PT79191B - Selection method using opine synthase genes - Google Patents

Description

Descrição Detalhada do Invento", Van Slogteren et al., (Van Slogteren, G. M.S. (1982) Plant Mol. Biol. j_ :133-142) divulgou que a homoarginina era menos tóxica para células transformadas do que para células normais. Apesar da homoarginina ser um substrato da octopina sintetase (Otten, L.A.B, (1979) Ph. D. Thesis, University Leyden, Nether lands; Petit, A. et a 1 ., ( 1966) Compt. Rend. Soc. Biol.(Paris)

160: 1806-1807), em experiências independentes não obtivemos uma selecção de células transformadas através da utilização de homoarginina. Foi observada pouca ou nenhuma selectividade pela homoarginina relativamente aos tecidos contendo octopina sintetase comparado com outros tecidos de galhas em coroa ou tecidos normais (Fig. 1). Estes resultados obtidos por nós independentemente sugerem que seja improvável a utilização satisfatória de análogos de aminoácidos na selecção de tecidos e células transformadas .

Sumário do Invento

Este invento serve-se de construções de T-DNA não repetitivos do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens para transferir genes estranhos a serem expressos em novas plantas e para reconhecer células transformadas contendo tais genes estranhos inseridos nos seus genomas através da selecção de um gene inalterado de opina sintetase do T-DNA. Tal selecção das células transformadas tendo genes estranhos pode ser feita sem o desenvolvimento de tecidos tumorais que tornem difícil a regeneração da planta e sem espalhar genes de resistência a antibióticos pela população de plantas.

Estas construções de T-DNA podem conter apenas as repetições de nucleotídeos directas as quais estão envolvidas na integração do T-DNA no genoma da planta e um ou mais genes de opina sintetase que são usados na selecção para detectar e isolar células transformadas.

De preferência, estas construções de T-DNA contêm um local versátil de ataque por endonucleases de restrição com extremidades coesivas que são compatíveis com as extremidades coesivas de uma série de endonucleases de restrição e que pode portanto ser usado para a inserção de fragmentos de DNA estranho obtidos com a ajuda de diferentes endonucleases de restrição. Nestas construções de T-DNA os genes que originam tumores podem ser removidos e os genes de resistência a antibióticos podem não ser utilizados.

Na presença de um análogo de amino£ eido tóxico, células normais não transformadas são incapazes de crescer em meio de cultura ou apenas capazes de crescer extremamente devagar, enquanto que as células transformadas contendo um ou mais genes de opina sintetase são capazes de desentoxicar o análogo de aminoácido tóxico e portanto são capazes de crescer. A difererça entre as taxas de crescimento das células normais e transformadas é nítida quando se usa uma série de análogos de aminoácidos tóxicos para seleccionar células ou protoplastos transformados. Na ausência de genes indutores de tumores é mais fácil regenerar plântulas a partir de células ou protoplastos em cultura de tecidos.

Ainda as construções de T-DNA usadas neste novo invento permitem o reconhecimento de células ou protoplastos vegetais que incorporaram apenas partes do T^-DNA, apenas partes do T_R-DNA ou partes quer de T^-DNA quer de Tp-DNA. Uma vez que no genoma de células vegetais transformadas se encontra com frequência múltiplas cópias

de TR-DNA esta característica tão desejada poderá ser usada quando fôr necessário um elevado nível de expressão de genes estranhos.

Descrição Detalhada do Invento

Este invento relaciona-se com construções de plasmídeos recombinantes derivados da região do T-DNA de plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens. Estes plasmídeos recombinantes contêm uma região de repetição directa esquerda e direita envolvida na transferência do T-DNA do plasmídeo Ti para o genoma da planta assim como do gene da octopina sintetase, o qual normalmente catalisa a condensação de um aminoácido com piruvato, e/ou os genes de agropina/manopina sintetase os quais normalmente catalisam a condensação de um aminoácido com um açúcar. As construções de plasmídeos recombinantes preferidas aqui descritas não apresentam especificamente os genes que controlam a formação de tumores e cada construção contem um único local BglII no qual podem ser inseridos fragmentos de DNA estranho codificadores de um ou mais genes funcionais de procariotas ou eucariotas. Outras construções contendo outros locais de restrição, substituindo ou em adição ao local Bgl 11 podem ser incluídas como se compreenderá pelos entendidos na matéria.

Células vegetais que tenham sido infectadas por A. tumefaciens transportando estes plasmídeos

recombinantes construídos podem ter incorporada a secção de T-DNA. Quando os genes de formação de tumores foram excisados ou tornados inoperáveis, as células contendo T-DNA não apresentam a morfologia e as condições de crescimento alteradas que normalmente permitem distinguir células transformadas de células não transformadas. Para reconhecer

quais as células vegetais que incorporaram secções de T-DNA destes plasmídeos recombinantes construídos sem possuírem os genes tumorais nos seus genomas, as células vegetais são cultivadas na presença de certos análogos de aminoácidos aqui divulgados. As células que transportam um ou mais de certos genes de opina sintetase podem metabolizar o análogo de aminoácido tóxico originando um produto não tóxico e serão portanto capazes de continuar a crescer enquanto que as células que não contem tais genes de opina sintetase incorporarão o análogo de aminoácido tóxico nas suas proteínas resultando na morte de tais células.

Para se ser capaz de construir com precisão uma variedade de plasmídeos recombinantes com T-DNA com as caracteristicas descritas atrás, determinou-se toda a sequência de nucleotídeos do T-DNA (22 874 nucleotídeos) e aproximadamente 900 nucleotídeos, de cada lado do T-DNA. Foram subclonados em pBR322 uma série de fragmentos de restrição do T-DNA e propagados em qualquer das estirpes de E.coli HB101 ou GM33. Os clones individuais foram então sequenciados usando o método de Maxam e Gilbert /<1977) Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 74: 5607 (ver Exemplo 1).

E apresentada (Fig. 2) a sequência de nucleotídeos de uma porção do plasmídeo Ti 15955, contendo a região do T-DNA. E apresentada apenas uma cadeia da sequência do DNA. Está orientada de 5' para 3' e estende-se continuamente ao longo de 24595 bases, a partir de um local BamHl à esquerda do fragmento Bam8 até um local EcoRI â direita do fragmento EcoD (Fig. 3). Ambas as cadeias foram sequenciadas para 90% do DNA. Os restantes 10% foram sequenciados numa cadeia mas isto foi muitas vezes duplicado através da sequenciação a partir de diferentes locais de restrição.

P'RTtjCA!

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Κι<ίΛ A/

Ε apresentado (Fig. 3) um mapa de endonuclease de restrição da região sequenciada para cinco enzimas de restrição diferentes. BamHI , EcoRI e HindIII foram usadas para dividir a região do T-DNA em fragmentos adequados â subclonagem em pBR322. Os fragmente, indicados pelas áreas sombreadas, foram usados na construção de recom binantes de T-DNA cionados em pSUP106 para transferência e subsequente replicação em A. tumefaciens. A construção destes recombinantes de T-DNA foi facilitada pelo conhecimento dos outros locais de endonucleases de restrição (Tabela 1). Das 73 enzimas analisadas, apenas os locais para EcoK não estavam presentes na sequência Ti. Não são dadas as localizações dos sítios de enzimas que digerem o DNA mais do que 30 vezes.

Foi divulgado que longas repetições directas de 21-25 bases ocorrem nas extremidades do T-DNA (bevan, M.W. e Chilton, M-D. (1982) Ann. Rev. Genet.

16: 357-384). Neste trabalho, estas duas repetições verificou-se começarem nas posições 909 e 23783, respectivamente, e estão marcadas nas posições A e D. (Fig. 3). Estas duas repetições são referidas como RoTL(A) e RoTR(D). Elas são repetições directas exactas de 12 bases mas podem ser consideradas repetições imperfeitas de 24 bases. Assumindo que as repetições RoTL(H) e RoTR(D) estabelecem os limites externos, o comprimento total da região T é de 22874 nucleotídeos. Estas sequências repetitivas dos extremos ocorrem em plasmídeos Ti quer do tipo octopina quer do tipo nopalina e desempenham um papel fundamental na transferência da região T para o genoma da planta. No presente estudo, encontraram-se sequências repetitivas semelhantes em dois locais dentro da regiãoTnas posições 14 060 (B) e 15 900 (C). Estas duas repetições são designadas RoTL(B) e RoTR(C). A presença destas repetições internas é especialmente interessante por se observar que o T-DNA em células de galhas

em coroa que sintetizam octopina tem uma organização complexa envolvendo uma (TL-DNA) ou duas (TL-DNA e TR-DNA) regiões (DE Beuckeleer, M, et a 1. (1981) Mol. Gen. Genet.

183: 283-288; Thomasbow, M.E. et al. (1980) Cell 19:729-739) 0 TL-DNA contem os genes indutores de tumores (tms, tmr e tml) e surge em todas as linhas de tumor até agora examinadas enquanto que o TR-DNA surge apenas em tumores primários e nalgumas linhas estáveis de tumores. 0 facto destas duas regiões de T-DNA parecerem conseguir integrar-se independentemente e de ambas serem delimitadas pelas repetições básicas constitui evidência adicional do seu papel fundamental na transferência do T-DNA do plasmídeo Ti para o genoma da planta. A sequência de nucleotídeos da quatro repetições está aqui apresentada.

Repetição Sequência de Nucleotídeos

RoTL(A)

GGCAGGATATATTCAATTGTAAAT

RoTL(B)

GGCAGGATATATAC CGTTG TA ATT

RoTL(C)

GGCAGGATATATCGAGGTGTAAAA

RoTL(D)

ãâÇ.AG.âAIAI^AIGCGGTTGTAATT

Dentro de toda a região T há 26 fase de leitura abertas (Fig. 3) maiores que 300 nucleotídeos e que começam com um codão de iniciação ATG. Estes possíveis produtos de transcrição codificariam polipeptídeos entre 11,2 quilodaltons e 8,38 quiIodaltons. Catorze destas fases de leitura abertas apresentam possíveis sequências de promotores eucarióticos com estreita homologia com a sequência ("box") de Goldberg-Hogness. Elas apresentam também uma concordância estreita com o possível local de ligação aos ribossomas dos eucariotas, divulgado por Kozak (M.Kozak (1978) Cell j_5: 1109-1 123; Kozak, M. /(1979) Nature(London) 280: 82-857 e contêm possíveis locais de adição de poli(A) nas suas extremidades 3' que se pensa actuarem como sinais de terminação da transcrição (Brawerman, G. (1974) Ann. Rev. Bio chem. 43: 621-642; ( 1975) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol.J_7: 117-148. A fase de leitura aberta "codifica a octopina sintetase enquanto que as fases de leitura 24,25 e 26 codificam as manopina e agropina sintetases. E de notar que todos os possíveis produtos de transcrição eucarióticos surgem dentro das regiões do TL e TR-DNA. As fases de leitura abertas entre as repetições directas RoTL(B) e RoTR(C) e também para a direita de RoTR(D) e para a esquerda de RoTL(A) apresentam possíveis locais de Shine-Dalgarno ligação aos ribossomas parecendo assim serem de origem procariótica.

A informação possibilitada pelo presente invento como descrito atrás permite a construção de uma variedade de plasmídeos recombinantes eminentemente úteis na transferência de genes estranhos e/ou DNA estranho para o genoma de células vegetais receptoras. Genes estranhos e/ou DNA estranho são aqui definidos como sequências nucleotídicas de DNA que normalmente não estão presentes no T-DNA de um plasmídeo Ti. 0 conhecimento da sequência de nucleotídeos proporciona informação sobre a localização das regiões promotoras dos vários genes e os limites das fases de leitura abertas e também, como corolário, também

dá a sequência de aminoáeidos e pesos moleculares das várias proteínas codificadas. Adicionalmente a sequência de nucleotídeos permite situar todas as regiões de repetições directas que são de importância vital para a transferência do T-DNA (incluindo vários genes estranhos e/ou DNA estranho) do plasmídeo Ti para o genoma da célula vegetal. Os Exemplos 2-7 dão detalhes da construção de uma série de T-DNAs recombinantes úteis que podem ser inseridos num plasmídeo com uma gama longa de hospedeiros. Em cada uma destas construções existem locais de restrição únicos adequa damente situados para a inserção de DNA estranho contendo um ou mais genes. Em adição, os genes de resistência a antibió ticos são incorporados na região vector do plasmídeo recombinante, i.e., fora das regiões repetitivas do T-DNA a qual inclui o gene selectivo de opina sintetase e o DNA estranho e/ou genes estranhos.

Uma nova característica destas construções de T-DNA recombinante é que os genes indutores de tumores (tms, tmr e tml) são de preferência destituídos de algumas sequências ou inactivados daí resultando uma maior facilidade na regeneração de plantas completas a partir de células transformadas. No entanto torna-se também mais dificil a distinção entre células transformadas e células normais uma vez que já não formam tumores e portanto um novo método de selecção tem de ser conseguido. Van Slogteren et al. /(1982) Plant Mol. Biol.J_: 133-1427 transformou células vegetais em células tumorais sintetizadoras de octopina após infecção com uma estirpe de A. tumefaciens portado ra de um plasmídeo Ti do tipo octopina.

-18Eles reivindicaram que quando pequenos rebentos normais e rebentos de galhas em coroa contendo octo pina sintetase eram transferidos para meios de agar sólido contendo vários níveis de homoarginina (HA), o crescimento de rebentos normais era claramente inibido após duas a três semanas. Ao contrário os rebentos de galhas em coroa não eram nada inibidos nas concentrações baixas de homoarginina e apenas ligeiramente inibidos nas concentrações mais altas.

Van Slogteren et a 1 ./(1982) supra7 também testaram o efeito da homoarginina em protoplastos normais e galhas em coroa recentemente isolados. Após três semanas observaram uma diferença clara (microscópicamente) no crescimento de protoplastos normais comparado com os de galhas em coroa. Em sete experiências os protoplastos de galhas em coroa não mostraram inibição do crescimento dificilmente foi observada qualquer diferença nas culturas de galhas em coroa na presença ou na ausência de HA enquanto que nas culturas normais em HA a taxa de sobrevivência foi estimada em 10% ou menos.

Experiências independentes realizadas por nós deram resultados diferentes. As linhas 15955/1 e 15955/01 de tumores do tipo galhas em coroa foram usadas para estes estudos; estes tecidos são derivados de clones de uma única célula obtidos a partir de tumores induzidos em N. tabacum cv. "Xanthi" por A. tumefaciens estirpe 15955 (Gelvin, S.B. et al.. (1982) Proc. Nat. Acad. Sei.

U.S.A. 79 76-80). Ambas as linhas crescem em meio sem citoquininas e auxinas e ambas contêm T-DNA. No entanto, não se encontrou octopina na linha 15955/1, enquanto que foi encontrada na linha 15955/01 reflectindo o facto de o gene da octopina sintetase não estar presente na primeira linha, enquanto que está presente na última. A presença de octopina sintetase na linha 15955/01 e a sua ausência na

linha 15955/1 foi mais tarde confirmada. Assim estas duas linhas são ideais para testar se o análogo tóxico homoarginina pode ou não ser usado para seleccionar genes contendo octopina sintetase como reivindicado por Van Slogteren et a 1. (supra). Como se pode ver pela Figura 1 a homoarginina afectou práticamente do mosmo modo o crescimento das duas linhas tumorais. Claramente o tecido de uma linha contendo o gene da octopina sintetase não se distinguia de uma linha sem o gene da octopina sintetase. A razão para a discrepância entre os nossos resultados e os de Van Slogteren et al. é neste momento pouco clara.

Surpreendentemente outras experiências com uma série de outros análogos de aminoácidos mostraram que a selecção de células vegetais transformadas contendo octopina sintetase era satisfatória com alguns dos análogos mas não com outros.

As diferenças relativas no crescimento dos tecidos no meio que continha ácido L-2,4-diamino-n-butírico (um análogo da L-ornitina)ou 2-tiazolilalanina (um análogo da histidina) eram pequenas e inconsistentes de experiência para experiência.e o trabalho com estes análogos foi abandonado.

As mesmas duas linhas de cultura de tecidos (i.e., 15955/1 e 15955/01)como foram usadas para testar as capacidades selectivas da homoarginina, foram também usadas para testar as capacidades selectivas da canavanina-SO^ (também um análogo da arginina) e 2-aminoetil cisteina (um análogo da L-lisina). Face ao fracasso da selecção de células com capacidade para sintetizar octopina sintetase por crescimento em meio contendo homoarginina foi ainda mais surpreendente encontrar um considerável grau de selecção de tais células quando os testes foram conduzidos

em canavanina-SO^ (CS) (Fig. 4). Ainda mais surpreendente foi a selecção poderosa e absoluta de células transformadas produtoras de opina sintetase quando a selecção era feita em meio contendo mesmo concentrações muito baixas de 2-aminoe tilcisteina (HEC) (Fig. 5). Estes dois análogos de aminoácidos (CS e AEC) podem ser usados para seleccionar células transformadas e regeneração de plantas obtidas a partir destas culturas de tecidos ou protoplastos transformados.

Ainda a mesma abordagem de selecção é útil para os genes de agropina sintetase. Agropina e manopina parecem derivar da condensação de glutamina com um açúcar e resultados deste invento também demonstraram claramente que quando os genes de agropina/manopina sintetase estão presentes nas células transformadas então a utilização de um análogo de aminoácido tóxico permite distinguir células transformadas de células normais. Em principio a nopalina sintetase poderá ser usada para desentoxicar um análogo tóxico adequado do seu substrato arginina para se conseguir selecção como foi descrito. Até à data ainda não foi identificado um análogo adequado.

Foram testadas uma série de estirpes de Nicotiana tabacum relativamente à sua capacidade para crescerem em análogos tóxicos de aminoácidos participando na via biossintética da agropina/manopina. São apresentados (Tabela 2) detalhes das estirpes pesadas.

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Em todas as experiências usou-se inicialnente pedaços de tecido de 50 mg. Três pedaços foram colocados em cada placa de petri e usadas placas em duplicado. Estes pedaços de tecido foram cultivados durante 9 semanas antes de serem colhidos, secos e pesados. Numa série de experiências testaram-se duas estirpes de Nicotiana tabacum cv. Xanthi. Uma estirpe 159 N⁹ -1 era agropina/manopina negativa enquanto que a outra estirpe 1590-1 era agropina/manopina positiva. Estas duas estirpes foram testadas relativamente à sua capacidade para crescer em vários níveis de hidrazida Jfglutâmica (GH-Tabela 3), S-carbamil-L-cisteina ( CC-Tabela 5) e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina

(DON-Tabela 7). Quando crescida em 20 >ug GH/ml deneio, a taxa de crescimento da Estirpe 159 N⁹ -1 (agropina/manopina negativa) baixou para 9,1% em relação à taxa de crescimento da testemunha (Tabela 3) enquanto que a Estirpe 1590-1 (agropina/manopina positiva) apenas baixou para 86,4% da taxa da testemunha. As diferenças entre as taxas de crescimento das duas estirpes neste análogo de aminoácido tóxico eram claras e notáveis. Quando estas duas estirpes cresceram em 25 /jg CC/ml de meio houve uma queda nítida na taxa de crescimento da estirpe agropina/manopina negativa para 6,9% do crescimento da testemunha (Tabela 5) enquanto que não houve essencialmente descida na taxa de crescimento da estirpe agropina/manopina positiva. Fianlmente, quando a estirpe agropina/manopina negativa foi cultivada em 0,25 ytig DON/ml de meio não houve qualquer crescimento enquanto que a estirpe agropina/manopina positiva sofreu apenas de 24% da taxa de crescimento da testemunha (Tabela 7).

Numa segunda série de experiências uma estirpe agropina/manopina negativa (WC 58-Tabela 2) e uma estirpe agropina/manopina positiva (W-B634) de Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 foram testadas com vários níveis de GH, CC e DON. No caso de GH (Tabela 4), a estirpe agropina/manopina negativa WC58 morreu na presença de 10/jg

GH/ml de meio enquanto que a taxa de crescimento da estirpe agropina/manopina positiva W-B634 era ainda de 55% da taxa de crescimento da testemunha. Quando estas duas mesmas estirpes foram testadas com CC (Tabela 6) a estirpe agropina/manopina negativa morreu na presença de 50/jg CC/ml de meio enquanto que a estirpe positiva não apresentou qualquer decréscimo na taxa de crescimento. Finalmente os resultados foram igualmente claros quando estas estirpes cresceram em DON (Tabela 8). Na presença de 0,12 /ug DON/ml de meio a estirpe agropina/manopina negativa (W-C58) morreu enquanto que a estirpe agropina/manopina positiva (W-B634) cresceu ainda (i.e., 12% da taxa de crescimento da testemunha) .

Assim os resultados apresentados neste invento ensinam um método único para selecção de tecidos células e protoplastos transformados. Estes resultados servem-se do facto de células transformadas sem os genes para a síntese de opinas não poderem crescer na presença de análogos de aminoácidos tóxicos, enquanto que as células transformadas contendo opina;sintetases conseguem fazê-lo. Ainda, a selecção pode ser usada quer quando os genes da octopina sintetase estão presentes quer quando os genes de agropina/manopina sintetase estão presentes.

A capacidade para seleccionar célu las transformadas através da selecção dos genes de octopina sintetase e/ou agropina/manopina sintetase, permite ainda um outro refinamento na manipulação genética de genes estranhos os quais se pretende que sejam expressos. Deste modo, as células transformadas podem ser obtidas por selecção de uma das vias biossintéticas das opinas sintetases e inserção de gene(s) estrano(s) no T-DNA reconstruído de modo a que a e^ressão destes genes se dê sob o controle da outra opina sintetase. Por exemplo, seria possível construir um T-DNA contendo RoTl(A), octopina sintetase,

' -23RoTL(B), agropina/manopina sintetase-RoTR(D).Um análogo da lisina, e.g., 2-aminoetiIcisteina, poderia ser usado para seleccionar células transformadas por selecção da octopina sintetase enquanto o único local Mst 11 (nucleotídeo 19471 dentro dos genes agropina/manopina) poderia ser usado para inserir qualquer DNA estranho.

Uma outra vantagem de tal construçêó de T-DNA seria que as duas sequências repetitivas RoTL(A) e RoTL(B) assim como o gene da octopina sintetase usado para seleccionar o(s) gene(s) transformado(s) seriam ainda expressos sob o controle da região promotora do gene de agropina/manopina sintetase.

Resumindo, a utilização de plasmíctos reconstruídos contendo T-DNA tendo apenas as repetições directas envolvidas na integração do T-DNA no genoma da planta e de um ou mais genes da síntese de opinas, resultou nos seguintes resultados úteis: 1. Os genes indutores de tumores foram destituídos de sequências resultando numa melhor regeneração de plantas a partir de culturas de tecidos ou protoplastos transformados. 2. Os genes da síntese de opinas podem ser usados para seleccionar as células vegetais que incorporaram o T-DNA (e portanto em adição quaisquer genes estranhos que sejam inseridos). 3. 0 invento permite

agora o reconhecimento de células vegetais que tenham incorporado apenas partes de TL, apenas partes de TR ou partes de TL e de Tr. Uma vez que no genoma de células transformados se encontram múltiplas cópias de TR, esta caracteristica poderá resultar num maior nível de expressão de genes estranhos inseridos nalgumas destas construções de T-DNA.

Exemplo 1: Sequenciação dos nucleotídeos do T-DNA do plasmídeo Ti pTi 15955

Fragmentos de T-DNA e as regiões ladeantes obtidas através da utilização de endonucleases de restrição foram cionados em pBR322 e depois propagados nas estirpes HB1O1 ou GM33 de L· coli. Os clones individuais foram então sequenciados usando o método de A.M. Maxam e W. Gilbert /(1977) Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 74: 5607. Para

a sequenciação 10 /jg do DNA cionado foi cortado com uma enzima de restrição adequada e depois tratado durante 30 minutos a 55°C com 2,5 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela após se ter ajustado o pH pela adição de um décimo de volume de Tris-HCl 1,0 M pH 8,4 ao tubo de reacção. A fosfatase alcalina foi removida por três extraeções com fenol seguido de duas precipitações com etanol. 0 DNA desfosforilado foi então seco e suspenso em 15 μ 1 de água e 15 yul de tampão de desnaturação consistindo em Tris-HCl 20 mM, pH 9,5, espermidina 1 mM e EDTA 0,1 mM. Esta mistura foi incubada a 70°C durante 5 minutos e depois colocado imediatamente em água gelada. Após arrefecimento adicionou-se 4 /j1 de tampão para cinases consistindo em Tris/HCl 500 mM pH 9,5, MgCl₂ 100 mM, ditiotreitol 50 mM, 50% (v/v) de glicerol, 100 juCi de P7 ATP e 2,0 unidades de poiinucleotídeo cinase e

a mistura de reacção foi incubada a 37°C durante 30 minutos.

A reacção foi parada por precipitação com etanol e a amostra seca. 0 DNA marcado em duas extremidades foi digerido com uma enzima de restrição adequada para produzir fragmentos marcados apenas numa extremidade os quais foram então separados num gel de poliacrilamida e eluidos do mesmo (processos 4,5a, 7 e 9 de Maxam e Gilbert). As reacções de sequenciação de DNA foram então efectuados como descrito (Maxam. A.M. e W. Gilbert (1977) supra) com as modificações que se seguem. A reacção limitante GTA foi efectuada pela adição de 30 /j 1 de ácido fórmico a 88% à mistura de reacção e incubação a 20°C durante 3 minutos. A reacção foi parada pela adição de

PQRTbCAI

-rf .........

,Λ

ψΠΛγ// · ⁷

^ie5^g>—

4C0 μ 1 de acetato de sódio 0,3M (paragem por hidrazina).

0 tempo de reacção G foi reduzido para 20 segundos e incubaco a 20°C. As reacções C + T e C foram reduzidas para três minutos a 20°C e paradas pela adição de 400 /il de solução de paragem por hidrazina. Todas as reacções foram então continuadas como descrito (Maxam, A.M. e W. Gilbert (1977) supra). Géis de sequenciação longos de 20 cm de largo, 10 cm de comprimento e 0,2 mm de espessura foram usados para separar os oligonucleotídeos. As placas dos géis foram trata das com um silano (Garoff, H. e Ansorga, W. (1981) Anal. Biochem. 115 : 450-457) para ligar quimicamente a acrilamida a uma placa. A outra placa de suporte é uma placa com termóstato que mantém o gel a 50° durante a electroforese. As amostras foram separadas em géis de 4%, 6% e 16% de acrilamidade. Diferentes tempos de aplicação das amostras foram evitados através da aplicação de cada amostra em simultâneo nos treê géis. Os géis correram durante 14 horas a 3 000 volts para dar cruzamento adequado das escadas de sequenciação de gel para gel. Após electroforese, o gel (ligado a uma placa) foi fixado em 10% de ácido acético durante 15 minutos, depois lavado em água. 0 gel secou directamente na placa, encolhendo para uma espessura de aproximadamente 0,01 mm. Consequentemente pôde-se pôr o gel seco em contacto directo com filme de raios X resultando num aumento de intensichde das bandas e de resolução. A autoradiografia foi feita à temperatura ambiente sem a utilização de écrans de intensificação. Usando estas técnicas foi possível sequenciar rotineiramente 500 pares de bases por fragmento. Portanto aplicando 5 fragmentos a cada série de 3 géis puderam obter-se 2500 bases de sequência. A análise das sequências de DNA e proteínas foram feitas por computador. Os programas usados foram os dos Dr. 0. Smithers e Dr. F. Blattner (Universidade de Wisconsin, Madison).

Exemplo 2: Construção de um microplasmídeo Ti incluindo

RoTL(A), RoTL(B) e o gene da octopina sintetase

0 clone p233 consiste no fragmento 17 BamHI e no fragmento E EcoRI (Figs. 6 e 6a) clonados no vector pBR322 (Bethesda Research Laboratories, Inc., P.O.

Box 577, Gaithersburg, MD 20760). 0 clone foi cortado com

a endonuclease de restrição Smal (Fig. 6a), o local de restrição Smal de extremidades cerses foi convertido num local Bgl 11 utilizando adaptadores Bgl 11 e o DNA foi ligado e depois usado para transformar E. coli K802. 0 plasmídeo

recombinante resultante foi purificado e depois usado para transformar E. coli GM33 a qual é Dam" e portanto incapaz de metilar resíduos de ademina. Nesta estirpe o local Ciai no nucleotídeo 14686 não foi metilado podendo ser cortado. Após digestão com Ciai e Bgl 11 obteve-se um fragmento de T-DNA (fragmento 2a estendendo-se do nucleotídeo 11207 ao nucleotídeo 14686) contendo todo o gene da octopina sintetase e a repetição direeta da extremidade direita de TL (i.e. RoTL(B)). Como alternativa pode-se obter um fragmento de tamanho idêntico (fragmento 2) usando a endonuclease de restrição Bcl I em vez de Cia I (Fig. 6).

Em seguida o clone HindIII ρ102 (cobrindo os nucleotídeos 602-3390 do T-DNA) préviamente cionado no vector pBR322 e contendo um local Bgl 11 (nucleotídeo 1617) foi cortado com Bgl II e HindIII (Fig. 7) para dar um fragmento de T-DNA (fragmento 1) contendo a repetição direeta do extremo esquerdo de T^ (i.e., RoTL(A)).

27Finalmente o plasmídeo pSUP106 com uma gama larga de hospedeiros que se replica em Agrobacterium tumefaciens foi cortado com HindIII e Ciai (Fig. 8). Estes três fragmentos têm os seguintes locais de restrição nos seus extremos: Fragmento 1 tem Bgl II e HindIII; fragmento 2 tem Bgl I I e Ciai; e pSUP106 tem ClaHI e HindIII. Uma vez que os locais de restrição que delimitam os três fragmentos nunca são comuns a mais de dois fragmentos, a ligação pode dar-se apenas segundo um arranjo (A-ocs-B) (Fig. 8). 0 local Bgl 11 entre os fragmentos 1 e 2 é um local único e pode ser usado para inserir qualquer fragmento de DNA estranho conforme se desejar. Este local de restrição é muito versátil uma vez que podem ser inseridos os fragmentos de DNA estranho cortados com Bgl II, BamHI, Bell, Mbol e Sau3A entre outros.

As enzimas de restrição e ligase foram usadas de acordo com as recomendações do fornecedor.

Exemplo 3 Construção de um microplasmídeo Ti incluindo RoTL(A), octopina sintetase, RoTL(B) RoTR(D).

Como descrito no Exemplo 2, o clone HindIII pl02 (abrangendo os nucleotídeos 602-3390 do T-DNA) foi usado para se produzir um fragmento 1 de T-DNA (Fig. 7) e o clone p233 foi usado para produzir o fragmento 2 (Fig. 6). Estes dois fragmentos foram ligados para produzir o fragmento 3 (Fig. 9) com um local HindIII numa extremidade e um local Bcl I na outra extremidade. 0 fragmento 3 contem as sequências de nucleotídeos para RoTL(A), octopina sintetase e RoTL(B).

Deve-se notar que RoTL(B) poderia ter sido omitido do plasmídeo reconstruído tendo T-DNA por corte com a enzima de restrição BamHI no local de restrição Bam HI no nucleotídeo 13774, i.e., 142 nucleotídeos a montante do codão de iniciação da octopina sintetase. Quando este local foi usado, não se encontrou expressão do gene da octopina sintetase. Quando o local Bell (nucleotídeo 14711) foi usado para isolar um fragmento contendo o gene da octopina sintetase então o gene era activamente expresso. E possível que um fragmento de DNA diferente substitua a região entre BclI e BamHI para permitir a expressão do gene da octopina sintetase, e.g., qualquer uma das sequências repetitivas, i.e., RoTL(A), RoTL(B), ToTR(C) ou RoTR(D).

0 passo seguinte é a amplificação do clone EcoRI p501 (Fig. 10) préviamente clonado em pBR322 e purificação do plasmídeo. 0 plasmídeo purificado é então cortado com as endonucleases de restrição StuI e ΚρηI para dar um fragmento de T-DNA abrangendo os nucleotídeos 21673 a 24337 e incluindo a sequência repetitiva RoTR(D) (fragmento 4). 0 corte produzido por StuI dá extremidades

cerses, enquanto que o produzido por ΚρηI tem uma projecção

3.¹ 0 local StuI cerse é convertido num local BamHI através da utilização de adaptadores BamHI. Após digestão com BamHI, os fragmentos 3 e 4 são ligados um ao outro para dar o fragmento 5 (Fig. 9) o qual possui um local HindIII numa extremidade e um local Kpnl na outra extremidade.

Deve-se notar que as endonucleases Bcl I e BamHI produzem extremos coesivos compatíveis.

Em seguida a projecção 3' produzida por corte do fragmento 4 com Kpnl é transformado num fragmento com extremidades cerses usando a actividade 3'-exonuclease da DNA polimerase do bacteriófago T₄ (Maniatis, T. et a 1 ., ( 1982) em Molecular Cloning p.140 Cold Spring Harbor). Após inactivação da polimerase por extracção com

fenol e precipitação do plasmídeo em etanol frio, a extremidade cerse é convertida num local HindIII usando os adaptadores sintéticos HindIII de modo a que o fragmento 5 possua agora locais HindIII em ambas as extremidades. 0 fragmento 5 é então digerido com a enzima HindIII.

Finalmente o plasmídeo pSUP106 com uma gama larga de hospedeiros é linearizado com HindIII e tratado com fosfatase alcalina bacteriana. 0 fragmento 5 é então ligado ao pSUP106 linearizado para dar um plasmídeo recombinante em que a secção de T-DNA contem em sequência RoTL(A), octopina sintetase, RoTL(B) e RoTR(D) (A-ocs-B-D) (Fig. 9). Deve-se notar que o local versátil Bgl II na união dos fragmentos 1 e 2 pode ser usado para inserir qualquer fragmento de DNA estranho tendo um ou mais genes que se pretende que sejam expressos.

Exemplo 4: Construção de um microplasmídeo Ti incluindo

RoTL(A), RoTR(D) e a agropina/manopina sintetase

Os genes de agropina/manopina sinteta· se incluem as fases de leitura abertas 24, 25 e 26 (Fig. 3) mas não se sabe ainda quais destas fasss de leitura corresponde â agropina sintetase e qual corresponde â manopina sintetase. As fases de leitura 24-26 são portanto definidas por genes de agropina/manopina sintetase (ags/mas). 0 clone EcoRI p403 (nucleotídeos 16202 a 21631 do T-DNA) e o clone EcoRI p501 (nucleotídeos 21632 a 24590 do T-DNA) foram ambos clonados em pBR322 e usados separadamente para transformar E. coli HB101. Após amplificação e purificação o clone p403 é cortado com SstI no nucleotídeo 18472 do T-DNA (Ver Fig. 11). A extremidade 3' "over-hanging" ê tornada cerse usando a actividade 3¹-exonuclease do DNA polimerase do bacteriófago T4 (Maniatis, T. et al., ( 1982) em Molecular Cloning pl40 Cold Spring Harbor). Após inactivação da polimerase por extracção com fenol e precipitação

do plasmídeo em etanol frio, as extremidades cerses são convertidas em locais BglII através da utilização de adaptadores sintéticos BglII. Em seguida o DNA é cortado com EcoRI e BglII para produzir um fragmento a partir do T-DNA abrangendo os nucleotídeos 18472 a 21631. Este fragmento (fragmento 6) contem alguns dos genes de agropina/manopina sintetase e está delimitado por um local Bgl11 e um local EcoRI.

Seguidamente o clone EcoRI p501 (nucleotídeos 21632-24590 do T-DNA), préviamente clonado em pBR322, é cortado com as endonucleases de restrição EcoRI e Kpnl. 0 fragmento 7 resultante (Fig. 12) contem o restante

dos genes da agropina/manopina sintetase (não incluído no fragmento 6) e adicionalmente a sequência repetitiva RoTR(D).

Os fragmentos 1 (Fig. 7), 6 (Fig. 11) e 7 (Fig. 12) são todos misturados e ligados. Uma vez que não mais de duas das seis extremidades possuem extremidades coesivas compatíveis, os três fragmentos só se podem ligar segundo uma orientação para dar o fragmento 8 (Fig. 12) (A-ags/mas-D) com um local HindIII numa extremidade e um local Kpnl na outra extremidade. Finalmente a projecção 3' no local Κρη I é removido pela DNA polimerase de T4 e convertido num local HindIII através da utilização de adaptadores sintéticos. (Nota: isto converterá ambos os extremos em extremos coesivos e adiciona adaptadores HindIII à extremidade HindIII . Isto adiciona 4pb a essa extremidade) este fragmento tem portanto locais HindIII em ambas as extremidades e pode ser inserido em pSUP106 após este vector com gama larga de hospedeiro ter sido linearizado pela endonuclease de restrição HindIII.

Exemplo 5: Construção de um mícroplasmídeo Ti incluindo

RoTL(B), RoTR(D) e os genes da agropina sintetase

0 clone p233 que engloba o fragmento 17 BamHI e o fragmento E EcoRI (Fig. 13) foi clonado no vector pBR322. 0 plasmídeo recombinante resultante foi

então usado para transformar E. coli GM53 a qual é Dam~ sendo portanto incapaz de metilação. Nesta estirpe o local Bcl I no nucleotídeo 14 711 não foi metilado e poderá ser cortado. Após amplificação o plasmídeo recombinante é purificado e cortado com a endonuclease de restrição HpaI (Fig. 13). 0 local de restrição HpaI com extremidades

cerses é convertido num local BglII através da utilização de adaptadores Bgl 11. Depois o fragmento é cortado com as endonucleases de restrição Bgl 11 e Bell. Este processo dá um fragmento de T-DNA (fragmento 9 a partir do nucleotídeo 13 800 ao nucleotídeo 14 711) o qual contem a repetição directa do extremo direito do T_ (i.e., RoTL(B)).

Um segundo fragmento (fragmento 10) o qual inclui os genes de agropina/manopina sintetase e a repetição directa do extremo direito de TR (i.e.,RoTR(D)) foi construido misturando os fragmentos 6 e 7 (Fig. 12) com o fragmento 9 (Fig. 13) e ligação uns aos outros para dar o fragmento 1° (PÍ9- I⁴)- θ "Over hanging"3'no local de restrição ΚρηI é então tornado cerse usando a DNA polimerase de TA e convertido num local Hind111 usando os adaptadores sintéticos. Este processo converterá ambas as extremidades em extremidades cerses e adiciona adaptadores Hi nd III à extremidade HindIII. A digestão subsequente com HindIII e Bc11 produzirá um fragmento com um local Bc 11 numa extremidade (compatível com um local BamHI) e um local HindIII na outra extremidade (fragmento 11-B-ags/mas-D) (Fig. 14).

0 vector pSUP106 com uma gama larga de hospedeiros o qual se pode replicar em Agrobacterium tumefaciens é então linearizado por digestão com BamHI e HindIII e o fragmento 11 é inserido no vector linearizado.

Exemplo 6: Construção de um microplasmideo Ti incluindo

RoTL(A), os genes de agropina/manopina sintetase,

RoTR(D), o gene da octopina sintetase e RoTL(B)

0 fragmento 1 foi obtido como descrito no Exemplo 2 (Fig. 7). Este fragmento tem um local HindIII numa extremidade e um local Bgl I na outra extremidade. 0 fragmento 12 foi obtido por ligação dos fragmentos 6 e 7 (Fig. 12) e tem um local Bgl 11 numa extremidade e um local Kpnl na outra extremidade.

0 clone p233 que abrange o fragmento 17 BamHI e o fragmento E EcoRI (Figs. 6 e 13) foi cionado novector pBR322. 0 plasmídeo recombinante resultante foi

então usado para transpormar E. coli. GM33 que é Dam" e portanto incapaz de metilação. Nesta estirpe o local Bcl I no nudeotídeo 14 711 não foi metilado e poderá ser cortado com a enzima Bell. Após amplificação, o plasmídeo recombinante é purificado e cortado com as endonucleases de restrição BclL e Kpnl para dar o fragmento 13 que abrange os nucleotídeos do T-DNA desde o local Κρη I (nudeotídeo 9838) até ao local Bcl I (nudeotídeo 14 711). A ligação de uma mistura dos fragmentos 1 (Fig. 7), fragmento 12 (Fig. 12) e fragmento 13 (Fig. 15) dá um fragmento recombinante 14 (Fig. 16) com um local HindIII numa extremidade e um local Bcl I na

outra extremidade (A-ags/mas-D-ocs-B).

0 plasmídeo pSUP106 com uma gama larga de hospedeiros é finalmente linearizado com as endonucleases de restrição BamHI e Hind111. Após linearização, o fragmento 14 é inserido por ligação.

Esta construção tem a avantagem de caso se desejar os genes estranhos poderem ser inseridos num dos genes de opina sintetase e o promotor deste gene será então usado para a expressão dos genes estranhos enquanto que o segundo gene de opina sintetase poderá ser usado na selecção de células transformadas.

Exemplo 7: Construção de um microplasmideo Ti incluindo

RoTL(A), genes de octopína sintetase em duplicado e RoTL(B) e RoTR(D).

Os métodos de obtenção dos fragmentos usados na presente construção de T-DNA foram descritos nos exemplos anteriores. Os fragmentos 1 e 2 foram obtidos como descrito no Exemplo 2 (Figs. 6 e 7). 0 fragmento 4

obtem-se como descrito no Exemplo 3 (Fig. 10) e o fragmento 13 é obtido como descrito no Exemplo 6 (Fig. 15).

No presente exemplo, os fragmentos 2 e 13 são ligados um ao outro para dar o fragmento 14 contendo dois genes de octopina sintetase e duas sequências repetitivas RoTL(B) em direcção opostas (Fig. 17). Após nova purificação do fragmento ligado a orientação correcta é testada fazendo um mapa de endonucleases de restrição e o fragmento 14 ligado e purificado é então misturado com os fragmentos 1 e 4 para dar o fragmento 15 (Fig. 17) contendo todos os elementos necessários. 0 fragmento 15 é inserido em pSUP106 mutante de gama larga de hospedeiros após lineari

zação do vector com as endonucleases de restrição HindIII e BamHI. A presença dos dois genes de octopina sintetase disponíveis para selecção aumentará a capacidade para seleccionar células ou protoplastos transformados a partir de uma mistura de células ou protoplastos normais e transforme^ dos quando crescem na presença de um aminoácido tóxico como seja a canavanina ou 2-aminoetileisteina.

Exemplo 8 Preparação de um gene da proteína do cristal de Baci1 lus tfíuringiensis

pESl (H.E. Schnepf et a 1. , Eur.

Pat. Appl. 63949, ATCC 31995} é cortado com PstI, depois misturado e ligado com mWB2344 linearizado com PstI (W.M. Barnes, et al., ( 1983) Nucleic. Acids Res. 1 1 :349-368) A mistura resultante é usada para transformar _E. coli.JMIO3 e seleccionados os transformantes resistentes â tetraciclina RFs (forma replicativa) de cadeia dupla são isoladas a partir dos transformantes e caracterizadas por mapas de restrição. Encontram-se dois tipos de transformantes: células tendo mWB2344-ESl-A; e células tendo mWB2344-ESl-S. Estes são vectores M13 que quando na forma virai de cadeia simples possuem as cadeias com e sem sentido do gene da proteína do cristal de pESl.

A sequência do gene da proteína do cristal (ver abaixo: b) (H.C. Wong et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 1960-1967), se mudada em três pares de bases terá um local Ciai (5'...AT*CGAT...3’) imediatamente antes do local de iniciação da tradução ATG. 0 oligonucleotídeo (ver abaixo: a) 5¹ATGGAGGTAATCGATGGATAACA3¹ é sintetizado por métodos "Standard", é hibridado com a forma virai de cadeia simples do mWB2344-ESl-A e usado para a iniciação da síntese de uma segunda cadeia de DNA pelo fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli. Após ligação e selecção do DNA circular covalentemente fechado, a mistura é usada para transformar JM103. DNAs de RFs são isolados das células infec tadas e caracterizados por análise com enzimas de restrição. Um clone proveniente da sequência mutante (a) e contendo-a é identificado pela presença de um novo local Ciai que se situa na extremidade 5' do gene da proteína do cristal e é designado mWB2344-ESl-A(Cla). 0 efeito da mutação pode

ser observado por comparação das sequências do oligonucleotídeo iniciador (a) com a extremidade 5' do gene da proteína do cristal (b):

a) 5'ATGGAGGTAAT*CG ATG GAT AAC A3'

b) 5¹...AGAGATGGAGGTAAC TT/ATG/GAT/AAC/AAT/CC...3 ¹

Met Asp Asn Asn Pro___

Note-se que apenas três de 23 pares de bases foram trocados (os nucleotídeos sublinhados de (a), assegurando assim as condições para uma boa hibridação.

0 gene da proteína do cristal é

rarovido de mWB2344-ESl-A(Cla) por diçpstão com CiaI e Xhol. As

extremidades coesivas Xhol são convertidas em extremidades

coesivas Ciai por ligação a um adaptador, sintetizado por

métodos "Standard", tendo a estrutura que se segue:

0 excesso de adaptadores é retirado do fragmento contendo

o gene da proteína do cristal por digestão com Ciai.

Exemplo 9: Construção e modificação de um veículo com promotor

Xho I

Ciai

5' TCGAGCCCAT3'

3 * CGGGTACG5¹

pKSlll, que é um clone de pRK290 correspondendo ao clone de T-DNA p403(Fig. 3) que codifica um gene cobrindo l,6kb (C.F. Fink (1982) tese de M-S., Universidade de Wisconsin-Madison), ou o próprio p403, é digerido com Ciai e em seguida religado. A mistura de ligação é usada para transformar E. coli K802 (W.B. Wood(1966)

J. Mol. Biol. j_6 :I18) e feita selecção relativamente ao gene de resistência à tetraciclina. Os plasmídeos são isolados fazendo "minipreps" (preparações de plasmídeos a partir de um pequeno volume de cultura celular) e fazem-se mapas de restrição para provar a estrutura. 0 novo veículo, pKS-prol (ver T.C. Hall et al.,U.S. Patent Application Serial No. 485.614, aqui incluído como referência), pode ser linearizado por Ciai.

As manipulações atrás descritas são feitas com o seguinte esquema: 0 gene de T-DNA em pKSlll é apresentado abaixo numa forma resumida como se segue:

60pb 50 pb

.....AAATAA....AAATAA...

na is de po >. iadenil ar’

promotor

ÇIâ.1 960 Pb 250 pb- Ciai

TACACCAAAT*CG/ATG/GAC/ATG/..../TGA/.....AT*CGAT Met Asp Met. . . . pg pggcj·,] <j j gene de "I,5"Kpb

Por remoção do fragmento Ciai, a região promotora do gene "l£" é trazida para junto da região 3' a jusante do gene.

Esta região 3' inclui sinais de poiiadenilação. A estrutura resultante está resumida como se segue:

pRK290 .

Ciai 60 -_pb 50 pb

5'...ATACACCAAAT*CGATAGT..........AAATAA..........AAATAAAA...3'. (pKS£ro

promotor sinais de poiiadenilação

Exemplo 10: Inserção do promotor pro1 no plasmídeo

A-ocs-B (Fig. 8)

Λ

pKS-prol é digerido com EcoRI e misturado e ligado a adaptadores EcoRI/BamHI, sintetizados por processos "Standard" tendo a estrutura que se segue:

EcoRI BamHI

5'AATTCCCCG3'

3¹GGGGCCTAG5'

Os adaptadores são desbastados por digestão com BamHI. Após o fragmento do promotor de T-DNA ser purificado por electroforese em gel, é misturado e ligado a A-ocs-B (Exemplo 2, Fig. 8) linearizado com BglÍI . A mistura é usada para transformar EL coli.GM33 e seleccionados os transformantes resistentes ao cloranfeF.^hT"·^

··· -' · - ·ί.ι

-38nicol. Os plasmídeos isolados a partir de tais transformantes são isolados e caracterizados por análise com enzimas de restrição. Um plasmídeo contendo o fragmento do promotor é designado pA-ocs-B-prol.

Exemplo 11: Inserção do gene da proteína do cristal no vector

pA-ocs-B-proI ê linearizado com Ciai e é em seguida misturado e ligado ao fragmento tendo o gene da proteína do cristal terminado por extremidades coesivas Ciai construídas atrás. Os plasmídeos resultantes são usados para transformar GM33. Os plasmídeos isolados a partir de transformantes resistentes ao cloranfenicol são caracterizados por análise com enzimas de restrição. Escolhe-se uma colónia que contenha um plasmídeo, pA-ocs-B-proI-ES1, tendo presente uma única cópia do gene da proteína do cristal orientado com a mesma polaridade do promotor prol.

para um hospedeiro formar células de

pA-ocs-B-proI-ES1 Agrobacterium adequado e

é transferido usado para transtabaco como descrito no Exemplo 12.

Exemplo 12:

Selecção de células vegetais transformadas por TRANSFERENCIA DE PLASMÍDEOS RECOMBINANTES DE T-DNA reconstruídos a partir de Agrobacterium

tumefaciens

0 objectivo deste exemplo é demonstrar um processo para seleccionar células transformadas a partir de misturas células transformadas e não transformadas. Normalmente, as células transformadas são seleccionadas pelo seu crescimento na ausência de hormonas. No entanto, quando plasmídeos Ti mutados em tms, tmr ou tml são usados então as células transformadas estão dependentes de hormonas e

IM

torna-se desejável uma marca de selecção. A resistência à canamicina ou ao G418 é uma possibilidade mas requere um gene de resistência obtido por engenharia genética. Uma outra possibilidade é a utilização de octopina sintetase como enzima de desentoxicação de análogos de aminoácidos adicionados exógenamente, e.g., 2-aminoetilcisteina (2AEC). Neste invento, foi demonstrado que tecidos não transformados são mortos por níveis baixos de AEC (Fig. 5) enquanto tecidos de galhas em coroa com expressão de octopina sintetase não o são.

Portanto, o presente exemplo usa plasmídeos Ti que são mutados em tms, tmr ou tml mas que contem um gene de octopina sintetase não mutado. As plantas são inicialmente inoculadas nos rebentos como anteriormente descrito (K.A. Barton et a 1 . ( 1983) Cell 32:1033-1043). Após 10-20 dias o crescimento fresco é removido e agitado cultura liquida até uma série de células ter-se separado.

A cultura é então passada através de um filtro e colhidos os pequenos agregados de células. Estes agregados são semeados sobre um papel de filtro colocado sobre uma cultura nutritiva de suporte contendo hormonas.

Uma vez que as células tenham começado a crescer todo o filtro é transferido para meios com hormonas contendo 2AEC. As células transformadas expressarão octopina sintetase que desentoxicará o análogo de aminoácido permitindo assim o seu crescimento enquanto que as células não transformadas morrerão.

As colónias que cresceram em 2AEC são removidas e testadas relativamente â octopina sintetase. Estas células podem então ser regeneradas e mostrar-se que possuem T-DNA contendo o gene da octopina sintetase.

Exemplo 13: Testes para as toxicidades relativas dos

análogos de aminoácidos usando as estirpes

15955/1 e 15955/01 de Nicotiana tabacum (tabaco) cv. "Xanttii".

Soluções aquosas dos análogos de amincá eidos foram ajustadas a pH 5,6-5,8 e esterilizadas por filtração (filtro Millipore de 0,45 micron). Diluições seriadas de cada análogo foram adicionadas a meio com agar sem citoquinina e sem auxina (Linsmaier, E.M. e F. Skoog (1965) Physiol. Plant 8 : 100-127) que tinha sido autoclavado e deixado arrefecer até cerca de 60°C. Uma série de outras estirpes de plantas foram usadas no rastreio inicial dos análogos. Três pedaços de 100 mg de tecido com 4-6 semanas foram plantados em meio contendo análogo em placas de Petri de 55 mm usando as linhas de tecidos de Helianthus annuus (girassol) cv. "Russian Mammoth" (Kemp, J.D. (1982) em Kahl, G. e J.S. Schell (eds) Academic Press, New York, London, Paris pp 461-474); E228 e Bo542, de fk tabacum cv. "Samsun" (Sacristan, M.D. e G. Melchers (1977) Mol. Gen. Genet. 152: :111-117); teratona de Braun de N. tabacum cv."Havana"

(Braun, A.C. e H.N. Wood (1976) Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A.

73: 496-500); A66 isolada de N. tabacum cv. "White Buríey" (Firmin, J. L. e G.R. Fenwick ( 1978) Nature, London, 276: 842-844); e W-AG, W-B634, W-C58 e W-T37 isoladas por J. Tournew,

CNRA, Versalhes, a partir de tumores induzidos em N. tabacum

cv. "Wisconsin 38" por estirpes de A. tumefaciens do tipo

octopina A6 ou B634 ou estirpes do tipo nopalina C58 ou T37,

respectivamente. Os resultados com todas as estirpes acima

foram essencialmente os mesmos que os descritos para N.

POKTLGAt

-4

tabacum cv."Xanthi" estirpes 15955/1 e 15955/01. Para os estudos de toxicidade com as linhas de tumor 15955/1 e 15955/01, três pedaços de 50 mg de tecido com 4-6 semanas foram plantados em meio dentro de placas de 90 mm. Em todos os casos usaram-se placas em duplicado ou triplicado para cada tecido e cada concentração de um análogo. Os tecidos foram pesados após 5-7 semanas de crescimento a 25° no escuro. 0 crescimento foi expresso em percentagem de aumento de peso fresco do mesmo tecido em meio não contendo qualquer análogo ou aminoácido. As experiências foram repetidas após os resultados iniciais terem delimitado a gama de concentrações a usar para um determinado análogo. As experiências com as linhas 15955/1 e 15955/01 foram repetidas pelo menos duas vezes com as gamas de concentrações adequadas.

Exemplo 14: Método para testar a presença de opinas sintetases

Octopina sintetase foi testada usando algumas modificações de métodos anteriores (Birnberg., P. et al. ( 1977) Phytochemistry 16: 647-650; Goldmann, A.( 1977) Plant Sei. Lett. 10 : 49-58; Hack, E. e J. D. Kemp (1977) Biochem. Biophys. Res. Comms. 78:785-791; Lejeune, B. (1967) C.R. Acad. Sei. Ser. D. 265: 1753-1755; Otten; L.A.B. M. e R.A. Schilperoort (1978) Biochim. Biophys. Acta. 527: 497-500). A cada mg de tecido num tubo Eppendorf de 1,5 ml adicionou-se 3yul de uma mistura de reacção tamponada (fosfato de potássio 0,15M, pH 6,9). Esta mistura de reacção contendo L-arginina 20mM, piruvato 50 mM e NADH

13,5 mM. 0 tecido foi cuidadosamente macerado na mistura de reacção com uma vara de vidro e incubado a 25°C durante uma hora. As amostras foram então clarificadas por centrifugação e 2 /ul de sobrenadante foi aplicado em papel Whatman 3MM. Usou-se até 30 μ 1 de amostra para verificar um resultado negativo. 0 papel Whatman 3MM com as amostras; assim

como 1-10 yug de octopina (ou outra opina) como padrão autêntico e Orange G como marca de migração, foi cuidadosamente molhado com tampão de electroforese (ácido fórmico/ácido acético/água; 3/6/91, v/v/v) e sujeito a electroforese a 50-75 volts/cm (Aparelho de Electroforese de Alta Voltagem Gibson, Modelo D) durante 10-20 minutos. Os electroforetogramas foram secos numa corrente de ar quente e corados para a octopina (ou outras opinas) com um reagente de fenantreno quinona (Yamada, S. e H.A. Itano (1966) Biochim. Biophys.

Acta 130:538-540) ou com reagente de Sakaguchi (Easley,

C.W. (1965) Biochim. Biophys. Acta. 107: 386-388). 0 reagente de Sakaguchi é várias vezes menos sensível mas mais específico para compostos de guanidinilo. Quando se usaram as condições acima verificou-se também que os tampões de extracção dos tecidos (Hack, E. e J.D. Kemp (1977) supra; Otten, L.A.B.M. e R.A. Schilperoort (1978) supra) não melhoram os resultados do teste e de facto até retardam a nu gração electroforêtica quando são aplicados maiores volumes de amostra. As mobilidades electroforéticas foram medidas a partir da origem (0) relativamente ao Orange G (1,0).

Tabela 1

Locais de corte por enzimas de pTI 15955

Enzima Locais Posição

Apa 1 Kit II Xha 1	1 1 t	11.730 n.A7i ít.osi
Klu 1	2	8,737	12,743
'.*1 1	2	A,771	23,272
Tth I	2	17.0*3	24,211
fipa I	3	7,237	7.442
Xpn 1	3	A23	7,131
Nt Z	3	7,211	10,047
S.c I	3	2,AIO	14,017
S.t XI	3	14,776	11,462
Xh· I	3	A.727	15.201
Xm III	3	A|1	11,713
Aat IX	A	4,311	11.743
X*I I	X	A,317	5,434
BacE II	A	11,748	11,776
Cca 1	A	12.*57	17.041
lm I	A	1A.SU'	17.144
Su I	A	1S3	2,212
St, I	A	4.217	4,731
Xar II	A	327	470
Ua Kl	í	1	7,402
Mar I	3	13.33A	17,158
Ul I	6	10,05» 24.40A	14,711
1(1 II	6	1.617 22,730	4,254
Mm 1	6	14,276 24,274	. 14,475
• Sph I	A	3,241 21,342	13,220
laaM II	7	A77 23,321	7.410 24,067
Kin< III	7	402 17,237	3,370 17,753
»it I	(	131 3,342	141 *12,130
Cca XI	1	4,474 14.202	3,545 21,631
Ma« I	1	311 20,104	5.177 22,353
Md« I	1	2,174 17.713	7,282 21,731
Ah· III	1	732 7,443	2,677 12,221
»,tX I	»	317 10,157	1.517 13.751
Eea XV	♦	2,707 12,774	4,111 11,027
Mca 1	7	2,721 11,372	3,216 21,080
Xan I	7	2,104 10,103	5.773 13,312
Η·Χ I	»0	1,401 15,077	4,462 t5.37O
>w X	lt	2,410 14,017 24,547	5.022 16,047
A»· X	12	153 4,727 21.474	2,210 11.205 21,803

de restrição da região do

13.800
24.337
22,436
18,472
23,123		•
21.474
22,463
14,663	13.1*0
4,253	21,418
22,86)	24,301
20,140	21.316
18.185	24,213
4,850	11.207-
14,673	21.473 ‘
1.204	23,033
8.082	7,062	11,774
17,170	•20,027	24,078
14.773	13,738	21.5*0
5.033	6,023	7,720
16,420	17,773	21,416
13,287	17,401	17.275
12,071	17,334	22.273
3,512	5,733	6,431
3,506	4,216	3.066
17.056
12,823	13:026	13,362
24.570
6.2Z6	10.475	12,077
24,076
7,475	6,360	17,084
24,586	•
2,724	2,777	3,777
13,685	16.306
5,862	6,150	8,002
20,131	22,741
7,354	7,272	12,777
21.522	22.041
13,376	15,421	15.362
21,710	24,065
4.547	4,637	6,772
17.677	21.343
7,855	11,632	n;oi7
17,601	17,721	20,474
4,767	11,730	12,574
18,472	22,310	23,317
4,846	5,114	6,017
11,760	13,208	18,678

Tabela la

Locais de corte por enzimas de restrição da região do T-DNA de pTI 15955

Enzima Locais Posição

Cla 1	>2	1,206 |4,4Í4 21,432	2.113 13,672 24,231	4,134 11.744	1,212 11.110	1,212 20,121
ii	12	2.134	3,061	4,612	3.131	4.031
		6,131	1,175	11,134	12,541	14,415
		22,616	24,011
Aet 1	14	1,161	‘2,667	6,317	6,771	4.714
		11,412	11,560	13,111	15,116	11,142
		23,213	23,417	23,677	24,021
ΗχΙΑ 1	1*	112	1,161	2,610	5.134	4,221
		7,621	12.410'	12,734	14,011	16,313
		11,113	11.472	20.166	21,013
Mine XI	»4	1,361	5.721	6,710	7.«7	1,442
		11,321	13,136	13,100	17.073	11,313
		21,472	21,727	22,440 .	23.214
H<1C X	17	621	3,516	4,160	3,111	6,153
		7,443	1.134	12,010	13.533	16,013
		17.157	11,161	20,026	22,701	24,017
		24,324	24,333
H<1D I	21	1,376	2,503	6,501	6,103	1,333
		'11,760	12,316	13,334	14,662	13,137
		13,231	15,101	14,470	17,131	11.170
		11.311	11,641	20,027	20,244	24,011
		*24,433
lati» X	24	301	377	1.423	2,331	4,210
		5,023	6,176	7,036	7.513	10,131
		10,165	11,161	12,144	12,602	tl.533
		14,672	16.147	11,313	11,346	11,422
		11,310	11,677	20,710	22,130
Ha* XX	21	531	2,206	2,331	3,327	3,116
		3,210	3,301	3,161	6.331	1,711
		10.474	12,261	13,331	13,645	14.335
	- .	14.707	15,731	13,172	16,<12	17.161
		17,110	11,301	11,173	11,576	20,030
		22,332	24,101	24.311

Mph 1	. 37
A»· 11	31
rok χ	31
*el X	40
Hat 1	40
Tth I	44
»1* 1	43
K1R{ 1	47
St»H 1	47
Kbe 11	61
Serr 1	64
Mt 1	66
Tae I	67
Saw 16	61
Hat ΠΙ	11
Hha 1	11
Ata X	11
Hpa ll	102
fria 4M	103
Tat 1	lll
Sau	116
H«1 1	131

Tabela 2

Uma lista dos tecidos usados para testar a crescimento na presença de vários análogos tóxicos.

capacidade de de aminoácidos

Estirpe No.	Cultivar	Transformado por:	Manopina	Pg rcpi re
159 No. 1	Nicotiana tabacum cv.Xanthi	Agrobacterium tumefac iens estirpe 15955
1590-1	do	do	+	+
W-C58	N. tabacum cv.Wisc. 38	A. tumefaciens estirpe C58
W-B634	N. tabacum cv. Wisc. 38	A. tumefaciens estirpe B634	+	+

Pesos secos de tecidos transformados contendo genes de

agropina/manopina sintetases comparados com pesos secos de

tecidos transformados sem genes de agropina/manopina sinte

tases quando cultivados na presença de vários níveis do

análogo de aminoácido tóxico hidrazida % -glutâmica (GH).

Nicotiana tabacum cv. XanthP '

Tabela 3

/ug/ml

meio Estirpe 159 No. 1

% da

testemunha

	Peso em mg
0	7230
2,5	5690
10	2900
15	2900
20	660
25	100

78,7

40.1 16,6

9.1

(b)

Peso em mg

1250

880 1180 1200 1080

1,4 650

Estirpe 1590~l^{(a) (b) (c)} % da

testemunha

70.4

94.4 96,0

86.4 52,0

(a) As experiências foram feitas com placas em duplicado com 3 pedaços de tecido/placa.

(b) Agropina/manopina negativo

(c) Agropina/manopina positivo

Pesos secos de tecidos transformados contendo genes de

agropina/manopina sintetases comparados com pesos secos de

tecidos transformados sem genes de agropina/manopina sintetases quando cultivados na presença de vários níveis do

análogo de aminoácido tóxico hidrazida $ -glutâmica (GH).

Tabela 4

Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38

(a)

/ig/ml me io

(c)

Estirpe W-C58^^b^

Estirpe W-B634

	Peso em mg	% da testemunha	Peso em mg	% da testemunha
0	1100	—	1670	_ -
2,	5 610	55,5	920	55,1
5	200	18,2	1300	77,8
10	Morta		920	55,1
15	Morta		620	37,1
20	Morta		430	25,7
25	Morta		580	34,7
(a)	As experiências	foram feitas	com placas	em duplicado
	3 pedaços de tecido/placa.
(b)	Agropina/manopina negativo
(c)	Agropina/manopina positivo

Tabela 5

Pesos secos de tecidos transformacte contendo genes de agropina/manopina sintetase comparados com pesos secos de tecidos transformados sem genes de agropina/manopina sintetases quando cultivados na presença de vários níveis do análogo de aminoácido tóxico S-carbami1-L-cisteína (CC).

í a)

Nicotiana tabacum cv. Xanthi ' '

yug/m 1

me i	o Estirpe 159 No.P '	Estirpe 1590-1
	Peso	% da	Peso	% da
	em mg	testemunha	em mg	testemunha
0	7230	- -	1250
6	7800	107,9	1180	94,4
12	6720	92,9	1640	131,2
25	500	6,9	1160	92,8
50	500	6,9	1400	112,0
100	400	5,5	1710	136,8
(a)	As experiências foram feitas	com placas	em duplicado
	3 pedaços de tecido/placa.
(b)	Agropina/manopina	negativo
(c)	Agropina/manopina	positivo

β

Tabela 6

Pesos secos de tecidos transformados contendo genes de agropina/manopina sintetase comparados com os pesos secos de tecidos transformados sem os genes de agropina/manopina sintetase quando cultivados na presença de vários níveis do análogo de aminoácido tóxico S-carbamil-L-cisteina(CC).

Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38^^a^

/ug/ml

me i o	Estirpe W-C58' '	Estirpe	W-B634' '
	Peso	% da	Peso	% da
	em mg	testemunha	em mg	testemun
0	1100		1670
6	270	24,5	1890	113,2
12	1040	94,5	1440	86,2
25	220	20,0	1720	103,0
50	Morta	--	2000	119,8
100	80	7,3	2580	154,5
(a) As	experiências	foram feitas com	placas em	dupliçado
com	3 pedaços de	tecido por placa

(b) Agropina/manopina negativo

(c) Agropina/manopina positivo

Tabela 7

Pesos secos de tecidos transformados contendo genes de agropina/manopina sintetases comparados com os pesos secos de tecidos transformados sem os genes de agropina/manopina sintetases quando cultivados na presença de vários níveis do análogo de aminoácido tóxico 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON).

/ _a)

Nicotiana tabacum cv. XanthP '

/ug/ml

meio Estirpe 159 No.l^ Estirpe 1590-l^^c

	Peso em mg	% da testemunha	Peso em mg	% da testemunha
0	7230	__	1250
0,015	5260	72,8	1230	98,4
0,03	2470	34,2	1330	106,4
0,06	2880	39,8	1180	94,4
0,12	90	1,2	600	48,0
0,25	60	0,8	300	24,0
0,50	Morto	--	140	11,2
1,0	Morto	--	100	8,0
2,0	Morto		300	24,0
(a) As	experiências	foram feitas com	placas em	duplicado
com	3 pedaços de	tecido/placa

(b) Agropina/manopina negativo

(c) Agropina/manopina positivo

Tabela 8

Pesos secos de tecidos transformados contendo genes de agropina/manopina sintetase comparados com os pesos secos de tecidos transformados sem genes de agropina/manopina sintetase quando cultivados na presença de vários níveis do análogo de aminoácido tóxico 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON).

Nicotiana tabacum cv. Wisconsin

38^)

pg/ml

meio Estirpe W-C58^^b^ Estirpe W-B634^^c^

	Peso	% da	Peso	% da
	em mg	testemunha	em mg	testemunha
0	1100	_ —	1670	M —
0,015	250	22,7	470	28,1
0,03	540	49,1	270	16,2
0,06	120	10,9	360	21,6
0,12	Morto	--	200	12,0
0,25	Morto		120	7,2
(a) As	experiências	foram feitas com	placas	em duplicado
com	3 pedaços de	tecido/placa.

(b) Agropina/manopina negativo

(c) Agropina/manopina positivo

Fil

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1~. - Processo para a produção de uma planta caracterizado por se incluir na referida planta uma célula vegetal transformada sensível a antibióticos tendo um fragmento de DNA compreendendo um gene de opina sintetase e um segmento de DNA estranho, sendo o referido fragmento de DNA ladeado por uma sequência repetitiva de T-DNA.

   25. - Processo de acordo com a re£ vindicação 1, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser o da octopina sintetase.

   3^S. - Processo de acordo com a re£ vindicação 1, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser o da agropina/manopina sintetase.

   4⁹. - Processo de acordo com a re£ vindicação 1, caracterizado por 0 referido gene de opina sintetase ser 0 da nopalina sintetase.

   55. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de T-DNA repetitiva ladeante ser seleccionada do grupo de sequências repetitivas RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) ou RoTR(D).

   65. - Processo de acordo com a

   reivindicação 5, caracterizado por a referida sequência repe titiva de T-DNA ladeante ser idêntica em cada uma das extremidades do referido fragmento de DNA.

   75. - Célula vegetal transformada

   sensível a antibióticos, caracterizada por conter um fragmento de DNA compreendendo um gene de opina sintetase e um

   segmento de DNA estranho, sendo 0 referido fragmento de DNA

   ladeado por uma sequência repetitiva de T-DNA.

   8^ã. - Célula vegetal de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido gene de opina sintetase ser o da octopina sintetase.

   9^ã. - Célula vegetal de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido gene de opina sintetase ser o de agropina/manopina sintetase.

   10^§. - Célula vegetal de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido gene de opina sintetase ser o da nopalina sintetase.

   11^â. - Célula vegetal de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a referida sequência repetitiva de T-DNA ser seleccionada do grupo de sequêrp cias repetitivas RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) ou RoTR(D).

   12-. - Célula vegetal de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a citada sequên cia repetitiva de T-DNA ladeante ser idêntica em cada uma das extremidades do referido fragmento de DNA.

   13^â. - Protoplasto transformado, sensível a antibióticos, caracterizado por conter um fragmerp to de DNA compreendendo um gene de opina sintetase e um segmento de DNA estranho, sendo o referido fragmento de DNA ladeado por uma sequência repetitiva de T-DNA.

   14^ã. - Protoplasto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido gene de opj_ na sintetase ser o da octopina sintetase.

   15-. - Protoplasto de acordo com

   a reivindicação 13, caracterizado por o referido gene de op^

   na sintetase ser o da agropina/manopina sintetase.

   16-. - Protoplasto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido gene de opj_ na sintetase ser o da nopalina sintetase.

   17^a. - Protoplasto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida sequência repetitiva de T-DNA ser seleccionada do grupo de sequências repetitivas RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) ou RoTR(D).

   18^a. - Protoplasto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida sequência repetitiva de T-DNA ladeante ser idêntica em cada uma das ex tremidades do referido fragmento de DNA.

   19^a. - Plasmídeo caracterizado por ter inserido um fragmento de DNA compreendendo um gene de opina sintetase e um segmento de DNA estranho ladeado por uma sequência repetitiva de T-DNA, contendo ainda o referido plasmídeo um gene de resistência a antibióticos fora do cita do fragmento de DNA inserido, ladeado pela referida sequên cia repetitiva de T-DNA.

   20^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser o do octopina sintetase.

   21^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 19. caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser o de agropina/manopina sintetase.

   22^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser o da nopalina sintetase.

   23^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a referida sequência repetitiva de T-DNA ladeante ser seleccionada do grupo de se quências repetitivas RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) ou RoTR(D).

   24^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida sequência repetitiva de T-DNA ladeante ser idêntica em cada extremidade do referido fragmento de DNA.

   25^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o gene de resistência a antibióticos ser o da resistência ao cloranfenicol.

   26^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o referido gene de resis^ tência a antibióticos ser o da resistência â ampicilina.

   27^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o referido gene de resis_ tência a antibióticos ser o da resistência â canamicina.

   28^a. - Método de selecção de célu las vegetais transformadas por T-DNA compreendendo um gene codificador de uma opina sintetase, a partir de uma mistura de células normais e transformadas, caracterizado por se efec_ tuarem os passos de:

   (a) sementeira da referida mistura de células normais e transformadas num meio de crescimento adequado con tendo um análogo de aminoácido tóxico metabolizável pela referida opina sintetase;

   (b) Crescimento da referida mistura de células normais e transformadas no referido meio de crescimento adequa do contendo o análogo de aminoácido tóxico durante um período de tempo seleccionado;

   (c) selecção de remoção das colónias de células produzidas por crescimento da referida mistura de células

   p, rtijg/’

   ,. ., ._í(

   SHy

   56normais e transformadas.

   29³. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido T-DNA ser qualquer construção de T-DNA obtida por engenharia genética compreendendo uma ou mais sequências repetitivas RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C), RoTR(D) e qualquer gene de opina sintetase.

   30⁵. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser a canavanina.

   31⁵. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser 2-amino-eti1-cisteína.

   32³. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser hidrazida ^-glutâmica.

   33⁵. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser S-carbami1-L-cisteína.

   34^s. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser 6-diazo-5-oxo-L-norleucina.

   35^â. - Método de acordo com a

   reivindicação 28, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser um gene de octopina sintetase.

   36^â. - Método de acordo com a

   reivindicação 28, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser um gene de agropina/manopina sintetase.

   37^â. - Método de acordo com a

   reivindicação 28, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser um gene da nopalina sintetase.

   38^â. - Método de selecção proto plastos transformados por T-DNA compreendendo um gene codificador de uma opina sintetase a partir de uma mistura de protoplastos normais e transformados caracterizado por se efectuarem os seguintes passos:

   (a) sementeira da referida mistura de protoplastos normais e transformados num meio de crescimento adequa_ do contendo um análogo de aminoácido tóxico metabolizável pela referida opina sintetase;

   (b) crescimento da referida mistura de células normais e transformadas no citado meio de crescimento ade quado contendo o referido análogo de aminoácido tóxico durante um período de tempo seleccionado;

   (c) selecção e remoção de colónias de protoplastos produzidas pelo crescimento da referida mistura de pr£ toplastos normais e transformados.

   39³. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido T-DNA ser qualquer construção de T-DNA obtida por engenharia genética compreendendo uma ou mais das sequências repetitivas RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C), RoTR(D) e qualquer gene de opina sintetase.

   40³. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser a canavanina.

   41-. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido análogo de

   aminoácido tóxico ser 2-amino-etil-cisteina.

   42^a. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser hidrazida #-glutâmica.

   43^a. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido análogo de aminoácido ser S-carbami1-L-cisteina.

   44^a. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido análogo de aminoácido tóxico ser 6-diazo-5-oxo-l-norleucina.

   45^a. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser um gene de octopina sintese.

   46®. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser um gene de agropina/manopina sintetase.

   47^a. - Método de acordo com a

   reivindicação 38, caracterizado por o referido gene de opina sintetase ser um gene da nopalina sintetase.

   48^a. - Tecido vegetal caracterizado por compreender uma célula vegetal transformada contendo não mais de três sequências de DNA repetitivas T seleccio nadas independentemente do grupo constituído por RoTL(A), RpTL(B), RoTR(C) e RoTR(D), quando está presente apenas uma sequência repetitiva; e seleccionadas do grupo de combinações constituído por: RoTL(A) em combinações com RoTL(A),

   4.

   ou RoTL(C); RoTL(B) em combinação com RoTL(B), RoTL(C) ou RoTL(D); e RoTL(C) em combinação com RoTL(C), quando estão presentes duas sequências respectivas; e seleccionadas do grupo de combinações constituido por quaisquer três das RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) e RoTR(D), seleccionadas independentemente, quando estão presentes três sequências repetitivas.

   49^a. - Tecido vegetal de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por a(s) referida(s) sequência(s) de DNA repetitiva(s) delimitarem uma sequência de DNA heteróloga.

   50^a. - Tecido vegetal de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por a referida sequência de DNA heteróloga compreender um gene estrutural expresável na referida planta.

   51^a. - Vector transformado

   caracterizado por compreender não mais de uma sequência de DNA repetitiva T seleccionada do grupo constituido por RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) e RoTR(D).

   52^a. - Vactor caracterizado por compreender duas sequências de DNA repetitivas T seleccionadas independentemente do grupo RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) e RoTR(D), mas excluindo as combinações RoTL(A) e RoTL(B); RoTL(A) e RoTL(D); e RoTR(C) e RoTR(D).

   53^a. - Vector, caracterizado por compreender três sequências de DNA repetitivas T seleccionadas do grupo constituido por:

   -601) três sequências repetitivas idênticas seleccionadas do grupo constituido das sequências especificadas: RoTL(A), RoTL(B), RoTR(C) e RoTR(D);
2. 2) duas sequências repetitivas idênticas seleccionadas do grupo constituido pelas referidas sequências especificadas em combinação com sequências repetitivas diferentes seleccionadas do grupo referido atrás;
3. 3) três sequências repetitivas diferentes seleccionadas do grupo constituido pelas referidas sequências especificadas e não compreendendo as restantes sequências repetitivas que delimitam numa sequência de DNA heteróloga.

   54³. - Vector de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por 0 grupo (3) também compreender a restante sequência repetitiva e por as quatro sequências repetitivas diferentes ocorrerem numa ordem que começa ou acaba com uma sequência repetitiva seleccionada do grupo constituido por RoTL(B) e RoTR(C).