベータまたはガ ンマ計数器などの任意の適当な計器によって定める。管１０は、市販の光度計ま たは比色計のセル室内に直接に受けられる寸法と形状のものであってもよい。行 われようとする特定の免疫検定次第で、色変化、または他の検出反応全停止液に よって停止することができる。

大規模の実験室では、任意の特定の、または所望の形状の容器を受入れるように 設計これている比色計または光度計などの定量的読取り装置を構成することは、 十分に可能性のあることである。これは、ある実験室では便利であるが、もちろ ん本発明の一部分ではない。

産業的用途 本発明の装置と方法は、免疫学的検定のどのタイプのものでも行われているとこ ろならば、どこでも一般に産業的、研究的、科学的及び臨床的実験室において用 いるのに適している。本発明は非常に効率的で、高い感度を有し、低コストの免 疫検定技術と装置全提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の装置の基本構造の斜視図である。

第２Ａ図は、フィルタ、可動シール、プシンジャ・フィルタ管の底及び容器管を 含むプランジャ・フィルタの下部の構造の詳細を示す断面図である。

第２Ｂ図は、第２Ａ図に示したソールの別形実施例を示す。

第う図は、免疫学的成分の液体からビードへの抽出の間液体を含んだプランジャ ・フィルタの斜視図である。

第４図は、液体を取除いた同じプランジャ・フィルタで、ビードをフィルタに保 持している。

第５図は、本発明の考え方と原理を具体化するキットの斜視図である。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．　開放端と閉端とを有する円筒形容器管（１０）と、容器管（１０）の開放 端の中に受けられて容器管（１ｏ）の中で摺動できるプランジャ・フィルタ・ア センブリ（２０，２２，２１１及び２６）とを備え、前記プランジャ・フィルタ ・アセンブリ（２０゜２２．２１１及び２６）が、両端が開いている円筒管（２ ０）と、円筒管（２０）の基部端で固着されて、末端が容器管（１０）の開放端 の方に向って外側に伸びて訃り、容器管（１０）の内壁に対して移動でき、プラ ンジャ・フィルタ（２０，２２，２ＩＩ及び２６）の基部端と容器管（ｌＯ）と の間に事実上液密な可動シールを形成する可動ソール（２２）と、プランジャ・ フィルタ円筒（２０）の内部でそれの基部端を閉じているドーム形フィルタ（２ ｕ）であって、液体及びフィルタ（２１１）を通過できる粒子を除いて前記基部 端から物質を出入りさせる通路となるフィルタ（２１１）と、使用時に検定され るべき液体の選択された免疫学的に活性の成分に結合する免疫学的反応性ビード （２６）とを（至）え、前記免疫学的に活性なビード（２Ｇ）は免疫学的に活性 な成分で処理された多孔性表面を有してフィルり（２１１）を通過するには太き すぎることを特徴とする免疫検定装置。 ２　フィルタ（２１１）は血球のような非検定液体成分が自由に両方向に通過で きるのに十分に大きい孔であるが、なお、フィルタ（２１１）の片側に低速沈降 ビード（２６）を保持するに十分に小さい孔を含む特許請求の範囲第１項に記載 の装置。 ５　前記シール（２２）がプランジャ・フィルタ管（２０）の円周の回りに伸び て容器管（１０）の内壁と可動シール接触をするスカート（２２ｂ）と、プラン ジャ・フィルタ管（２０）の内側にしつかり受けられたスリーブ（２２ａ）とを 備え、スリーブ（２２ａ）の最上部がプランジャ・フィルタ管（２０）の内壁と ９０未満の角度で交さするほぼ平らな環状上部表面を形成するように構成されて 配置されている特許請求の範囲第１項または第２項に記載の装置。 ４　前記角度が約つぼでるる特許請求の範囲第う項に記載の装置。 ５　前記ビード（２６）が免疫学的分子及び顕色分子を排除するがそのほかの点 では浮力及び低速ビード（２６）沈降を助長するために最大の気孔率と最小の全 ビード寸法とを示す孔寸法をもつが、一方ではなおフィルタ（２４）の片側に保 持される特許請求の範囲第１．２、）または４項のいずれかに記載の装置。 ６　各りが大体円筒形である複数の容器管（１０）と、複数のプランジャ・フィ ルタ・アセンブリ（２０，２２，２４及び２６）とを備え、前記プランジャ・フ ィルタ・アセンブリ（２０，２２，２１１及び２６）の各々が両端の開いている 円筒管（２０）と、前記円筒管（２０）の基部端に付着され、末端が容器管（１ ０）の開放端の方に外側に伸びており、容器管（１０）の内壁に対して移動でき 、かつプランジャ・フィルタ（２０，２２，２１１及び２６）の基部端と容器管 （１０）との間に事実上液密な可動シールを形成する可動シール（２２）とプラ ンジャ・フィルタ円筒（２０）の基部端（２０）の内側でその基部端を閉じて前 記フィルタ（２＋１）を通過できろ液体と粒子を除いて前記基部端に材料を出入 りさせろ通路になる高い表面積フィルタと、使用時には検定されるべき液体の選 択された免疫学的に活性の成分に結合する免疫学的に反応性のビード（２６）を 含み、前々己免疫学的に活性など一ド（２６）が免疫学的に活性な成分で処理さ れた多孔質の表面を有し、前記フィルタ（２＋＋）を通過するには大きすぎるも のであり、 また試薬と洗浄溶液とのための複数の分与器（３１１ａ及び３　ｎ　ｂ　）とを 備えた免疫学的検定を行うキット。 ７　前記フィルタ（２１Ｉ）が血球などの被検定液体成分の２方向への自由な通 過を可能にするに十分に大きい孔であるが、なおフィルタ（２４）の片側に低速 沈降ビード（２６）を保持するに十分に小さい孔を備えた特許請求の範囲第６項 に記載の装置。 ８　前記シール（２２）が前記プランジャ・フィルタ管（２０）の円周の回りに 伸びて前記容器管（１０）の内壁と可動シール接触をするようになっているスカ ート（２２ｂ）と前記プランジャ・フィルタ管（２０）の内側にしつかり受入れ られるスリーブ（２２ａ）とを備え、前記スリーブ（２２ａ、　）の最上部がプ ランジャ・フィルタ管（２０）　ノ内ｉト９０未満の角度で交さするほぼ平らな 環状最上部表面を形成するように構成されて配置されてい゛ろ特許請求の範囲第 ６項または第７項に記載の装置。 ９　前記角度が約９０である特許請求の範囲第８項に記載の装置。 １０　前記ビード（２６）が免疫学的分子及び顕色分子を排除するが、他の点で は浮力及び低速ビード（２６）の沈降を助長するために最大の気孔率と最・」１ の全ビード寸法とを示す孔」法を泪するが、一方なおフィルタ（２１１）の片側 で保持される特許請求の範囲第６．７．８または９頂のいずれかに記載の装置。 １１　液体検定試料を所定の物理的形態で含む段階と、前記形状を通してフィル タ（２１，１）を押付けて前記フィルタ（２１＋）を通して液体試料を第２の形 態に押入れて免疫学的に反応性の部位を有する多数のビード（２６）と接触させ ろ段階と、 前記液体を所定の時間の間前記ビード（２６）と接触状態に保って前記ビード（ ２６）の上の前記免疫学的に反応性の個所と反応するように試料内の免疫学的成 分の反応を可能にする段階と、前記形状からフィルタ（２１１’）を引出してフ ィルタ（２１＋）を通る液体試料を第２の形態から強制的に離してビード（２６ ）との接触を離す段階と、ビード（２６）から残りの液体を溝浄する段階と、試 料からの免疫学的成分のビード（２６）の上の免疫学的に反応性の部位との反応 を判定する段階とからなる免疫検定法。 １２　前記判定段階がビードから免疫学的成分を除いて前記第２の形態になって いる液体に入れろ段階と、前記成分を指示薬と反Ｕと、させる段階と、第２の形 態になっている前記液体の中の指示薬の存在を試ネ１内の免疫学的成分の量の尺 度として判定する段階とを含む特許請求の範囲第１１項に記載の方法。