FR2505844A1 - Procede de traitement d'une substance proteique en vue de separer les proteines et les groupements prosthetiques, et applications a l'hemoglobine et a la chlorophylle - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE TRAITEMENT DE SANG EN VUE DE SA CONSERVATION SOUS FORME LIQUIDE. CE PROCEDE CONSISTE A AJOUTER DANS LE SANG UN ANTICOAGULANT, EN PARTICULIER DES IONS CITRATES ETOU PHOSPHATES, ET UN CORPS CONTENANT DU SOUFRE ET DE L'OXYGENE DU TYPE METABISULFITE DE FACON A OBTENIR ENTRE CES DEUX CORPS UNE ACTION SYNERGIQUE DE DESTRUCTION ETOU D'INHIBITION AU MOINS PARTIELLE DU DEVELOPPEMENT DES GERMES DANS LE SANG. L'INVENTION PEUT ETRE APPLIQUEE POUR TRAITER LE SANG A LA SORTIE DES ABATTOIRS ET PERMETTRE DE LE MANIPULER, ET, LE CAS ECHEANT, DE LE STOCKER SOUS FORME LIQUIDE.

Description

PROCEDE DE TRAITEMENT D'UNE SUBSTANCE PROTEIQUE EN VUE DE
SEPARER LES PROTEINES ET LES GROUPEMENTS PROSTHETIQUES,
ET APPLICATIONS A L'HEMOGLOBINE ET A LA CHLOROPHYLLE
L'invention concerne un procédé de traitement d'une substance protéique composée d'au moins une protéine et d'au moins un groupement prosthétique en vue de séparer la ou lesdites protéines du ou desdits groupements prosthétiques ; elle s'étend en particulier à des applications en vue de séparer des protéines sensiblement blanches de groupements prosthétiques colorés, par exemple séparation de la globine d'une substance contenant de l'hémoglobine (cruor, sang, hématie), séparation des protéines contenues dans la chlorophylle ou substances issues ou dérivées de celle-ci.

On sait que les protéines constituent un des éléments essentiels des denrées alimentaires et de nombreux produits sont enrichis en protéine aussi bien pour l'alimentation de l'homme que pour celle des-animaux.

Or le sang et particulièrement le cruor qui en est dérivé est très riche en hémoglobine composée de l'association de l'hème (constituant un groupement prosthétique) et de la globine (constituant une protéine bien connue). Toutefois, à l'heure actuelle, cette protéine n'est pas récupérée et de considérables quantités de sang et de cruor sont rejetées, laissant perdre un produit noble, et au surplus, provoquant une forte pollution lors des rejets. Cette perte est d'autant plus préjudiciable que la globine possède des propriétés technologiques extrvemement intéressantes telles que pouvoirs moussant et émulsifiant très prononcés (qui sont d'après plusieurs auteurs supérieurs à ceux du plasma et de l'albumine d'oeuf qui sont les produits actuellement les plus utilisés pour remplir ces fonctions).

Cette absence de récupération et de valorisation des dérivés du sang provient d'une incapacité pratique de préparer, dans des conditions économiques satisfaisantes, un produit contenant la globine, qui soit sensiblement blanc afin d'être utilisable comme additif.

En effet, on connatt à l'heure actuelle essentiellement quatre types de procédés qui permettent d'éliminer la coloration de l'hémoglobine, mais tous ces procédés présentent des inconvénients qui, en pratique, rendent la récupération non rentable ou très faiblement rentable.

Un premier type de procédé consiste à effectuer la décoloration au moyen d'eau oxygénée concentrée. Les inconvénients spécifiques de ce procédé sont les suivants : dangers provenant de la manipulation de l'eau oxygénée concentrée et de la présence de traces d'eau oxygénée dans le produit final, forte dénaturation de la protéine qui perd ses propriétés technologiques, mise en oeuvre industrielle extrêmement délicate sur de grandes quantités en raison de la formation de volumes considérables de mousses, coût élevé du procédé en raison de la cherté du produit de base utilisé.

Un autre type de procédé consiste à traiter l'hémoglobine au moyen d'éthanol qui provoque la formation d'agrégats de l'hèmes ou dérivés et permet la séparation de la globine. Toutefois, les quantités d'éthanol nécessaires sont très élevées et le procédé doit être mis en oeuvre à basse température (inférieure à - se C).

De ce fait, le coût de sa mise en oeuvre industrielle est 61éve èt ne permet pas de rentabiliser la récupération des globines du sang.

Un autre type de procédé, très utilisé dans le domaine médical à l'occasion d'analyses ou de recherches, consiste à placer l'hémoglobine en milieu acide acétonique ; dans ces conditions la globine précipitée en flocons blancs peut être facilement séparée de l'hème qui reste en solution. Ce procédé, très efficace pour assurer une séparation complète, présente toutefois le grave inconvénient d'obliger à manipuler de l'acétone qui est un produit dangereux, ave t isques importants de résidus toxiques dans la globine obtenue, rendant sa consommation dangereuse. Ce procédé acceptable pour des analyses où la globine séparée n'est pas consommée, ne l'est plus pour l'obtention d'une globine destiné à l'ali mentation.

Un dernier type de procédé consiste à hydrolyser l'hémoglobine, par voie chimique à haute température et en milieu acide très concentré, Par voie tique en présence de protéase, en vue de scinder l'hémoglobine en divers constituants : l'un d'eux contient l'hème qui, insoluble, peut ê.tre facilement séparé. Toutefois, au cours de-l'hydrolyse, la globine est elle-meme fractionnée en petits peptides (enchaSnement de 3 à 4 résidus d'acides aminés) ou même en acides aminés, ce qui lui fait perdre ses propriétés technologiques et lui donne un goût amer, la rendant difficilement utilisable comme additif alimentaire.Par ailleurs, l'hydrolyse par voie chimique s'effectue dans des conditions opératoires contraignantes (chauffage à 110 C pendant 24 heures, présence d'un milieu acide de concentration au moins égale à 6 N...).

Les défauts ci-dessus résumés des procédés classiques ont pour conséquence que d'énormes quantités de sang provenant des abattoirs sont actuel le ment rejetées sans aucune récupération ; dans certains cas, la plasma jaune est récupéré mais le cruor qui est le produit rouge restant, contenant l'hémoglobine, est perdu.

La présente invention se propose de pallier les défauts et insuffisances des procédés classiques de traitement de l'hémoglobine en vue de permettre une séparation de la globine sans dénaturation de celleci et dans des conditions de mise en oeuvre très économiques.

Dune façon plus générale, l'invention se propose d'indiquer un procédé de traitement permettant de séparer une ou des protéines du ou de leurs groupements prosthétiques sans altérer la protéine et sans risque de trace de produit toxique ou dangereux dans celle ci.

Un objectif de l'invention est en particulier de fournir une protéine insipide gardant toutes ses propriétés et notamment ses propriétés technologiques.

Un autre objectif est d'éviter de façon rigoureuse toute manipulation de produits dangereux ou toxiques et de permettre l'obtention d'une protéine strictement exempte de résidus toxiques.

Un autre objectif est de fournir un traitement utilisant des matières de base très bon marché, bénéficiant d'une mise en oeuvre simple et facile i tem- ou relativement peu élevée pérature ambiante et, en consequence, susceptible d'etre développé sur le plan industriel à un coût extrêmement bas.

A cet effet, le procédé de traitement conforme à l'invention consiste
- dans une première étape, à disposer la substance protéique en milieu aqueux non neutre de pH i 5 ou ss 9 en vue de former un précipité PI contenant la majeure partie du ou des groupements prosthétiques, et de garder préférentiellement en solution la ou les protéines de la substance,
- et dans une seconde étape, à séparer la phase solide PI obtenue de la phase liquide LI.

Les expérimentations ont mis en évidence que, de façon inattendue, il se forme en milieu aqueux non neutre au pH précité et en l'absence d'addition d'un quelconque produit auxiliaire, un précipité contenant préférentiellement les groupements prosthétiques, qui peut être aisément séparé par toute voie connue (centrifugation, filtration, décantation...) pour obtenir une phase liquide très pauvre en groupements. prosthétiques.

Ainsi, dans le cas de l'hémoglobine, cette phase liquide est faiblement colorée et contient en majeure partie de la globine qui n'a subi aucune modification sensible.

Il est à noter que les groupements prosthétiques initiaux sont généralement transformés au cours du traitement pour fournir des groupements dérivés mais sans que la protéine elle-même n' ait subi de modifications sensibles (c'est-à-dire susceptibles d'altérer notablement ses propriétés). Les conditions opératoires préférentielles du procédé conforme à l'invention sont les sui vantes ::
- milieu aqueux acide de pH compris entre 4 et 0,5,
- concentration pondérale de la substance protéique dans le milieu aqueux approximativement comprise entre 20 et 60 grammes par litre,
- Substance protéique en milieu aqueux chauffée à une température approximativement comprise entre 70e C et 100 C pendant quelques minutes à quelques dizaines de minutes, ou bien, à température ambiante)substance protéique laissée dans le milieu aqueux pendant un laps de temps supérieur à 3 heures environ, avant de procéder à l'étape de séparation.

Ces conditions opératoires sont douces et permettent d'accroitre la quantité de protéine séparée et de réduire la proportion résiduelle de groupement prosthétique dans la phase liquide.

En outre, on a pu constater que, au cours de la première étape, l'addition dans le milieu, d'une certaine quantité de précipité formé au cours d'un traitement antérieur favorise considérablement la formation du précipité PI et permet daccroitre la quantité de précipité formé au cours d'un laps de temps donné et d'obtenir après séparation une phase liquide appauvrie en groupements prosthétiques ; dans le cas de l'hémoglobine ou plus généralement d'une substance protéique colorée par la présence des groupements prosthétiques, la phase liquide obtenue est ainsi encore plus claire.

Par ailleurs, il a été mis en évidence que la phase solide séparée P1 qui contient la majeure partie des groupements prosthétiques contient également de la substance protéique qui n'a pas été scindée par rapport auxdits groupements. Le procédé peut se limiter à un seul cycle en vue de récupérer dans la phase liquide L1 une partie seulement des protéines pratiquement exemptes des groupements prosthétiques génants.

Il est également possible de récupérer une quantité plus importante de protéines en soumettant au terme de la seconde étape, la phase solide PI au traitement complémentaire suivant : dilution de cette phase dans de l'eau en vue de permettre le passage en solution d'une partie des protéines contenues dans celleci et séparation de la nouvelle phase liquide L3 et de la nouvelle phase solide P3 au bout d'un laps de temps déterminé en vue de récupérer une quantité supplémentaire de protéines dans ladite phase liquide, ces opérations pouvant, le cas échéant, être reproduites. On constate de façon quelque peu paradoxale que la nouvelle phase li quide obtenue L3 contient une proportion de groupement prosthétique inférieure à celle de la phase liquide LI obtenue lors du premier cycle.Ainsi, pour l'hémoglobine, la nouvelle phase liquide obtenue L3 est parfaitement jaune clair et conduit après séparation et séchage à des globines d'une blancheur remarquable. Ce mode de mise en oeuvre fournit un moyen de préparer des protéines de meilleure qualité, ce qui peut être intéressant dans certaines
de la globine applications (notamment en vue d'une utilisation comme produit moussant en pâtisserie pour remplacer le blanc d'oeuf).

Par ailleurs, selon un autre mode de mise en oeuvre qui peut se combiner au précédent, le procédé peut être adapté pour obtenir une solution plus concentrée de protéines afin notamment de réduire les coûts de séchage. Dans ce mode de mise en oeuvre, la phase liquide LI obtenue après séparation du précipité PI est portée à un pH correspondant au minimum de solubilité des protéines concernées ; par exemple, pour la globine, ce pH est sensiblement compris entre 7 et 7,5 et correspond à une solubilité de la globine très réduite . Il se forme alors un nouveau précipité P2 floconneux, riche en protéines et pauvre en sel. Ce précipité est ensuite séparé de la nouvelle phase liquide L2 en vue d'obtenir des protéines concentrées, contenant peu de sel.

Ce dernier mode de mise en oeuvre est en particulier très intéressant lorsque la substance protéique a fait l'objet d'un traitement préalable de conservation (ou autre) avec des sels toxiques : il permet alors une élimination naturelle de la plus grande partie de ces sels.

La première étape du procédé de l'invention est de préférence réalisée en préparant d'abord le milieu aqueux non neutre au pH approprié et en ajoutant ensuite la substance protéique dans celui-ci. On écarte ainsi les risques de coagulation dans le cas de certaines substances protéiques. Toutefois, il est bien entendu que l'invention s'étend à tout processus permettant de disposer la substance protéique dans le milieu aqueux non neutre (en particulier on peut ajouter la substance au milieu aqueux et ajuster ensuite le pH dudit milieu).

Le procédé de l'invention s'applique en particulier dans le cas de substances protéiques colo rëes (notamment hémoglobine ou chlorophylle et substances issues de celle-ci) pour obtenir à partir de celles-ci des protéines sensiblement blanches. Les applications du procédé à l'hémoglobine et à la chlorophylle et substances issues de celle-ci sont illustrées par les exemples décrits ci-après.

Exemple 1 - Le corps de départ traité est du cruor (qui est constitué par le culot de centrifugation du sang dont on a séparé le plasma surnagean9.

Le cruor traité dans cet exemple provient de sang de boeuf recueilli sur un mélange de sulfite et de citrate conformément à la demande de brevet déposée simultanément par les demandeurs.

On prépare un milieu aqueux acide en mélangeant un acide minéral fort à de l'eau ; en l'exemple, 26 cm3 d'HCl 12 N ont été ajoutés à 3,6 litres d'eau.

On verse alors dans ce milieu 400 cm3 de cruor et on homogénéise la solution dont le pH est de l'ordre de 2,1. On attend 24 heures au cours desquelles on constate la formation d'un précipité noirâtre P1 qui décante au fond du récipient ; la solution liquide restante
LI est de couleur brun clair.

Au terme des 24 heures, on opère une filtration sur papier filtre classique. Dans cet exemple, le précipité noirâtre P1 est éliminé et la phase liquide recueillie L1 est analysée ; elle contient une concentration pondérale d'environ 15 g/litre de globine.

Cette phase liquide LI est ensuite soumise à un traitement d'atomisation qui permet d'obtenir environ 50 g de poudre blanche, légèrement teintée en brun.

La quantité initiale de cruor traitée contenait environ 90 g de globine liée à l'hère sous forme d'hémoglobine compte tenu d sels présents, on a ainsi récupéré en un seul cycle et par un procédé de mise en oeuvre extrtmement simple, environ la moitié de la globine initialement présente.

Exemple 2 - On réitère les deux étapes du procédé de l'exemple 1 pour obtenir une phase liquide
LI de même nature après élimination du précipité P1.

On verse dans cette phase liquide (dont le volume est d'environ 3,5 litres) 1,7 litre de soude 0,1 N de façon à ramener le pH & une valeur égale à 7. 11 se forme immédiatement un précipité floconneux blanc rosé
P2 que l'on laisse décanter.

La phase liquide L2 surnageante est éliminée ; cette phase contient la plus grande partie, d'une part, des sels formés par mise en oeuvre du procédé lors des ajouts d'acide et de base, d'autre part, des sels présents ou ajoutés dans le cruor initial (notamment sulfites et citrates).

Le précipité floconneux P2 qui est donc riche en globine et pauvre en sel est dissous dans un milieu aqueux non neutre, de façon à former une solution de pH de l'ordre de 5 à 5,5, contenant 30 g de précipité par litre de solution. Dans ces conditions, on constate que tout le précipité est passé en solution.

On réalise alors un traitement de deshydratation par atomisation et on obtient une poudre blanche très faiblement rosée ; son analyse fait apparaître que cette poudre contient 82 X de globine.

Exemple 3 - On réitère les deux étapes du procédé de l'exemple 1, mais on conserve la phase solide P1 obtenue au terme de la filtration, afin de la soumettre à un traitement supplémentaire permettant de récupérer une partie des globines contenues dans celle-ci.

Cette phase solide P1 est diluée trois fois en volume dans de l'eau pour obtenir une nouvelle phase solide P3 et une nouvelle phase liquide L3. On laisse décanter cette nouvelle phase P3 pendant 48 heures et on prélève la phase liquide L3 surnageante. Cette phase liquide qui contient en solution une partie des protéines demeurées dans la phase PI, est de couleur jaune clair.

Cette phase est atomisée pour la transformer en poudre. On obtient une poudre parfaitement blanche contenant en poids une proportion d'environ 80 % de globine.

Exemple 4 - On prépare un milieu aqueux acide en mélangeant 65 cm3 d'HCl 12 N dans 9 litres d'eau et on verse dans ce milieu 1 litre de cruor obtenu à partir de sang recueilli sur phosphate et chlorure de sodium. On homogénéise la solution dont le pH est de l'or- dre de 2,2.

On attend 12 heures environ au cours desquelles on constate la formation d'un précipité noire- tre P'1 qui décante ; la solution liquide restante L't est de couleur brun clair.

On opère une centrifugation et on récupère environ 9 litres de surnageant L'i. On fait passer cette solution sur une colonne de charbon actif ; on constate que la solution obtenue L"1 est notablement plus claire. Le charbon actif permet donc d'éliminer une partie des groupements prosthétiques qui étaintencore contenus dans la solution Lrl,
On ajoute ensuite à la solution Lw 4,3 litres de soude 0,1 N : on constate la formation d'un précipité P'2 de couleur blanchâtre. Ce précipité est soumis aux rayonnements lumineux solaires pendant deux jours on peut constater que sa blancheur s'accentue, ce qui démontre un effet de dégradation des groupements prosthétiques par la lumière.

Le procédé se poursuit par dissolution du précipité en milieu acide et atomisation de la nouvelle phase liquide obtenue. On parvient ainsi à une poudre ex trèmement blanche contenant une proportion d'environ 85 % de globine.

Exemple 5 - On prépare un milieu aqueux acide en mélangeant 78 cm3 d'HCl 12 N dans 8,4 litres d'eau et on verse dans ce milieu 1,2 litre de cruor obtenu à partir de sang recueilli sur citrate et sulfite conformément à la demande de brevet déposée simultanément par les demandeurs. On homogénéise la solution dont le pH est de l'ordre de 2,2.

On porte la solution à 900 C pendant 15 minutes et on constate la formation d'un précipité noi râtre qui décante en cours de refroidissement ; la solution liquide restante est de couleur jaune pâle.

Le volume total restant après refroidissement est de 6,4 litres. Par filtration, on récupère 3,8 litres de solution jaune pâle, contenant environ 48,5 g/litre de globines, soit en poids 57 X de l'hémoglo- bine initiale.

La poudre obtenue après déshydratation est de couleur blanche (sans aucune nuance rosée).

La température est donc un facteur favorable qui permet de réduire considérablement la durée de réaction, tout en augmentant le rendement et la qualité de blancheur obtenue.

Exemple 6 - Cet exemple porte sur la séparation des protéines et des groupements prosthétiques contenus dans un résidu d'algues bleues du type spiruline.

Ces algues contiennent les substances protéiques suivantes: chlorophylle A, caroténolde, xanthophylle, phycobiline (phycocyanine et phycoérythrine).

On prépare un milieu aqueux acide en mélangeant 3,5 cm3 dHCl 12 N dans 500 cm3 d'eau et on verse dans ce milieu 30 g de résidus de spiruline en poudre, obtenus après séparation grossière de la substance protéique bleue. On homogénéise la solution dont le pH est de l'ordre de 3 (une partie de la poudre demeure à l'état non dissous).

On porte la solution à 90 C pendant 50 minutes et on constate la formation dtun précipité vert foncé qui décante en cours de refroidissement ; la solution liquide restante est de couleur jaune clair.

Le volume total restant après refroidissement est de 400 cm3. Par centrifugation, on récupère 250 cm3 de solution jaune clair, contenant environ 14,1 g/litre des protéines précitées, soit 14 % des protéines initiales.

La poudre obtenue après déshydratation est de couleur blanche (sans aucune nuance colorée).

Claims (15)

REVENDICATIONS

1) Procédé de traitement d'une substance protéique composée d'au moins une protéine et d'au moins un groupement prosthétique, en vue de séparer la ou lesdites protéines du ou desdits groupements prosthétiques, caractérisé en ce qu'il consiste

- dans une première étape, à disposer la substance protéique en milieu aqueux non neutre de pH / 5 ou > , 9, en vue de former un précipité P1 contenant la majeure partie du ou des groupements prosthétiques et de garder préférentiellement en solution la ou les protéines de la substance,

- et, dans une seconde étape, à séparer la phase solide P1 obtenue de la phase liquide LI.

2) Procédé de traitement selon la revendication I,caractérisé en ce que la substance protéique est placée en milieu aqueux acide de pH compris entre 4 et 0,5.

3) Procédé de traitement selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on place la substance protéique en milieu aqueux non neutre de sorte que la concentration pondérale de cette substance soit approximativement comprise entre 20 et 60 grammes par litre de milieu aqueux non neutre.

4) Procédé de traitement selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on laisse la substance protéique en milieu aqueux non neutre à température ambiante pendant un laps de temps supérieur à 3 heures environ, avant de procéder à l'étape de séparation.

5) Procédé de traitement selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on porte le milieu aqueux non neutre contenant la substance protéique à une température approximativement comprise entre 70e C et 1000 C.

6) Procédé de traitement selon l'une des revendfcations 1, 2 ou 3, 4 ou 5, caractérisé en ce que, au cours de la première étape, on ajoute dans le milieu une quantité de phase solide P'1 obtenue au cours d'un traitement antérieur, en vue de catalyser la précipitation se déroulant au cours de ladite première étape.

7) Procédé de traitement selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caractérisé en ce que la phase liquide L1 obtenue au terme de la seconde étape est portée à un pH correspondant au minimum de solubilité des protéines, en vue de former un précipité P2 riche en protéines et pauvre en sel, ledit précipité P2 étant ensuite séparé de la nouvelle phase liquide L2 en vue d'obtenir des protéines concentrées.

8) Procédé de traitement selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on dissoud au moins partiellement le précipité P2 riche en protéines et pauvre en sel en milieu aqueux non neutre, l'on mélange éventuellement les deux phases et l'on fait subir au liquide ou mélange obtenu un traitement de deshydratation, en vue de le transformer en poudre.

9) Procédé de traitement selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caractérisé en ce que, au terme de la seconde étape, la phase solide obtenue P1 est diluée dans de l'eau, en vue de dissoudre une partie des protéines contenues dans ladite phase solide, la nouvelle phase liquide L3 étant séparée de la nouvelle phase solide P3, en vue de récupérer une quantité supplémentaire de protéines, cette opération étant le cas échéant reproduite.

10) Procédé de traitement selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, 8 ou 9, carac térisé en ce que la première étape consiste à préparer d'abord le milieu aqueux non neutre et à ajouter ensuite dans celui-ci la substance protéique.

11) Procédé de traitement selon la revendication 2, caractérisé en ce que, pour obtenir le pH précité, l'on utilise un acide minéral fort.

12) Procédé de traitement selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la seconde étape consiste à effectuer l'une des opérations de sdpa ration suivantes : centrifugation, filtration ou décantation.

13) Procédé de traitement conforme à l'une des revendications précédentes d'une substance protéique contenant au moins une protéine et au moins un groupement prosthétique coloré, en vue d'obtenir des protéines sensiblement blanches.

14) Procédé selon la revendication 13 appliqué à un corps tel que le cruor contenant comme substance protéique de l'hémoglobine, en vue d'obtenir de la globine sensiblement blanche.

15) Procédé selon la revendication 13 appliqué à une substance protéique végétale issue de la chlorophylle.