JPS60120985A - 新規な修飾酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な修飾酵素に関する。

更に詳しくは、ナクロモバクター・リティカスから産生
されるリシルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタ−・
プロテアーゼＩ　）　ｌＪ、Ｔ、Ｐ　Ｔ、Ｔ’と略称す
る。）をポリアルキレングリコールを架橋剤として用い
て、分子間で架橋重合させて得られる新規な修飾酵素に
関する。

酵素反応は一般に広く利用されているが、通常、酵素は
水性溶液に溶解した状態で使用される為、反応終了後の
酵素回収は至難であると共に、反応生成物の分離精製も
容易ではない。更に元来、酵素は決して安定ではなく、
通常中性域で常温付近、常圧下に使用されるが、回収に
よって著しく損耗する。従って、広い温度域及び広いｐ
　Ｉ−１域で安定、各種の溶剤中に於いても使用出来、
簡単に回収できるという要件を備えることは、全ての酵
素に共通した志向であり、Ｐ　Ｔ、　Ｐに於いても当然
の要求てあった。

Ｐｌ・Ｐは土壌から分離されたアクロモバクタ−・リテ
ィカスＭ　４９７−１が産生ずる菌体外酵素で、副島、
正木らによって発見され、アグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー、第４２巻１４４３頁
（１，９７８年）、及び特開昭５４−１１９０８５号に
記載されているアクロモバクタ−・プロテアーゼＩと同
一の酵素である。至適温度１ｉ４５’ｃ、カゼインを基
質とした場合、プロテアーゼ活性の至適ｐ　Ｔ−］は８
５〜１０５、ゲルｒ過法てよる分子量は２７，０００、
等電点１）Ｈ６，９、ジイソプロピルフォスフオクロリ
ド及びトシル−Ｌ−リジンクロロメチルケト／によって
強く阻害を受け、１・−／ルーＬ−フェニルアラニンク
ロロメチルケトン、エチレンジアミンテトラアセテート
、オルソソ毛ナンスロリン及ヒＰ−１’ロロマーキコリ
ーヘンゾエートで阻害されないセリン酵素であり、Ｌ−
リジンのカルホＡ−シル基に於けるエステル結合及びア
ミド結合を特異的て氷解し、それ故にアミノ酸配列決定
の際のペプチドの酵素分解並びにリシル−ペプチドの分
解及び合成に於いて山川な酵素であることは周知の如く
である。近年、この酵素を利用して豚イン／ニリンから
ヒトインシュリンの合成が行なわれているが（副島・正
木らの特開昭５４−１３５７８９号及び森原・岡らのバ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケインヨン、９２巻、３６２頁（１９８０年）
）、これらの方法はいずれも水溶性酵素Ｑｉ体を使用す
る液相反応であるため、得られたヒトインシュリンと異
質の蛋白であるＰ　Ｔ・Ｐを分離精製する必要があり、
もし精製が不十分である場合は、医薬品として人体に投
与した場合に異種蛋白による抗体の生成という免疫学的
な副作用を伴ない、殊に長期間に連続的に投与する場合
は極めて重大な結果を惹起する恐れがある。更に当然の
如く分離精製には多大の労力と時間を要し、又分離後の
酵素は失活の為、再使用に４えないので、冒価な酵素を
製造バッチ毎に使い捨てることになり、その経済的世失
は犬なるものがある。それ敵本酵素を何らかの誘導体に
導き、安定性を増し、１１１つ反応液からの分離を容易
に行なえる形態にして使用ずれば、目的物の品質向上並
びに経済面からも優位性を保ち得ることは明らかである
。

一般にこのような目的を達成する為、酵素を誘導体に導
く方法としては数多くの方法が知られているが、それら
の方法の内、代表的な方法を列挙すると、（１）酵素を
水不溶性の担体に共有結合させる方法、（２）酵素を水
不溶性の担体にイオン結合させる方法、（３）酵素を水
不溶性の担体に吸着させる方法、（４）酵素を架、矯剤
で架ａさせ、水に不溶性なものにする方法、（５）相体
を重合させ、酵素を包括させ水に不溶なものにする方法
、などがある。

しかしながら、ト記の方法で得られた所甜、固定化酵素
は、水に不溶性であるために、バッチ法で種々の反応に
使用するに際して、反応液が不均一な１鵠濁状態圧なっ
たり、あるいは比重が高い固定化酵素はすぐに沈澱して
しｆうために、反応を速やかに進行させる場合には、可
能な限り反応液を４賓拌させたり、あるいは反応容器を
回転させたりする串Ｖこより出来るだけ均一々懸濁状態
を作り、固定化酵素と反応物との接触時間を長くしたり
、あるいは接触頻度を多くする必要がある。従って、反
応させる物質が非常に不安定であり、空気中の酸素によ
り酸化され易く、激しい機械的な攪拌又は回転は避けな
ければならないような反応には固定化酵素は使用出来な
い場合もある。

また、水圧不溶性の固定化酵素を用いた反応に於ては、
当然のことながら、固相と液相との不均一な反応となる
為、液相中での反応て比較すると必然的に反応速度が遅
くなることは否めない事実である。

更に、カラム法及びバッチ法に於いて、水不溶性固定化
酵素を反応に用いる場合、基質は溶媒に溶解させている
が、反応中に生じてくる反応生成物あるいは副生成物の
いずれが又（ｄ−両者ともが、用いる溶媒に難溶性もし
くは不溶性の時に目、固定化酵素との分離が非常に困難
になってくる。ｆＡ澱として生じてくる反応生成物と固
定化酵素とを分離するために、数多くの方法が試みられ
ているが、例えば、沈澱を生じせしめないような有機ρ
ｆ媒などを使用する方法罠於ては、有機溶剤の種類によ
っては、時には著しく固定化酵素の失活を招き、その結
果、繰り返し使用回数も減少し、経済性も悪くなる。ま
た、反応生成物が反応溶媒に溶解する場合であっても、
繰り返し使用している間に、反応生成物が水に不溶性な
固定化酵素に非特異的な吸着を惹起し、目的物の収率が
悪くなる欠点もある。

また、繰り返し固定化酵素を使用するに従い、その担体
の比活性が徐々に低下するため、反応率を上昇させるに
は、当然新しい固定化酵素を補充せねばならないが、バ
ッチ法て於いて反応を行なう場合、基質濃度との関係か
ら溶媒の量を増加できない事もあり、このような時には
実際には反応が不可能になる。

本発明者らは、固定化酵素のかかる問題点を解決するべ
く、水に可溶で、尚且ろ原料及び得られた生成物との分
離が容易な修飾酵素について鋭意研究を重ねた結果、ポ
リアルキレングリコール（以下、ＰＡＧと略称する。）
を架橋剤として弔いて、ＰＬＰを分子間で架橋重合させ
ることにより、酵素活性を減することなく、水溶性を保
ったままで、安定で、且つ原料及び反応生成物との分離
が容易な、新規な修飾酵素が得られることを見出し、本
発明を完成するに到った。

これまで酵素療法の分野で、その免疫原性を低下させる
ことを目的として、分子表面に存在するアミノ酸残基に
非免疫原性高分子を化学結合させ、これにより酵素分子
表面に存在する抗原決定部位を覆いか＜１７、抗体との
結合能を減少あるいは消失させる為に、酵素タンパクを
合成高分子、例えば、七ノメトキ７ポリエチレングリコ
ールのような一価性のポリエチレングリコールで化学修
飾する試みがなされている例があるが、この場合はあく
までも酵素タンパクのもつ免疫原性を低下させることが
目的であって、その為に一価性のポリエチレングリコー
ル即ち、モノメトキノポリエチレングリコールでその周
囲を覆うわけで゛あるが、本発明の如く、水溶性を保っ
たままで酵素を更に高分子化し、酵素反応に用いられる
基質や反応生成物との分離を容易ならしめる目的で、架
橋剤として二価性のポリアルキレングリコールを用いて
酵素を架、矯重合させている例はこれまでに無く、本発
明者らが独自の知見に基いて完成した新規な発明である
。

本発明の修飾酵素即ち、ポリアルキレングリコールーリ
ンルエンドベプチダーゼ重合体（以下、ＰＡＧ−ＰＬＰ
重合体と略称する。）は、ＰＡＧ分子中の水酸基を活性
化剤で活性化後、次いでこれにＰ　Ｌ　Ｐ　２作用させ
ることにより製造される。

本発明に使用されるポリアルキレングリコールとしては
、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略称する。

）、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコー
ル等が挙げられ、いずれも両端の水酸基がメトキシ基等
に置換されていない二価性のものが用いられる。また、
ＰＥＧの場合には通常、分子量２００〜２０，０００の
ものが用いられるが、好ましくは分子量６，０００〜２
０，０００のものがよＶ、Ｘｏ 本発明の修飾酵素を得る方法は、好ましくけ２工程で行
なわれる。先ず、Ｐ　Ａ、　Ｃｒ　ｖｃ活活性化合反応
させて活性化させる。活性化剤としては、例えば１，１
′−カルボニルジイミダゾール、塩化／アヌル等が使用
され、これらはＰ　Ａ　Ｇ中の水酸基１個に対し１〜１
０倍量を用いるのが好ましい。反応は一般にジオキサン
やベンゼンなどの有機溶剤中へ で行なわれ、温度は０〜５０℃で行なうのが好ましい。

このようにして活性化されたＰ　Ａ、　Ｇは、−ロー反
応液から単離・精製したのち、第２の反応を行なうのが
好ましい。活性化Ｐ　Ａ　Ｇの畦離は、反応後、透析に
より未反応の低分子量のものを除去するか、ゲル濾過す
るか、限外濾過するか、もしくは有機溶媒による沈澱法
を用いるのが良い結果を与える。

第２工程は、活性化されたＰ　Ａ、　ＧとＰＬＰとを水
溶液中、好ましくは弱アルカリ性の条件下で反応させる
。活性化ＰＡ、Ｇの量は、ＰＬＰ分子中のアミン基の数
に対し１〜１，０００倍量になるようにする。反応は０
〜４０℃で行なわれ、塩化シアヌルで活性化されたＰ　
Ａ　Ｇを用いた場合は１〜５時間で、１，１′−カルボ
ニルジイミダゾールで活性化されたＰ　Ａ、　Ｇ　＠用
いた場合は１〜５日間で完結する。

反応後の分離・精製は、水溶性高分子化合物、特に蛋白
質の精製法として汎用されている方法、例えば透析法・
ゲルｒ過性・限外−過性・有機溶剤による沈澱法などを
適宜選択して利用する事ができる。

Ｐ　Ｌ　Ｐの反応液中での最終濃度は、通常０．０２〜
２０重量係、より好ましくは０１〜１５重量係にに製さ
れる。酵素濃度が低すぎると、目的物である水溶性Ｐ　
Ａ　Ｇ　−Ｐ　Ｌ　Ｐ重合体の収率が低く、実用性に乏
しくなる。また、酵素濃度が高すぎると、得られてくる
重合体が水不溶性となる恐れがある。

本発明に使用される活性化ＰＡＧは、三官能基もしくは
それ以上の官能基を有するものであればいずれでもよい
が、通常は先は挙げた１、１′−カルボニルジイミダゾ
ール又は塩化シアヌルで活性化された三官能基、若しく
は三官能基を有する活性化ＰＡＧが用いられる。

本発明のＰ　Ａ　Ｇ　−Ｐ　Ｔ、　Ｐ重合′体は、重合
前のＰＬＰと基質特異性に於て変らず、また、至適ｐＨ
１至適温度、ミカエリス定数（ｋｍ値）及び最大速度Ｖ
ｍａｘに関して、重合前のＰ　Ｌ　Ｐの値と変化がなか
った。

′例えば、ＰＥＧ−ＰＬＰ重合体の基質特異性を第１表
に示す。

第　１　表 ＊１）活性化Ｐ　Ｅ　Ｇ　６，０００　（平均分子量７
，５００のポリエチレングリコール）とＰＬＰとの重合
体 ）ｌ＝　２　）　活性化、　Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０，０００
　（平均分子量２０，０００のポリエチレングリコール
）とＰ　Ｌ　Ｐとの重合体 尚、上記酵素類の活性測定法は次のように行なった。即
ち、０２Ｍ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン
ジオール緩衝液（ｐＨ９，５）　２．６ｍｌに、２．５
ｍＭ各基質溶液０．３　ｍｅを加え、３０℃にて予備加
温後、酵素溶液Ｑ、　ｌ　ｍｌを添加し、各基質に応じ
て１０分間から２０時間、３０℃にて反応させた。反応
後、４５係酢酸水溶液１．　Ｏｍｅを加え反応を停止さ
せたのち、４０５　ｎｍＫで比色測定し、その吸光度を
めた。酵素単位としては、３０°Ｃに於いて１分間当り
１μｍｏｌｅのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素喰を
１単位とした。酵素力価の算出方法は、次式に従った。

（ｐ−ニトロアニリンの分子吸光係数は、９．６２　Ｘ
’　１　（３３１＊ｍｏｌｅ　’＊Ｃ１ｎ　’　である
。） 第１表から明らかなように、本発明のＰＥ（’ｒ−ＰＬ
Ｐ重合体はリジンのカルボキン基のアミド結合に強く作
用し、アルギニンに対しては殆んど作用せず、またその
他のアミノ酸残基のアミド結合を加水分解することはな
く、重合前のＰ　Ｌ　Ｐと同じ基質特異性を示すもので
ある。

本発明の酵素誘導体の大きな特徴の１つは、分子量が大
きいために、ゲル濾過法によって目的の反応生成物と酵
素とを非常に容易に分離でき、また回収できた本発明Ｐ
　Ａ　Ｇ　−Ｐ　Ｌ　Ｐ重合体は、その酵素活性に全く
損耗をきたしていないので、繰り返し使用する事ができ
る点である。即ち、Ｐ　ＬＰは分子量が２７，０００〜
３０，０００であるため、分子量１０万以下のペプチド
あるいは蛋白とのゲルｆ過性による完全な分離は容易で
はなく、他の、より複雑な方法を用いる必要があるが、
本発明の酵素誘導体は、分子量４０万以上と極めて高分
子であるので容易に分離ができ、蛋白やペプチドの分機
溶剤の内、重合前のＰＬＰはジメチルスルホキッドにし
か溶けず、またべ／ゼンにわずかに溶解するだけである
が、ＰＥＧ−ＰＬＰ重合体はいずれもメタノール、ジメ
チルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン
、ベンゼン、クロロポルム及びテトラヒドロフランに対
し溶解度が増し、完全に溶解するか、もしくは殆んど溶
解するようになった。

また第２人に於ける有機溶剤に溶解された本島の溶液舎
、３０°Ｃにて２００分間加温した後、アミダーゼ活性
の測定を行ない、水に溶解させたものとの活性の比較を
行なった結果を第３表に示す。

第　３　表 ＊）水に溶解した時の活性を１００係とし７て表わした
。

・活性測定方法：第１表の活性測定法に同じ。

第３表から明らかなように、重合前のＰ　Ｌ　Ｐはジメ
チルスルホキッドとベンゼンにり、か溶解せず、また溶
解しても殆んど活性が残っていないが、一方、ＰＥＧ−
ＰＬＰ重合体は、７　セｌ−ｙ中テｒｔ失活はなく、Ｐ
　Ｅ　Ｇ　−Ｐ　Ｌ　Ｐに於てはむしろ活性が６ 増大しており、またジオキサン、ベンゼン、クロロホル
ム及びテトラヒドロフラン中ではかなりの活性を保持し
ている。

このようにｆ’ＡＧ−ＰＬＰの重合体は、水桑では勿論
の事、有機溶剤系に於いても反応に使用することが可能
である。従来、酵素反応は酵素、の溶解性の故に水の存
在下で行なうのが通常の方法であり、有機溶剤下では実
施できないというのが當識であったが、本発明の酵素誘
導体をもってすれば、酵素反応を利用した各種技術分野
での新しい展開が期待できる。

例えば化学法によるペプチド合成は、一般に熱や圧力を
かけるためラセミ化が起こり易く、光学純度が下がる欠
点があり、また、圧力をかける場合には特別の装置を必
要とする。

一方、酵素を用いるペプチド合成は、一般には常温・常
圧での反応のため、ラセミ化が起こ抄に＜＜、且つ酵素
の基質特異性が高いために、ラセミ体の原料を用いても
いずれか一方の原料としか反応せず光学分割が容易であ
るので、光学純度の高いものが得られる。

一般に、ペプチド合成は、反応機構及び使用する原料や
反応生成物の溶解性の面からすれば、有機溶剤中で反応
を行なうのが好ましいが、酵素法の場合、反応に性いる
酵素の溶解性及び活性の発現の面から、反応は水溶液中
で行なわざるｋ　ｆ）ず、水と混和する有機溶剤を用い
る場合でも、有１幾溶剤の濃度は可能な限り低い方がよ
いとされており、一般的には６５チ以下の１震度で使用
されている。

従って、酵素によるペプチド合成は、ペプチド合成の反
応機構からは有機溶剤を高濃度に使用するのがよいとさ
れているが、他方、酵素を触媒に用いるためには有機溶
剤を出来るだけ低濃度て抑える必要があるという二律背
反の問題から生じる種々の制約を受けることになる。

しかしながら、本発明者らは、本発明の酵素誘導体、即
ちＰＡＧ−ＰＬＰ重合体の有機溶剤中での溶解性に着目
し、９５容量係という高濃度の有機溶剤中、Ｐ　ＥＧ　
−Ｐ　Ｔ、　Ｐ重合体を用いてペプチド合成を試みた結
果、ペプチド合成が高収率で進行するという驚くべき事
実をも見い出している。

即ち、ジメチルホルムアミド８５容量係、エタノール１
０容量チ及び０．５　Ｍ　）　！Ｊスス−酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）　５容量チ中、ＰＥ、Ｇ６−ＰＬＰ重合体０
９５単位存在下、デスアラニンインスリ７２０ｍ９（３
５ｍＭ）とスレオニン第３　級７’チルエステル９０ｍ
９（３４０ｍＭ　）とを３７°Ｃで１５時間反応させ、
反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析したと
ころ、Ｂ３０位スレオニン第３級ブチルエステルインス
リンが８１係の変換率で得られていることが確認された
。

この場合、有機溶剤としてジメチルホルムアミド及びエ
タノールを用いているが、これらの溶剤に溶かしたＰＥ
Ｇ−ＰＬＰ重合体は、第３表に示されているようにペプ
チドの加水分解に於いては、あまり活性が残っていなか
ったものであるが、ペプチド合成に於いては、意外にも
有効な酵素活性を示しており、また、回収したＰＥＧ６
−ＰＬＰ重合体は、その酵素活性に全く損耗をきたして
いなかった。

このように浴解能の高い有機溶剤系でのＰＡＧ−Ｐ　Ｌ
　Ｐ重合体の利用は、す／ンを含むペプチドの合成及び
氷解に於いて有効な手段となりうろこと自明で・ある。

本発明の修飾酵素、即ちＰ　Ａ−Ｇ　−’Ｐ　Ｔ−Ｌ’
重合体は水溶性であるため、均一系で反応できること及
び極めて安定性が高いため、酵素活性を損うことなく、
回収及び繰り返し使用が可能である事、水単独でも、水
と混和できる有機溶媒を広範囲に併用する系でも、高収
率に酵素反応が行なわれる事、更に本発明Ｐ　Ａ　Ｇ　
−Ｐ　Ｌ　Ｐ重合体１ｄ、高分子量であるため、反応系
から例えば分子篩ゲルｒ過１去等により簡単に取り出す
ことができるので、目的物の分離・精製も、−！た本発
明Ｆ　Ａ、　Ｇ　−Ｐ　Ｌ、Ｐ重合体の回収も極めて有
利である事から、本発明の利用価値は非常に高く、具体
的には、アミノ酸配列決定の際のペプチドの酵素分解、
並びにり／ルーペプチドの分解及び合成など幅広い目的
に利用でき、斯業に貢献するところ甚だ犬なるものがあ
る。

以下に参考例及び実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるもの
でないことはいうまでもない。

参考例１ ２００ｍｅ容：ｌ’ｌ　ルヘ：／中、Ｔ’　ＥＧ　６，
０００　（平均分子量７，５００　、ライオン油脂製）
１５．１：ジオキサン　５０　ｍｌに溶解し、１，１′
−カルホ゛ニルジイミダゾール４．０５，９を添加溶解
後、３７℃にて２時間反応させた。反応後、反応液を透
析チューブ（スペクトラポア６、分画分子量　３，５０
０．スヘ、クトラム・メディカル・インダストリフ社製
）に入れ、水に対して一夜透析後、透析内液を凍結乾燥
させ、活性化ＰＥＧ６，０００（以下、活性化Ｐ　Ｅ　
Ｇ６と略称する。）全１４５ｇ得た。

参考例２ 塩化／アヌル　５．５　ｇ　（０，０３ｍｏｌｅ　）−
ｐ、無水炭酸ナトＩＪウム　１ｏｇ−２含有する無水ペ
ンゼア　４００ｍ１４ｃ溶解し、Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０，０
００（平均分子量　２０．ＯＱ　Ｏ±５，０００．　日
本油脂製）　］　ＯＯｇ（０，０（１，Ｓ’ｍｏｌｅ　
）を加えた後、宰温で一夜反応後、反応混合物をｒ過し
、沢液に石油エーテル　６００ｍｅｆｆ：ゆっくり攪拌
しながら加えた。祈／出する沈澱をｆ取後、沈澱をベン
ゼン　４００ｍ１に再溶解し、石油エーテル　６００ｍ
１ｉ攪拌下ゆっくり加え、析出する沈澱をｒ取する。同
様に沈澱析出工程及び１過工程を数回繰り返し、活性化
Ｐ　ＥＧ　２０，０００　（以下、活性化ＰＥＧ２ｏと
略称する。）が８０ｇ得られた。

８．５　）　０．５　ｍｅに溶解後、参考例１で得られ
た活性化ＰＥＧ、、（５３３８ｍ９添Ｊｏｎ　ｉ’＠　
Ｍ　Ｌ、４°ＣＫ”’Ｃ７２時間攪拌反応させた。反応
後、反応液をセファテックスＧ−１００（ファルマ／ア
社製）のカラム（Ｓ、１．５　Ｘ　８５４．　）てよる
ケル濾過て＋ｔ　Ｌ、カラム容積叱０３６の位置にＰ　
Ｆ、　Ｃ＞６−　’Ｐ　Ｌ　１’重合体が２９２単位（
収率８１１％）得られた。ここに得られた重合体の諸性
質は以下の西りである。

（１）分子量 ４０万以上（セファテックスＧ−２００を用いるゲルｆ
過性による） （２）ｐ［Ｉ安定性 緩衝液としてブリトン・ロビンソン緩衝液（ｐ　Ｈ２〜
］２）を用い、３０℃にて１時間保持した後、本重合体
の活性を測定した結果、本重合体はｐＨ５〜１１で安定
である事が認められた。（第１図参照） （３）熱安定性 ０２Ｍ　２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジ
オール緩衝液（ｐｒ１９．５　）　’ｓ：用いて、各温
度で１時間加温後の結果、本重合体は４０°Ｃまで安定
である事が認められた。（第２図参照）（４）ミカエリ
ス定数（ｋｍ値） ０２Ｍ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオ
ール緩衝液（ｐＴ−１９，５）中、３０°Ｃにてべ／ソ
イル・す／／−ｐ−ニトロアニリドを基質とした場合、
本重合体のｋｍ値は０．１．７ｍＭであった。

また最大法度Ｖｍａｘば０．１９　μｍｏｌｅ／ｍｉｎ
／ｍｌであった。

（５）至適ｐｌＩ プリトン・ロビンソン緩衝液（ｐ）１３〜１２）を甲い
て、３０℃にて各ｐＨに於ける本重合体の活性測定を行
なった結果、本重合体の至適ｐｉｔ　Ｉｄ９５で゛あっ
た。

（６）至適温度 ０２Ｍ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオ
ール緩衝液（ｐ１１９．５　）中、ベンゾイル・リジン
−ｐ−ニトロアニリドを基質とし、各温度に於ける活性
を測定した結果、本重合体の至適温度は５０°Ｃであっ
た。

（力保存安定性 ］ＱｍＭ　ポウ酸塩緩衝に＋　（ｐｒ−１８，５）中、
４℃にて４０日間保存後の活性をチェックした結果、活
性の低下はなく、またセファテックスＧ−１００のカラ
ムによるゲル濾過では、本重合体の分解も認められなか
った。

実施例２ ＰＬＰ　２．８単位と、参考例２で得られた活性化ＰＥ
０　３００ｍ！？とｆ！：ｌ−００ｍＭ　ホウ酸塩緩衝
液（ｐＨ９，２）　０．５ｍｅＶＣ溶解し、４℃にて１
時間攪拌反応させた後、実施例１．と同様に処理を行な
い、Ｐ　Ｅ　Ｃｒ２ｏ−Ｐ　Ｌ　Ｐ重合体が１５８単位
（収率５６４係）得られた。ここに得られた本重合体の
諸性質を以下に示す。（測定法は実施例１．０場合と同
様に行なった。） （］）分子量：４０万以上。

（２）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１１に於いて安定（第１図
参照）。

（３）熱安定性：４０℃迄安定（第２図参照）（４）ミ
カエリス定数（ｋｍ値）：Ｏ，１８ｍＭ最大速度Ｖｍａ
ｘ　：　０．１８　μｍｏ１ｅ／ｍｌｎ／ｍ１（５）至
適ｐＩＩ　：　ｐＩ−ｒ　９．５〜１００（６）至適温
度＝５０°Ｃ （７）保存安定性：失活及び分解なし

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１．及び実施例２に於ける本発明のＰ
　’Ｉ’、　Ｇ　、Ｐ　Ｌ　Ｐ重合体及びＰＥＧ２ｏ−
ＰＬＰ重合体のｐ　Ｉ−１安定性を示す曲線を、また第
２図は、同じく熱安定性を示す曲線を表わす。 第１図 ｐＨ 第２図 温度Ｃｃ） 手続補正書 昭和６０年　３月　１日 特許庁長官　殿 １’ｌ’３０５″８４ヒ卒手＊ｔＫｉｉｙ　２２ｇ２２
０　？２　発明の名称 ３　補正をする者 事件どの関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許ｖｌ（東京）　置　０３−２７０−８５７
１５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）　明細書１７頁４行目に記載の「メタノール、ジ
メチルスルホキシド、」を「メタノール、アセン、ジメ
チルスルホキシド、」と補正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　アクロモバクタ−・リティカス産生りシルエン
   ドペプチダーゼ（アクロモバクタ−・プロテアーゼ１）
   をポリアルキレングリコールで架橋重合させて得られる
   、新規な修飾酵素。 （２）　ポリアルキレングリコールが、１＋１’　：ｌ
   ｌ’Ｊ／Ｌ／ボニルジイミダゾールで活性化されたポリ
   アルキレングリコールである、特許請求の範囲第１項記
   載の新規な修飾酵素。 に（）　ポリアルキレングリコールが、塩化シアヌルで
   活性化されたポリアルキレングリコールでル）る、特許
   請求の範囲第１項記載の新規な修飾酵素。 （４）　ポリアルキレングリコールがポリエチレングリ
   コールである、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
   項記載の新規な修飾酵素。 （５）　ポリエチレングリコールの発子量が２００から
   ２０，０００である特許請求の範囲第４項記載の新規な
   修飾酵素。