JPS6033087B2 - 免疫賦活剤及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はホルヘニシンを有効成分とする新規な免疫賦活
剤に関するものである。

ホルヘニシンは、梅沢等が放線菌培養液中より単離、採
取した物質でアルカリ フオスフアターゼの強力な阻害
剤として知られ、ホルヘニシンは腹腔内注射でマウスに
毒性を示さず、その５０％致死量は５００の３／ｋ９以
上である。

さらにホルヘニシンは次式で表わされる化合物であると
認められている（特顔昭４９−１班１６号：特開昭５０
一１１６粥５号）。

本発明者はホルヘニシンの医薬としての有用性について
更に種々検討した結果、ホルヘニシンが免疫賦活作用を
有することを見出した。従って、本発明は、次式 で表わされるホルヘニシン又はその薬理上許容し得る塩
又は水加物を有効成分とする免疫賦活剤を要旨とする。

本発明の免疫賭活剤におけるホルヘニシンは、その薬理
上許容し得る塩、またはその化合物の水加物、または水
加物の塩のいずれであってもよい。ホルヘニシンの薬理
上許容し得る塩には、そのホルヘニシンのカルボキシレ
ートとしてのアルカリ金属塩、アルカリ士類金属塩、等
及びトリアルキルァミン塩、並びにアミノ基の所での酸
付加塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩
、トリフルオロ酢酸塩、等がある。

本発明の免疫賦活剤は適切な投与方法で使用され、一注
射剤を調製する場合は、上記主薬にｐＨ調整剤、緩衝剤
、安定化剤、賦形剤などを添加してもよく、さらに常法
により凍結乾燥を行い、凍結乾燥注射剤を作ることがで
き、また主薬にｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張剤
、局麻剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内
用注射剤を作ることもできる。固型製剤を調製する場合
は、主薬に通常の賦形剤、安定化剤、さらに必要に応じ
て結合剤、崩壊剤、糟沢剤、着色剤、橋味剤、鰭臭剤な
どを加えたのち常法により錠剤、被覆錠剤、額粒剤、散
剤、カプセル剤等を作ることができる。

ホルヘニシンと間体担体又は液体担体との割合は、調製
した経口投与し得る製剤の形に応じて適当に選択し得る
が通常１：１〜１：１０の重量比であることができる。
ホルヘニシンの投与量は症状により異なるが、通常、成
人に対する１回投与量は、ホルヘニシンとして０．０２
Ｍ〜２００の９で、１日１回あるいは症状により１日１
回以上投与するのがよい。

次にホルヘニシンの免疫応答に対する作用を実験例をも
って示す。

【１ー 抗体産生に対する作用 ■ マウスに於ける抗体産生に対するホルヘニシンの効
果羊赤血球１び個をマウスに静脈注射して免疫を施し、
同時にホルヘニシンを１地、１００ムタ、１０仏夕及び
１ムタを腹腔内注射して４日後、マウス碑細胞中の抗体
産生細胞数をＪｅｍｅの方法に準じて算定し、ホルヘニ
シンの抗体産生に対する作用を検討した。

その結果、表１に示すようにホルヘニシンの１の９・１
００山夕、および１０Ａ夕の腹腔注射は抗体産生細胞数
を増加させ、本物質が抗体産生促進作用を有することが
明らかにされた。表−１ ＠ マウス碑細胞培養による抗体産生に対するホルヘニ
シンの効果次にＭｉｓｈｅｌｌ、Ｄｕ他ｎの方法に準じ
、ＣＤＦ，マウス碑細胞培養による羊赤血球に対する抗
体産生系への影響について、培養開始時にホルヘニシン
を１ムタ、０．１〃夕、０．０１ムタ、０．００１山夕
及び０．０００１ムタ添加して４日間培養し、培養細胞
中の抗体産生細胞数を測定して、これを検討した。

その結果、表２に示すようにホルヘニシン０．１〜０．
００１ムタの添加で勝細胞培養に於いても抗体産生の促
進を示した。表−２ 次に培養の各時間にホルヘニシン０．００１仏夕を添加
して、その影響を検討した。

表３に示すようにホルヘニシンは培養開始時の添加で明
らかな抗体産生促進を示したが、培養開始２独特間後、
４糊時間後及び７幼時間後の添加では抗体産生に対する
影響が見られず、本物質が抗体産生に関与する細胞群の
うちマクロフアージに作用している可能性が示唆された
。表−３ ‘２１細胞性免疫に対する作用 Ｌａｇａｎｇｅらの方法に準じて羊赤血球を抗原として
惹起される遅延性過敏症（ＤＴＨと略記）を細胞性免疫
の指標としてホルヘニシンの作用を検討した。

羊赤血球１ぴ個をＣＤＦ，マウス（雄性、１０週齢）後
肢右足藤に皮下注射して免疫を施し、４日後、左足藤に
１ぴ個の羊赤血球を皮下注射して反応を誘起し、２少時
間後左足藤の腫脹の程度を／ギスで測定してその効果を
検討した。

ホルヘニシンは１００仏夕、１０ムタ、１山夕及び０．
１山夕を免疫時、又は誘発時に腹腔内在射した。その結
果は表４に示すように、ホルヘニシン１００ｒ夕〜１山
夕の投与はＤＴＨの成立を増強させ、さらに誘発時の投
与でも増強がみられた。免疫を施さないマウス足藤皮下
への本物質の単独投与は何等、起炎的作用を示さないこ
とから、本物質が細胞性免疫に対しても強い免疫増強作
用のあることが明らかにされた。表 ４ （注１）腹隆内投与 ‘３１ ホルヘニシンの実験動物移植腹場に対する効果
■ Ｌ−１２血珍楯に対するホルヘニシンの効果１び個
のＬ−１２１晩曲砲をＣＤＦ，マウス（１０週齢）に静
脈注射するとマウスは１１〜１２日で全身に転移を示し
白血病死するが、細胞にホルへニシンを１ムタ混和して
これを静脈注射したものでは１０匹中４匹が６０日以上
の延命を示した。

その試験結果を表５に示す。ホルヘニシンの１‐仏夕を
１び個のＬ−１２１０細胞と混じ、３７０、１時間培養
しても細胞毒性はみとめられない。表‐５ 延命率＝（無処処理薄幸雲平均均死死亡亡雷数数Ｘ・〇
。

）−・〇。＠ Ｇａｒｄ脂ｒｌｙｍｐｈｏｍａ固型種糠
に対するホルヘニシンの効果Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスに移植
継代されているＣａｒｄｎｅｒｌｙｍｐｈｏｍａ細胞１
『個をＣ３Ｈ／Ｈｅマウス鼠磯部皮下に移植し、ホルヘ
ニシン１００山夕／マウスを０日から５日まで１日１回
腹腔注射し、３０日後腫湯を摘出して質量を測定し、ホ
ルヘニシンの効果を検討した。

その結果を表６に示す。ホルヘニシン投与群では無処理
対照群に比して種場の増楠が６６．８％まで抑制された
。表 ６ ※ 腫湯細胞移植後５日間毎日投与 ホルヘニシンは細胞毒性のない物質であり、本物質の腫
湯に対する上記の効果は、宿王を仲介している反応によ
るものと考えられる。

これらの実験例からホルヘニシンが担溝生体に於ける免
疫不全、腫湯の免疫療法及び転移阻止に有用性であるこ
とが明らかである。さらに免疫不全が原因と考えられる
疾病、たとえばリウマトィド、多発性硬化症、勝原病、
甲状腺炎、全身性紅斑性狼損などに用いることができる
。本発明の免疫賦活剤について実施例を示せば次の通り
である。

実施例 １ ホルヘニシン１夕を蒸留水に溶解してｌ０００の‘とし
、常法により除菌したのちに２泌ずつバィアルに分注し
、凍結乾燥した。

本剤は使用に際し、蒸留水で希釈溶解して注射液とする
。で表わされる化合物を原料としたホルヘニシを製造す
る新規方法を確立した。

すなわち、次式 で表わされる化合物を酸化することから成るホルヘニシ
ンの製造法を今回開発した。

本法では、原料化合物〔１〕のヒドロキシメチル基をア
ルデヒドへ酸化することによりホルヘニシンが製造され
るが、その際、化合物〔１〕のアミノ基は通常保護した
形で酸化反応が行なわれるのが好ましい。

アミン基の保護基としては、酸化反応後、保護基を除去
する際に、その条件下でホルヘニシンが分離されない保
護基であればすべて使用できる。たとえばｔ−ブチルオ
キシカルボニル基などの如きアルコキシカルボニル基は
好ましい保護基である。本法で用いられる酸化剤として
は芳香族ヒドロキシメチル基をアルデヒドへ酸化する公
３句の酸化剤、たとえば活性二酸化マンガン、クロム酸
、四酢酸鉛、四酸化ルテニウム、二酸化セレン、ハロゲ
ンなどが使用され得る。

使用できる溶媒は酸化反応に不溶性な有機溶剤例えば塩
化メチレン、酢酸であり、使用される酸化剤が水溶性で
あれば水も用い得る。反応は通常、室温で行われるが加
温してもよい。酸化反応後、常法にしたがって保護基を
除去することによりホルヘニシンは製造されるが、保護
基を除去する前に、酸化物は常法にしたがって単離、採
取されるが、特に単欧することなく保護基を除去する反
応を行なうこともでき、保護基を除去したのち特願昭４
９−１処１６号明細書（椿公昭５７−７？１５号公報参
照）に記載のホルヘニシンの精製法、たとえばＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｃ一２５＊＊（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社製、スウェーデン）などを用いて精製
、単離することができる。なお、本法で用いる原料化合
物〔１〕の調製方法の概略を反応チャートに表わすと次
のとおりである。

なお式中Ｒ，はアルキル基、特に低級アルキル基、また
Ｒ２、Ｒ３は水素またはアルキル基、特に低級ァルキル
基を表わす。この原料化合物〔１〕の調製実例は、本出
願人の同日出願に係る侍豚昭５２一１０８９３６号（免
疫賦活作用を有する新規化合物及びその製法と用途）明
細書（特公昭５７−６１２６５号公報参照）に記載され
てある。

次に前述した方法によるホルヘニシンの製造例を参考例
として示す。

参考例 １ ‘ａ） アミ／基の保護工程。

式〔１〕の化合物３７９の９に水５の‘、トリェチルア
ミン０．４２の‘を加えて溶解し、ｔ−ブチルＳ−４・
６ージメチルピリジン−２ーイルチオールカーボネート
５２８のｏを５Ｍのジオキサンに溶解して、これに加え
、室温で２幼時間反応した。

反応液に３０の‘の水を加えて希釈したのち、未反応の
カーボネートを１０私の酢酸エチルで２回抽出して除去
しーついで水層を００に冷却し、１規定塩酸を用いて舟
２．０に調節した。この反応液より生成物を１０の‘の
酢酸エチルで５回抽出し、油出液を合わせ、１回水洗し
たのち減圧下に溶媒を留去して淡黄色粘楓生成物６７２
の９を得た。残笹に塩化メチレンを加え、生じた白色沈
澱を炉取し、塩化メチレンで洗って真空乾燥すると白色
粉末４３６凧９力ミ得られた。この白色粉末は化合物〔
１〕のアミノ基がｔ−ブトキシカルボニル基で保護され
た形の誘導体であって、次式で表わされる化合物である
。

ｍｐ．１４３〜１４５００ 赤外線吸収スペクトル： し帯墓支 ３５２５・３２２５・３０８〇・２９９〇・
２７４〇・２６２５、１７３５、１６５０、１５９５、
１５０５、１４８７、１４３５、１４０５、１３７５、
１３００、１２５０、１２３０、１２１０、１１９０、
１１６５、１１２０、１０６０、１０斑、９８０、９２
リ８６０、８３い ８０ふ ７８い ７２０ ６９５核
磁気共鳴スペクトル（６０ＭＨｚ、重メタノール溶液） ６吉総：１．４３（班、ｓ）、５１０（ＩＨ、ｓ）、６
６７（が、ｓ）、６．斑（ＩＨ、ｄ）、６．８９（ＩＨ
、ｄｄ）、７．２９（ＩＨ、ｄ）。

‘ｂー 酸化工程 参考例１‘ａ）にしたがって製造された化合物（ロ）６
０のりを酢酸０．５の‘に溶解し、氷冷下、酸化クロム
（Ｗ）ーピリジン錆体（ｃｏｉｌｉｎｓ試薬）２５０風
を加え、０００、５分間、ついで室温で１時間反応した
のち減圧乾固した。

残澄に３０の‘の水と５の‘のブタノールを加えて溶解
し、５叫のブタノールで４回抽出後、ブタノール層を合
し、５叫の水でブタノール層を１回水洗したのち、減圧
下にプタノールを留去した。得られた残笹にトリフロロ
酢酸１の‘を加え、室温で３０分反応した（脱保護）の
ち減圧乾固した。

残澄に水を加え、不溶物を炉別し、炉液をＳＰ−Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｃ−２５（日十型、ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社製、スウェーデン）を充填した１０の
‘のカラムを通過させ、さらに水で溶出した。ホルヘニ
シンの溶出された分画を集め、減圧下に濃縮し、真空乾
燥して微黄色微結晶１２の９を得た。この結晶のアルカ
リフオスフアターゼに対する阻害活性はＩＣ別＝０．７
５ｒタ′の‘を示した。

ｍｐ．＞３０００赤外線吸収スベクトル レ総；：２９６０、２９００ ２８３０、２６４０、１
６６５、１６５０、１６２リ１斑０、１５２０１５００
１４３０、１３９０、１３７０、１３５ｉ１３１０、
１２９０１２７ふ１２３５、１２０５、１１６０、１１
５０、１１２８、１０４５、９５０、９１０、９０５、
８６５、８０ふ ７９ふ ７３５ 総０核磁気共鳴スペ
クトル （１０帆伍ｚ、重トリフロロ酢酸溶液） ６蛇島：５．５１（ＩＨ、ｓ）、７．２〜７．５（汎）
、７．９１（ＩＨ、ｄ）、１０．０２（ＩＨ、ｓ）。

参考例 ２ 参考例１‘ａーにしたがって製造された化合物〔Ｄ〕１
１９のｏを１８の【の酢酸エチルに溶解し、活性二酸化
マンガン１．５夕を加えて、室温で４時間反応した。

反応終了後、二酸化マンガンを炉別し、二酸化マンガン
は３０瓜‘の水−メタノール（１：１）混液、ついで３
０泌のメタノールで洗い、炉液と洗液を集め、減圧乾固
した。銭澄をトリフロロ酢酸１のＺに溶解し、室温で３
０分反応した（脱保護）のち減圧乾固した。得られた残
澄に１０机の水を加え、ＳＰ一Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−
２５（参考例１脚に同じ）を５０の‘充填したカラムに
吸着し、水で溶出し０た。溶出液を２０戊商ずつ分画す
ると、分画６〜１０に次式で表わされる化合物〔ｍ〕が
、分画１８〜２９にホルヘニシンが、分画３０〜４８に
化合物〔１〕が溶出された。

それぞれの分画を集め、減圧濃縮し、真空乾燥して化合
物〔ｍ〕５８２、ホルヘニシン乳雌、化合物〔１〕１１
のｏを得た。このようにして得られたホルヘニシンのア
ルカリフオスファターゼに対する阻害活性はＩＣｏ＝０
．０５７ムタ′の‘であった。

理イ乙学的性状は参考例１‘ｂ’で得たホルヘニシンと
全く同一であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるホルヘニシン又はその薬理上許容し得る塩
   又は水加物を有効成分とする免疫賦活剤。