NO841835L - Immunoproeve-hurtigmetode og apparatur dertil - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår immunologiske metoder og apparaturer. Mere spesielt angår oppfinnelsen en spesiell teknikk og apparatur for gjennomføring av en immunologisk prøve på et fluid slik som et kroppsfluid, eller på et bærerfluid på hvilket den immunologiske komponent som skal påvises bæres.

Med fremskrittene i immunokjemien har det vært et økende

og i den senere tid akselerert behov for mere effektive og mindre kostbare metoder og teknikker for gjennomføring av immunoprøver. På mange områder i forbindelse med molekylær-biologi, biokjemi, biology" og genetikk, er det nødvendig å gjennomføre hundrevis eller sågar tusenvis av immunologiske prøver for å fastslå et enkelt resultat.

Ved klinisk behandling av immunologiske sykdommer og mangler, er det meget ønskelig å gjennomføre enhver nødvendig immunologisk prøve hurtig, rimelig og effektivt slik at man ikke bruker for mye tid for pasient og lege i forbindelse med store forsinkelser og gjentatte besøk. Det er i henhold til dette et sterkt behov for nøyaktigere, rimeligere,

enklere og mere effektive immunologiske prøveprosedyrer og apparaturer for anvendelse på legekontorer og i kliniske laboratorier. Et stort antall immunologiske detektormekani-smer, -teknikker og -materialer er utviklet i de siste tiår. Den nå klassiske radioimmuno-teknikk er fremdeles i utstrakt bruk, selv om den erstattes med andre teknikker som benytter ikke-radioaktive indikatorer. Enzymbundne immunoprøveteknikker som et eksempel og andre fotometriske, fluorfotometriske og kolorimetriske metoder kan også anvendes på spesielle typer immunologiske komponenter. Mens disse fremskritt har gjort den relativt hurtige og nøyaktige prøving av antigener og antistoffer heller gjennomførbare,

er det fremdeles behov for ennå nøyaktigere og samtidig rimeligere og effektivere apparaturer og metoder, både når det gjelder forskningslaboratorier og i det kliniske laboratorium.

Eksisterende immunoprøve-teknologier er hyppig så kompliserte eller tidskrevende at det kun er mulig å gjennomføre et meget begrenset antall prøver pr. dag. På den annen side kan i et klinisk laboratorium som et eksempel antall prøver som skal. kjøres i løpet av en spesiell dag ikke rettferdiggjøre en oppmontering og en drift av en apparatur for gjennomføring av prøven. Enkelte ganger under visse omstendigheter tillater man at pasientprøver samles opp inntil det er tilstrekkelig prøver til å rettferdiggjøre at laboratoriet gjennomfører prøvene. I mange kliniske situasjoner slik som f.eks.

ved mistanke om hjertesykdommer, er det ytterst ugunstig for pasienten hvis det er forsinkelser og lignende i forbindelse med prøveteknologien. Hurtig og nøyaktig prøving i et slikt tilfelle er av vesentlig betydning for pasientens helse.

Blant oppfinnelsens trekk er fremgangsmåter og apparatur

som helt ut eller i stor grad overvinner alle manglene ved den kjente teknikk..

I henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte blir et fluid

som inneholder den interessante immunologiske bestanddel, f.eks. et antigen, innført i en plungerfilterapparatur, karakteristisk men ikke nødvendigvis gjennom filteret,

og i kontakt med immunologisk bindende kuler som befinner seg i plungerfilteret. Disse immunologiske bindende kuler binder seg til den immunologiske bestanddel av interesse, f.eks. antigenet eller antistoffet, og ekstraherer det fra oppløsningen hvori bestanddelen bæres. Oppløsningen tvinges deretter til strømning ut av plungerfilteret, gjennom filteret, og etterlater kulene i plungerfilteret. Kulenevaskes for å fjerne overskytende fluid og for å holde tilbake kun den immunologiske bestanddel av interesse som er bundet til kulene. En fremkaller innføres i plungerfilteret som binder seg til den immunologiske bestanddel av interesse,f.eks. antigenet eller antistoffet. Overskytende fremkaller kan fjernes ved vasking, filtrering eller lignende. Til

slutt bestemmes den immunologiske bestanddel av interesse ved måling av fremkalleren i henhold til indikatoren som karakteriserer fremkalleren.

Som en apparatur omfatter oppfinnelsen en ny og forbedret plungerfilterapparatur inneholdende småkuler som binder valgte immunologiske aktive bestanddeler av fluidet som skal prøves, et beholderrør hvori plungerfilteret passer inn i bevegelig, men fluidtett forbindelse for å tillate fluid å tvinges gjennom filteret i begge retninger. Videre omfattet av apparaturen er et sett inkludert et antall slike elementer i forbindelse med hverandre i egnede beholdere for å tilveiebringe en apparatur som er total og tilstrekkelig for operatøren til å gjennomføre immunoprøver i henhold til oppfinnelsen.

I et mere spesifikk og ikke begrensende omfang kan oppfinnelsen beskrives som en immunoprøveapparatur omfattende et sylindrisk beholderrør med en åpen ende og en lukket ende, et plungerfilter som opptas i den åpne ende av beholderrøret og som kan gli i beholderrøret, idet plungerfilterelementet omfatter et sylindrisk rør som er åpen i begge ender, en bevegelig forsegling festet til den proksimale ende av det sylindriske rør, idet den distale ende strekker seg utover mot den åpne ende av beholderrøret, hvorved pakningen kan beveges i forhold til de indre vegger av beholderrøret og danne en i det vesentlige fluidtett, bevegelig pakning mellom den proksimale ende av plungerfilteret og beholderrøret,

et høyt overflateareal, med karakteristisk hvelvingsformet filter innvendig og lukkende den proksimale ende av plungerfiltersylinderen mot passasjen av materialet inn og ut av den proksimale ende bortsett fra fluider og partikler som kan passere igjennom filteret, og immunologiske reaktive kuler som i bruk avbinder utvalgte immunologisk aktive bestanddeler av fluidet som skal prøves, idet de immunologisk aktive kuler har porøse overflater behandlet med en immunologisk aktiv bestanddel og hvorved disse er for store til

å passere gjennom filteret.

I en foretrukket utførelsesform omfatter filteret porer

så store som mulig for å tillate fri toveispassasje av utprøvet fluid og dettes bestanddeler, slik som blodceller, mens porene fremdeles er små nok til å holde på plass kulene på den ene side av filteret uten tilstopping av dette;

hvorved filterpakningen omfatter et skjørt som i omkrets strekker seg rundt plungerfilterrøret i bevegelig pakningskontakt med den indre vegg av beholderrøret, samt en mansjett fast festet til det indre av plungerfilterrøret, hvorved toppen av mansjetten er slik konstruert og anordnet at det danner en generelt flat ringtoppoverflate som skjærer den indre vegg av plungerfilterrøret i en vinkel på ikke mer enn 9 0°.

Igjen er i en foretrukket form de immunologisk aktive kuler store nok når det gjelder den totale diameter til ikke å passere gjennom eller å tette filteret, men ellers så

små som mulig for å redusere deres avsetningshastighet for derved å akselerere prøvereaksjonene. I tillegg må

kulene ha små nok porer til å forhindre at antistoffer eller fremkallingsmidler trer inn i det indre av kulene;

på denne måte vil alle koplings- og reaksjonstrinn skje på den ytre overflate av kulene, noe som øker reaksjonstiden og reduserer bakgrunnsinterferens. Innenfor denne porestør-relsesbegrensning bør kuleporestørrelsen fremdeles være maksimal for å redusere kulenes spesifikke densitet, fordi dette reduserer avsetningshastigheten for kulene og akselererer prøvereaksj onstiden.

I en annen definisjon av oppfinnelsen beskriver denne en immunoprøveprosess omfattende å bringe en flytende prøve inn i en på forhånd bestemt fysikalsk konfigurasjon, å

tvinge et filter gjennom nevnte konfigurasjon for derved å tvinge væskeprøven gjennom filteret til en andre konfigurasjon i kontakt med et antall kuler med immunologisk reaktive seter; å holde væsken i kontakt med kulene i et på forhånd

bestanddeler i prøven med nevnte immunologiske reaktive seter på kulene; å trekke av filteret fra konfigurasjonen for derved å tvinge væskeprøven gjennom filteret ut av den andre konfigurasjonen ut av kontakt med kulene; vasking av restfluid fra kulene; å bestemme reaksjonen mellom de immunologiske bestanddeler fra prøven med de immunologiske seter på kulene.

I en foretrukket utførelsesform omfatter bestemmelsestrinnet

å fjerne immunologiske bestanddeler fra kulene til væsken i nevnte andre konfigurasjon, å omsette bestanddelene med en indikator og å bestemme nærværet av indikator i fluidet i den andre konfigurasjonen som et mål på mengden immunologisk bestanddel i prøven.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til

de ledsagende tegninger, der

Fig. 1 viser den prinsipielle konstruksjon av oppfinnelsens

apparatur;

fig. 2A er et tverrsnitt som i detalj viser konstruksjonen

av den nedre del av plungerfilteret inkludert filteret, den bevegelige pakning, bunnen av plungerfilterrøret

og beholderrøret;

fig. 2B viser en alternativ utførelsesform av pakningen

som vist i fig. 2A;

fig. 3 er et perspektiv riss av et plungerfilter med et

deri inneholdt fluid under ekstrahering av immunologisk

komponent fra fluidet til kulene;

fig. 4 er det samme plungerfilter, men med fjernet fluid

idet kulene er bibeholdt på filteret; og

fig. 5 er et perspektivriss av et sett som benytter oppfinnelsens konsept og prinsipp.

I den følgende beskrivelse vil oppfinnelsen beskrives ved hjelp av illustrasjoner med henblikk på en antigen-bestem-melses-immunoprøve. Diskusjonen er imidlertid kun for å illustrere konstruksjonen og bruken av apparaturen og metodens teknikker og trinn. Variasjoner vil være åpenbare for fagmannen. F.eks. skal det beskrives en teknikk for bestemmelse av et bundet enzym. Selvfølgelig kan immunofluore-scerende, RIA- eller andre teknikker så vel som ELISA-teknik-kene benyttes. Den nedenfor beskrevne antatte beste måte skal således kun ansees som et eksempel og ikke på noen måte begrense omfanget og rammen for oppfinnelsen.

Under henvisning til fig. 1 for en generell beskrivelse

av apparaturen omfatter denne et beholderrør 10 som karakteristisk har en konvensjonell sylindrisk form med rund bunn, ofte kalt et prøverør eller reagensrør. Hovedreaksjons-beholderen er en sylinder 20 hvortil det er festet en fjernbar pakning 22 som tetter rommet mellom røret 20 og beholder-røret 10 når det førstnevnte er innført i det sistnevnte. Reaksjonsbeholderen omfatter også et filter 24 og kuler

26 idet disse sistnevnte er bedre vist i fig. 3 og 4. Kombinasjonen av røret 20, pakningen 22 og filteret 24

som inneholder kulene 26 kalles her plungerfilter.

Konstruksjonen av pakningen 22 og filteret 24 er ikke uvesent-lig. Det henvises til fig. 2A for detaljer når det gjelder denne konstruksjonen.Pakningen 22 omfatter en innført mansjett 22a som er i fluidtett forbindelse mot det indre av røret 20, samt et skjørt 22b som strekker seg utover rundt omkretsen av røret 20 i kontakt med de indre vegger av røret 10 og danner en bevegelig, men fluidtett pakning mellom røret 20 og røret 10. Skjørtet er ettergivende og fortrinnsvis fremstilt av en elastisk gummi eller polymer.Mansjetten 22a er karakteristisk laget av det samme elastiske materialet og 22a og 22b er karakteristisk et enhetlig legeme, selv om dette ikke er vesentlig. Mansjetten 22a kan f.eks. være forholdsvis stivt og adhesivt eller på

annen måte festet til røret 20. Det er viktig at den øvre del av mansjetten 22 er anordnet slik at man forhindrer innfanging eller retensjon av partikler. I den spesielle viste utførelsesform er det funnet at når toppen av mansjetten 22b har rette vinkler eller omtrent rette vinkler fra veggen

av røret 20, er det ingen vesentlig innfanging av partikler.

En alternativ utførelsesform er vist i fig. 2B der mansjetten 22c har en øvre kant som skrår nedover og innover mot filteret 24. På tilsvarende måte er det ingen innfanging av partikler ved denne anordning. Under spesiell henvisning til fig.

2B er således vinkelen mellom den indre vegg av sylinderen 20 og toppoverflaten av skulderen på pakningen 22 90° eller mindre.

I tillegg er det vesentlig at den øvre kant av mansjetten

22 har en fast fysisk kontakt med filteret. Dette tillater at nedoverrettet sug kan legges på gjennom filteret, noe som kvantitativt kan fjerne alt fluid i filterplungeren.

Uten denne faste kontakt mellom mansjetten 22 og filteret

24 vil fluidlommer bibeholdes på mansjetten 22 på tross av alle sugeforsøk og vasketrinnene vil bli ineffektive.

I praksis har det vist seg at det rettvinklede forhold

mellom den indre vegg av sylinderen 20 og toppen av mansjetten av pakningen 22 er funnet å være mest fordelaktig, uansett om det er visse teoretiske fordeler å ha en vinkel på mindre enn 90°. I praksis tilveiebringer 90° vinkelen en sterk pakning, den kan monteres lett og forhindrer på gunstig måte innfanging av partikler.

Antistoffet som kovalent er koplet til kulene 26 anbringes

i plungerfilteret og holdes i dette selv om sug legges på nedover gjennom filteret fordi størrelsen av partiklene er slik at de ikke kan passere gjennom filteret. Et viktig filterkarakteristikum er at det har et høyt overflateareal, karakteristisk en hvelvet overflate for å tillate maksimal sugeeffektivitet selv når kulene trekkes ned sterkt mot filteret.

Apparaturen i sett-form omfatter de samme vesentlige komponenter med ytterligere komponenter som er hensiktsmessige ved gjennomføring av immunoprøven. Settet skal beskrives

Den prinsipielle immunologiske reaksjon i en eksempelvis utførelsesform skal beskrives nedenfor. Et antistoff med spesifisitet for et "prøveantigen" koples kovalent til kulene. Kulene hvortil antistoffet er koplet, holdes i plungerfilteret. Disse "antistoffkuler" resuspenderes under bruk i plungerfilteret i nærvær av de biologiske fluider eller andre fluider som skal prøves med henblikk på "prøveantigen". På samme tid eller deretter blir antistoffkulene inkubert i en oppløsning inneholdende et "andre antistoffenzym". Dette andre antistoffenzym har også spesifisitet for prøveantigenet og er i tillegg kovalent koplet til et enzym. Hvis prøveantigenet er tilstede i det prøvede biologiske eller et eventuelt annet fluid, vil det avbindes til begge antistoffer. Noe av prøveantigenet vil samtidig bindes til antistoffkulen og til det andre antistoffenzym.

På denne måte vil det andre antistoffenzym bindes til kulene og holdes på kulene gjennom den meget spesifikke immunologiske reaksjon. Antistoffkulene med antigenet og antistoffenzymet bundet dertil vaskes deretter ved hjelp av sug lagt på filterbasisen ved innføring av vaskeoppløsning til plungerfilteret og ved å trekke plungerfilteret opp som vist i figurene, i det sylindriske beholderrør 10 for å tvinge vaskeoppløs-ningen gjennom filteret. Til slutt blir kulene resuspendert i en "fremkallingssubstratoppløsning". Enzymet, koplet til det andre antistoffet, endrer substratet og resulterer i en fargeendring eller i et annet påvisbart fenomen. Fremkallingsoppløsningen vil ved den kolorimetriske metode forandre fargen på synlig måte eller eventuelt i det ultra-fiolette eller infrarøde området, og denne fargeendring kan påvises enten visuelt eller ved bruk av egnede ultra-fiolette eller infrarøde fotometriske instrumenter. For-andringen per se, utgjør en kvantitativ indikasjon på nærværet av prøveantigenet. Forandringsgraden i fremkallingsoppløs-ningen, f.eks. fargeintensiteten, bestrålingsintensiteten o.s.v., er en kvantitativ indikator på den mengde prøveantigen som foreligger i det utprøvede fluid.

Det skal være klart at den ovenfor angitte beskrivelse

er en tilpasning av et kjent antistoffenzymbundet immunoprøve til plungerfiltersystemet ifølge oppfinnelsen og er kun gitt som et eksempel.

Ved å ha et "første antistoff" tilstede på suspenderbare

små kuler i stedet for på flate overflater oppnås det hurtig en meget større tilgjengelig grenseflate mellom antistoffet og prøveantigenet. Fordi antistoffet mere hyppig vil "se" prøveantigenet, blir reaksjonstiden kortere og reaksjonen går lengre ved fullføring. Det er vist at hvis kulene holdes i suspensjon under inkuberingen, kan inkubasjonstider på under 15 minutter resultere i immunoprøver med en følsomhet på minst nanogram/milliliter. Det kan sammenlignes med immunoprøver som krever flere timer hvis det første antistoff kun bindes til en flat overflate.

Et annet viktig trekk er at sentrifugering helt og holdent unngås. Væsken kan evakueres fra plungeren ved sug, idet antistoffkulene holdes i plungerfilteret.

Filterplungere fremstilles idag for en enkelt klinisk bruk, samling av serum eller plasma fra pasientblod. Når blodet sentrifugeres, spinnes blodcellene ned på bunnen av røret og etterlater plasma-serum på toppen. Filterplungere innføres i rørene, stoppes kort fra blodcellene, noe som muliggjør at serum-plasma passerer inn i plungeren. Filteret forhindrer at koagulerte klumper og andre partikkelformige stoffer trer inn i plungere. Ingen av de idag fremstilte filterplungere er imidlertid egnet for prøving i henhold til oppfinnelsen. For å oppnå en prøve med høy sensitivitet, kort reaksjonstid og lav fargebakgrunn er betingelser for kulestørrelse og kuleporøsitet, filterporestørrelse, plunger-geometri og fluiddensitet under antistoff-antigen-reaksjonen meget vesentlig. I tillegg til at foreliggende oppfinnelse direkte immunoprøving av fullblod i motsetning til konvensjonelt prøvet serum eller plasma. Disse forskjellige aspekter ved oppfinnelsen skal diskuteres nærmere nedenfor.

Ved bruk av omhyggelig definerte filter- og kuledimensjoner er det mulig å prøve antikoagulert fullblod. Dette eliminerer en tidkrevende preparering av plasma eller serum fra blod. For å prøve fullblod blir plungere utstyrt med filtere

med en effektiv porestørrelse på 15-17 unt. Fordi vanlige blodceller er mindre enn 15 um i diameter, kan de passere fritt gjennom filtere til plungerfiltere som definerer reaksjonskammere for å begynne antistoff-antigen-reaksjonen og deretter passere fritt ut gjennom filteret ved slutten av reaksjonen, noe som etterlater antistoffkulene. Hemolysen er minimal.Antistoffkulene velges til å være tilstrekkelig større enn filterporene slik at de bibeholdes av og ikke tilstopper filteret. Det er funnet at kryssbundne dekstrankuler med en svellet diameter på 20-30 um, med svellet kuleporestørrelse som utelukker proteiner på over 30.000-70.000 Dalton, er heller egnet for.dette formål. Slike kuler er små og porøse nok til å forbli i det vesentlige i suspensjon uten mekaniske hjelpemidler under reaksjons-trinnene, i motsetning til kuler på 35 um eller derover.

Kuler med tilsvarende størrelse av polyakrylamid er også egnet for denne type prøving. Kuletypen som her defineres er kun nevnt som eksempel, andre kulekilder er også egnet.

For å gjennomføre en reaksjon optimalt på fullblod, er

det nødvendig med et filter med en porestørrelse akkurat stor nok til å la blodcellene passere fritt, men lite nok til å holde tilbake kulene som ikke er så små at de tetter igjen filteret, men i seg selv er så små som mulige til allikevel å kunne holdes tilbake i suspensjon under inkubering. Ved mindre enn optimale resultater kan selvfølgelig oppnås ved bruk av mindre kuler selv om en viss tiltetting kan oppstå eller med større kuler som har en tendens til avsetning med tiden, noe som krever omrøring, rysting eller andre hjelpemidler for å overvinne spesielle oppståtte mangler.

Kulene bør være porøse nok til å redusere kuleavsetningen for derved å akselerere prøvereaksjonen, men allikevel være små nok hva porestørrelsen angår til å forhindre antistoff- og fremkallermiddelmolekyler til å tre inn i kulene. Kryssbundne dekstrankuler med en svellet porestørrelse

som utelukker proteiner over 30.000-70.000 Dalton er egnet for disse formål, viser god brukbarhet mens de fremdeles utelukker større proteiner slik som antistoffer, fra sitt indre. Tilsvarende størrelsesgitte polyakrylamidkuler er også egnet og disse kuletyper er kun nevnt som eksempel. Denne omhyggelig definerte kulegeometri hva angår diameter

og porestørrelse er vesentlig for prøvens hurtighet og sensitivitet. Kuleporestørrelsen er liten nok til å sikre at alle immunologiske reagenser som koples til kulene er tilstede på den ytre overflate av kulene. Dette øker hastig-heten for prøvereaksjonen, fordi prøveantigenet ikke behøver å vandre inn kulene til grenseflaten med antistoff bundet til kulene. På den samme måte viser oppfinnelsens definerte kulegeometri meget mindre kuleavsetning i løpet av tiden enn tilfellet ville være med kuler med større diameter eller mindre porer, noe som i vesentlig grad øker prøvehurtig-heten. Til slutt utelukker porestørrelsen andre antistoff-enzym- eller fremkallingsmidler fra å tre inn i kulene. Større porede kuler slik som "Sepharose" tillater at andre antistoff-enzymer trer inn i kulene og forblir ikke spesifikt innfanget under vasketrinnet og forårsaker til slutt uønsket høy bakgrunnsinterferens under fremkalling. Den definerte kulegeometri ifølge oppfinnelsen utelukker denne kilde for prøvebakgrunnsinterferens.

I idag fremstilte filterplungere holdes filteret på plass

ved hjelp av en gummiringanordning. Hvis gummiringen vrir seg rundt filteret på innsiden av plungeren, forårsaker dette uønsket fluidretensjon, selv etter at det er lagt på et betydelig sug. Det er vist at ved å omforme gummi-ringene slik at filteret fritt rager ut godt over gummien inn i plungerfilteret, kan antistoffkulene eller andre immunologiske reagensbundne kuler suges helt tørre under vasketrinnet. Det er vesentlig at kulene suges helt tørre

under hver vasking hvis man ønsker å oppnå en kvantitativ utvasking av enzymet som ikke spesifikt er bundet til kulene. I henhold til oppfinnelsen er plungerne konstruert for

å oppnå dette. Dette er en vesentlig endring i plunger-konstruksjonen. I tillegg kan man ved å øke eksponert overflateareal av filteret i plungerfilterkonstruksjonen oppnå et meget mere effektivt sug. Uten denne konstruksjons-endring er det for alle praktiske formål umulig på effektiv måte å vaske små kuler.

Det er også funnet viktig at gummiringen har kontakt med

det indre av plungerfiltersylinderen i en vinkel på 90° eller mindre, dette under henvisning til vinkelen <t> i fig. 2A og 2B. Hvis kontaktvinkelen er mer enn 90°, oppstår det et hulrom der blodceller kan innfanges. Disse blodceller kan ikke helt fjernes under vaskingen og hemolyse kan for-årsake en meget sterk øket bakgrunn i det endelige fremkal-lingstrinn i prøven. Omforming av gummien for å gjøre den loddrett på kontakten med det indre av røret 20 eliminerer blodcelleinnfanging og overføring. Et alternativ, om enn noe mindre foretrukket, er å gjøre kontaktvinkelen mindre enn 90° .

Første trinns inkubering under hvilket antistoffkulene omsettes med prøveantigenet, skjer hurtigere hvis kulene jevnt er dispergert i inkuberingsfluidet. Det er derfor meget ønskelig å unngå avsetning av kulene. Dette kan oppnås ved å ryste, omrøre eller agitere plungerfilterapparaturen under reaksjonen. Dette kan skje for hånd eller automatisk ved hjelp av egnet utstyr. Ifølge oppfinnelsen unngås imidlertid også denne mangel ved omhyggelig å velge på forhånd kulestørrelse og porøsitet for å mini-malisere avsetning, men allikevel tillate kuleretensjon i filteret. I tillegg til dette har visse bærerstoffer stilstrekkelig densitet og har egnede ladningsegenskaper for på denne måte ytterligere å forhindre avsetning av antistoffkuler. Bærere slik som kasein og albumin er hensiktsmessige for mange prøver. Andre densitetsøkende bærere kan også benyttes. Det skal bemerkes at i prøver med fullblod er det lite eller intet behov for ytterligere bærer, fordi densiteten i blodet i seg selv vanligvis er tilstrekkelig høy til å forhindre avsetning eller i det minste å tilveiebringe meget lav avsetning av kulene.

Et ytterligere viktig trekk ifølge oppfinnelsen er anvendelsen av spaltbare kryssbindingsmidler for å kople det andre antistoff til enzymet. Dette tillater hurtig frigivelse av enzymet fra kulene ved innføring av et reduksjonsmiddel, under fremkalling, for å spalte enzymet fra antistoffet, noe som etterlater enzymet i oppløsning og i stand til å reagere med fremkallingsoppløsningen for å tilveiebringe farge- eller annet indikatorresultat. Frigivelse av enzymet til den flytende fase øker sterkt reaksjonshastigheten for fargereaksjonen og tillater at enzymet passerer gjennom plungerfilteret til et nytt avlesningsrør. I henhold til denne utførelsesform kan således den fremkalte oppløsning i plungerfilterrøret kvantitativt overføres fra plunger-filterrøret til et beholderrør, ganske enkelt ved å legge på vakuum gjennom filteret, og så å trekke fremkalt oppløs-ning inn i beholderrøret.

Det er andre viktige trekk ved oppfinnelsen også. Det

er vist at ikke-ioniske vaskemidler gir en mere total vasking av ikke-bundet enzym fra plungerfilterrøret, noe som resulterer i en lavere bakgrunn. Ikke-ioniske vaskemidler gir ikke enzymaktivitet eller antigen-antistoff-reaksjoner under vasketrinnene. I tillegg fremmer de lyse og fjerning av blodceller holdt tilbake i plungeren. Noen ganger opptrer det skumming når ikke-ioniske vaskemidler benyttes. For stor skumming kan forhindres ved å tilsette små mengder antiskummingsmidler. Antiskummingsmidler har vist ikke å påvirke enzymaktiviteten under vasketrinnet .

Belagte plungerfilteroverflater er også funnet å være for delaktige. Belegging av overflaten med polytetrafluor-etylen, "Teflon", silikonsmøremidler, akryliske smøremidler eller andre forskjellige belegg, endrer egenskaper på den indre overflate av plungerfilteret og kan resultere i mindre klebing av kulene til de indre vegger av plungerfilteret. Slike behandlinger reduserer også uønsket klebing av det andre antistoff-enzym, noe som så reduserer bak-grunnen.

Den foregående teknikk er generelt anvendbar på biologiske fluider av i det vesentlige av enhver type. Teknikken kan også anvendes på andre fluider og på andre typer bio-prøver, noe som vil være klart for fagmannen. F.eks. kan hvis det er ønskelig å eksudater, sekreter, fekalstoffer o.s.v., lett mulig å tilpasse teknikken til dette. Et mykt, inert, lett sammenpressbart materiale slik som silikon-skum eller et gjenoppløselig kalsiumalginatmateriale, f.eks. anbrakt■på en fjernbar plast- eller papp"prøve"pinne, strykes over området som skal prøves slik som farynks, rektum, hvoretter pinnen deretter løsnes fra svampen som så slippes i en egnet dimensjonert beholder. Plungeren inneholdende antistoffkuler presses så mot prøverøret så langt som mulig, mens svampkulen med kraft trykkes ned. Når fluidet dekker svampballen, kan denne "pumpes" noen ganger. Ved sterk sammenpressing en eller flere ganger blir det biologiske fluid trykket ut av kulen og deretter ført med oppløsningen gjennom filteret til plungerfilteret. Når prøven kjøres på en slik type materialer i stedet for fullblod, kan filter-porøsiteten være meget mindre enn 20 um og kulestørrelsene tilsvarende mindre, noe som resulterer i en lavere kuleavsetning.

Teknikken ifølge oppfinnelsen kan som nevnt ovenfor anvendes på i det vesentlig enhver type immunoprøve. F.eks. kan den benyttes for å gjennomføre immunosammenligningsprøver.

Mens antistoffkuler har vært benyttet i en viss tid i immuno logiske prøver (se f.eks. Richman, Douglas D, et al., "The Binding of Staphylococcal Protein A By the Sera of Different Animal Species", Journal of Immunology, vol. 12 8, nr. 5, 1982), antas plungerfilterkonstruksjonen og den teknikk som er beskrevet ovenfor å være helt ny og meget fordelaktig i forhold til all kjent teknikk. Plungerfilterapparaturen ifølge oppfinnelsen er helt ny og dens bruk som system for prøving uten radioaktivitet og på enkel måte å eliminere flere trinn er også ny. Spesielt er prøvemetodens brukbarhet med henblikk på å redusere reaksjonstid med timer et nytt konsept og nytt i denne teknikk. Som beskrevet ovenfor er den eksisterende plungerteknologi så vel som reagenser og prøvebehandling sterkt forbedret for å oppnå de spesielle resultater med høy sensitivitet, hurtig reaksjonstid, anvende-lighet, lave omkostninger og lav bakgrunnsfremkalling.

Oppfinnelsen som beskrevet ovenfor inkluderer et antall fordelaktige trekk. Det første er anvendelsen av et enzym-tilknyttet prøveopplegg i et plungerfiltersystem, noe som gir ekstremt høy sensitivitet sammenlignet med lave omkostninger og høy effektivitet i løpet av kort tid. Den tilsiktede bruk av antistoffkuler i stedet for et antistoff på

en flate fase for å øke reaksjonsoverflatearealet akselererer reaksjonstiden. Kombinasjonen av anvendelse av kuler med plungerfiltersystemet reduserer ytterligere den nødvendige tid i en prøve. En avveining av de nødvendige egenskaper for filteret og kulene for å redusere kuleavsetning under inkubering i prøven forkorter i sterk grad inkuberingstiden med store og uventede fordeler i forhold til den kjente teknikk. Det tilsiktede valg av langsomt avsettende kuler med porer små nok til å forhindre inntrengning av et fremkallingsmiddel, f.eks. et andre antistoff-enzym, og for å fremme møte mellom antigen og fremkallingsmiddel, har også vist seg å være en meget stor fordel, noe som reduserer tiden og øker sensitiviteten for prøven. Konstruksjonen av plungerfilteret for å eliminere fluid og selvretensjon er også ansett som et meget viktig trekk ved oppfinnelsen. Effektivt vaskesug kan ikke legges på plungerfilteret ved

de kjente teknikker.

Disse trekk inkluderer eventuell anvendelse av et spesifikt densitetsøkende middel, slik som albumin, for å holde kulene i suspensjon. Det reduserbare kryssbindende enzym i det andre antistoff-enzym-konjugat er også meget fordelaktig, slik at enzymet kan frigis fra kulene, og fargefremkalling eller annen fremkallingsreaksjon kan skje i et rent rør,

noe som også er av betydning. Bruken av ikke-ioniske vaskemidler og antiskummingsmidler er en ytterligere fordel ved anvendelse av et belegg for å forhindre klebing av kulene til de indre vegger av plungerfilteret.

En meget distinkt og viktig fordel ved foreliggende oppfinnelse er at den kan benyttes for å prøve fullblod, ukoagulert blod, annet blod og bæreroppløsninger, så vel som biologiske stoffer. En annen fordel er at teknikken og apparaturen ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å gjennomføre i det vesentlige enhver type immunologisk prøve.

For visse prøver slik som utprøving av nærværet av en viss type bakterielt antigen i strupen, er legen ikke interessert i noen kvantitativ utmåling, et kvalitativt resultat er tilstrekkelig. I andre situasjoner, f.eks. når det gjelder hjertemangler der et indikerende protein vil finnes i blodet som et mål på angrepets alvorlighet, er legen interessert både i nærværet av og mengden av proteinet, og således er kvantitative resultater viktige. I det sistnevnte tilfellet er tiden også en ekstremt viktig faktor og legen kan ganske enkelt ikke vente i mange dager eller timer før behandlingen påbegynnes.

Det sett som er vist i fig. 5 er spesielt fordelaktig for

å kunne gi legen eller det kliniske laboratorium en meget hurtig og effektiv apparatur for å gjennomføre små antall prøver til lave omkostninger i løpet av meget kort tid.

Det tilveiebringes vanligvis en sokkel 30 for å holde settet som holdes av en holder 32 og som kan ha en hvilken som helst konstruksjon og som holder et antall beholderrør 10 og plungerfilterelementer 20. I en spesiell utførelsesform inkluderer holderen 32 fire beholderrør, to for bruk for standarder eller referanser og to for gjennomføring av prøvingen av det biologiske fluid. Settet omfatter karakteristisk også to plungerfiltere, et for en standard eller referanse og et for prøven. I en foretrukket utførelsesform er referansebeholderene og plungerfilterne fargekodet som vist ved 12a, 12b og 12c, f.eks. i grønt, mens antigen-prøvekomponentene er fargekodet i rødt som vist ved 14a,

14b og 14c i fig. 5. Et antall, vanligvis to eller flere, reagensdispensere 34a og 34b, vanligvis utstyrt med en reagenspumpe 36a og 36b, også tilstede. Disse er fargekodet på samme måte med en grønn kode ved 12d og en rød kode ved 14d og 14e.

Et par vakuumbeholdere 38a og 38b, forbundet gjennom en forbindende rørledning til 40, i bruk tilkoplet en vakuum-anordning, er tilveiebrakt for hensiktsmessig vasking og fjerning av væsker fra plungerfilteret.

Basisen 3 0 kan enten være permanent eller temporær. F.eks. kan den bestå av tre eller metall eller den kan være temporær, fremstilt av papp eller styroskum. Basisen har et antall mottakerhull inn i hvilke enten individuelle beholderrør og plungerfilterelementer kan innføres eller inn i hvilket et sett slik som 32 og som inneholder beholder-rørene og plungerfiltere, kan innføres. Denne basis vil også karakteristisk sørge for et antall reagensdispensere og, selvfølgelig for vakuumbeholderen. Basisen kan være konstruert for å inkludere et antall sett, f.eks. kan basisen inkludere et antall mottakere for å ta imot to, tre eller flere sett etter ønske.

I bruk inneholder som et eksempel og ikke på noen måte begrensende, hvert sett et antall holdere, hvert f.eks.

med et sett på seks rør, slik som f.eks. vist i fig. 5. Beholderen 32 vil inneholde alle rørene som er nødvendig til å gjennomføre en enkelt pasientprøve.

Under henvisning til fig. 5 der settet 32 inkluderer rør

og plungerfiltere er et rør 10a fargekodet f.eks. grønt,

og er et rent prøverør der standardkontrollen gjennomføres. Det andre rør 10b, fargekodet med en annen farge, f.eks. rødt, er et rent prøverør der pasientens blod eller et annet fluid prøves. Når det gjelder fullblod, kan røret 10d være et blodprøvesamlerør av typen "vacutainer", den type som konvensjonelt benyttes ved blodprøvetaking.

20a er et plungerfilter inneholdende antistoffkuler i en buffer med et egnet preserveringsmiddel. Det er fylt til toppen og lukket tett.

Røret 20b er identisk med røret 20a, bortsett fra at røret 20a er fargekodet grønt som vist ved 12c og røret 20b er fargekodet rødt som vist ved 14c. Beholderrøret 10c er et rent, grønnfargekodet prøverør der standardkontrollen til slutt avleses. Røret 10d er identisk med røret 10c, bortsett fra at det er fargekodet rødt for avlesning av fluidprøven. I tillegg til den foregående del av settet vil det videre inneholde reagensdispensere. Disse dispensere vil inneholde de nødvendige lageroppløsninger slik som det andre antistoff-enzym eller kontrollstandarder.

De vil ha fargekoder for å indikere hvorvidt oppløsningen skal avgis til røde rør eller til grønne rør eller til begge deler. I den spesielle utførelsesform som kun er et eksempel, er reagensdispenseren 34a konstruert til å avgi til både det grønne og det røde rør, mens reagensdispenseren 34b kun gir til de røde rør. Det skal være klart at et hvilket som helst antall fargekoder kan benyttes for å tilfredsstille de spesielle behov for enhver spesiell prøve.

Settet kan også inkludere andre dispensere slik som en øyedråpeflaske som inneholder en stoppoppløsning. Ekstra-flasker, f.eks. en vaskeflaske, kan også være inkludert i settet.

Ved gjennomføring av en spesiell immunologisk prøve, dette

kun som et eksempel, blir de seks rør i settholderen 32 innført i hulrommet i basisen 30. Hvis basisen er tilpasset til mottak av mer enn et sett, kan et hvilket som helst antall sett som kan mottas i basisen innføres i denne.

Pasientprøven eller et annet biologisk fluid som skal prøves, tilsettes til røret 10b opp til et nivå som kan bestemmes på forhånd. Hvis alternativt røret 10b er et blodprøvetakings-rør av vakuumtypen, vil vakuumet i dette være slik at man samler den nøyaktige mengde blod som forbrukes i prøven, hvortil et egnet volum av et antikoaguleringsmiddel, slik som EDTA eller heparin, er tilstede eller tilsettes.

Reagenser sprøytes så inn i røret som antydet ved farge-kodingen 10a og 10b. Røret 10 mottar både et andre antistoff-enzym og en standard. Røret 10c mottar kun det andre anti-stof f -enzym . De to plungerfiltere 20a og 20b åpnes, anbringes i vakuum-mottakerne og kulene suges tørre. Plungerne innføres deretter i de riktig fargede rør 10a og 10b. I og med dette blir blodet eller den andre biologiske oppløsning i et rør samt standarden i det andre tvunget opp gjennom filteret i plungerfilteret, antistoffkulene blir resuspendert og reaksjonen initiert. Kulene holdes i suspensjon på en hvilken som helst egnet måte inkludert anvendelse av høydensitetsbærere slik som albumin, eller ganske enkelt ved mekanisk rysting eller røring.

Ved slutten av reaksjonstiden som vanligvis er kun ca.

15 eller 20 minutter, blir plungerne trukket av fra rørene og anbrakt i vakuumbeholderne 30a og 30b, koplet i fluid-forbindelse med en hvilken som helst vakuumkilde.Rørene

10a og 10b kan deretter kasseres. Kulene i plungerne 20a og 20b vaskes deretter det ønskede antall ganger med en egnet vaskeoppløsning som kan tilveiebringes som en del av settet eller ganske enkelt være en standard lageroppløsning tilgjengelig i laboratoriet. Vaskingen fjerner blodceller og enzymer som ikke spesifikt er bundet til kulene. Det pålagte vakuumsugevaskeoppløsningene gjennom kulene og gjennom filteret. Så blir plungerfiltrene deretter innført i de riktig fargekoderør 10c og 10d og plungerne innføres ned til den på forhånd bestemte posisjon. Fremkallings-oppløsningen, i en vanligvis på forhånd bestemt mengde,

selv om dette ikke er nødvendig, føres deretter inn gjennom plungerfilteret i henhold til den spesielle immunoprøve som skal gjennomføres. Hvis det benyttes et reduksjonsmiddel, frigjør reduksjonsmidlet i oppløsningen enzymet fra kulene og tillater enzymet å passere gjennom filteret i plungerfilteret. Etter et visst tidsrom ble plungerne trukket ut av disse rør, noe som gir et vakuum som suger fremkallings-oppløsning som bærer enzymet inn i de respektive rør 10c og 10d. Plungerne kan deretter kasseres. Rørene 10c og 10d måles deretter, enten ved visuell fargeforandring eller ved spektrofotometri, eller på en hvilken som helst annen egnet måte. Kvalitative kolorimetriske forskjeller kan måles visuelt eller ved en egnet apparatur. Kvantitative forskjeller vil vanligvis bestemmes ved hjelp av et hvilket som helst egnet instrument slik som f.eks. et fotometer,

en b- eller y-teller o.s.v.Rørene kan være av en hvilken som helst størrelse og konfigurasjon for opptak direkte i cellekammerne i kommersielt tilgjengelige fotometere eller kolorimetere. Avhengig av den spesielt gjennomførte immunoprøve kan fargeforandringen eller en annen påvisnings-reaksjon fastholdes ved en'stoppoppløsning.

I store laboratorier er det helt mulig å konstruere en kvantitativ avlesningsinnretning slik som et kolorimeter eller et fotometer som er konstruert for å ta imot beholderrør av en hvilken som helst spesiell eller ønsket konfigurasjon. Dette er hensiktsmessig i visse laboratorier, men selvfølge-lig ikke en del av oppfinnelsen.

Apparaturen og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er tilpasset bruk i industrielle, forsknings-, vitenskapelige og kliniske laboratorier rent generelt der enhver type immunologiske prøver gjennomføres. Oppfinnelsen tilveiebringer meget effektiv, meget følsom og meget rimelig gode immunoteknikker og -apparaturer.

Claims (12)

1. Immunoprøveapparatur, karakterisert ved at den omfatter: et sylindrisk beholderrør (10) med en åpen ende og en lukket ende ; et plungerfilterelement (20, 22, 24 og 26) mottatt i den åpne ende av beholderrøret (10) og glidbart i dette; idet plungerfilterelementet (20, 22, 24 og 26), omfattende et sylindrisk rør (20) som er åpent i begge ender, en bevegelig pakning (22) fast festet til den proksimale ende av det sylindriske røret (20), den distale ende ragende utover mot den åpne ende av beholderrøret (10), hvorved pakningen (22) er bevegelig med henblikk på de indre vegger av beholder-røret (10) og dannende en i det vesentlige fluidtett, bevegelig pakning mellom den proksimale ende av plungerfilteret (20, 22, 24 og 26) og beholderrøret (10), et hvelvingsformet filter (24) innvendig i og avlukkende den proksimale ende av plungerfiltersylinderen (20) mot passasjen av materialet inn og ut av nevnte proksimale ende bortsett fra fluider og partikler som kan passere gjennom filteret (24), og immunologisk reaktive kuler (26) som i bruk binder utvalgte immunologisk aktive bestanddeler av fluidet som skal prøves, idet de immunologisk aktive kuler (26) har porøse overflater behandlet med en immunologisk aktiv bestanddel, idet kulene ikke er for store til å passere gjennom filteret (24).

2. Apparatur ifølge krav 1, karakterisert ved at filteret (24) har porer store nok til å tillate fri toveispassasje av prøvede fluidbestanddeler slik som blodceller, men porer allikevel små nok til å holde tilbake langsomt avsettende kuler (26) på en side av filteret (24).

3. Apparatur ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at pakningen (22) omfatter et skjørt (22b) som strekker seg i omkrets rundt plungerfilterrøret (20) i bevegelig pakningskontakt med den indre vegg av beholderrøret (10) og en mansjett (22a) fast opptatt i plungerfilterrøret (20), hvorved toppen av mansjetten (22a) er slik konstruert og anordnet at den danner i det vesentlige flat ringtoppoverflate som skjærer den indre vegg av plungerfilterrøret (20) i en vinkel på ikke mer enn 90°.

4. Apparatur ifølge krav 3, karakterisert ved at vinkelen er ca. 90°.

5. Apparatur ifølge kravene 1 til 4, karakterisert ved at kulene (26) har en porestørrelse som utelukker immunologiske og fremkallingsmolekyler, men på den annen side sikrer maksimal porøsitet og minimal total kulestørrelse for å fremme flyteevne og lav kule-(26)avsetning, med samtidig tilbakeholding på en side av filteret (24).

6. Sett for gjennomføring av en immunologisk prøve, karakterisert ved at det omfatter: et antall beholderrør (10), hvert av hvilke generelt er sylindriske; et antall plungerfilterelementer (20, 22, 24 og 26), hvert av hvilke omfatter et sylindrisk rør (20) som er åpen i begge ender, en bevegelig pakning (22) fast festet til den proksimale ende av det sylindriske rør (20), idet den distale ende strekker seg utover mot den åpne ende av behol-derrøret (10), hvorved pakningen (22) er bevegelig i forhold til de indre vegger av beholderrøret (10) og danner en i det vesentlige fluidtett, bevegelig pakning mellom den proksimale ende av plungerfilter (20, 22, 24 og 26) og beholderrøret (10), et filter med høyt overflateareal (24) innvendig og lukkende den proksimale ende av plungerfiltersylinderen (20) for passasje av stoff inn og ut av den proksimale ende bortsett for fluider og partikler som kan passere gjennom filteret (24), og immunologisk reaktive kuler (26) som i bruk binder valgte immunologisk aktive bestanddeler fra fluidet som skal prøves, idet de immunologisk aktive kuler (26) har porøse overflater som er behandlet med en immunologisk aktiv bestanddel og er for store til å passere gjennom filteret (24); og et antall dispensere (34a og 34b) for reagens- og vaske-oppløsninger.

7. Apparatur ifølge krav 6, karakterisert ved at filteret (24) inkluderer porer store nok til å tillate toveispassasje av prøvede fluidbestanddeler slik som blodceller, men porer fremdeles små nok til å holde tilbake langsomt avsettende kuler (26) på en side av filteret (24 ) .

8. Apparatur ifølge krav 6 eller 7. karakterisert ved at pakningen (22) omfatter et skjørt (22b) som strekker seg i omkrets rundt plungerfilterrøret (20) i bevegelig pakningskontakt med den indre vegg av beholderrøret (10), og en mansjett (22a) fast opptatt innvendig i plungerfilterrøret (20), idet toppen av mansjetten (22a) er slik konstruert og anordnet at den har en generelt flat ringformet toppoverflate som skjærer den indre vegg av plungerfilterrøret (20) i en vinkel på ikke mer enn 90° .

9. Apparatur ifølge krav 8, karakterisert ved at vinkelen er ca. 90°.

10. Apparatur ifølge kravene 6 til 9, karakterisert ved at kulene (26) har en porestørrelse som utelukker immunologiske og fremkallende molekyler, men på annen måte manifesterer maksimal porøsitet og minimal total kulestørrelse for å fremtvinge sveveevne og langsom kule(26)avsetning, fremdeles holdt tilbake på en side av filteret (24) .

11. Immunoprøvingsprosess, karakterisert ved at den omfatter: å inneholde en flytende prøve i en på forhånd bestemt fysikalsk konfigurasjon; å tvinge et filter (24) gjennom nevnte konfigurasjon for derved å tvinge den flytende prøve gjennom filteret (24) inn i en andre konfigurasjon i kontakt med et antall kuler (26) med immunologisk reaktive seter; å holde væsken i kontakt med nevnte kuler (26) i et på forhånd bestemt tidsrom for å tillate reaksjon mellom immunologiske bestanddeler i prøven og nevnte immunologisk reaktive seter på kulene (26); avtrekking av filteret (24) fra konfigurasjonen for derved å tvinge flytende prøve gjennom filteret (24) ut av den andre konfigurasjon, ut av kontakt med kulene (26); vasking av restvæske fra kulene (26); bestemmelse av reaksjonen av immunologiske bestanddeler fra prøven med de immunologisk reaktive seter på kulene (26) .

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at bestemmelsestrinnet omfatter: å fjerne immunologiske bestanddeler fra kulene til væske i nevnte andre konfigurasjon, omsetning av nevnte bestanddeler med en indikator, og bestemmelse av nærværet av indikator i nevnte væske i den andre konfigurasjon som et mål på mengden immunologiske bestanddeler i prøven.