JPS60156333A - オピンシンタ−ゼ遺伝子を用いた選別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 過去１０年のうちに２種々の起源からＤＮＡを取り出し
て組み換えＤＮＡ分子へ組み継ぎ、そのＤＮＡ分子を異
なる種の原核および真核生物に導入することが可能にな
った。このことは、生物学の歴史において最も興奮させ
る革命をおこした。この研究の大部分においてバクテリ
ア、カビ、動物が使われてきた。それに比べて、植物は
まず、無視されてきた。なぜなら、適当なベクターが手
に入らなかったからである。最近、多くの有効なベクタ
ーが得られるようになってきたが、それらは。

そのままの状態では種々の起源の遺伝子の植物への導入
および発現に用いるのに有効ではない。本発明は、植物
の遺伝子操作において自然に存在する植物ＤＮＡベクタ
ーの有用さを増加するいくつかの新発見に関している。

本発明の技術分野は、植物中で発現させたい外来ＤＮＡ
の形質転換ベクターへの挿入（すなわち。

ＤＮＡの植物細胞への導入および植物内での保持が可能
であるプラスミド）を含む。この形質転換ベクターによ
って導入された外来遺伝子を有する植物細胞は、外来遺
伝子を有する正常な形態へ再生するのに用いる。理想的
な状況にお（１ては、これらの外来遺伝子は植物の再生
に続く減数分裂を通して保持されるべきである。

植物の遺伝子操作の目標は、植物に望みの遺伝子を導入
し、正しい時期に希望する組織で機能させることである
。このような植物の遺伝子操作のための最も見込みのあ
るビークル（ｖｅｈｉｃ’ｌｅ）は。

アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）のＴ
ｉプラスミドと、アグロバクテリウム・リゾゲネス（紅
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のＲｉプラスミドを用いてし）
る。多くの研究者が２毛根病（（：ｏｓｔａｎｔｉｎｏ
、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、・（１９８０）　Ｇｅｎｅ　旦：
　７９−８７）を゛引き起こす土壌細菌アグロバクテリ
ウム・リゾゲネス（Ａ、穂ｎ匹皿亜）を用いてきた。形
質転換された植物の組織はプラスミド由来のｐＮＡ配列
を有し、その組織はアグロピンに似ているオピンを合成
する（Ｃｈｉｌｔｏｎ。

Ｍ−Ｄ、＋　ｅｔ　ａ’１．　（１９８２）　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　Ｌｏｎｄｏｎ　２男池４３２−４３４、　Ｗｈ
ｉｔｅ、　Ｆ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、八、、７ヨ９　：　３
１９３−３１９７）。アグロバクテリウム・リゾゲネス
（Ｌ負■■叩亜）の優れている点の一つは、クラウンゴ
ール腫瘍と違って形質転換された組織が極めて容易に高
濃度のオピンを含む小植物に再生することである。

それに加えて、特定の外来ＤＮＡ断片は、すでに、アグ
ロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａ、ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｃｅ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域
へ挿入されている（Ｌｅｅｍａｎｓ＋　Ｊ、　ｅｔ　ａ
ｌ。

（１９８１）　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、上
：　１４９−１６４；　Ｏｏｍｓ。

Ｇ、ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｌａｓｍｉｄ　７　
：１５−２９）。標準的なインビトロ組み換えＤＮＡ技
術を用いて９選ばれた制限断片がクローン化したＴ−領
域に横たわる特定の制限部位へ挿入された。得られたプ
ラスミドを野性型のＴｉプラスミドをもつアグロバクテ
リウム・チューメ７７シエンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｃｅ）株に導入後、２つのプラスミド間の相同部位
組み換えによりＴ領域に外来ＤＮＡを持つＴｉプラスミ
ドが作成された。外来ＤＮＡを含む組み換えＴｉプラス
ミドを持つアグロバクテリウム・チューメファシエンス
（／Ｉ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）を感染させて腫瘍
を作成させた（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ＋　Ｄ、Ｊ、　ｅｔ
　ａｌ、（１９８１）Ｃｅｌｌ　２７：１４３−１５３
　；　Ｏｏｍｓ、　Ｇ、Ｂｔ　ａｌ、’　（１９８１）
Ｇｅｎｅ　１４：３３−５０　；　Ｈｅｒｎａｌｓｔｅ
ｅｎｓ、　Ｊ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ。

（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｌｏｎｄｏｎ　２８７
　：６５４−６５６）。

形質転換ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）に外来遺
伝子を保持させ、Ｔ−ＤＮＡ領域の植物ゲノムへの導入
により安定的に植物細胞に導入することができる。これ
らのベクターは単細胞やプロトプラストを形質転換でき
るはずである。そのような形質転換は次に示すいくつか
の方法によりなされている＝　（ｉ）バクテリアのスフ
二ロプラストとプロトプラストとの融合（Ｈａｓｅｚａ
ｗａ、　Ｓ、財ａ１．　（１９８１）　Ｍｏ１．　Ｇｅ
ｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８２：２０６）　；　（ｉｉ）
完全なバクテリアによる部分的に再生した細胞壁をもつ
プロトプラストの形質転換（Ｍａｒｔｏｎ＋　Ｌ。

ｅｔ　ａｌ、（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｌｏｎｄ
ｏｎ　２７７　：　１２９−１３１）　；（ｉｉｉ　）
ポリエチレングリコールと塩化カルシウム存在下で遊離
ＤＮＡとしてＴｉプラスミドをプロトプラストに専大す
る（Ｗｒｅｎｓ、　Ｐ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、（１９Ｂ２
）Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｏｎｄｏｎ　２９虹７２−７４）、
あるいはリポソームに包括した形でのＤＮＡとして導入
する（Ｄｒａｐｅｒ。

Ｊ、ｅｔ　旦、（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　
Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２３　：２５５）。

これらの方法を用いる場合２選択指標を手に入れる必要
がある。抗生物質耐性の指標を用いることが考えられる
が、遺伝子工学の商業的応用にこのような耐性遺伝子を
蔓延させるのは好ましくない。腫瘍を形成した形質転換
細胞は概して避けられるべきである。なぜなら、そのよ
うな腫瘍組織から植物を再生させることが困難な場合が
あるからである。腫瘍形成を避ける一つの方法として。

腫瘍を引き起こすことはできないが、Ｔ−ＤＮＡの植物
ゲノムへの挿入ができるような不完全なＴｉプラスミド
を用いる方法がある（Ｌｅｅｍａｎｓ、　Ｊ。

旦　ａｔ、（１９８２）　［！ＭＢＯ，Ｊ、　１　：　
１４７−１５２）。

要約すると３本発明の技術分野は、植物のゲノムへの外
来遺伝子の導入において最大の効率を持ち、かつ必要に
応じていつでも植物ゲノムにおいて増幅されうる植物形
質転換ベクターの構成である。これらの植物形質転換ベ
クターは所望の組織で所望の時期にこれら外来遺伝子の
最大の発現を与えるはずである。

（発明の背景） 双子葉植物のクラウンゴール病はグラム陰性土壌細菌ア
グロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａ、ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｃｅ）の感染により起こる。Ａ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ株の植物細胞を形質転換し、
腫瘍を誘導する能力は、巨大な１コピーのプラスミド（
Ｔｉプラスミド（１４０〜２３５　ｋｂ）　）の存在と
関係する。

植物細胞の形質転換は遺伝情報の導入により起こる。す
なわち、　Ｔｉプラスミドから植物細胞の核へ（７）Ｔ
−ＤＮＡの移行である。一度この導入がなされるとバク
テリア（細胞は形質転換の維持にもはや必要ない（Ｃｈ
ｉｌｔｏｎ、　Ｍ−Ｄ、、　Ｄｒｕｍｍｏｎｄ、　Ｍ、
）１．ｔＭｅｒｌｏ、Ｄ、Ｊ、、５ｃｉａｋｙ、Ｄ、＋
　Ｍｏｎｔｏｙａ、Ａル、＋　Ｇ　ｏ　ｒ　ｄ　ｏ　’
　＋Ｍ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ　（１
９７７）　Ｃｅ１ｌ　１１　：　２６３−２７１）。

導入されたＴ−ＤＮＡにより宿主においてオピン合成の
ような表現型が観察されるようになる。

最も初期のオピンはアミノ酸とケト酸の縮合から生じる
ものと同定されている（Ｇｏｌｄｍａｎ、　Ａ、、　Ｔ
ｅｍｐｅ。

Ｊ、ａｎｄ　Ｇ、　Ｍｏｒｅｌ　（１９６８）　Ｃｏｍ
ｐｔ、　Ｒｅｎｄ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（Ｐａｒｉｓ）　１６２　：　６３０−６３１）。上記
のように、植物の腫瘍は原因となるバクテリアがいなく
なっても成長し、オビンを合成する。オクトピンシンタ
ーゼ（リソピンデヒドロゲナーゼとも呼ばれる）は分子
量３８．０００〜３９，０００の一本のポリペプチド鎖
であり、そしてピルビン酸とアルギニン、ヒスチジン。

リジンあるいはオルニチンとの縮合を、ＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨを補因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ　）として
用いて、触媒する（Ｈａｃｋ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｄ
、Ｋｅｍｐ　（１９８０）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ
、６５　：　９４９−９５５）。二番目のグループのオ
ビンは約４０，０００の分子量のポリペプチド鎖４本か
らなる４量体のツバリンシンターゼにより生産される。

これもまた、ＮＡＤＨあるいはＮＡ（）ｐＨが補因子と
して用いられる。しかし、このケト酸はα−ケトグルタ
ル酸であり、このアミノ酸はアルギニンあるいはオルニ
チンである（Ｋｅｍｐ、　Ｊ、Ｄ、。

５ｕｔｔｏｎ、　Ｄ、Ｗ、　ａｎｄ　Ｅ、Ｈａｃｋ　（
１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８　：　３７
５５−３７６０）。後に２例えばオクトピンを合成し腫
瘍を誘発するＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅの特別な株
がオクトピンを単一の炭素および窒素源として使用しう
ろことが示された（Ｍｏｎｔｏｙａ、　Ａ、Ｌ、＋　Ｃ
：ｈｉｌｔｏｎ＋Ｍ、Ｄ、＋　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｍ、Ｐ
、　５ｃｉａｋｙ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｅ、Ｗ、　Ｎｅ５
ｔｅｒ（１９７７）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２
９　：　１０１−１０７）。別のオピンカ同定されティ
る（Ｆｉｒｍｉｎ、　Ｊ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｇ、　Ｒ。

Ｆｅｎｗｉｃｋ　（！９７８）　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｌｏ
ｎｄｏｎ　２’７６　：　８４２−８４４）。

このオピンはアグロピンであり、アミノ酸と糖との間の
縮合によりできる（Ｃｏｘｏｎ＋　Ｄ、　Ｔ、＋　Ｄａ
ｖｉｅｓ。

＾０Ｍ、Ｃ，＋　Ｆｅｎｗｉｃｋ、　Ｇ、　Ｒ，＋　５
ｅｌｆ、　Ｒ，Ｆｉｒｍｉｎ、　、ｒ。

Ｌ、＋　Ｌｉｐｋｉｎ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｎ、　Ｆ、　
Ｊａｍｅｓ　（１９８０）　Ｔｅｔｒａｈｅｌ＋Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ　２１　：　４９５−４９８）。

Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｔｉプラスミドから植物の核へ導
入されるＤＮＡ）は一つのＴｉプラスミド群から別のＴ
ｉプラスミド群に変化する。このオクトピンＡ型のプラ
スミドは２片のプラスミドＤＮＡを植物細胞へ一緒にあ
るいは別々に導入する（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ。

Ｍ、　Ｆ、、　Ｎｕｔｔｅｒ、　Ｒ，、’Ｍｏｎｔｏｙ
ａ＋＾−Ｉ−、ＩＧｏｒｄｏｎ、　Ｍ。

Ｐ、　ａｎｄ　Ｅ、　Ｗ、　Ｎｅ５ｔｅｒ　（１９８０
）　Ｃｅ１ｌ　１９ニア２９−７３９）。

一方の約８×１０６ダルトンの片は１コピー／細胞の頻
度で常に腫瘍に存在する。しかし、もう一方の約５Ｘ１
０６ダルトンの片は存在しない場合もある。存在すると
きの頻度は３０コピー／細胞である。

該２片は該Ｔｉプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ地
図上で共直線上にあるが、別々の単位として宿主植物の
核に組み込まれる。それに反して、ツバリン型のプラス
ミドはＴｉプラスミドＤＮＡの一つの大きな片（約１０
　Ｘ　１０６ダルトン）を導入する。

そして、これは１〜２０コピー／腫瘍細胞の頻度で維持
される（ｌｌｏｌｓｔｅｒｓ、　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、プラ
スミド３　：　２１２−２３０）。

導入されたＴ−ＤＮＡは形質転換された植物細胞の染色
体ＤＮＡに組み込まれ（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ、　Ｍ。

Ｆ、旦　虹、（１９８０）前出）、そしてポリＡ含有ｍ
　ＲＮ　Ａへ広い範囲にわたって転写される（Ｇｕｒｌ
ｅｙ。

Ｌ　Ｂ、、　Ｋｅｍｐ、　Ｊ、Ｄ、、　Ａｌｂｅｒｔ、
　Ｍ、　Ｊ、、　５ｕｔｔｏｎ、Ｄ。

Ｗ、ａｎｄ　Ｊ、Ｃｏ１１ｉｎｓ　（１９７９）　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６　：　１２７３−１２７７　；　Ｍ
ｃＰｈｅｒｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，、ｅｔａｌ、（１９８
０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
、Ｓ、Ａ、　７互２６６６−２６７０）。この転写の一
部分はオピンシンターゼをコードしている（Ｋｏｅｋｍ
ａｎ＋　Ｂ、　Ｔ、ｅｔ　ａｌ。

（１９７９）　Ｐｌａｓｍｉｄ　２　：　３４７−３５
７）。

Ｔ−ＤＮＡを有する腫瘍細胞は、培養中、漠然と保持さ
れ得る。さらに、正常な植物細胞と違って、腫瘍細胞は
、オーキシンとザイトカイニン（植物成長ホルモン）を
欠く化学合成培地上で成育することができる（Ａ、　Ｃ
，Ｂｒａｕｎ　（１９５８）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、」虹：
　３４４）。変異Ｔｉプラスミドを用いて２次に示すよ
うな機能的遺伝子の配置を明らかにすることができる：
（ｉ）Ｔ−ＤＮＡにおいて、腫瘍の形態とオピンの合成
を決定する場所；　（ｉｉ　）　Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａの外
にあり、病毒性に必要な場所；そして（ｉｉｉ　）腫瘍
化に関して目立った効能を持たない領域（ｎｏｌｓｔｅ
ｒｓ＋　Ｍ、ｅｔ　ａｌ。

（１９８０）　Ｐｌａｓｍｉｄ　３　：２１２−２３０
　；　ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ、　Ｈ。

叶　旦、（１９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：２３５
−２４８　；　Ｏｏｍｓ。

Ｇ、ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｌａｓｍｉｄ　７　
：１５−２９）。

（以下余白） オクトピンＴｉプラスミドを有するＡ、ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｃｅ株により引き起こされる多くの腫瘍のＴ−Ｄ
ＮＡの遺伝的機構は研究されてきた（Ｍｅｒｌｏ、　Ｄ
、　Ｊ。

ｅｔ’　ａｌ、（１９８０）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇ
ｅｎｅｔ、　１７７：６３７−６４３；Ｄｅ　Ｂｅｕｃ
ｋｅｌｅｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｍ
ｏ１．　Ｇｅｎ。

においては、Ｔ−ＤＮＡは２つの部分として表れる。Ｔ
−ＤＮＡの左端はＴＬと呼ばれｔｍｓ（ｔｕｍｏｒ　□
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　５ｈｏｏｔ　（腫瘍　形態　芽
ばえ）、ｔｍｒ（ｔｕｍｏｒ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　
ｒｏｏｔ　（腫瘍　形態　根）　、　ｔｍｌ（ｔｕｍｏ
ｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｌａｒｇｅ　Ｃ腫瘍　形態　
大〕）そして２時々、　’　ｏｃｓ　（オクトピンシン
ターゼ）を含む。一方、右端は’ｒＲ，！：呼ばれる。

腫瘍の維持にはＴＬが必要だがＴＲは必要ではない。野
性型オクトピンＴｉプラスミドによりｍｍされた形質転
換細胞は次の２つの方法により選別されてきた。

（ｉ）該組織は腫瘍を形成できなければならない；そし
て、（ｉｉ）植物ホルモンを欠くインビトロで成育でき
なければならない。野性型Ｔｉプラスミドを用いたとき
の深刻な問題は、腫瘍組織から完全植物を再生させるの
が非常に困難であるということである。

形質転換した組織培養から植物を再生させるために、ｔ
ｍｓ、ｔｍｒおよびｔｍｌの場所の変異を得ることがで
きる。しかしながら、そうするといくつかの形式の選別
の必要性などにより形質転換されていない細胞から形質
転換された組織を識別するのが困難となる。選別の一つ
の形式は、Ｔ−ＤＮＡへの抗生物質耐性遺伝子の挿入に
より行われてきた（Ｕｒｓｉｃ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、
（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ５．１０１　：
　１０３１）　（Ｊｉｍｉｎｅｚ、　Ａ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ
ｏｆｆ）　２８７　：　８６９）（ＪｏｒＨｅｎｓｅｎ
、　Ｒ，＾、　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）　Ｍｏ１．　
Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１７７　：　６５）−一つは抗生物質Ｇ
４１Ｂ　（培養中のタバコ細胞に対して毒性がある）に
対する耐性をＴ−ＤＮＡへ取り込ませることであり、２
番目には、バクテリアのトランスボッ゛ンＴｎ５　（カ
ナマイシン耐性を付与する）をＴ−ＤＮＡへ取り込ませ
ることである。形質転換された植物組織を見つけるため
にこの型の選別法を用いるのは、不必要に抗生物質耐性
遺伝子を蔓延させるという点について不利である。この
ような抗生物質の蔓延は。

もしそのような選別がＴｉプラスミドベクターを通して
の遺伝子導入の農業商業的応用に用いられたとすれば、
非常に重大な事になるであろう。もしそのような選別が
Ｔｉプラスミドの正常な成分を利用するものであるなら
、そのような形質転換されていない植物組織から形質転
換された植物組織を区別する別の方法が特に望まれるで
あろう。

植物の遺伝的変化を含むすべてのプログラムにおいて１
重要な外来ＤＮＡは形質転換ベクターに挿入されねばな
らない。すなわち、そのベクターとは植物細胞にＤＮＡ
を安定に導入できるプラスミドである。形質転換ベクタ
ー法により導入された外来遺伝子を有するこれらの植物
細胞は生態学的に正常な植物への再生に利用できる。理
想的な場合、変化した植物はそれらの種子を通して外来
遺伝子を伝達するべきである。

目下のところ最も有用な形質転換ベクターは。

アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）の感
染によりそのＴｉプラスミドから植物ゲノムへ導入され
組み込まれるＴ−ＤＮＡ断片である。しかしながら、も
し野性型のＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅを用いると植
物はクラウンゴール′をつくり、かつそのようなりラウ
ンゴール組織から完全な植物を再生することば難しくな
る。腫瘍遺伝子（ｔｍｓ、ｔｍｒあるいはｔｍｌ）中に
変異のあるものを用いると、植物の再生は実用的な比率
で起こるが形質転換組織の選別が困難になる。選別法は
、Ｔ−ＤＮＡに抗生物質耐性遺伝子を挿入することによ
り再び確立することはできるが、この方法はすでに述べ
た理由により望ましくない。

後述の“本発明をより詳細に説明する項”で述べられる
研究が完成された後に、　Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ
軒　１．　（Ｖａｎ　Ｓｉｏｇｔｅｒｅｒ＋＋　Ｇ、　
Ｍ、、　Ｓ、　（１９８２）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、　１　：　１３３−１４２）はホモアルギニン
は正常な細胞に比べて形質転換された細胞に対して毒性
が低いことを報告した。ホモアルギニンはオクトビンシ
ンターゼの基質であるけれども（Ｏｔｔｅｎ。

Ｌ、Δ、　Ｂ、　（１９７９）　Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅ
ｓｉｓ、　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＬｅｙｄｅｎ、　Ｎｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓ　；　Ｐｅｔｊｔ、　Ａ、　ｅｔ　
ａｌ、（１９６６）Ｃｏｍｐｔ、　Ｒｅｎｄ、　Ｓｏｃ
、　Ｂｉｏｌ、　（Ｐａｒｉｓ）　１６０　：　１８０
６−１８０７）　、別の実験において我々はホモアルギ
ニンの使用によっては形質転換細胞の選別はできなかっ
た。オクトビンシンターゼを有する組織を、他のクラウ
ンゴールあるいは正常な組織と比較して。

ホモアルギニンによる選別を調べてみると選別性が非常
に小さいか皆無であった（第１図）。これら私たちの別
個の結果によると、アミノ酸アナログを用いて形質転換
組織および細胞を選別することは成功しそうには思えな
い。

（発明の要約） 本発明は、八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｃ’ｅのＴｉプラスミドからの独特のＴ−ＤＮ
Ａ構成を用いて。

新植物中に発現用の外来遺伝子を導入させ、そして元の
ままのＴ−ＤＮＡＮビオシンターゼ遺伝子に関する選別
により植物のゲノムに組み込まれたそのような外来遺伝
子を有する形質転換細胞を認識させるものである。外来
遺伝子を有する形質転換細胞についてのそのような選別
は、植物の再生を困難にする腫瘍の形成および全植物に
対する抗生物質の蔓延なしになされうる。

これらのＴ−ＤＮＡの構成には植物ゲノムへのＴ−ＤＮ
Ａの組み込みにおいて含まれる直接塩基反復のみを含み
うる。そして、また、形質転換細胞を発見し単離する選
別において用０られる１つあるいはそれ以上のオピンシ
ンターゼ遺伝子を含みうる。むしろ、これらの独特のＴ
−ＤＮＡ構成は粘着末端をもつ融通のき（制限エンドヌ
クレアーゼ部位を有している。その粘着末端は、多（の
制限エンドヌクレアーゼの粘着末端と結合することがで
きる。そして、異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて
得た外来ＤＮＡＩＩＴ片の挿入のため４こ用いることが
できる。これらのＴ−ＤＮＡ構成心こおいて、腫瘍形成
遺伝子は欠失して０てもよし）。

そして、抗生物質耐性遺伝子も利用される必要力くない
。

ある毒性アミノ酸アナログ存在下では、正常な形質転換
されていない細胞は培養培地中で生育できないか、非常
に遅く成育するかである。しかるに、１つあるいはそれ
以上のオピンシンターゼ遺伝子を有する形質転換細胞は
、毒性アミノ酸アナログを解毒し、成育することができ
る。正常細胞と形質転換細胞の成育速度の違いは、いろ
いろな毒性アミノ酸アナログを形質転換された細胞およ
びプロトプラストを選択するために用いたときに極めて
明瞭である。腫瘍誘導遺伝子の不在下では組織培養細胞
あるいはプロトプラストから植物を再生することはより
容易である。

それに加えて、この新しい発明において用いられたＴ−
ＤＮＡの構成により、ＴＬ　ＤＮＡの部分だけ、または
’ｒＲ−ＤＮＡの部分だけ、またはＴＬ−１）ＮＡとＴ
ｉｔ　−ＤＮＡの両方の部分を組み込んだ植物細胞ある
いはプロトプラストの認識も可能である。多コピーのＴ
Ｒ−ＤＮＡが形質転換植物ゲノム中で頻繁に発見される
ので、外来遺伝子の高レベルの発現が要求されるときこ
の非常に望まれる特徴が用いられるだろう。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｃｅのＴｉプラスミドのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　
領域由来の組み換えプラスミドの構成に関係する。これ
ら組み換えプラスミドは、左および右の順方向繰り返し
領域を含んでいる。その繰り返し領域は、Ｔｉプラスミ
ドがら。

植物ゲノムおよびオクトピンシンターゼ遺伝子（通常、
アミノ酸とピルビン酸の縮合を触媒する）そして／ある
いはアゾロピン／マンノピンシンターゼ遺伝子（通常、
アミノ酸と炭水化物の縮合を触媒する）へのＴ−ＤＮＡ
の導入に必要である。

ここに示された。好ましい組み換えプラスミドの構成は
、腫瘍形成を制御する遺伝子が特異的に欠失している。

そして、各々の構成は唯一の」ｇｌｎ部位を有していて
、そこに１つあるいはそれ以上の原核あるいは真核生物
の遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片を挿入できるようになっ
ている。他の構成は他の制限部位（ＢｇｌＩ［に代わる
ものがＢｇｌＩＩに加えて）を有していて、それらの構
成は当業者により理解されるように組み入れられる。

植物細胞（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅに感染し、こ
れらの構成された組み換えプラスミドを有する）は。

該Ｔ−ＤＮＡ部分を既に組み入れているがもじれない。

腫瘍形成遺伝子を欠失させるか、ａ能しないようにする
と、Ｔ−ＤＮＡを有する細胞は２通常、形質転換細胞と
形質転換していない細胞を識別する指標となる形態や成
育の仕方などの変化を示さない。どの植物細胞がゲノム
内へ腫瘍遺伝子を欠失するこれらの構成された組み換え
プラスミドのＴ−ＤＮＡ部分を有するかを識別するため
に。

該植物細胞をここに開示されたある毒性アミノ酸アナロ
グ上で成育させる。あるオピンシンターゼ遺伝子を１つ
かそれ以上有する細胞は毒性アミノ酸アナログを無毒性
の生産物に代謝することができ、それゆえ成育し続ける
。他方、そのようなオビンシンターゼ遺伝子を有さない
細胞は毒性アミノ酸アナログをタンパク中にとり入れ、
結果としては死に敗るであろう。

上記の特徴をもつ種々の組み換えＴ−ＤＮＡプラスミド
を正確に構成することができるように。

Ｔ−ＤＮＡ　（２２，８７４塩基）およびＴ−ＤＮＡの
各側の約９００塩基の塩基配列を決定した。多くのＴ　
−Ｄ　Ｎ’Ａの制限断片をｐＢＲ３２２にクローン化し
エセリシア・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩある
いはＧＭ３３によってふやした。個々のクローンについ
てＭａｘａｍとＧ１１ｂｅｒｔの方法（（１９７７）　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４　：　５６０
　）により塩基配列を決定した（実施例１を参照）。

Ｔ−ＤＮＡ領域を含むＴｉプラスミド１５９５５の一部
分の塩基配列は第２図に示されている。ＤＮＡ配列の片
方の鎖の配列のみが示しである。それは５′から３゛へ
の方向であり全長２４５９５ベースである。そしてそれ
は断片勿８の左のＢａｍ１１１部位から断片ＥｃｏＤの
右のＥｃｏＲＩ部位までである（第３図）。両方鎖は９
０％のＤＮＡについて配列決定がなされた。残りの１０
％は片方鎖のみ配列決定したが、異なる制限部位からの
配列決定と頻繁に重複していた。

配列を決定した領域の制限エンドヌクレアーゼ地図を５
種類の異なる制限酵素について示した（第３図）。」憇
旧、」匹Ｒ１および…閃■はｐＢＲ３２２にサブクロー
ン化するためにＴ−ＤＮＡ領域を適当に断片化するのに
用いた。該断片（影の領域で示している）は、　Ａ、ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅに導入し、続いて複製するため
に、　ｐｓＵＰ１０６にクローン化したＴ−ＤＮＡ組み
換え体の構成に用いた。これらのＴ−ＤＮＡ組み換え体
を構成するにあたり、他の制限エンドヌクレアーゼ部位
の知識が役立った（第１表）。分析した７３の酵素のう
ちＥｃｏ　Ｋに関する部位だけはＴｉ配列に存在しなか
った。３０回以上ＤＮＡを分解するかもしれない酵素の
部位の位置は与えられていない。

広範囲にわたる２１−２５ベースの順方向繰り返し配列
がＴ−ＤＮＡの端に存在することが報告されている（Ｂ
ｅｖａｎ、　Ｍ、　Ｈ，、ａｎｄ　Ｃｈｉｌｔｏｎ、　
Ｍ−Ｄ、　（１９８２）Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、　１６　：、３５７−３８４）。この研究において
、これらの２つの繰り返しが９０９および２３，７８３
の位置にそれぞれ存在し、それらを位置ＡおよびＤと標
識するということが報告されている。（第３図）。以下
において、これら２つの反復をＲｏＴＬ（Ａ）およびＲ
ｏＴＲ（Ｄ）　と称する。それらは１２ベースの正確な
繰り返しを有するが、不完全な２４ベースの反復へ広げ
られることができる。反復ＲｏＴＬ（＾）とＲｏＴＲ（
Ｄ）が最も外側であると仮定すると、Ｔ−領域の長さは
２２，８７４塩基となる。これらの端の繰り返し配列は
、オクトビンおよびツバリンＴｉプラスミドの両方に存
在し、植物ゲノムへのＴ　−９１域の導入に関する基本
的な役割を演じている。現在の研究において、類似の繰
り返し配列がＴ−領域内の１４，０６０（Ｂ）および１
５，９００（Ｃ）の位置に見つけられている。　これら
の２つの繰り返しを今後。

ＲｏＴＬ（Ｂ）　とＲｏＴＲ（Ｃ）と称する。これらの
内部の反復の存在は特に興味深い。なぜなら、オクトピ
ンクラウンゴール細胞が１つの（ＴＬ　＝　ＤＮＡ）領
域あるいは２つの（ＴＬ　−Ｄ　Ｎ　ＡおよびＴ、１−
ＤＮＡ）領域を包む複雑な機構を有しているのが観察さ
れるからである（Ｄｅ　Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ、　Ｍ、
　ｅｔ　ａｌ。

（１９８１）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１
８３　：　２８３−２８８　；Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ、　
Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｃｅ１ｌ　１９
　：’７２９−７３９）。（Ｔ、−ＤＮＡ）は腫瘍誘導
遺伝子（ｔｍｓ＋ｔｍｒおよびｔｍ　１）を有し１ｍべ
た限りのすべての腫瘍系列に見られる。しかるに、ＴＲ
−Ｄ’ＮＡは初期の腫瘍および安定な腫瘍系列において
のみ存在する。これらの２つのＴ−ＤＮＡ領域が明らか
に独立に１組み込むことが可能であり９両方とも基本的
反復により境界されているという事実は、それらが、植
物ゲノムにＴｉプラスミドからＴ−ＤＮＡが導入される
ときの基礎的役割の追加すべき証拠を供給する。４つの
反復の塩基配列をここに示す。

■　塩基配列 ＲｏＴＬ（Ａ）　ＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＴ
ＴＧＴＡ＾八ＴＲｏＴＬ（Ｂ）　ＧＧＣＡＧＧＡＴへＴ
ＡＴＡＣＣＧＴＴＧＴＡＡＴＴＲｏＴＲ（Ｃ）　ＧＧＣ
ＡＧＧＡＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＴＧＴＡＡＡＡＲｏＴＲ
（Ｄ）　ＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧＴＡ
ＡＴＴ全Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　６Ｊ？域の中に、２６個の
オープンリーディングフレームが存在する（第３図）。

そのオープンリーディングフレームは、ＡＴＧ開始コド
ンで始まり３００残基より長い。これらの可能な転写物
は大きさがＩｌ、２キロダルトンから８３．８キロダル
トンの範囲のポリペプチドをコードし得る。これらのオ
ープンリーディングフレームのうち１４個はゴールドバ
ーグボグネスボソクスに非常に相同性をもつ真核生物の
プロモーターと考えられる配列を示している。それらは
、また、　Ｋｏｚａｋ　らに報告された真核生物のりポ
ゾーム結合部位（Ｍ、　Ｋｏｚａｋ（１９７８）Ｃｅｌ
ｌ　１５　：　１１０９−１１２３　；　Ｋｏｚａｋ、
Ｍ、（（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　
２８０　：　８２−８５　）　）　と考えられるものを
有し、そして転写終結の信号として働くと考えられる３
”末端のポリ　（Ａ）付加部位（Ｂｒａｉｙｅｒｍａｎ
＋Ｇ、（１９７４）　八ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、４３　：　６２１−６４２　；（１９７５）　Ｐｒｏ
ｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｂｉｏｌ、　
１７　：　１１７−１４８）と考えられるものを有して
いる。オープンリーディングフレーム１１はオクトビン
シンターゼをコードし、他方、オープンリーディングフ
レーム２４、２５および２６はマンノビンおよびアグロ
ピンシンターゼをコードしている。注目すべきことは真
核生物の転写物と考えられるものがすべてＴｔとＴｌ１
−ＤＮＡ領域の中に存在していることである。

直接反復ＲｏＴＬ　（８）およびＲＱＴＲ（Ｃ）の間の
オープンリーディングフレーム、そしてまた、ＲｏＴＲ
（Ｄ）の右およびＲｏＴＬ　（Ａ）の左にかけてのオー
プンリーディングフレームはシャイン・ダルガノリボゾ
ーム結合部位と考えられるものを示しており、それゆえ
これらは原核生物起源であることは明らかである。

上で述べたように本発明により入手された情報により、
受容植物細胞のゲノムへの外来遺伝子およびあるいは外
来ＤＮＡの導入に際して著しく有用な種々の組み換えプ
ラスミドの構成が可能となる。外来遺伝子および／ある
いは外来ＤＮＡは。

ここでは９通常、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに存在し
ないＤＮＡ塩基配列と定義する。塩基配列の知識により
２様々な遺伝子のプロモーター領域の位置およびオープ
ンリーディングフレームの境界に関する情報が供給され
る。そして、それゆえ。

当然の結果として、様々なコードされているタンパク質
のアミノ酸配列および分子量がわかる。それに加えて、
塩基配列よりＴｉプラスミドから植物細胞ゲノムへＴ−
ＤＮＡ　（様々な外来遺伝子および／あるいは外来ＤＮ
Ａを含む）が導入される際に非常に重要であるすべての
直接反復領域がわかる。実施例２−７に、広い宿主範囲
をもつプラスミドへ挿入可能な多くの有用な組み換えＴ
−ＤＮＡの構成の詳細が記述しである。これらの構成の
各々において、適切に位置する特異な制限部位は１つあ
るいはそれ以上の遺伝子を有する外来ＤＮＡの挿入に利
用されうる。それに加えて、抗生物質剛性遺伝子が組み
換えプラスミドのベクター領域、すなわち２選別に用い
るオピンシンクーゼ遺伝子および外来ＤＮＡおよび／あ
るいは外来遺伝子を含むＴ−ＤＮＡ反復領域の外側、に
組み入れられる。

これらのＴ−ＤＮＡ組み換え体の構成の新規な特徴は、
腫瘍誘導遺伝子（ｔｍｓ、　ｔｍｒおよびｔｍｌ）が好
ましくは欠失もしくは不活化され、その結果。

形質転換細胞からまともな植物の再生が容易になるとい
うことである。しかしながら、形質転換細胞と正常細胞
との識別が一層困難になる。なぜなら、腫瘍をもはや形
成しなくなり、それゆえに。

形質転換細胞の新しい選別法が発明されなければならな
い。Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（（１
９８２）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１　：　
１３３−１４２　）は、オクトピンＴｉプラスミドを有
する紅　ｔｕｍｅｆａｃＬｅｒｉｃｅ株を感染させてオ
クトピンを合成する腫瘍細胞に植物細胞を形質転換した
。

彼らは、小さな正常シュートおよびオクトピンシンター
ゼ含有クラウンゴールシュートを種々濃。

度のホモアルギニン（ＨＡ　）を含む固体寒天培地に移
すと、正常シュートの増殖は２〜３週間後明らかに阻害
されたと報告した。対照的にクラウンゴールシュートは
低濃度のホモアルギニンでは全く阻害されず、高濃度で
僅かに阻害された。

Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（（１９Ｂ
２）前出〕もまた新しく単離された正常およびクラウン
ゴールプロトプラストに対するホモアルギニンの効果を
調べた。３週間後、彼らはクラウンゴールプロトプラス
トに比べ正常プロトプラストの増殖に明確な差（顕微鏡
的に）を認めた。７回の実験において。

クラウンゴールプロトプラストは増殖阻害を示さず、ま
たＨＡの存在、不在下でのクラウンゴール培養に何ら差
は観察されなかったが、他方、　ＨＡ存在下の正常培養
では生存率が１０％あるいはそれ以下であった。

我々の別の実験は異なった結果を示した。クラウンゴー
ル腫瘍系１５９５５／１と１５９５５１０ｆをこの研・
究に用いた：これらの組織はニコチアナ・タバカムｃｖ
、　”キザンチ”のアグロバクテリウム・チューメファ
シエンス株１５９５５により刺激された腫瘍から得た単
細胞クローンに由来している（Ｇｅｌｖｉｎ。

Ｓ、Ｂ、ｅｔａｌ、　（１９Ｂ２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、　八ｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、八。

７虹７６−８０）。両系はサイトカイニンおよびオーキ
シン欠乏培地で増殖し、共にＴ−ＤＮＡを含有する。し
かし、オクトピンは１５９５５／１系には認められず、
他方、　１５９５５１０１系には認められ、この事はオ
クトピンシンターゼ遺伝子は前者の系には存在せず、後
者の系には存在する事実を反映している。

ゆえに、これら２系は、　Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ
　ｅｔ　旦。

（前出）が述べているように、毒性アミノ酸アナログ、
ホモアルギニンがオクトピンシンターゼを含む遺伝子の
選択に用い得るか否かの試験に理想的である。第１図に
見られるように、ホモアルギニンは２つの腫瘍系の増殖
にほぼ同等に影響を与えた。明らかにオクトピンシンタ
ーゼ遺伝子を含む系の組織はオクトピンシンターゼ遺伝
子を含まない系と区別できなかった。　我々の結果とＶ
ａｎＳｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、のものとの矛盾
に対する理由は今のところ不明である。

したがって、多くのアミノ酸アナログを用いた別の実験
において、オクトピンシンターゼ含有形質転換細胞の選
別がある種のアナログでは可能で。

また他のものでは不可能であった事は注目される。

Ｌ−２，４−ジアミノ−ｎ−酪酸（Ｌ−オルニチンのア
ナログ）または２−チアゾイルアラニン（ヒスチジンの
アナログ）含有培地でのｍ織の増殖の相対的変動は小さ
く、実験毎に変動した。それゆえ、これらアナログを用
いた研究は中止された。

ホモアルギニンの選別能試験に用いた同じ２つの組織培
養系（すなわち、　１５９５５／１および１５９５５１
０１）をカナバニン−３０４（これもアルギニンのアナ
ログ）および２−アミノエチルシスティン（Ｌ−リジン
のアナログ）の選別試験に用いた。ホモアルギニンを含
む培地での増殖によりオクトピンシンターゼ合成能を有
する細胞の選別に失敗することを考えると、試験をカナ
バニンーｓｏ、（Ｃ３）で行う場合そのような細胞の選
別にかなりの程度差がある事を見出したのは最も驚いた
事である（第４図）。さらに驚くことは選別を極めて低
濃度の２−アミノエチル−システィン（ＡＢＣ）を含む
培地で行っても形質転換オクトピンシンターゼ産生細胞
の選別が強力かつ完全な事である（第５図）。

これら２つのアミノ酸アナログ（Ｃ３とＡＢＣ）は組織
培養で形質転換細胞およびこれらの組織培養から得られ
た再生植物、あるいは形質転換プロトプラストの選別に
用いられ得る。

さらに２選別の同じ手法はアグロピンシンターゼ遺伝子
にも有用である。アグロピンとマンノピンはグルタミン
と炭水化物の縮合に基づくらしく。

本発明の結果はまたアグロピン／マンノビンシンターゼ
遺伝子が形質転換細胞に存在するとき、毒性アミノ酸ア
ナログを使用すると形質転換細胞を正常細胞と区別でき
るという事を明示する。原理的にはツバリンシンターゼ
を記述した方法で選別を達成するために、アルギニン基
質の特有の毒性アナログの無毒化に用い得た。特有のア
ナログは今のところ同定されていない。

多くのニコチアナ・ツバカムの株がアグロビンーノパリ
ン生合成経路に関与するアミノ酸の毒性アナログでの増
殖能の試験に用いられた。使用株の詳細を第２表に示す
。

すべて実験において、最初に２組織の５０■片を用いた
。３片を各ペトリ皿に置き２連の皿を用いた。これら組
織を９週間増殖させ、集め、乾燥し秤量した。１組の実
験に２株のニコチアナ・タバカムｃｖ、キサンチを用い
た。１株１５９Ｎａ−１はアゾロピン／マンノピン陰性
で、もう１株１５９０−１はアゾロピン／マンノピン陽
性であった。これら２株を種々レベルのグルタミソクー
γ−ヒドラジド（Ｇ　Ｈ，第３表）、Ｓ−カルバミル−
Ｌ−システィン（ＣＣ，第５表）および６−ジアシー５
−オキソ−し−ノルロイシン（ＤＯＮ、第７表）での増
殖能を試験した。２０μｇＧＨ／ｎ＋ＩＶ、培地で増殖
し弛場合、　１５９　Ｎｕ−４（アゾロピン／マンノピ
ン陰性）の増殖速度は対照の増殖速度の９．１％に低下
したが（第３表）、他方、　１５９０−１株（アゾロピ
ン／マンノピン陽性）は対照の速度の８６．４％にしか
低下しなかった。両株のこの毒性アミノ酸アナログでの
増殖速度の差は明白であり顕著でる。両株を２５μＨＣ
Ｃ／ｍβ培地で増殖させた場合、アゾロピン／マンノピ
ン陰性株の増殖速度は対照の増殖の６．９％に明らかに
低下したが（第５表）、他方。

アゾロピン／マンノビン陽性株の増殖速度は事実上低下
しなかった。最後に、アグロピン／マンノビン陰性株は
０．２５μｇ　ＤＯＮ／　ｍβ培地では全く増殖しなか
ったが、アゾロピン／マンノビン陽性株は第２の組の実
験ではニコチアナ・ツバカムｃｖ。

ライスコンシン３８のアグロピン／マンノピン陰性株（
ＷＣ５８，第２表〉とアグロピン／マンノビン陽性株（
Ｗ−８６３４）を種々レベルのＧＨ，ＣＧおよびＤＯＮ
で試験した。Ｇｌｌの場合（第４表）、アグロピン／マ
ンノピン陰性株は１０μｇＧＨ／ｍ１２培地存在下で死
滅したが、アゾロ陽性株マンノピン陽性株（トＢ６３４
）の増殖速度はなお対照の５５％であった。同じ２株を
ＣＣで試験した場合（第６表）、アグロビン／マンノピ
ン陰性株は５０μｇ　ＣＣ／ｍβ培地の存在下で死滅し
たが、陽性株は増殖速度の低下は全くなかった。最後に
１両株をＤＯＮで増殖させた場合も。

結果は極めて明瞭であった（第８表）。０．１２μｇＤ
ＯＮ／　ｍβ培地存在下でアグロビン／マンノピン陰性
株（Ｗ−Ｃ５８）は死滅したのに対し、陽性株（Ｗ−８
６３４）はある程度（すなわち、対照の増殖速度の１２
％）増殖した。

このように本発明で明らかにされた結果は形質転換組織
、細胞およびプロトプラストを選別する特徴ある方法を
教示する。これらの結果は、オピン合成の遺伝子を欠く
非形質転換細胞は毒性アミノ酸アナログの存在下で増殖
できない・が、オピンシンターゼを有する形質転換細胞
は増殖し得るという事実を利用している。したがって、
この選別はオクトピンシンターゼ遺伝子がある場合、あ
るいはアグロピン／マンノピンシンターゼ遺伝子がある
場合に用いることができる。

オクトピンシンターゼまたはアグロピン／マンノピンシ
ンターゼ遺伝子の選別により形質転換細胞を選別できる
ことは発現を期待される外来遺伝子の操作にさらに改善
をもたらす。オピンシンターゼ生合成経路の１つで選別
し、外来遺伝子の発現が他のオピンシンターゼの制御下
になるように再構成Ｔ−ＤＮＡにこの外来遺伝子を挿入
することにより形質転換細胞が得られるだろう。例えば
。

ＲｏＴＬ　（Ａ）　、オクトピンシンターゼ、　ＲｏＴ
Ｌ（Ｂ）、アグロピン／マンノビンシンターゼ−ＲｏＴ
Ｒ（Ｄ）を含むＴ−ＤＮＡを作成する事が可能であろう
。リジンのアナログである２−アミノエチルシスティン
を。

特異なＭｓｔｎ部位（アグロビン／マンノビン遺伝子の
１９４７１番塩基）を外来ＤＮＡの挿入に用し）る一方
、オクトピンシンターゼの選択による形質転換細胞の選
別に用いることができた。

そのようなＴ−ＤＮＡ作成のそれ以上の利点は。

これら２つの反復配列ＲｏＴＬ　（Ａ）とＲｏＴＬ　（
Ｂ）およびオクトピンシンターゼ遺伝子をアグロピン／
マンノピンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の支配
下で発現する形質転換遺伝子の選択に用０るということ
であろう。

要約すれば、Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへの取込みに関与
する順方向反復と１つまたはそれ以上のオピン合成遺伝
子を含む再構成Ｔ−ＤＮＡプラスミドを用いることは以
下の有用な結果をもたらす＝１、腫瘍誘導遺伝子の欠失
は形質転換組織培養またはプロトプラストからの植物再
生に大きな成功をもたらした。２．オビン合成遺伝子は
Ｔ−ＤＮＡ（および更に挿入されたいかなる外来遺伝子
）を取り込んだ、これら植物細胞の選別に用し）られた
。３．この発明により、Ｔｔの一部のみ、ＴＲの一部の
みあるいはＴＬとＴＲ双方を取り込んだ植物細胞の認知
が今や可能になる。ＴＲの多コピーが形質転換植物ゲノ
ムに見出されることから。

この現象は、これらＴ　−Ｄ　Ｎ　、Ａ構成物のいくつ
かに取り込まれた外来遺伝子の相当高いレベルの発現を
もたらすことができる。

制限エンドヌクレアーゼにより得たＴ−ＤＮＡと隣接領
域の断片をｐＢＲ３２２にクローン化し、エセリシア・
コリーＨＢＩＯＩまたは６Ｍ３３株中で増幅させた。次
いで、各クローンをΔ０Ｍ０Ｍａｘａｍ　’ｈ　Ｗ。

Ｇ１１ｂｅｒｔ　（（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌＪ、ｓ、Ａ。

７４　：　５６０）　（７）方法でシーフェンシングし
た。シーフェンシングにはクローン化ＤＮＡｌ０μｇを
適当な制限酵素で切り１次いで反応液に１．０Ｍ　）リ
ス・塩酸、　ｐＨ８，’４を１／／１０量加えることに
よりｐＨ調整後、牛腸のアルカリフォスファターゼ２．
５ユニツトで５５℃、３０分間処理した。アルカリフォ
スファターゼをフェノール抽出３回１次いでエタノール
沈澱２回により除去した。脱リン酸したＤＮＡを乾燥し
、水１５μｌと２０１１１Ｍトリス・塩酸、ｐＨ９，５
゜１ｍＭスペルミジンおよび０．１ｍＭ　ＥＤＴＡから
なる変性緩衝液１５μβを加えた。この混合液を７０℃
、５分間保ち、直ちに氷水につけた。冷却後、　５００
ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ９，５，１００ｍＭ　ＭｇＣ１
ｚ、５０ｍＭジチオスレイトール、５０％（ｖ／ｖ）グ
リセロール、１００μＣｉの〔γ−”Ｐ）ＡＴＰおよび
２．０ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼよりなるキ
ナーゼ緩衝液４μβを加え、３７℃で３０分間反応させ
た。エタノール沈澱により反応を止め、サンプルを乾燥
した。両端をラベルしたＤＮＡを適当な制限酵素で切断
し、生じた一端をラベルされたＤＮＡをポリアクリルア
ミドゲルから分離、溶出した（ＭａｘａｍとＧ　ｉ　ｌ
　ｂｅｒ　ｔの手順４．５ａ、？および９）、ＤＮＡシ
ークエンシング反応は（Ｍａｘａｍ　、Δ、門、とＷ。

Ｇ１１ｂｅｒｔ　（１９７７）　、前出）に述べられて
いる方法で、以下の修正を加え行った。部分Ｇ＋Ａ反応
は反応液に８８％ギ酸３０μβを加え、２０℃で３分間
行った。反応を０．３Ｍ酢酸ナトリウム４００μβを加
え止めた（ヒドラジン停止）。Ｇ反応時間は２０秒間に
短縮し、２０℃で行った。Ｃ＋ＴおよびＣ反応は２０℃
で３分間に短縮し、ヒドラジン停止液４００μβを加え
止めた。次いですべての反応は（Ｍａｘａｍ＋Ａ、Ｍ、
と−、Ｇ１１ｂｅｒｔ　（１９７７）　、前出）にした
がい行った。幅２０ｃｍ、長さ１０ｃｍ、厚み０．２０
の長いシーフェンシングゲルをオリゴヌクレオチド分離
に用いた。　アクリルアミドがゲル板の一面に化学的に
結合するようにゲル板をシランで処理した（Ｇａｒｏｆ
ｆ、　Ｉｌ、とＡｎＳＯｒｇｅ＋　Ｈ，（１９８１）Ａ
ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１１５　：　４５０−４５７）。他の支持板は電気泳動
中ゲルを５０℃に保つための保温板である。サンプルを
４％。

６％および１６％アクリルアミドゲルで分離した。

各サンプルを各３つのゲルに同時にのせ２時間別にはの
せなかった。ゲル毎のシーフェンシングラダーが十分型
なるようにゲルを３．０００　Ｖで１４時間通電した。

電気泳動後、ゲル（板面に結合している）を１０％酢酸
で１５分間固定し９次いで水洗いした。　ゲルを板面で
直接乾燥させたが、厚みは約０．０１ｍｍに縮んだ。そ
の結果、Ｘ線フィルムを乾燥ゲルに直接接するように置
くことができ、バンドの強度と解像力が増大した。オー
トラジオグラフィーは室温で増感スクリーンなしで行っ
た。これらの手法により、フラグメント当り５００塩基
対の配列が常時可能であった。したがって各３ゲルのセ
ントに５７ラグメントをのせることにより２５００塩基
の配列が得られた。ＤＮＡとタンパク質の配列の解析は
コンピューターで行った。用いたプログラムはＤｒ、　
Ｏ，Ｓｍ１ｔｈｅｒｓとＤｒ、　Ｆ、　Ｂｌａｔｔｎｅ
ｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
、　Ｍａｄｉｓｏｎ）のものである。

クローンｐ２３３ばベクターｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋
　Ｉｎｃ、、　Ｐ、０．Ｂｏｘ　５７７＋Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　２０７６０）にクローン化した
ＢａｎｃＨＩ断片１７とＥｃｏＲＩ断片Ｅ（第６．６ａ
図）からなる。

このクローンを制限エンドヌクレアーゼＳｍａｌ（第６
ａ図）で切り、平滑末端のＳｍａ　ｒ制限部位をｈＬＩ
［リンカ−でＢｇｌ　１１部位に変え、ＤＮＡを連結し
エセリシア・コリーに８０２を形質転換した。

得られた組み換えプラスミドを精製し９次いでＤａｍし
たがってアデニン残基のメチル化ができないエセリシア
・コリーＧＭ３３を形質転換した。本株では核酸残基１
４６８６のＣ１ａ　１部位がメチル化されず。

切断され得る。Ｃ１ａ　ＩとＢｇｌ　ＩＩで分解すると
完全なオクトビンシンターゼ遺伝子とＴＬの右側境界の
順方向繰り返し配列（すなわちＲｏＴＬ（Ｂ）　）を含
むＴ−ＤＮＡ断片（１１２０７から１４６８６番残基の
断片２ａ）が得られる。また同様の大きさの断片（断片
２）が制限エンドヌクレアーゼＣ１ａ　Ｉの代わりに」
匣」を用いて得られる（第６図）。

次に、既にベクターｐＢＲ３２２にクローン化され。

賄辷■部位（１６１７番残基）を含む肛閃■クローンｐ
１０２　（Ｔ−ＤＮＡの６０２−３３９０番残基を含む
）を１■とＨｉｎｄｌｌｌ　（第７図）で切断しＴＬの
左側境界の順方向繰り返し配列（すなわちＲｏＴＬ　（
Ａ）　）を含むＴ−ＤＮＡ断片（断片１）を得た。

最後に、アグロバクテリウム・チューメファシエンスで
複製する広宿主域プラスミド、　ｐｓｔｌＰ１０６をＨ
ｉｎｄＩＩＩとＣ１ａ　Ｉで切断したく第８図）。これ
ら３つの断片の末端の制限部位は以下の通り：断片１は
１１工■とｌ如ｄｕｌｌ、断片２は１ｇｌ　ＩＩと夏堕
−Ｉ。

ｐｓ［ＩＰ１０６はＣ１ａ　ＩとＨｉｎｄｎ［。３断片
を結合する制限部位は２つの断片より以上に共通でない
から。

結合は唯一の配列（Ａ−ｏｃｓ−Ｂ）　（第８図）での
み起こる。断片１と２の間のＢｇｌ　１１部位は特殊な
部位であり、望みの外来ＤＮＡ断片の挿入に用い得る。

この制限部位は極めて有用で、外来ＤＮＡ断片のうち、
ＢｇｌＩＩ、ハし旧、Ｂｃｌ’　Ｉ　、熊ｏＴおよびＳ
ａｕ、３Ａで切断されたものを挿入し得る。

制限酵素およびリガーゼばすべて販売社の推奨する方法
にしたがい用いた。

実施例２に記載のようにＩ（ｉｎｄＩ［Ｉクローンｐ１
０２’（Ｔ−ＤＮＡの残基数６０２−３３９０にわたる
）からＴ−ＤＮＡ断片１　（第７図）を、クローンｐ２
３３からＨｉｎｄＩ［［部位で、他端はＢｃｌ　１部位
で連結し、断片３（第９図）を得た。断片３はＲｏＴＬ
　（Ａ）　、オクトピンシンターゼおよびＲｏＴＬ　（
Ｂ）の塩基配列を含む。

ＲｏＴＬ　（Ｂ）は再構成したＴ−ＤＮＡプラスミドが
ら塩基数１３７７４番、　（すなわち、オクトビンシン
ターゼの開始コドンの１４２塩基上流）、の展層制限部
位をＢａｍ■■で切断することにより除去できることに
注目されたい。この部位を用いるとオクトピンシンター
ゼ遺伝子の発現が阻止された。オクトピンシンターゼ遺
伝子を含む断片を単離するため、ＢｃｌＩ部位（塩基１
４７１１番）を用いると、この遺伝子は強く発現した。

オクトピンシンターゼ遺伝子の発現を回復させるため−
”ｃｌ　ＩとＢａＬＨｌの間のこの領域を他のＤＮＡ断
片９例えばＲｏＴＬ　（Ａ）　。

ＲｏＴＬ（Ｂ）　、ＲｏＴＲ（Ｃ）またはＲｏＴＲ（Ｄ
）などの繰り返し配列のいずれかで置換する事が可能で
ある。

次の段階は、既にｐＢＲ３２２中にクローン化した取乞
ＲＩクローンｐ５０１　（第１０図）を増幅し、プラス
ミドを精製することである。次いで精製プラスミドを制
限エンドヌクレアーゼ−５，ｔｕ　Ｉと」Ｕｌで切り、
塩基２１６７３から２４３３．７番を有し、繰り返し配
列ＲｏＴＲ（Ｄ）　（断片４）を含むＴ−ＤＮＡ断片を
得る。５ｔｕｌでの切断では平滑末端が生じ、他方、　
」ＵＩでは３“の突出した末端が生じる。平滑末端Ｓｔ
ｕ　Ｉ部位をＢａｍ　ｌｊＩリンカ−でハＬ旧部位に変
換する。Ｂａｍ　ＨＩ分解後断片３と４を連結し。

一端が財皿■部位、他端がＫｐｎ　Ｉ部位の断片５（第
９図）を得る。　エンドヌクレアーゼＢｃｌ　ＩとＢａ
ｎ　ＩＩＩは適合する粘着末端を生ずることに注目され
たい。

次いで、断片４のＫｐｎ　Ｉ分解で生じた３゛末端の突
出部をバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼの３
″　〜エキソヌクレアーゼ活性で平滑末端にする（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、（１９Ｂ２）　Ｉｎ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ、１４０　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）。

ポリメラーゼをフェノール抽出で不活性化し、７゜ラス
ミドの冷エタノール沈澱した後、この平滑末端を肛皿■
合成リンカ−で肛皿■部位に変換し。

したがって断片５は両端に…ｎｄｌ［部位になる。断片
５を次いで酵素ＨｉｎｄＩ［［で分解する。

最後に広宿主域プラスミドｐｓＵＰ１０６をＨｉｎｄＩ
［［で線状にし、細菌アルカリフォスファターゼで処理
する。次に断片５を線状ｐｓＵＰ１０６に連結し、Ｒｏ
ＴＬ（八）、オクトビンシンターゼ、　ＲｏＴＬ（Ｂ）
およびＲｏＴＲ（Ｄ）　（Ａ−ｏｃｓ−Ｂ　−Ｄ）がこ
の順に入った組み換えプラスミドを得る（第９図）。断
片１と２の結合部の有用な」れ■部位は発現させたい１
つまたはそれ以上の遺伝子を有するいかなる外来ＤＮＡ
断片の挿入にも用い得ることに注目されたい。

化炭 アグロピンーマンノピンシンターゼ遺伝子はオープンリ
ーディングフレーム２４．　、２５および２６（第３図
）を含むが、これらのうち、どれがアグロビンシンター
ゼ、マンノピンシンターゼに相当するかは、未だ不明で
ある。したがって、リーディングフレーム２４−２６を
アゾロピン／マンノビンシンターゼ遺伝子（ａｇｓ／ｍ
ａｓ）と見做す。ＥｃｏＲＩクローンｐ４０３　（Ｔ−
ＤＮＡの塩基１６２０２−２１６３．１番）および」並
Ｒ１クローンｐ５０１　（Ｔ−’ＤＮＡの塩基２１６３
２−２４５９０番）両者をｐＢＲ３２２にクローン化し
、別個にエセリシア・コリーＨＢＩＯＩを形質転換した
。増幅、精製後クローンｐ４０３をＴ−ＤＮＡの塩基１
８４７２番（第１１図参照）で５ｓｔｌで切断した。突
出した３゛末端をバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼの３”　−エキソヌクレアーゼ活性で平滑末端に
する（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、（１９８
２）　ＩｎＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ、
１４０　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）。

ポリメラーゼをフェノール抽出で不活性化し、プラスミ
ドを冷エタノールで沈澱後、平滑末端を」峠■合成リン
カ−でＢｇｌＩ［部位に変換する。次いで。

このＤＮＡを一彫辺ＲＩと」旦■で切ると塩基１８４７
２から２’１６３１番を含むＴ−ＤＮＡ断片が得られる
。

この断片（断片６）はアゾロピン／マンノピンシンター
ゼ遺伝子のどれかを含み、かつ末端は」旺■、および」
飴Ｒ１部位である。

次に、既にｐＢＲ３２２にクローン化されたＥｃｏＲＩ
クローンｐ５０’ｌ　（Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａの塩基２１６
３２−２４５９０番）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩおよび血Ｉで切る。得られた断片７　（第１２図）
はアゾロピン／マンノピンシンターゼ遺伝子の残り（断
片６に含まれないもの）と繰り返し配列ＲｏＴＲ（Ｄ）
を含む。

断片１　（第７図）、断片６（第１１図）および断片７
（第１２図）を混ぜ連結する。６つの末端の２つより以
上の適合する粘着末端はないので、３つの断片は一方向
のみで連結され断片８（第１２図）（Ａ　−ａｇｓ／ｍ
ａｓ　−Ｄ　）を生じ、一端はＨｉｎｄ　ＩＩＩ　、他
端は血■部位である。最後に」Ｕ１部位の３′末端の突
出部をＴ　４　Ｄ　Ｎ、、Ａポリメラーゼで除き。

合成リンカ−でＨｉｎｄ　Ｗｉ部位に変換する。（註：
これに−より両端が平滑末端になり、肚皿■末端にもＨ
ｉｎｄｌｌリンカ−が入るだろう。この付加は４塩基対
である。）したがって、この断片は両端にＩ（ｉｎｄ■
部位を有し、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｎ［で線
状化した広宿主域ベクターｐｓＵＰ１０６に挿入できる
。

”乍匁５　：　ＲｏＴＬ（Ｂ）、　ＲｏＴＲ（Ｄ）およ
びアグロピンＡ」憇旧断片１７とＥｃｏＲＩ断片Ｅ（第
１３図）にわたるクローンｐ２３３をベクターｐＢＲ３
２２にクローン化した。得られた組み換えプラスミドで
Ｄａｍ−すなわちメチル化不能のエセリシア・コリーＧ
Ｍ３３を形質転換した。本枕では塩基１４７１１番の」
劇」部位はメチル化されず切断可能であった。増幅後。

組み換えプラスミドを精製し、制限エンドヌクレアーゼ
ＩＩｐａＩで切断したく第１３図）。　平滑末端」μｍ
制限部位をＢｇｌ　ｎリンカ−を用いてＢｇ１１１部位
に変えた２次いで、この断片を制限エンドヌクレアーゼ
Ｂｇｌ　ＩＩとＢｃｌ　Ｉで切る。　その結果。

ＴＬの右側境界の順方向繰り返し配列（すなわち。

ＲｏＴＬ（Ｂ）　）を含むＴ−ＤＮＡ断片（１３８００
から１４７１１番塩基の断片９）ができる。

アゾロピン／マンノピンシンターゼ遺伝子とＴＲの右側
境界の順方向繰り返し配列（すなわち、　ＲｏＴＲ（Ｄ
））を含む第２の断片（断片１０）を、断片６と断片７
　（第１２図）を断片９　（第１３図）と混ぜそしてそ
れらを連結し断片１０（第１４図）を得ることにより構
成した。」凱Ｉ制限部位の３゛末端突出部をＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端にし２合成リンカーにより…ｎ
ｄ１１［部位に変換した。これにより両端を平滑末端に
しＨｉｎｄｌｌｌ末端に肛門■リンカ−が加わっている
。次いでＨｉｎｄＩ［ＩξＢｃｌ　Ｉで分解し、一端に
」劇」部位（Ｂａｍ　ＨＩ部位と適合）、他端にＨｉｎ
ｄ　ｍ部位（断片１１−Ｂ　−ａｇｓ／ｍａｓ　−Ｄ）
を持つ断片を作出する（第１４図）。

アグロバクテリウム・チューメファシエンスで複製でき
る広宿主域ベクター、　ｐｓＵＰ１０６をＢａｍ旧とＨ
ｉｎｄ　Ｉ［［分解により線状化し、断片１１を線状ベ
クターに挿入する。

実施例２に記載の如くに断片１を得た（第７図）を有す
る。断片６と断片７（第１２図）を連結して断片１２を
得、これば一端に、Ｂｇ１１１部位、他端に１１部位を
有する。

ハと旧断片１７と」製ＲＩ断片Ｅ（第６，１３図）にわ
たるクローンｐ２３３はベクターｐＢＲ３２２にクロー
ン化された。得られた組み換えプラスミドをＤａｍすな
わちメチル化不能のエセリシア・コリーＧＭ３３に導入
した。本枕では塩基１４７１１番の」劇」部位はメチル
化されず、酵素Ｂｃｌ　Ｉで切断できながった。増幅後
１組み換えプラスミドを精製し、制限ヌクレアーゼ」旦
Ｉと」匹Ｉで切り、Ｔ−ＤＮＡのＫｐｎ　Ｉ部位（９８
３８番塩基）か９ＢｃｌＩ部位（１４７１１番塩基）に
およぶ断片１３を得た。断片１　（第７図）、断片１２
（第１２図）および断片１３（第１５図）の混合物を連
結し、一端が１ｌｉｎｄｌ［［部位、他端が」Ｊ１部位
の組み換え断片１４（第１６図）　（Ａ　−ａｇｓ／　
ｍａｓＤ　−ｏｃｓ−Ｂ）を得る。

最後に広宿主域プラスミドｐｓＵＰ１０６を制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍ旧とＨｉｎｄＩ［Ｉで線状にする。

線状化後断片１４を連結挿入する。

このプラスミドは次の利点を有する。望みの外来遺伝子
をオビンシンターゼ遺伝子の１つに挿入し、その遺伝子
のプロモーターを外来遺伝子の発現に用い、他方、第２
のオピンシンターゼ遺伝子を形質転換細胞の選別に用い
得る。

このＴ−ＤＮＡ作成に用いる断片獲得方法は前述の実施
例に述べである。断片１，２は実施例２に準じ得たく第
６，７図）。断片４は実施例３（第１０図）、断片１３
は実施例６　（第１５図）に準じて得られる。本実施例
においては断片２と１３を連結し、２つのオクトピンシ
ンターゼ遺伝子と２つの反復ＲｏＴＬ　（Ｂ）配列を逆
方向に含む断片１４を得る（第１７図）。連結断片を再
精製し、正しい方向を制限エンドヌクレアーゼ地図によ
り確認し、この精製、連結断片１４を次いで断片１と４
と混ぜ、すべてのめる要素を含む断片１５（第１７図）
を得る。

断片１５を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌ［と−
〇ａｍＩＩＩで線状化した広宿主域変異ベクターｐｓｕ
ｐｔｏ６に挿入する。選別に利用し得る２つのオクトピ
ンシンターゼ遺伝子の存在は、形質転換細胞またはプロ
トプラストを正常細胞またはプロトプラストの混合物か
らそれらをカナバニンまたは２−アミノエチルシスティ
ンなどの毒性アミノ酸の存在下で増殖させるとき１選別
する可能性を増大させるだろう。

ｐＥｓＬ　（Ｈ，Ｅ、５ｃｈｎｅｐｆ　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｅｕｒ、　Ｐａｔ、＾ｐｐｔ。

６３．９４９．　ＡＴＣＣ３１９９５）をＰｓｔｌで切
りＰｓｔＩで線状化したｍＷＢ２３４４　（Ｗ、Ｍ、Ｂ
ａｒｎｅｓ、　ｅｔ　旦、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　３４９−３６８）
と混ぜ連結する。得られた混合物でエセリシア・コリー
ＪＭ１０３を形質転換し、テトラサイクリン耐性形質転
換株を選別する。２本鎖ＲＦｓ　（複製型）を形質転換
株から単離し制限地図で性格づけをする。２種の転換株
が見出された：　ｍＷＢ２３４４−ＥＳＩ−Ａを保持す
る細胞およびｍＷＢ２３４４−　ＥＳＩ−３を保持する
細胞。これらは１本鎖ウィルスが生じるとき、　ｐＥ５
１の結晶蛋白質遺伝子の反センスおよびセンス鎖を持つ
Ｍ１３ベクターである。

結晶蛋白質遺伝子の配列（下記す参照）　（Ｈ，Ｃ。

Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　（’１’９８３）　Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８　：　１９６０−１９６７）は
、もし３塩基対で変わっておれば、Ｃｌａｌ部位（５”
、、、、ＡＴ”ＣＧＡＴ、、、３°）をＡＴＧ翻訳開始
部位のすぐ手前に有するであろう。オリゴヌクレオチド
（下記ａ参照＞　５’ＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＴＣＧΔＴ
ＧＧ＾ＴＡＡＣ＾３１を標準法で合成しｌｍ−Ｂ２３４
４−ＥＳＩ−Ａの１本鎖ウィルス型とハイブリダイズさ
せ、エセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片によるＤＮＡの第２の鎖の合成の開始に用いる。

　共有閉環状ＤＮＡを連結し選別してのち、その混合物
をＪＭ１０３に導入する。感染細胞から複製型ＤＮＡを
単離し、制限酵素解析により性格づけする。変異配列ｉ
ａｌの子孫であり、それを含むクローンを結晶蛋白質遺
伝子の５”末端に位置する特異なＣ１ａ　Ｉ部位の存在
により同定し、ｍＷＢ２３４４−ＥＳＩ−Ａ（Ｃ１ａ）
と命名した。変異の効果はオリゴヌクレオチドプライマ
ー（ａｌの配列と結晶蛋白質遺伝子の５°末端（ｂｌと
の比較から明らかにされ得る：ａ　）　５’　ＡＴＧＧ
ＡＧＧＴＡＡＺ”ρＧ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＣＡ３’
２３塩基対のうち３つのみが変化している（（ａ）の下
線を引いたヌクレオチド）こと、故に良好なハイブリダ
イゼーション能があることに留意のこと。

結晶蛋白質遺伝子はＣ１ａ　ＩとＸｈｏ　Ｉで分解する
ことでｍＷＢ２３４４−Ｅｓ１−八（Ｃ１ａ）力）ら除
かれる。」橡■粘着末端は通常の方法で合成された以下
の構造を有するリンカ−と連結することによりＣ１ａ　
Ｉ粘着末端に変換される。

Ｘｈｏ　Ｉ　Ｃ１ａ　Ｉ ５’　ＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴ３’ ３’　ＣＧＧＧＴＡＣＧ５” 過剰のリンカ−は結晶蛋白質遺伝子含有断片のＣ１ａ　
Ｉ分解により除去される。

、族１１９：プロモーターベクターの作　とび飾１．６
　ｋｂの遺伝子（Ｃ，Ｆ、Ｆｉｎｋ　（１９８２）　Ｍ
、Ｓ、ｔｈｅｓｊｓ。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍ
ａｄｉｓｏｎ）をコードするＴ−ＤＮＡクローンｐ４０
３　（第３図）に相当するｐＲＫ２９０クローンである
ｐＫｓｌｌｌ、またはｐ４０３自身をＣ１ａ　Ｉで分解
し再結合する。結合混合物をエセリシア・コリーに８０
２　（Ｗ、Ｂ、Ｗｏｏｄ　（１９６６）　Ｊ、Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ。

１６　：　１１８）に導入し、テトラサイクリン耐性で
選別する。プラスミドを“ミニプレソブス″　（小容量
の細胞培養からのプラスミド調製）を行い調製し、構造
を証明するため制限地図を作成する。新しいベクターｐ
ＫＳ−肛虹Ｉ　（Ｔ、Ｃ，Ｈａｌｌ　ｅｔ　旦、、　Ｕ
、Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　５ｅｒｉａｌ
　Ｎｏ、　４８５＋６１４＋ここで参考文献として採用
、参照）はＣ１ａ　Ｉで直線化できる。

上記操作は次の理論に基づいて行われる：　ｐＫｓｌｌ
ｌのＴ−ＤＮＡを要約した形で下に示す：ｕ】　＜　Δ ：　０ 一°ト 且とＩ断片を除くことにより、“１．６　″遺伝子のプ
ロモーター領域は遺伝子の３′下流領域に来る。

この３′領域はポリアデニル化信号を含む。その結果性
じた構造を以下に要約する。

（以下余白） ρ　・　ム ：　ト １０：　ｒｏ■プロモーターの八−ｏｃｓ−Ｂプラスｐ
　Ｋ　Ｓ−」皿１をＥｃｏＲＩで分解し標準手順により
合成された以下の構造を有するＥｃｏＲＩ／　Ｂａｍ旧
リンカ−と混ぜ、連結する。

ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ ３”ＡＡＴＴＣＣＣＣＧ３’ ３’　ＧＧＧＧＣＣＴＡＧ５’ リンカ−を」転層分解で削る。Ｔ　−Ｄ、Ｎ　Ａプロモ
ーター断片をゲル電気泳動で精製後、Ｂｇｌｌｌで線状
化したＡ−ｏｃｓ−８（実施例２．第８図）で混ぜ結合
させる。その混合物でエセリシア・ｈリーＧＭ３３を形
質転換し、クロラムフェニコール耐性株を選択する。こ
の転換株から分離したプラスミドを精製し制限酵素分析
で解析する。プロモーター断片を含むプラスミドをｐＡ
−ｏｃｓ−Ｂ−」皿１と名付ける。

ｐＡ−＋ｑｃｓ−Ｂ−□　ＩをＣ１ａ　Ｉで線状にし、
上で作成したＣ１ａｌ粘着末端を有する結晶蛋白質遺伝
子を含む断片と混ぜ、連結する。得られたプラスミドを
ＧＭ３３に導入する。クロラムフェニコール耐性形質転
換株からプラスミドを単離し制限酵素解析で性格づけす
る。」匹Ｉプロモーターと同一極性で１コピーの結晶蛋
白質遺伝子が存在するプラスミドルへ−ｏｃｓ−［１−
ｐ皿Ｉ−ＥＳＩを含むコロニーを選ぶ。

面−ｏｃｓ−Ｂ−ｐ皿Ｉ−ＥＳＩを適当なアグロバクテ
リウム宿主に導入し、実施例１２に記載のタバコ細胞の
形質転換に使用する。

本実施例の目的は形質転換および非転換細胞混合物から
転換細胞を選別する手順を示すことである。一般的に形
質転換細胞はそのホルモン自己生成増殖により選別され
る。しかしｔｍｓ、　ｔｍｒまたはｔｍｌに変異を受け
たＴｉプラスミドを用いるとき。

形質転換細胞は自己生成性でなく１選択マーカーが必要
である。カナマイシンあるいばＧ４１８耐性はマーカー
の可能性があるが、耐性遺伝子に工夫を加える必要があ
る。他の可能性は外から加えた毒性アミノ酸アナログ、
例えば、２−アミノエチルシスティン（２ＡＥＣ）を無
毒化する酵素、オクトピン合成酵素を用いることである
。本発明では非形質転換組織は低濃度のＡＢＣで死滅す
るが（第５図）、オクトピンシンクーゼを発現するクラ
ウンゴール組織は死滅しない事を明示する。

したがって１本実施例では、ｔｍｓ、　ｔｍｒまたはｔ
ｍｌが変異を受けているが、正常なオクトピンシンター
ゼ遺伝子を含むＴｉプラスミドを使用する。

植物は既報（Ｌ八、Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９
８３）　Ｃｅ１１３２　：　１０３３−１０４３）に従
い植えられた第−茎である。

１０〜１２日後、新鮮な組織をとり液体培養で多（の細
胞が取れ落ちるまで振盪する。次いで培養を濾過し、細
胞小塊を集める。これら塊をホルモンを含むフィーダー
培地の上に置いた濾紙にのせる。

一度細胞が増殖を始めたら、濾紙全体を２ＡＥＣを含ん
だホルモン培地会移す。形質転換細胞はアミノ酸アナロ
グを無毒化するオクトピンシンターゼを発現し、増殖す
るが、非転換細胞は死滅する。

２ＡＥＣで増殖した細胞をとり、オクトピンシンターゼ
を調べる。これらの細胞は次いで再生でき、オクトピン
シンターゼ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡを保持することを示
し得る。

アミノ酸アナログ水溶液をｐＨ５，６〜５．８に調整し
濾過（０，４５μミリポアフィルタ−）除菌する。

順次希釈した各アミノ酸アナログ液を、オートクレーブ
をかけ約６０°Ｃに冷やしたサイトカイニンおよびオー
キシン不含寒天培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ、　Ｅ、Ｍ。

ａｎｄ　Ｆ、Ｓｋｏｏｇ　（１９６５）　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　Ｐｌａｎｔ　８　：　１００−１２７）に加える
。多数の他の植物をアナログの初期選別に用いた。４−
６週令の組織１００■片を３個、５５鰭のペトリ皿のア
ナログ含有培地に置いたが、用いた組織は以下の通り：
ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎ
ｎｕｕｓ）　（ヒマワリ）ｃｖ、″ロシアマモス”の組
織系（Ｋｅｍｐ、　Ｊ、Ｄ、　（１９８２）　Ｉｎ　Ｋ
ａｈｌ。

Ｇ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｓ、５ｃｈｅｌｌ　（ｅｄｓ、）＾
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｌ
ｏｎｄｏｎ、　Ｐａｒｉｓ　ｐｐ、４６１−４７４）　
：ニコチアナ・ツバカムｃｖ、　”サムサン”のＥ２２
８およびＢｏ３４２（Ｓａｃｒｉｓｔａｒ＋＋　Ｍ、Ｄ
、　ａｎｄ　Ｇ、Ｍｅｌｃｈｅｒｓ　（１９７７）　Ｍ
ｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１５２　：　１１１−１１７
）　：ニコチアナ・ツバカムｃｖ、　”ハバナ”のブラ
ウン奇形側（Ｂｒａｕｎ、　Ａ、Ｃ。

ａｎｄ　Ｈ，Ｎ、Ｗｏｏｄ　（１９７６）　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、ユニ　４９６−５００）　：ニコチアナ・
ツバカムｃｖ、“ホワイト　バーレイ”から分離した八
６６（Ｆｉｒｍｉｎ、　Ｊ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，Ｆ
ｅｎ１ｙｉｃｋ　（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ。

Ｌｏｎｄｏｎ　２７６　：　８４２−８４４）　：およ
びオクトピン型アグロバクテリウム・チューメファシエ
ンスへ６または８６３４株あるいはツバリン型Ｃ５８ま
たはＴａ２株によるニコチアナ・ツバカムｃｖ、　”ラ
イスコンシン３８″の腫瘍からＪ、Ｔｏｕｒｎｅｗ、　
ＣＮＲＡ＋　Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓにより分離されたＷ
−Ａ６．　Ｗ−Ｂ６４３　、　Ｗ−Ｃ５８およびＷ−Ｔ
ａ２゜上述のすべての株について得られた結果は本質的
にはニコチアナ・ツバカムｃｖ、“キサンチ”１５９５
５／１および１５９５５／旧株で得られたものと同一で
あった。１５９５５／１および１５９５５１０１腫瘍系
を用いた毒性試験では４−６週令の組Ｐａ５０■を３個
。

９０鰭皿の培地に置いた。すべての場合で２連あるいは
３連の皿を各組織、各アナログ濃度に対して用いた。２
５°Ｃ２暗下で５−７週間増殖後の組織の重量を測定し
た。増殖をアナログまたはアミノ酸を含まない培地での
同じ組織の湿重量の増加に対するパーセントで表示した
。実験は、与えられたアナログについて用いる濃度限界
を定める初めの結果を得た後、繰り返し行った。１５９
５５／１および１５９５５１０１系の実験は少なくとも
２回適当な濃度範囲で繰り返した。

実施例１４ニオピンシンターゼの測定法オクトピンシン
ターゼは既報を少し修正して測定した。（Ｂｉｒｎｂｅ
ｒｇ＋　Ｐ、ｅｔ　ａｌ、（１９７７）Ｐｈｙｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　１６　：　６４７−６５０　；　Ｇｏ
ｌｄｍａｎ、＾。

（１９７７）、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、１０
　：　４９−５８　；　１ｌａｃｋ。

Ｅ、ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、Ｋｅｍｐ　（１９７７）　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ５．７８　：　７８５−７９１　；　Ｌｅｊｅ
ｕｎｅ、Ｂ、（１９６７）　Ｃ，Ｒ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｓｅｒ、　Ｄ、　２６５　：　
１７５３−１７５５　；　０ｔｔｅｎ。

Ｌ、八、Ｂ、Ｍ、ａｎｄ　Ｒ，Ａ、５ｃｈｉｌｐｅｒｏ
ｏｒｔ　（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｔｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　５２７　：　４９７−
５００）。１．５ｎｌエソペンドルフ管内の組織１■当
り３μβの反応緩衝液（０，１５Ｍリン酸カリウム緩衝
液、　ｐＨ６，９）を入れた。この反応混液は２０ｍＭ
　Ｌ−アルボ１２，５０ガラス棒を用い反応混液で注意
深く破壊し，２５°Ｃで１時間反応させた。次いでサン
プルを遠心分離し，上清２μβをワットフッ３ＭＭ濾紙
にスポットした。陰性の結果を示すときには３０μｉま
でスポットした。サンプルおよび既知標準資料としての
１−１０μｇのオクトピン（または他のオビン）。

移動指標としてのオレンジＧをスポットした濾紙を注意
深く電気泳動緩衝液（ギ酸／酢酸／水−３７６／９１，
容量比）でぬらし、　５０−７５ボルト／ｃｍ（Ｇｉｂ
ｓｏｎ　ｌｌｉｇｈ　Ｖｏｌｔａｇｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ＋Ｍｏ１ｌｅｌ
　Ｄ）で１０−２０分間電気泳動した。　次に濾紙を熱
風下で乾かし、フェナンスレンキノン試薬（Ｙａｍａｄ
ａ＋　Ｓ、　ａｎｄ　Ｈ，Δ、Ｉｔａｎｏ　（１９６６
）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Δｃｔａ　、　１３０　：　５３８−
．５４０）または扱口試薬（ＩＥａｓｌｅｙ＋　ＣＪｌ
、（１９６５）Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｅ
ｔａ１０７　：　３８６−３８８）でオフＩ・ビン（ま
たは他のオピン）を染色した。扱口試薬は感度が数倍劣
るが。

グアニジニル化合物により特異的である。上記条件で行
った場合１組織抽出緩衝液（Ｉｌａｃｋ、　Ｅ、　ａｎ
ｄＪ、Ｄ、Ｋｅｍｐ（１９７７）前出　；　０ｔｔｅｎ
、Ｌ、八、Ｂ、Ｍ、ａｎｄ　Ｒ，八。

５ｃｈｉ１ｐｅｒｏｏｒｔ（１９７８）前出）は分析結
果を改良せず。

また事実、大容量のサンプルをスポットした場合。

電気泳動の移動が遅くなった。電気泳動の移動度は原点
（０）とオレンジＧ　（１，０）に対する相対値からめ
た。

（以下余白） トロ叩　ト　寸 尾 トドωω■ｃｃＩ■■■■■ロー　へ 第２表 種々の毒性アミノ酸アナログの存在下 株　培養物　形質転換に用いた １５９　Ｎｏ、１　ニコチアナ・ツバカム　アグロバク
テリウム・ｃｖ、キサンチ　１５９５５株 １５９０−１　同上　同上 ＬＣ５８ニコチアナ・ツバカム　アグロバクテリウム・
ｃｖ、　Ｗｉｓｃ、　３８　Ｇ５８株 Ｗ−８６３４ニコチアナ・ツバカム　アグロバクテリウ
ム・ｃｖ、　Ｗｉｓｃ、　３８　８６３４株での増殖能
試験に用いた組織のリスト ■株　マンノピン　アグロピン チューメファシエンス　−− ＋　＋ チューメファシエンス　−− チューメファシエンス　＋　＋ 第３表 毒性アミノ酸アナログ、グルタミンクーγ−増殖したア
グロピン／マンノピンシンターゼビン／マンノビンシン
クーゼ遺伝子を含まなニコチアナ・タハカ μｇ７ｍｌ 培地　１５９　Ｎｏ、１株（ｂ） 重量（■）　対照に対する％ ０　７２３０ ２．５　５６９０　７８．７ １０　２９００　４０、１ １５　２９００　１６．６ ２０　６６０　９、１ ２５　１００　１．４ ［ａｌ　実験は皿当り３片組織で２連で行っノコ（ｂｌ
　アグロビン／マンノピン陰性 （Ｃ１アグロビン／マンノピン陽性 ヒドラジド（ＧＨ）の種々レヘルの存在下で遺伝子含有
形質転換組織の乾燥重量とアグロい形質転換組織の乾燥
重量の比較 ムｃｖ、キサンチ（ａｌ １５９０−１株（Ｃ１ 重量（ｎｗ）　対照に対する％ ２５０ ８８０　７０．４ １１８０　９４．４ １２００　、９６．０ １０８０　８６．４ ６５０　５２．０ 第４表 毒性アミノ酸アナログ、グルタミンクーγ−増殖したア
グロピン／マンノピンシンターゼコビン／マンノピンシ
ンクーゼ遺伝子を含まな１ニコチアナ・タパカ。

μｇ７ｍｉｌ 培地　Ｗ−Ｃ５８株ｆｂ１ 重量（■）　対照に対する％ ０　１１００ ２．５　６１０　５５．５ ５　２００　１８．２ １０　死滅 １５　死滅 ２０　死滅 ２５　死滅 （ａｌ　実験は皿当り３片組織で２連で行った（ｂｌ　
アゾロピン／マンノピン陰性 （ｃｌ　アグロピン／マンノピン陽性 ニドラジド（ＧＨ）の種々レベルの存在下でｈ転子含有
形質転換組織の乾燥重量とアグロ・）形質転換組織の乾
燥重量の比較 Ｌ　ＣＶ、ライスコンシン３８（ｂｌ 讐−８６３４株ｆｃ１ 重量（■）　対照に対する％ ６７０ ９２０　５５、１ １３００　７７．８ ９２０　５５、１ ６２０　３７、１ ４３０　２５．７ ５８０　３４．７ 第５表 毒性アミノ酸アナログ、Ｓ−カルバミル−■。

で増殖したアグロピン／マンノピンシンターロピン／マ
ンノピンシンターゼ遺伝子ヲ含まニコチアナ・タハ μｇ／ｍβ 培地　１５９　Ｎｏ、１株（ｂ１ 重量（■）　対照に対する９４ ０　７２３０ ６　７８００　１０７．９ １２　６７２０　９２．９ ２５　５００　６．９ ５０　５００　６．９ １００　４００　５．５ （ａｌ　実験は皿当り３片組織で２連で行ったｆｂｌ　
アゾロピン／マンノビン陰性 （Ｃ１アゾロピン／マンノビン陽性 −システィン（ＣＣ）の種々レベルの存在下ゼ遺伝子含
有形質転換組織の乾燥重量とアゲない形質転換組織の乾
燥重量の比較 カムＯＶ、キサンチ（ａｌ １５９０−１株ｔＣ） 重量（■）　対照に対する％ ２５０ １１８０　９４．４ １６４０　１３１．２ １１６０　９２．８ １４００　１１２．０ １．７１０　、　１３６．８ 第６表 毒性アミノ酸アナログ、Ｓ−カルバミル−で増殖したア
グロピン／マンノビンシンタ・ロピン／マンノピンシン
ターゼ遺伝子を含：ニコチアナ・タハ μｇ　／ｍβ 培地　−０５８株（ｂｌ 重量（■）　対照に対する ０　、１１００ ６　２７０　２４．５ １２　１０４０　９４．５ ２５　２２０　２０．０ ５０　死滅 １００　８０　７．３ （ａｌ　実験は皿当り３片組織で２連で行つ（ｂｌ　ア
ゾロピン／マンノピン陰性 （Ｃ１７グロピン／マンノピン陽性 、−システィン（ＣＣ，）の種々レヘルの存在下−ゼ遺
伝子含有形質転換組織の乾燥重量とアゲ１、ない形質転
換組織の乾燥重量の比較りムｃｖ、ウィスコンシン３８
　（ａｌＷ　−８６３４株（Ｃ１ １ぢ　重量（■）　対照に対する％ ６７０ １８９０　１１３．２ １４４０　８６．２ １７２０　’　１０３．０ ２０００　’　１１９．８ ２５８０　１５４．５ た 第７表 毒性アミノ酸アナログ、６−ジアシー５−オ存在下で増
殖したアゾロピン／マンノピンシロピン／マンノピンシ
ンターゼ遺伝子を含まニコチアナ・タパ μｇ／ｌｔ＃１ 培地　１５９　Ｎｏ、１株（ｂ１ 重量（ｍｇ）　対照に対する％ ０　７２３０ ０、吋５　５２６（１７２，８ ０，０３２４７０３４，２ ０，０６２８８０３９，８ ０，１２９０１，２ ０、２５６００，８ ０、５０死滅 １．０　死滅 ２．０　死滅 （ａｌ　実験は皿当り３片組織で２連で行った（ｂ）　
アゾロビン／マンノビン陰性 ＋０１　アゾロビン／マンノピン陽性 キソーＬ−ノルロイシン（ＤＯＮ）の種々レヘルのンタ
ーゼ遺伝子含有形質転換組織の乾燥重量とアゲない形質
転換組織の乾燥重量の比較 カムｃｖ、キサンチ（ａｌ １５９０−　１　株（Ｃン 重量（■）　対照に対する％ １２５０・ １２３０　９８．４ １３３０　１０６、４ １１８０　９４．４ ６００　４８．０ ３００　２４．０ １４０　１１．２ １００　８．０ ３００　２４．０ 第８表 毒性アミノ酸アナログ、６−ジアシー５−オ存在下で増
殖したアゾロピン／マンノピンシロピン／マンノピンシ
ンターゼ遺伝子を含まニコチアナ・ツバカ μｇ／ｍｆｆ 培地　Ｗ−Ｃ５８株ｆｂ１ 重量（■）　対照に対する％ ０　１１００ ０．０１５　２５０　２２．７ ０．０３　５４０　４９．１ ０．０６　１２０　１０．９ ０．１２　死滅 ０．２５　死滅 （ａｌ　実験は皿当り３片組織で２連で行った（ｂｌ　
アグロピン／マンノピン陰性 （Ｃ）　アグロピン／マンノピン陽性 キソーＬ−ノルロイシン（ＤＯＮ）の種々レヘルのンタ
ーゼ遺伝子含有形質転換組織の乾燥重量とアゲない形質
転換組織の乾燥重量の比較 ムＣシ、ウィスコンシン３８　（ａｌ 匈−８６３４株（Ｃ１ 重ｉｔ（ｍｇ）　対照に対する％ ６７０ ４７０　２８、１ ２７０　１６．２ ３６０　２１．６ ２００　１２．０ １２０　７．２ ４、ヌ面の節゛な言゛■ 第１図はホモアルギニン存在下での形質転換オクトピン
シンターゼ産生細胞の増殖を正常細胞に比較して示すグ
ラフ、第２図はｐＴ１１５９５５のＴ−ＤＮＡ領域の全
塩基配列図、第３図はｐＴ１１５９５５の制限酵素地図
、第４図はカナバニン存在下での形質転換オクトビンシ
ンターゼ産生細胞の増殖を正常細胞に比較して示すグラ
フ、第５図ば２−アミノエチルシスティン存在下での形
質転換オフ１−ビンシンターゼ産生細胞の増殖を正常細
胞に比較して示すグラフ、第６図、第６図ｔａ）および
第７図片４．断片６．断片８．断片９．断片１１．およ
び断片１３の作成手順を示す模式図、第１６図はＡ−ａ
ｇｓ／ｍａｓ−Ｄ−ｏｃｓ−Ｂの構造を示す模式図、第
１７図は八−ｏｃｓ−Ｂ−Ｂ−ｏｃｓ−Ｄの作成手順を
示す模式図である。

以上 代理人　弁理士　山本秀策 Ｆｉｇ、２２− １Ｆｉ、２２− ２Ｆｉ、２２− ３Ｆｉ、２−４ ＋＋；−１〒−Ｈ＋；＋Ｈ＋ＭＰ＋Ｗｕｙｅｔｍａｌ！
’ｌ＋ｅｅ’ｌｕｅ＆Ｍｎ’？ＩＪＪＪＪＡζａａｘｃ
ａａｃｃａｃｃｍｒａｒａｃｏ５０ＣＴＣζ＾＾＾Ｃ；
１６」Ｅシ〔）Ｃ）トｊ９．２２− ５Ｆｉ、２−６ エ冑　殖の　すす、Ｅ、’ｌ　ｉｓす丁ローＬ！　殖の
　１１幌　１＝バ万３　ンろ（断片　の Ｆｊ９．７ （断片４） Ｆｉｇ、　１０ （断）＋９） Ｆｉｇ、１３ １ （断片１１） Ｆｉｇ、　１４ （断Ｈ１２） （〔片１３） Ｆｉｇ、１５ Ｋｐｎ　Ｉ Ｆｉ９．１６ Ｆｊ９．１７ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整／／Ｃ０１２Ｎ
　５７００ Ｃ１２Ｒ１：９１） ０発　明　者　リチャード　エフ・ベ　アメリカ合；イ
カ−ラフトン 着国　ライスコンシン　５３７１６　マジソン、グロー
ド　１７１８ 手続補正書（方式） １．事件の表示　昭和５９年特許願第１９３８４１号２
．発明の名称 オピンシンターゼ遺伝子を用いた選別 ３．補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　コロラド８０３０１−２２４４
ボールダー，ミンチェル　レーン３３７５名称　アグリ
ジェネティクス　リザーチアソシエイツ　リミテソド ｛｛Ｊｔ者　デール　ジェイ．ハンセン国籍　アメリカ
合衆国 ４．代理人　〒５３０ 住所　大阪府大阪市北区西天満４丁目３番１７号５．補
正命令の日付く発送日） 昭和６０年１月２９日 ６．補正により増加する発明の数：０ ７．補正の対象 図面（第２図）および法人証明書 ８．補正の内容 第２図（図中の文字を大きくした。内容に変更なし）お
よび法人証明書（訳文添イ１）は別紙のとおり。

１ＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＣＭＧＧＣＣＡＣ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、オピンシンターゼ遺伝子とＴ−ＤＮＡの繰り返し配
   列に隣接する外来ＤＮＡ区分とを有するＤＮＡ区分を含
   む抗生物質感受性形質転換植物細胞を有する植物。 ２、オピンシンターゼ遺伝子がオクトピンシンターゼで
   ある特許請求の範囲第１項に記載の植物。 ３、オピンシンクーゼ遺伝子がアグロピン／マンノピン
   シンターゼである特許請求の範囲第１項に記載の植物。 ４、オピンシンターゼ遺伝子がツバリンシンターゼであ
   る特許請求の範囲第１項に記載の植物。 ５、前記隣接Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ繰り返し配列が繰り返し
   配列ＲｏＴＬ（Ａ）、　ＲｏＴＬ（Ｂ）、　ＲｏＴＲ（
   Ｃ：）またはＲｏＴＲ（Ｄ）の群から選択された特許請
   求の範囲第１項に記載の植物。 ６、前記隣接Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列が前記ＤＮＡ断片
   の各末端で同一である特許請求の範囲第５項に記載の植
   物。 ７、オピンシンターゼ遺伝子とＴ−ＤＮＡの繰り返し配
   列に隣接している外来ＤＮＡとを有するＤＮＡ断片を含
   む形質転換、抗生物質感受性植物細胞。 ８、前記オピンシンターゼ遺伝子がオクトピンシンター
   ゼである特許請求の範囲第７項に記載の形質転換、抗生
   物質感受性植物細胞。 ９、前記オピンシンターゼ遺伝子がアグロピン／マンノ
   ビンシンターゼである特許請求の範囲第７項に記載の形
   質転換、抗生物質感受性植物細胞。 ・ｌＯ０前記前記オレンシンターゼ遺伝子バリンシンタ
   ーゼである特許請求の範囲第７項に記載の形質転換、抗
   生物質感受性植物細胞。 １１、前記隣接Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列が繰り返し配列
   ＲｏＴＬ（Ａ）、　ＲｏＴＬ（Ｂ）、　ＲｏＴＲ（Ｃ）
   またはＲｏＴＲ（Ｄ）の群から選択された特許請求の範
   囲第７項に“記載の形質転換、抗生物質感受性植物細胞
   。 １２、前記隣接Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列が前記ＤＮＡ断
   片の各末端で同一である特許請求の範囲第１１項に記載
   の形質転換、抗生物質感受性植物細胞。 １３、オピンシンターゼ遺伝子とＴ−ＤＮＡ繰り返し配
   列に隣接する外来ＤＮＡ区分とを有するＤＮＡ断片を含
   む形質転換、抗生物質感受性プロトプラスト。 １４、前記オピンシンターゼ遺伝子がオクトビンシンタ
   ーゼである特許請求の範囲第１３項に記載の形質転換、
   抗生物質感受性プロトプラスト。 １５−　前記オピンシンターゼ遺伝子がアグロビン／マ
   ンノビンシンターゼである特許請求の範囲第１３項に記
   載の形質転換、抗生物質感受性プロトプラスト。 １６　、　前記オピンシンターゼ遺伝子がツバリンシン
   ターゼである特許請求の範囲第１３項に記載の形質転換
   、抗生物質感受性プロトプラスト。 １７、前記Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列が繰り返し配列Ｒｏ
   ＴＬ（八）、　ＲｏＴＬ（Ｂ）、　ＲｏＴＲ（Ｃ）また
   はＲｏＴＲ（Ｄ）の群から選択された特許請求の範囲第
   １３項に記載の形質転換、抗生物質感受性プロトプラス
   ト。 １８、前記Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列が前記ＤＮＡ断片の
   各末端で同一である特許請求の範囲第１３項に記載の形
   質転換、抗生物質感受性プロトプラスト。 １９、オピンシンターゼ遺伝子とＴ−ＤＮＡ繰り返し配
   列に隣接した外来ＤＮＡ区分とを有する挿入ＤＮＡ断片
   を含むプラスミドであり、該Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列に
   隣接した該挿入ＤＮＡ断片の外側に抗生物質耐性遺伝子
   をさらに有するプラスミド。 ２０、前記オピンシンターゼ遺伝子がオクトビンシンタ
   ーゼである特許請求の範囲第１９項に記載のプラスミド
   。 ２１、前記オピンシンターゼ遺伝子カアグロビン／マン
   ノピンシンターゼである特許請求の範囲第１９項に記載
   のプラスミド。 ２２、前記オピンシンターゼ遺伝子がツバリンシンター
   ゼである特許請求の範囲第１９項に記載のプラスミド。 ２３、前記隣接Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列が繰り返し配列
   ＲｏＴＬ（Ａ）、　ＲｏＴＬ（Ｂ）、　ＲｏＴＲ（Ｃ）
   またはＲｏＴＲ（Ｄ）の群から選択された特許請求の範
   囲第１９項に記載のプラスミド。 ２４、前記隣接Ｔ−ＤＮＡ繰り返し配列が前記ＤＮＡ断
   片の各末端で同一である特許請求の範囲第２３項に記載
   のプラスミド。 ２５、前記抗生物質耐性遺伝子がクロラムフェニコール
   耐性である特許請求の範囲第１９項に記載のプラスミド
   。 ２６、前記抗生物質耐性遺伝子がアンピシリン耐性であ
   る特許請求の範囲第１９項に記載のプラスミド。 ２７、前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性であ
   る特許請求の範囲第１９項に記載のプラスミド。 ２８ｉａ）正常および形質転換細胞混合物をオピンシン
   ターゼにより代謝され得る毒性アミノ酸アナログを含む
   適当な増殖培地に置くこと；（ｂ）該正常および形質転
   換細胞混合物を該毒性アミノ酸アナログを含む該適当な
   増殖培地で選択された期間増殖させること； （Ｃ１該正常および形質転換細胞混合物の増殖により生
   じる細胞のコロニーを選別すること。 を包含する正常および形質転換細胞の混合物からオピン
   シンクーゼをコードする遺伝子を含むＴ−ＤＮＡにより
   形質転換された植物細胞を選別する方法。 ２９、前記Ｔ−ＤＮＡが１個あるいはそれ以上の繰り返
   し配列ＲｏＴＬ（Ａ）、　ＲｏＴＬ（Ｂ）、　ＲｏＴＲ
   （Ｃ）、ＲｏＴＲ（Ｄ）およびいずれかのオピンシンタ
   ーゼ遺伝子を有する何らかの遺伝子操作されたＴ−ＤＮ
   Ａ構成である特許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０、前記毒性アミノ酸アナログがカナハニンである特
   許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３１、前記毒性アミノ酸アナログが２−アミノエチルシ
   スティンである特許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３２、前記毒性アミノ酸アナログがグルタミツクーＴ−
   ヒドラジドである特許請求の範囲第２８項に記載の方法
   。 ３３．前記毒性アミノ酸アナログがＳ−力ルハミルーし
   一システィンである特許請求の範囲第２８項に記載の方
   法。 ３４、前記毒性アミノ酸アナログが６−ジアシー５−オ
   キソ−し−ノルロイシンである特許請求の範囲第２８項
   に記載の方法。 ３５、前記オピンシンターゼ遺伝子がオクトビンシンタ
   ーゼ遺伝子である特許請求の範囲第２８項に記載の方法
   。 ３６、前記オビンシンターゼ遺伝子がアグロビン／マン
   ノピンシンターゼ遺伝子である特許請求の範囲第２８項
   に記載の方法。 ３７、前記オピンシンターゼ遺伝子がツバリンシンター
   ゼ遺伝子である特許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３８ｉａｌ正常および形質転換プロトプラスト混合物を
   オピンシンターゼにより代謝され得る毒性アミノ酸アナ
   ログを含む適当な増殖培地に置くこと； （ｂｌ該正常および形質転換プロトプラスト混合物を該
   毒性アミノ酸アナログを含む適当な増殖培地で選択され
   た期間増殖させること；（Ｃ１該正常および形質転換プ
   ロトプラスト混合物の増殖により生じるプロトプラスト
   のコロニーを選別すること。 を包含する正常および形質転換プロトプラスト混合物か
   らオピンシンターゼをコードする遺伝子を含むＴ−ＤＮ
   Ａにより形質転換されたプロトプラストを選別する方法
   。 ３９、前記Ｔ−ＤＮＡが１個あるいはそれ以上の繰り返
   し配列ＲｏＴＬ（Ａ）、　ＲｏＴＬ（Ｂ）、　ＲｏＴＲ
   （Ｃ）、ＲｏＴＲ（Ｄ）およびいずれかのオピンシンタ
   ーゼ遺伝子を有する何らかの遺伝子操作されたＴ−ＤＮ
   Ａ構成である特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 ４０、前記毒性アミノ酸アナログがカナバニンである特
   許請求の範囲第３８項に記載の方法。 ４１、前記毒性アミノ酸アナログが２−アミノエチルシ
   スティンである特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 ４２、前記毒性アミノ酸アナログがグルタミソクーＴ−
   ヒドラジドである特許請求の範囲第３８項に記載の方法
   。 ４３、前記毒性アミノ酸アナログがＳ−カルバミル−Ｌ
   −システィンである特許請求の範囲第３８項に記載の方
   法。 ４４、前記毒性アミノ酸アナログが６−ジアシー５−オ
   ｌ／−Ｌ−ノルロイシンである特許請求の範囲第３８項
   に記載の方法。 ４５、前記オピンシンターゼ遺伝子がオクトビンシンタ
   ーゼ遺伝子である特許請求の範囲第３８項に記載の方法
   。 ４６、前記オピンシンターゼ遺伝子がアグロピン／マン
   ノピンシンターゼ遺伝子である特許請求の範囲第３８項
   に記載の方法。 ４７、前記オピンシンターゼ遺伝子がツバリンシンター
   ゼ遺伝子である特許請求の範囲第３８項に記載の方法。