JPS60136519A - ヘモグロビンからグロビンを得る方法並びに該方法で得られるグロビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヘモグロビンからグロビンを調製するだめの
新規方法並びに該方法によって得られるグロビンに関す
る。

＾ｎ５ｏｎ　ｅｔ　ＭｉｒＳｋｙの研究（、Ｊ、　Ｇｅ
ｎ、　ｒ’ｈｙｓｉｏｌ、　、　１９３０゜１：ｌ、　
４６９−４７６　）は、酸性アセトンを用いる技術によ
って、へモグｖ１ビンの色素（ヘム）を分離し得ること
を開示している。このようにして、既にヒトまたは動物
ヘモグロビンを種々のグロビンに転化することが知られ
ている。この方法の２つの変法が、一般に、研究段階で
使用されており、これらはいずれも、酸性ｐｌ＋領域に
おけるへムの弱い親和力に基いている。

該方法の１つは酸性アセトンを使用する方法（例えば、
Ｒｎ５ＳＩ−ｒ’八へｌ！ＬＬ１等のＢｉｏｐｈｙｓ、
口１ｏｃｈ。

八ｃｔａ、　、　１！１５８．’３０．６０８−６１５
参照）である。この方法は３０ｇ／βのヘモグロビン溶
液１容に２ＮｌＩＣＩを３ｍｌ／Ｒの届で含む一２０℃
のアセトン２０〜３０容を添加し、−２０℃にて攪拌し
、次いで遠心分離し、グロビン沈澱を水に再溶解し、蒸
留水で透析することからなっている。

このグロビン溶液はｐ＋＋が酸性側にある場合にのみ安
定であり、そのためにアルカ１ＪｐＨの下でのグロビン
の柔和な加水分解により、中性ｐｕにおいて可溶性の分
子を回収し円る方法が提案された（ＳＴＲＩＩＭ＋八等
のＪ、Ｌａｂ、　＆ＣＩｉｎ１ＭｅｄＣｌ１ｎ１　、１
９５１゜３７−６、９５９−９６８参照）。

第２の方法は、ＴＢＡＬＢのＢｉｎｃｈ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ａｃｔａ、　。

１９５９、　亜、　５４３に開示されたブタノン−酸に
よる方法である。アセトンを、水に対する溶解度がより
低いブタノンに代えることにより、へｌ、　（ケトン相
）とグロビン（水性相）との２相による急速分離が可能
となる。

しかしながら、これら２つの方法は工業的規模での応用
には適していない。というのは、使用すべき有機溶媒の
量が多く、かつこれに伴って事故が発生する恐れがある
からである。また、最終的に得られるグロビンは、動物
グロビンにおける飲食物での用途もしくはヒトグロビン
における治療」二の応用に対して危険な化学的残留物を
、無視し得ない量で含有している。

このような情況の下で、既に、飲食物に適用するための
、動物起源グロビンを得る目的で、他の多くの方法が提
案されている。

Ｙ、５ＡＴｎ＆Ｓ、ＩＩ八へＡＫ八へ八へこよる特願昭
５５−００８２６１号明細１旧よ、酸性ｐＨ領域におい
て、ＣＭセルロース（カルボキシメチルセルロース）で
ヘモグロビンの色素を選択的に吸着する方法を提案して
いる。

この方法では、アルコールおよび溶媒の使用を避けてい
るが、ヘモグロビンの十分な脱色ができず、その生成物
はへｌ・の毒性のために治療上での利用に対して不向き
であるという欠点を有している。

Ｋ八、　１，０ｎＬＩＮＩｉＴＳによるソビエト特許第
２５４４３６５／２８−１３号（Ｈ］７７年８月８日）
は、治療上の利用のために、ヒト赤血球の溶面物からグ
ロビンを調製する方法を開示している。この方法は高温
の酸素含有水を使用する技術であるが、タンパク質がひ
どく変性されるという欠点を有している。

以下の３つのスウェーデン特許： 第６７　４１１７８８２−５号 第７５　１３９８７−３号、および 第８０　０２５９１−　！］号 において、Ｐ、　Ｇ、　ＬＩＮＯＲＤＯ３は、低温度下
で、酸性ｐａｔ領域で、アルコール性溶液を処理する種
々の方法を提案している（フランス特許第２３！’ｉｌ
　６０４　号参照）。添加すべき塩の性質並びに濃度に
応じて、グロビンが選択的に溶液中で沈澱または残留し
、凝集する色素が分離される。イミダゾールもしくはそ
の同族分子の添加により、前記分離は容易となる。しか
しながら、これらすべての場合において、得られるグロ
ビンは治療上の目的で使用するには余りに色素が多ずぎ
る。

類似する方法が、Ｐ、　ＩＥＳＰＩＮ八Ｎのフラへス特
許第８１０９８９０号または、１．１１．　ｌ、旧ＪＢ
ＲＩＮＫの英国特許第１．９７７、２７８号において提
案されているが、これらも同様な欠点を有している。

ところで、完全に脱色されかつまったく変性されていな
いグロビンを大量に提供することを可能とすることは、
特に、ＳへＭＰＬＩ！等のＪ、　Ｌａｈ、　＆Ｃｌ１ｎ
。

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　１９５２．４０−２．　２０６−
２１０　並び１こＳ１’ＲＵＭｌ八等のＪ、Ｌａｂ、　
＆Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　、　１９５２．４０−
２　。

２１１−２２２において既に記載されているように、例
えば代ｊ旧口１漿などの治療」ニの用途のために、極め
−（１ｉｌｊ味あることである。

そこで、本発明は」ニ記の如き従来法の諸欠点を克服し
、かつ工業的規模での実施が可能な、ヘモグロビンから
の新規なグロビンの製造方法を提供する、二と、並びに
経済的に極めて純粋かつ殆どもしくはまったく変性され
ていないグロビンを得ることに関する。

本発明の目的の１つは、特に、治療の目的で使用し１）
るグロビンを工業的に製造できる方法を提供することに
ある。

本発明の他の目的は、例えば特に ａ、ヒト胎盤の溶面々液、 ｂ、他のヒトの溶面々液、 Ｃ１血液銀行の血液、 ｄ　、贋殺場からの動物血液、 などであり得る、極めて多岐に亘る起源からのヘモグロ
ビンからグロビンを得るために応用できる方法を提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、動物性ヘモグロビンから飲食物用
グロビンを得ることを可能とすることにある。

被処理ヘモグロビンは天然状態（例えば溶血４球残渣）
、未変性の精製体形状（例えば精製胎盤血液をイオン交
換クロマトグラフィーにより精製したもの）、も１．＜
は更に変性された沈殿物形状（例えば、クロロホルムも
しくはカプリン酸ナトリウトにより選択的に沈澱させた
もの〔１，１ΔＩＩＴ八ｌＩＩ］等の“Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　ｉｎ旧ｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄ
ｉｚａｔｉｏｎ　”、　１９７４．２７．　１０７−１
１４または５ＴｌＥｌＮＤＨＣＩ＋　等のＲｅｖｕｅ　
Ｆｒａｎｙ、６ｔｕｄｅｓ　ｃｈｉｍ、ｅｔｆｌｉｎｔ
、　、　１９６９．　ＸＩＶ　、　１０．１０５４−１
０５８参照〕）テ存在し得る。

本発明はヘモグロビンからグロビンを調製する方法を目
的とし、該方法においては酸性側ｐｈ＋領域でヘモグロ
ビンのアルコール性溶液を調製する。

またその特徴は酸性側ｐＨで、好ましくは周囲温度下で
、ヘモグロビンのアルコール性溶液を活性炭素上で吸着
させることにある。

驚くべきことに、タンパク質を強く吸着することが知ら
れている活性炭は、ヘムを固定するがグｒ】ビンを吸着
しないことがわかった。グロビンの収・ｔは殆ど１００
％である。

例えば、エタノールもしくはメタノールなどのアルコー
ルの濃度は少なくとも４０％、好ましくは７５〜８０％
であることが望ましい。

ヘモグロビンが沈澱物として使用される場合には、約１
０％（市潰／体積）濃度の溶液に戻すことが有利である
。この復元は、例えば水（全体積の２０％）を添加し、
３ＮｌｌＣＩで酸性とし、次いで８０％のエタノールを
添加することによって実施できる。

酸性側ｐｌ＋は、４以下、好ましくは２以上、例えば３
近傍とすることが望ましい。ｐｌ（が、特に４以」−に
増大した場合、活性炭は無視できない量のタンパク質を
吸着しはじめる。同様に、ｐ＋＋が著しく酸性である場
合には、タンパク質の回収率は低下し、同様にクロビン
の変性が生ずる恐れがある。

活性炭の選択は、ヘモグロビンの脱色容量を考慮してな
される。この容量は比Ｒ＝　Ｄ、　Ｏ，２８０％ｍ’／
１１．０．４［１３％ｍによって見積られる。この比は
脱色されていないヘモグロビンに対しては０．２６であ
る。

粉末状活性炭が特に好ましく、本明細書において以下に
明らかとされる表により、実際に使用できる市販活性炭
の例が提示され、これらの使用により良好な結果を得る
ことができる。

活性炭は最適の量で、しかも操作をできるだけ簡略化す
るのに十分少攬で使用することが好ましい。ヘモグロビ
ンの重量に対する活性炭の重量の割合は、ヘモグロビン
が溶液中で天然物状態にあるか、もしくは沈澱状態の変
性されたものであるかに応じて変化する。後者の場合に
おいて活性炭の量は増大し、例えばヘモグロビン沈澱物
１０ｇ当たり活性要約３ｇであり得る。

接触時間は１５時間程度であることが好ましい。

この時間は大巾に変動でき、特に生産の工業的考察なら
びに容器の大きさおよび数によって決定される。

イオン強度は十分に低い値、例えばＮａＣ１０，０３Ｍ
以下に調節される。

温度は、安全性の観点からアルコール蒸気の発生を回避
するように２０℃を越えないことが好ましい。

特に有利には、接触中常に攪拌することができ、１（’
を拌は収率を著しく増大する。

本発明はまた、このようにして工業的に精製されたグｒ
］ビンにも関する。脱色率、即ちり、　０．２８０％ｍ
／　１１．　［１，４６３％ｍは１０以上であり、ヒト
グロビンは治療のｌ］的で利用するのに適している。

本発明の前記以外の利点並びに特徴は、以下の非限定的
な実施例の記載を考察することにより明らかになるであ
ろう。

実施例１ 変性へモグ［１ビン沈澱を、クロロホルムによる沈澱処
理によって、溶血した胎盤血液から得る。

該沈澱を水の添加（全体積の２０％）により再分散させ
、次いで３ＮｌｌＣＩで酸性とし、その後濃度を８０％
とするのに必要な蛍のエタノールを添加する。再溶解の
達成のために必要最低限の体積は１０％（重量／体積）
に相当する。これは、極めてわずかなアルコール消費と
なるので好ましい体積である。

不溶性画分は初めの沈澱の約３３％である（カプリン酸
ナトリウムによる沈澱の場合、復元即ち再分散の割合は
６％であり、不溶性画分ははじめの沈澱の２５％である
）。

ヘモグロビン溶液のｐ＋＋は３．３に調節する。

選ばれた活性炭素はフランスの会社ｃｌ！ｃへにより調
製されたＬ　ｄＳ型炭素である。

２０℃において、ヘモグロビン溶液に活性炭を、初めの
ヘモグロビン沈＃１０ｇ当たり３ｇの割合で添加する（
カプリン酸塩による沈澱の場合は１０ｇ当たり３．４ｇ
である）。

容器内で作製された混合物は、１５時間に亘り連続的に
攪拌する。見掛けのｐｌ＋は３．３である。

次いで、遠心分離法により炭素を除去する。上澄みを構
成するグロビンのアルコール性溶液は、次に同体積の水
で希釈され、１Ｎソーダの添加により中和される。遠心
分離または濾過によるグロビン沈澱の沈積および回収の
後、得られる液体は完全に透明であり、かつ無色であり
、蒸留によるアル−】−ルの再循環操作に対して完全に
適したものである。

次いで、りＣｌビンの沈澱は、既に公知の方法によっ−
Ｃ完全に脱色されたクロビン溶液に変えることができる
。

実施例２ 免疫グロブリン、γルブミンおよび場合によっては他の
血漿成分を抽出した、溶＋ｍ胎盤血液のへモクロビンな
どのヘモグロビンを精製した源、もしくはまた、血球残
渣の溶解により得られるヘモグＶ】ビン溶液を出発物質
とし、エタノール−酸混合溶媒中にヘモグロビンを溶解
する。該混合溶媒においてエタノール添加量は８０％と
なるようにし、屏掛けのｐＨを３．１とする。沈澱はま
ったくみられず、かつヘモグロビン溶液は完全に透明で
ある。

該溶液に０．２％（重量／体積）の１４４８型活性炭を
添加する。この混合物を、２０℃の温度にて１５時間攪
拌する。次いで、活性炭を、例えば濾過用白陶土によっ
て濾過するか、もしくはまた遠心分離によって除去する
。

得られる酸性のグロビンのアルコール性溶液は完全に脱
色されている。次いで、これを同体積の水で希釈し、１
Ｎソーダの添加により中和する。

遠心分離または濾過によりグロビン沈澱の沈降、回収後
、得られる液は完全に無色透明であり、蒸留によるアル
コールの再循環操作にまったく適したものであることが
わかる。

（）られろグロビンは完全に脱色されており、既に記載
した方法に従って、治療用誘導体に変えることができる
。

活性炭の比較 以下のような粉東状活性炭について調べた。

これら活性炭の１Ｌ較された有効性は以下の表に示され
ており、指標Ｒによって決定されたものである。

活性炭１，４Ｓが最も大きなＲを有するものであること
がわかる。活性炭の量はヘモグロビン沈澱１０ｇにつき
３ｇ程度であることが有利であり、好ましくは６ｇ以下
である。

１例として、１０トンの胎盤から ・約２５トンのクロロホルムもしくはカプリン酸ナトリ
ウムにより変性されたヘモグロビン沈澱、 ・約２５０ｋｇのヘモグロビン水溶液 が得られる。

好Ｊニジい方法に従って１ワられた結果を以下の表に総
めた１゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （＋）　ｌ’ｉｔｅ性ｐＨ側で、へそグｒ７ビンのアル
   コール性溶液を調製する工程を含む、ヘモグロビンから
   グロビンを調製する方法に′Ｊ、５いて、 前記アルコール性溶液を活性炭上で吸着させるこＬを特
   徴とする上記グロビンの調製方法。 （２）前記溶液のアルコール濃度が少なくとも４０％で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 （３）該アルコール濃度が７５〜８０％の範囲内である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 （４）該アルコールとしてエタノールを使用することを
   特徴とする特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に
   記載の方法。 （５）　前記ｐＩｔが２〜４の範囲内であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載
   の方法。 （６）前記ｒｉ１１が約３であることを特徴とする特許
   請求の範囲第５項記載の方法。 （７）前記活性炭の量が、ヘモグロビン沈澱］０ｇ当た
   り６ｇ以下であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   〜６項のいずれか１項に記載の方法。 （８）　該活性炭の量が、ヘモグロビン沈澱１０ｇ当た
   り約３ｇであることを特徴とする特許請求の範囲第７項
   記載の方法。 （９）前記炭素の量が、天然ヘモグロビン溶液に対して
   、約０．２％（重量／容量）であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。 ００　前記活性炭が粉末状炭素であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の方法
   。 （１１）　前記活性炭として、ＣＲＣＡ　Ｌ　ｄＳ型の
   活性炭を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
   ０項記載の方法。 （１２）　前記吸着中に、前記混合物を攪拌することを
   特徴とする特許請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項
   に記載の方法。 （１３）　更に、前記グロビンから前記活性炭を、遠心
   分離または濾過により分離することを特徴とする特許請
   求の範囲第１〜１２項のいずれが１項に記載の方法。 （１４）　前記吸着を１５時間続けることを特徴とする
   特許請求の範囲第１〜１３項のいずれが１項に記載の方
   法。 （１５）　前記方法が、約２０ｔの温度条件下で実施さ
   れることを特徴とする特許請求の範囲第１〜１４項のい
   ずれか１項に記載の方法。 （１６）　前記溶液のイオン強度を十分に低い値に調節
   し、特にＮａＣ］を０．０３　Ｍ以下に調節することを
   特徴とする特許請求の範囲第１〜１５項のいずれが１項
   に記載の方法。 （１７）　脱色され、比Ｒ＝　Ｄ、　Ｏ，２８０ｎｍ　
   ／　Ｉ］、　ｏ、４０３ｎｍが１０以上であることを特
   徴とし、前記特許請求の範囲第１〜１６項のいずれか１
   項に記載の方法に従って得られるグロビン。